JP2006526393A5 - - Google Patents
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Description
フラビウイルス構造タンパク質は、ウイルスによる細胞変性(viral cytopathicity)およびウイルス誘導性アポトーシスの主因の一つであると思われる(Nunes Duarte dos Santos et al.,2000,Virology 274,292-308)。全長RNA(Khromykh, 2000, supra)と比較したフラビウイルスレプリコンの低い細胞変性は、さらにまた構造タンパク質がウイルスによる細胞変性に対して大きく寄与することも示している。DEN2およびJEウイルス由来のprMおよびEカセットを発現する安定な細胞系は生成されているが、天然prM−E遺伝子を使用した場合の発現レベルは低かった(Hunt et al.,2001,J.Virol.Methods.97 133-149)。比較的多量のprM−E粒子を発現する安定な細胞系を樹立するためには、低い膜融合活性を有する未熟prM−E粒子を産生するためにprMタンパク質内のフリン切断部位の不活化(Konishi et al.,J Virol.75 2204-2212)、または抗アポトーシス性bcl−2遺伝子の共発現(Konishi & Fujii,2002,Vaccine.20 1058-1067)が必要とされた。これらの安定な細胞系はいずれも、全3種のフラビウイルス構造タンパク質を同時には発現しなかった。
Claims (31)
- 動物細胞内でフラビウイルス構造タンパク質を調節可能に発現するためのパッケージング構築物であって、前記ベクターが、Cタンパク質、prMタンパク質およびEタンパク質を含むフラビウイルス構造タンパク質翻訳産物をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節可能なプロモーターを含むパッケージング構築物。
- 前記調節可能なプロモーターがテトラサイクリン抑制性である、請求項1に記載のパッケージング構築物。
- 前記調節可能なプロモーターがテトラサイクリン抑制性CMVプロモーターである、請求項2に記載のパッケージング構築物。
- 前記ヌクレオチド配列が、Cタンパク質、prMタンパク質またはEタンパク質に対して各々少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する1つ以上の変異体または突然変異フラビウイルス構造タンパク質をコードする、請求項1に記載のパッケージング構築物。
- IRESNeo選択マーカーヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1に記載のパッケージング構築物。
- 前記Cタンパク質、prMタンパク質およびEタンパク質が、クンジンウイルスの構造タンパク質である、請求項1に記載のパッケージング構築物。
- 請求項1に記載のパッケージング構築物を含むパッケージング細胞。
- 請求項2に記載のパッケージング構築物およびテトラサイクリン転写活性化因子構築物を含むパッケージング細胞。
- BHK21細胞である、請求項7または8に記載のパッケージング細胞。
- (i)請求項1に記載のパッケージング構築物と;
(ii)フラビウイルス発現構築物であって、
(a)フラビウイルスレプリコン;
(b)異種核酸;および
(c)前記レプリコンに作動可能に連結したプロモーター、
を含むフラビウイルス発現構築物と、
を含むフラビウイルスパッケージング系。 - 前記フラビウイルスレプリコンが、クンジンウイルスレプリコン、デング熱ウイルスレプリコンまたは西ナイル熱ウイルスレプリコンである、請求項10に記載のフラビウイルスパッケージング系。
- 前記異種核酸が、動物細胞内で発現可能である1つ以上のタンパク質をコードする、請求項10に記載のフラビウイルスパッケージング系。
- 前記1つ以上のタンパク質が免疫原性である、請求項12に記載のフラビウイルスパッケージング系。
- 前記レプリコンが、1つ以上の突然変異構造タンパク質をコードする、請求項10に記載のフラビウイルスパッケージング系。
- 前記突然変異構造タンパク質が、
(i)非構造タンパク質NS1内のプロリンによって置換されたロイシン残基250と;
(ii)非構造タンパク質NS2A内のプロリンによって置換されたアラニン30と;
(iii)前記非構造タンパク質NS2A内のアスパラギン酸塩によって置換されたアスパラギン101と;
(iv)非構造タンパク質NS5内のセリンによって置換されたプロリン270と、
からなる群から選択された突然変異を含む、請求項14に記載のフラビウイルスパッケージング系。 - 前記調節可能なプロモーターがテトラサイクリン抑制性である、請求項10に記載のフラビウイルスパッケージング系。
- 前記調節可能なプロモーターがテトラサイクリン抑制性CMVプロモーターである、請求項16に記載のフラビウイルスパッケージング系。
- 前記フラビウイルス発現構築物がRNAの形態である、請求項10に記載のフラビウイルスパッケージング系。
- 請求項10に記載のフラビウイルスパッケージング系を含むパッケージング細胞。
- 請求項16に記載のフラビウイルスパッケージング系およびテトラサイクリン転写活性化因子構築物を含むパッケージング細胞。
- BHK21細胞である、請求項19または20に記載のパッケージング細胞。
- フラビウイルスVLPを産生する方法であって、
(i)請求項1に記載のパッケージング構築物を宿主細胞内へ導入し、パッケージング細胞を産生するステップと;
(ii)前記パッケージング細胞内へ、
(a)フラビウイルスレプリコンと;
(b)異種核酸と;
(c)前記レプリコンに作動可能に連結したプロモーターと、
を含むフラビウイルス発現構築物を導入するステップと;
(iii)前記パッケージング細胞によって1つ以上のVLPの産生を誘導するステップと
を含む方法。 - 前記フラビウイルス発現構築物がRNAの形態である、請求項22に記載の方法。
- 請求項22の方法によって産生されるフラビウイルスVLP。
- 請求項24に記載のVLPおよび医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む免疫療法用組成物。
- ワクチンである、請求項25に記載の免疫療法用組成物。
- 組み換えタンパク質を産生する方法であって、請求項24に記載のVLPに宿主細胞を感染させ、前記タンパク質をコードする前記異種核酸を前記宿主細胞内で発現させるステップを含む方法。
- 前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項27に記載の方法。
- 動物を免疫する方法であって、請求項26に記載の免疫療法用組成物を前記動物へ投与し、前記動物において免疫応答を誘導するステップを含む方法。
- 前記動物が哺乳動物である、請求項29に記載の方法。
- 前記動物がヒトである、請求項30に記載の方法。
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