CN1798845A - 黄病毒复制子包装系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种四环素调控型黄病毒包装系统，其利于动物细胞中黄病毒RNA复制包装及病毒样颗粒产生所必需的黄病毒结构蛋白的表达。这种调控型包装系统与Kunjin、登革和西尼罗病毒及其它基于黄病毒复制子的表达系统相容，并产生出乎意料的高效价病毒颗粒。这种包装系统的一种特殊应用是产生病毒样颗粒，所述病毒样颗粒包装包含黄病毒复制子并编码异源蛋白质或肽的RNA以在动物细胞中表达。更特别地，所述包装系统能输送诱导保护性CD8 T细胞介导的免疫应答的免疫原。

Description

黄病毒复制子包装系统
发明领域
本发明涉及黄病毒起源的病毒样颗粒的生产。更特别地，本发明涉及一种诱导型黄病毒包装系统，其促进黄病毒RNA包装必需的黄病毒结构蛋白在动物细胞中的诱导型表达。特别地，本发明提供了一种与Kunjin或其它黄病毒表达系统相容的四环素诱导型包装系统，其产生出乎意料的高效价病毒样颗粒。所述包装系统的一特殊应用是产生病毒样颗粒，该病毒样颗粒包装包含黄病毒复制子并编码异源蛋白或肽的RNA以在动物细胞中表达。
发明背景
正链RNA病毒的基于复制子的载体已经被开发用于抗病毒和抗癌疫苗(参见Khromykh，2000.Curr Opin Mol Ther.2：555-569)。一些特征使得这些载体成为开发高效并安全的疫苗的一种合适的选择。这些特征包括：(i)由于复制子RNA扩增自身的能力使得编码的异源基因(HG)高水平表达，(ii)只在胞质复制消除了与核剪接和/或染色体整合相关的任何可能的并发症，(iii)复制子RNA不能从转染的(或感染的)细胞中逃脱，因此限制了疫苗载体在免疫的对象中的传播，使得这些载体是生物学安全的，(iv)相对小的基因组大小(7-9kb)使得易于操作其cDNA及产生重组体。
对于代表性的大多数正链RNA病毒科已经开发了基于复制子的表达载体，所述病毒科包括α病毒、小核糖核酸病毒和黄病毒(参见Khromykh，2000，文献如前)。
一般地，已经示出VLP输送在诱导哺乳动物体内保护性免疫应答方面最有效。
特别地，已经示出利用Kunjin(KUN)黄病毒VLP的表达系统诱导对病毒蛋白的保护性免疫应答，如国际申请PCT/AU02/01598所述。
然而，将KUN复制子RNA包装成VLP相对精细及耗时，并且需要两个连续的转染，首先用KUN复制子RNA转染，在24-36小时后用SFV复制子(表达KUN结构基因的RNA)转染(Khromykh，etal.，1998.J Virol.72 5967-5977)。另外，使用这种系统产生的VLP的最大效价仅为大约2-5×106感染性VLP/ml(Khromykh etal.，1998，文献如前；Varnavski & Khromykh，1999，Virology.255 366-375)，这样使得难以大规模生产VLP。
黄病毒结构蛋白看起来是导致病毒致细胞病变性和病毒诱导的凋亡的主要原因之一(Nunes Duarte dos Santos etal.，2000.Virology 274292-308)。黄病毒复制子与全长RNA(1，2，4，9-11，13，14)相比较低致细胞病变性也表明了结构蛋白对病毒致细胞病变的主要作用。尽管已经产生了表达来自DEN2和JE病毒的的prM和E盒的稳定细胞系，但是当使用天然的prM-E基因时表达水平较低(Hunt etal.，2001，J.Virol.Methods.97133-149)。建立表达相对高量prM-E颗粒的稳定细胞系需要prM蛋白中弗林蛋白酶切割位点的失活以产生低融合活性的不成熟的prM-E颗粒(Konishi et al.，J Virol.752204-2212)或者需要抗凋亡bcl-2基因的共表达(Konishi & Fujii，2002，Vaccine.201058-1067)。这些稳定的细胞系无一同时表达所有三种黄病毒结构蛋白。
本发明人先前尝试产生同时表达在各自独立启动子控制下的所有三种KUN结构基因的稳定细胞系(独立表达C和prM-E)，但表达显著不稳定，在几次细胞传代之后仅产生10-20％阳性表达。使用这些细胞系产生KUN复制子VLP的尝试导致非常低的VLP效价。
发明目的
本发明的一个目的是提供一种黄病毒包装系统，其实现与现有技术中的包装系统相比更有效和/或更高的VLP产量。
发明概述
本发明广义上涉及一种调控型黄病毒包装系统、包装构建体和/或包含其的包装细胞。
尽管国际申请WO 99/28487简要地提及了稳定及可诱导地表达黄病毒结构蛋白的细胞系的建立对于VLP的生产是一种有益的方案，但是本发明人令人惊奇地发现C和prM-E的诱导型表达自身不足以实现VLP包装的高产量及高效率。
在调控型黄病毒包装系统的建立和实践中，本发明人出乎意料地发现结构蛋白C、prM和E必须表达为单一的前体翻译产物而不是表达为独立的C和prM-E蛋白才能产生本领域期望的更高量的VLP。
本发明的一个特殊优点是VLP效价是使用现有技术包装系统典型获得的效价的至少500倍。
本发明的另一个特殊优点是调控型黄病毒包装系统可用于包装衍生自任何各种黄病毒亚群的复制子。
第一方面，本发明提供了一种包装构建体以在动物细胞中可调节地表达黄病毒结构蛋白，所述载体包含与编码一种黄病毒结构蛋白翻译产物的核苷酸序列可操纵地连接的调控型启动子，所述黄病毒结构蛋白翻译产物包含C蛋白、prM蛋白和E蛋白。
第二方面，本发明提供了一种包装细胞，其包含第一方面所述的包装构建体。
第三方面，本发明提供了一种黄病毒表达系统，其包含
(i)用于在动物细胞中可调节表达黄病毒结构蛋白的包装构建体，所述载体包含与编码黄病毒结构蛋白的核苷酸序列可操纵地连接的调节型启动子；
(ii)一种黄病毒表达构建体，其包含
(a)一种黄病毒复制子；
(b)一种异源核酸；及
(c)与所述复制子可操纵地连接的启动子。
优选地，根据前述方面所述调控型启动子是四环素诱导型启动子。
第四方面，本发明提供了一种包装细胞，其包含本发明的黄病毒表达系统。
第五方面，本发明提供了一种产生黄病毒VLP的方法，包括如下步骤：
(i)将第一方面所述的包装构建体导入宿主细胞中，从而产生包装细胞；
(ii)将所述包装细胞导入一种黄病毒表达构建体中，所述黄病毒表达构建体包含：
(a)一种黄病毒复制子；
(b)一种异源核酸；及
(c)与所述复制子可操纵地连接的启动子；以及
(iii)诱导所述包装细胞产生一或多种VLP。
第六方面，本发明提供了根据第五方面的方法生产的黄病毒VLP。
第七方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含第六方面的VLP及一种药物可接受的载体稀释剂或赋形剂。
第八方面，本发明提供了一种生产重组蛋白的方法，包括用第六方面的VLP感染宿主细胞的步骤，从而编码所述蛋白质的异源核酸在所述宿主细胞中表达。
适当地，所表达的蛋白质随后被纯化。
第九方面，本发明提供了一种免疫动物的方法，包括给予动物第七方面所述的药物组合物的步骤，从而在动物体内诱导免疫应答。
优选地，所述动物是哺乳动物。
更优选地，所述哺乳动物是人。
优选地，根据前述方面所述C、prM和E结构蛋白源于Kunjin病毒(KUN)。
优选地，根据前述方面所述黄病毒复制子源于Kunjin病毒、西尼罗病毒或登革病毒。
在特殊的实施方案中，所述黄病毒复制子编码一或多种突变的非结构蛋白。
在本说明书中，除非特别说明，术语“包含”是指包含在内而不是除外，由此一指定整数或整数组可包括一或多个其它未指出的整数或整数组。
附图简述
图1：稳定的包装细胞系tetKUNCprME的产生和鉴定。(A)用于产生稳定的包装细胞系tetKUNCprME的质粒构建体的示意图。使用pEF-tTA-IRESpuro质粒产生第一种稳定的BHK细胞系BHK-Tet-Off，其从人延伸因子1α启动子(pEF-1a)连续表达四环素反式激活蛋白(tTA)。从四环素诱导型CMV启动子(PminCMV)表达KUN结构基因C、prM和E(KUN CprME)的tetKUNCprME是通过将pTRE2CprME-IRESNeo质粒DNA转染进BHK-Tet-Off细胞并选择在存在G418和嘌呤霉素的情况下生长的细胞而建立的(见正文所述)。在未诱导的tetKUNCprME细胞中，强力霉素(DOX，一种具有较高比活性的四环素形式)结合tTA，并防止其结合四环素应答元件(TRE)及进而防止其激活从CMV启动子转录CprME mRNA。为诱导KUNCprME基因表达，将DOX从培养基中去除导致释放tTA，tTA结合TRE的，及激活从CMV启动子转录CprME mRNA。tetR-Tet阻抑蛋白；VP16-单纯疱疹病毒VP16激活结构域；IRES-EMCV内部核糖体进入位点；puro-嘌呤霉素N-乙酰转移酶；TRE-四环素应答元件；Neo-新霉素抗性基因；SV40polyA-SV40转录终止子/poly(A)信号；β-珠蛋白polyA-β-珠蛋白转录终止子/poly(A)信号。(B)在存在和不存在KUN复制子RNA的情况下在诱导的和未诱导的tetKUNCprME细胞中分泌的E蛋白和VLP的产生。“-RNA”图(左侧)示出无复制子RNA转染的实验结果，“+RNA”图(右侧)示出用KUN复制子RNA-RNAleu电穿孔的另一个实验的结果。将tetKUNCprME细胞用KUN复制子RNA电穿孔(+RNA)或未电穿孔(-RNA)，并在有(未诱导的)或无(诱导的)0.5μg/ml强力霉素的培养基中保持48小时。如“材料和方法”章节所述通过抗原捕获ELISA进行分泌的KUN E蛋白的检测(白色条柱)及通过在Vero细胞上的感染性分析进行VLP效价的确定(黑色条柱)(以感染单位(IU)/ml表示)。这两个实验中的阴性对照(Cont)是来自正常BHK细胞的培养液。每个实验中使用的KUN病毒阳性对照(KUN)的效价通过在BHK细胞上的噬斑分析而确定。
图2：Kunjin病毒结构蛋白C、prM和E的加工示意图。切割位点示作：□NS2B-NS3(病毒)蛋白酶；·宿主细胞信号酶；←宿主细胞弗林蛋白酶。
图3：除去强力霉素对KUN结构基因在tetKUNCprME细胞中表达的诱导。(A)从诱导的(-DOX)和未诱导的(+DOX)tetKUNCprME和BHK细胞中提取的RNA的Northern印迹杂交分析。将20μg每种RNA在1％聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶上分离，然后通过毛细管印迹移至Hybond N膜上。(B)从诱导的(-DOX)和未诱导的(+DOX)tetKUNCprME和BHK细胞中提取的RNA的Western印迹杂交分析。将5μg总蛋白质在12.5％聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后移至Hybond P膜上。将该膜与KUN抗E单克隆抗体保温，结合的KUN E蛋白通过化学发光检测。
图4：tetKUNCprME细胞中KUN复制子VLP的扩增与传播。将tetKUNCprME和BHK21细胞的盖玻片用0.1MOI(感染复数)的RNAleuMpt VLP感染，并在感染后第2天和第3天用KUN抗NS3抗体通过IF分析。
图5：用高效价的KUN VLP复制子免疫的小鼠中CD8T细胞应答。(A)将C57BL/6小鼠(4只/组)经腹膜内用如下制剂免疫：PBS(天然的)，108IU的不编码重组抗原的KUN VLP(KUN VLP对照)，或者指定剂量的编码鼠多表位KUN-Mpt VLP(Anraku et al.，2002，J Virol.76 3791-3799)的KUN VLP。2周后，取出脾细胞并通过IFNγELISPOT分析(H-2Kb限制的)SIINFEKL-特异性应答。(B，C)将BALB/c小鼠(3只/组)经腹膜内用2.5×107IU的编码呼吸道合胞病毒基质2蛋白的KUN VLP(KUN-M2VLP)，2.5×107IU的不编码重组抗原的KUN VLP(KUN VLP对照)免疫，或者如先前所述(Elliott etal.，1999，Vaccine.17 2009-2019)用与破伤风毒素在Montanide ISA 720中配制的含有H-2Kd限制的RSV M2表位SYIGSINNI的肽疫苗(SYIGSINNI/TT/M720)皮下免疫接种。2周后，取出脾细胞并通过(B)IFNγELISPOT及(C)标准铬释放分析(黑色方块—用SYIGSINNI肽敏化的P815靶细胞，白色方块—未用肽敏化的P815靶细胞)分析SYIGSINNI特异性应答，所述分析如前所述(Anraku et al.，2002，文献如前)。
图6：使用KUN VLP和IL-2的肿瘤治疗。将4组小鼠经s.c.在背部注射5×104 LLOva。一旦LLOva肿瘤可以触知(＞1mm2)，则将小鼠在图中指定的时间用有和没有IL-2的KUN VLPMpt或PBS(对照)接种2次。(A)监测肿瘤大小并经ANOVA对比各组，VLP vsVLP+IL-2组，p＝0.34；对照组vs对照组+IL-2，p＝0.96；对照组vsVLP，p＜0.001；对照组vs VLP+IL-2，p＜0.001。(B)同一实验的以KaplanMeier图表示的存活力(当1个肿瘤达到15×15mm2时将动物安乐死)。通过Log Rank统计学对比各组：VLP vs VLP+IL-2，p＝0.11；对照组vs对照组+IL-2，p＝0.41；对照组vs VLP，p＝0.0015；对照组vs VLP+IL-2，p＜0.001。
图7：适应性突变对于在用复制子VLP感染后在BHK21、HEp-2和293细胞中建立KUN复制子RNA持久复制能赋予优势。将BHK21、HEK293和HEp-2细胞用野生型rep/PAC-gal复制子VLP或每种突变体分别以0.01、1和10的MOI感染。感染48小时后，将1μg/ml(HEK293和HEp-2)和5μg/ml(BHK21)的嘌呤霉素加入培养基中并将细胞额外增殖7天。将嘌呤霉素抗性细胞集落在4％甲醛中固定，用结晶紫(BHK21)或者用X-gal(HEK293和HEp-2)染色。
图8：tetKUNCprME细胞在增强从Kunjin复制子载体表达异源基因中的应用。将24孔平板中95％铺满的KUN包装A8细胞系和BHK21细胞用KUNrepPAC/β-gal VLP以MOI＝1感染，并在感染2、4和6天后通过X-gal染色(A)和β-gal分析(B)进行分析。空心条柱表示BHK21细胞，实心条柱表示A8细胞的KUN包装。每个条柱均表示一式两份样品的平均值。误差杆表示标准误差。
发明详述
本发明揭示了一种稳定的包装构建体和包装细胞系tetKUN-CprME，该包装细胞系能实现KUN复制子VLP的简化的(即一次RNA转染)诱导生产。在本发明的稳定包装细胞系中，KUN结构基因C、prM和E从四环素诱导型CMV启动子表达(图1)。在这个包装细胞系的增殖和维持期间，毒性KUN结构基因产物的产生通过向培养基中加入四环素(或强力霉素)而抑制。在KUN复制子RNA转染进tetKUN-CME细胞中之后从培养基中除去强力霉素导致KUN结构基因表达的诱导，其产物然后将复制中的KUN复制子RNA包装成分泌的VLP(图1)。
令人惊奇地，从本发明的这个包装构建体中产生的KUN结构蛋白能将转染的和自身扩增的Kunjin复制子RNA包装成分泌的VLP，效价高至约109VLP/ml。这表示比先前应用致细胞病变的SemlikiForest病毒复制子RNA瞬时表达Kunjin结构基因的包装方案改良了约1500倍。分泌的KUN复制子VLP可以连续收获3-4次，直至RNA转染后8天，从3×106个转染的细胞产生总量高至约5.4×1010VLP(表3)。VLP在Vero细胞上的传代及将VLP经颅内注射进2-4天龄哺乳幼鼠中示出在VLP制备物中无任何感染性Kunjin病毒存在的迹象。用编码人呼吸道合胞病毒M2基因的KUN复制子VLP免疫小鼠可诱导格外强的CD8+T细胞应答。包装细胞也能包装来自远缘相关的黄病毒2型登革病毒的复制子RNA以及西尼罗病毒复制子，表明这些细胞包装任何黄病毒复制子RNA的潜力。
来自C-prM-E前体翻译产物的黄病毒结构蛋白加工为产生病毒颗粒(或者复制子VLP)所需的单独的C、prM(M)和E蛋白是一个复杂的过程，需要细胞信号酶、细胞弗林蛋白酶和病毒编码的蛋白酶NS2B-NS3的5次切割(图2)。根据本发明应用的邻近的C-prM-E前体翻译产物因此在不提供从复制子RNA中表达的病毒蛋白酶的前体下不能被正确加工。如图1示出在诱导C-prM-E表达时从tetKUNCprME细胞中无分泌的E蛋白(分泌的VLP的一个指征)产生，除非细胞用复制子RNA转染。天然的黄病毒C-prM接点的切割需要由病毒和细胞蛋白酶双重切割，并且除非已经发生了病毒蛋白酶切割，否则细胞信号酶切割不能进行下去(Stocks & Lobigs，1998，JVirol.722141-2149)。这导致ER中未切割的C-prM产物积聚，可能触发对细胞有害的ER应激应答。另外，如果prM不从C中切割，则其不能参与分泌的病毒颗粒产生所必需的prM-E异源二聚体的形成。尽管可以设计C和prM之间的疏水序列中的突变使得prM通过细胞信号酶而不用病毒蛋白酶即可从C中有效切割，它们看起来不能产生病毒颗粒(Lee etal.，2000，J Virol.74 24-32.)，提示细胞和病毒蛋白酶对C-prM接点的协调切割对分泌的病毒颗粒的产生的重要作用。因此，本发明应用编码C-prM-E前体翻译产物的核苷酸序列的表达联合编码病毒蛋白酶的复制子RNA的转染，提供了正确加工KUN结构蛋白及产生高效价分泌的复制子VLP的有利条件。
更特别地，本发明的诱导型表达系统通过向细胞培养基中加入四环素而提供了一种“关闭”具有潜在毒性的C-prM-E前体翻译产物表达的能力。这使得可以选择并维持tetKUNCprME稳定的包装细胞系而不降低C-prM-E表达，并因此可以高水平、可诱导地产生高效价的复制子VLP。
应意识到本发明因此对黄病毒复制子包装可具有如下广泛的应用：
(i)具有包装任何黄病毒复制子的能力；和/或
(ii)具有表达对于黄病毒复制子包装充分必要的任何黄病毒结构蛋白的能力。
如本文所用术语“黄病毒”是指黄病毒科内黄病毒属的成员，含有65或更多个相关的病毒种。典型地，黄病毒是小型包膜RNA病毒(直径大约45nm)，具有包含一个单一糖蛋白E的包膜粒。其它的结构蛋白称为C(核心)和M(膜样)。单链RNA是感染性的并典型地具有大约为4×106的分子量，在5’末端有一个m7G“帽”，但在3’末端无poly(A)序列；其行使唯一信使的功能。黄病毒广泛的感染脊椎动物，许多是通过节肢动物如蜱和蚊传播的，尽管有单独一组黄病毒称为无已知载体(NKV)。
特别地，黄病毒的非限制性实例是西尼罗病毒、Kunjin病毒、黄热病病毒、日本脑炎病毒、登革病毒、蜱传播脑炎、Murray Valley脑炎、Sent Louis脑炎、Montana Myotis白质脑炎病毒、Usutu病毒及Alkhurma病毒。
本文所用术语“核酸”是指单链或双链的mRNA、RNA、cRNA、RNA-DNA杂交体及包含cDNA及基因组DNA的DNA。
优选地，本发明的包装构建体是双链质粒DNA包装构建体。
术语“蛋白质”是指氨基酸聚合物。氨基酸可包括天然的(即遗传编码的)、非天然的、D-及L-氨基酸，这些为本领域所熟知。
术语“肽”是指具有少于50个氨基酸的蛋白质。
术语“多肽”是指具有50或更多个氨基酸的蛋白质。
根据本发明，术语“包装构建体”包含与编码一或多个黄病毒结构蛋白的一或多个核苷酸序列可操纵地连接的一个可调节启动子。
适当地，所述包装构建体包含编码结构蛋白C、prM和E的核苷酸序列。
本发明人已经发现编码C、prM和E结构蛋白的邻近氨基酸序列可诱导的表达为“前体”或“前蛋白”是迄今为止最有效的产生VLP的系统。这与典型的现有技术中C和prM-E蛋白分别由单独的核苷酸序列编码的方法相反。
在这点上，根据本发明结构蛋白C、prM和E在动物细胞中可表达为单一的前体翻译产物，其经历随后的蛋白酶解产生VLP产生所需的单独的C、prM和E结构蛋白。
提议的描述前体翻译产物加工的模型概括示于图2。尽管加工通常依赖于细胞蛋白酶和复制子编码的蛋白酶同时存在，但也预期可以将另外的蛋白酶切割位点工程化进入一或多个结构蛋白C、prM和E中，与动物宿主细胞对合适的蛋白酶表达一起可以提供另一种通常发生的加工系统。
这种系统在C、prM和E翻译产物的加工中不需要黄病毒复制子编码的蛋白酶。
在一个优选的实施方案中，所述结构蛋白是KUN结构蛋白C、prM和E。
然而，可以使用任何其它黄病毒的结构蛋白。已经非常清楚一个黄病毒中的结构蛋白用另一个或其它黄病毒的结构蛋白置换可以产生嵌合黄病毒(Monath etal.，2000，J.Virol.741742；Guirakhoo etal.，2000，J.Virol.74 5477；Pletnev etal.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910532)，这表明一种黄病毒的结构蛋白能包装另一种黄病毒的RNA。最近已经示出(i)黄热病病毒复制子能通过提供黄热病prME和西尼罗或登革病毒核心蛋白而包装，(ii)西尼罗复制子可以通过提供病毒而包装。
也应意识到结构蛋白C、prM和E包括并涵盖了一或多种这些蛋白质中的任何突变或其它序列变化，这种突变不阻止或不显著损害翻译产物的加工和/或病毒包装。
在这点上，参考前述可能性提示可以将另外的蛋白酶切割位点工程化进入一或多个结构蛋白C、prM和E中。另外，由病毒和细胞蛋白酶识别的切割位点的紧邻上游或下游序列可以加以修饰以增强切割效力(Stocks & Lobigs etal.，1998，J Virol，72 2141-2149)，这可以导致VLP的切割和/或分泌改良。
典型地，预期突变的和/或变体结构蛋白与C、prM或E蛋白氨基酸序列分别具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％或者有益地至少95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列相同性。
因此，应意识到编码突变的和/或变体结构蛋白的核苷酸序列与编码C、prM或E蛋白的核苷酸序列具有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少90％或者有益地至少95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列相同性。
本文所用短语“序列相同性百分比”是通过氨基酸或核苷酸与参考序列的精确匹配数除以重叠区域中残基数确定的百分比。重叠的最小区域典型地为至少6、12或20个相邻残基。氨基酸序列相同性可以通过标准方法学确定，包括可在www.ncbi.nlm.nih.gov上获得的NCBI BLAST搜索方法学，包含无缺口的BLAST和有缺口的Blast2.0。然而，也可考虑使用美国专利5,691,179和Altschul et al.，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402所述的序列分析方法学。
本发明的包装构建体的一个特征是存在与编码黄病毒结构蛋白翻译产物的核苷酸序列可操纵地连接的一个可调控启动子。
“可调控启动子”是指在动物细胞中可操纵的任何启动子，其中启动子活性在应答一或多种调节剂中是可控制的。调节剂可以是物理性的(例如温度)或者可以是化学性的(例如类固醇激素、重金属、抗生素)。
这种启动子例如包括热休克诱导型启动子、蜕皮激素诱导型启动子、四环素诱导型/抑制型启动子、金属硫蛋白诱导型启动子及通过细菌lac操纵子诱导型哺乳动物可操纵的启动子(例如lac调节的CMV或RSV启动子)。
优选的可调控启动子是“tet关闭”启动子，其在存在强力霉素的情况下被抑制并通过除去强力霉素而诱导。
根据这个实施方案的一个特别的优选形式，所述可调控启动子包含与四环素应答元件(TRE)连接的一个CMV启动子，其促进对由一个单独的构建体编码的四环素反式激活蛋白(tTA)的应答。
本发明的包装构建体可进一步包含其它调节序列如内部核糖体进入位点(IRES)，3′聚腺苷酸化和转录终止子序列(例如β-球蛋白或SV40-衍生的)及一个可选择的标记基因(例如新霉素、潮霉素或嘌呤霉素抗性基因)以便于稳定的转化体的选择。
在一个特别优选的方式中，本发明的包装构建体包含一个IRES-新霉素核苷酸序列以便于稳定的转化体的选择。
在这个实施方案的一优选形式中，所述包装构建体进一步包含一个β-球蛋白聚腺苷酸化信号。
根据本发明，稳定的包装细胞系典型地在两个阶段产生：(i)确定表达四环素(强力霉素)反式激活蛋白的稳定细胞系；(ii)使用(i)中产生的稳定细胞系以在除去强力霉素后产生能可诱导地表达KUN结构基因的包装细胞。
在一特殊的实施方案中，步骤(i)中的稳定细胞系是通过将包含与人延伸因子α启动子可操纵地连接的四环素反式激活蛋白核苷酸序列的四环素反式激活构建体转染进入细胞中而产生。
然而，应意识到在这点上可以使用其它启动子，非限制性地例如RSV、SV40、α晶体蛋白、腺病毒和CMV启动子。
“可操纵地连接”是指所述可调控启动子被定位于起始并可调节地控制编码所述黄病毒结构蛋白的RNA的胞内转录。
优选地，所述四环素反式激活构建体进一步包含一个IRES嘌呤霉素选择标记，其促进稳定的转染物的选择。
在步骤(ii)，本发明的包装构建体转染进入表达四环素反式激活蛋白的稳定细胞系中。
对于VLP包装的合适的宿主细胞可以是适合转录、翻译和蛋白表达所需的任何转录后和/或翻译后加工或者修饰的任何真核细胞系、动物或哺乳动物细胞系。典型用于核酸转染和蛋白质表达的哺乳动物细胞非限制性的例如是COS、Vero、CV-1、BHK21，293、HEK、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NIH 3T3、Jurkat、WEHI 231、HeLa MRC-5及B16黑素瘤细胞。
优选地，所述宿主细胞是BHK21。
应意识到本发明产生的包装细胞随后可用于包装编码一或多种蛋白质的黄病毒复制子RNA。
本发明涵盖的黄病毒复制子包括衍生自黄病毒RNA的任何自身复制成分，如国际公开WO 99/28487和国际申请02/01598所述。这些复制子非限制性包括基于DNA的复制子构建体，其中复制子cDNA被置于哺乳动物表达启动子如CMV的控制下，并以质粒DNA的形式输送；包括基于RNA的复制子构建体，其中复制子cDNA被置于噬菌体RNA聚合酶启动子如SP6、T7、T3的控制下，使得可以使用相应的DNA依赖性RNA聚合酶在体外产生复制子RNA，其中所述复制子RNA可以裸RNA或包装成VLP中的RNA形式输送。
尽管本发明优选的黄病毒复制子衍生自Kunjin病毒，但本领域技术人员意识到本发明的包装系统可用于包装任何黄病毒复制子。
相对被充分研究的黄病毒复制子的实例包括西尼罗毒株谱系I(Shi et al.，Virology，2002，296 219-233)和谱系II(Yamshchikov et al.，2001，Virology，281 294-304)、2型登革热病毒(Pang et al.，2001，BMCMicrobiology，118)和黄热病病毒(Molenkamp et al.，2003，J.Virol.，771644-1648)的复制子。
在一个特殊的实施方案中，所述黄病毒复制子可编码一或多个突变的结构蛋白，包括NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和/或NS5。
在一个特殊的实施方案中，NS1蛋白的亮氨酸残基250由脯氨酸取代。
在另一个特殊的实施方案中，非结构蛋白NS2A中丙氨酸30由脯氨酸取代。
在又一个特殊的实施方案中，非结构蛋白NS2A中天冬酰胺101由天冬氨酸取代。
在再一个特殊的实施方案中，非结构蛋白NS5中脯氨酸270由丝氨酸取代。
也应意识到可以使用另外的氨基酸，从而在复制子中导入细胞适应的突变。
根据本发明，“黄病毒表达载体”包含黄病毒复制子及一或多个其它调节核苷酸序列。这种调节序列包括但非限于启动子，内部核糖体进入位点(IRES)，用于插入一或多个异源核酸的限制酶位点，聚腺苷酸化序列及其它序列如肝炎δ病毒核酶(HDVr)的抗原性序列，以分别保证转录终止和3’末端的精确切割。
在特殊优选的形式中，黄病毒表达载体包含一个CMV启动子，其促进编码C、prM和E的可操纵地连接的核苷酸序列在包装细胞中的表达。然而，应意识到在这点上也可以使用其它启动子，非限制性的例如RSV、SV40、α晶体蛋白、腺病毒和人延伸因子启动子。
因此，“黄病毒表达构建体”是这样的一个表达载体，其中已经插入了一个异源核酸，可以RNA和/或编码的蛋白质的形式表达。
所述异源核酸可编码一或多种肽或多肽，或者编码与靶序列基本相同或者基本互补的核苷酸序列。
所述异源核酸可编码可在动物细胞中表达的任何蛋白质。
另外，黄病毒复制子可以被修饰、调整或另外工程化为能包括所述异源核酸，典型地通过导入一或多个克隆位点而进行，例如国际公开WO 99/28487所述。
将四环素反式激活构建体、包装构建体或黄病毒表达构建体导入动物宿主细胞可以通过适合动物细胞的任何方法进行。这些方法包括磷酸钙沉淀、电穿孔、通过脂质转染胺试剂(lipofectamine)，脂质转染试剂(lipofectin)及其它亲脂性制剂输送、DEAE-Dextran转染、微粒轰击、显微注射和原生质体融合。
从前文所述可意识到本发明的包装系统可用于在动物细胞优选在哺乳动物细胞中表达蛋白质。
这样可以促进需要的动物细胞提供的翻译后加工和/或修饰的任何真核蛋白的表达。这种蛋白质的非限制性实例包括激素、生长因子、转录因子、酶、重组免疫球蛋白(recombinant immunoglogulin)或其片段、抗原、免疫原等等。
在一特殊的实施方案中，根据本发明产生的VLP可用于感染合适的动物细胞并从而促进编码的蛋白质在细胞中表达。然后可使用合适的蛋白质纯化技术分离及纯化表达的蛋白质。
这种系统可使用能高水平表达复制子编码的异源蛋白质的动物细胞，非限制性例如CHO细胞。
在一个特殊的实施方案中，所述异源核酸可编码衍生自或得自病原生物体如病毒、真菌、细菌、原生动物、无脊椎动物如寄生虫和节肢动物的免疫原性蛋白质或肽，或者可编码衍生自或得自动物包括动物和人的突变的、致癌的或肿瘤蛋白质如肿瘤抗原。异源核酸也可编码合成的或人工的蛋白质如构建的以诱导免疫的免疫原性表位。
本发明的免疫治疗性组合物可用于预防性或治疗性地免疫动物如人。
针对病毒、肿瘤、细菌、原生动物及其它无脊椎动物寄生虫的免疫应答可以通过表达本发明的VLP编码的合适的免疫原性蛋白质或肽表位而激发或诱导。优选地，所述免疫应答包含CTL的诱导。
根据这个实施方案，本发明产生的VLP可用于免疫治疗性组合物或疫苗组合物的制备中，所述组合物进一步包含一种可接受的载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂。
“药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂”是指可安全地用于全身性给予的固体或液体充填剂、稀释剂或胶囊化物质。根据特殊的给予途径，可以使用本领域熟知的各种载体。这些载体可选自糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、褐藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水及盐如无机酸盐包括氢氯酸盐、溴化物和硫酸盐、有机酸盐如乙酸盐、丙酸盐和丙二酸盐，及无热原水组成的一组。
关于药物可接受的载体、稀释剂和赋形剂的有益的参考文献是Remington的Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA，1991)，在此并入参考。
可以应用任何安全的给予途径以为患者提供本发明的组合物。例如可以应用口服、直肠、非肠道、舌下、口腔、静脉内、关节内、肌内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹膜内、脑室内及经皮给予等方式。
本领域理解“佐剂”是指增强疫苗组合物的免疫原性和/或效力的一或多种物质。合适的佐剂的非限制性实例包括鲨烷和鲨烯(或者源于动物的其它油)、封闭聚合物、去污剂如Tween-80、QuilA、矿物油如Drakeol或Marcol、植物油如花生油、棒状杆菌衍生的佐剂如小棒杆菌(Corynebacterium parvum)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)衍生的佐剂如疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acne)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(Bacille Calmette和Guerin或BCG)、白细胞介素如白细胞介素2和白细胞介素12、单核因子如白细胞介素1、肿瘤坏死因子、干扰素如γ干扰素、组合物如皂苷-氢氧化铝或Quil-A氢氧化铝、脂质体、ISCOM和ISCOMATRIXS佐剂、分枝杆菌细胞壁提取物、合成的糖肽如胞壁酰二肽或其它衍生物、阿夫立定(Avridine)、脂质A衍生物、葡聚糖硫酸酯、DEAE-葡聚糖或者具有磷酸铝、羧基聚亚甲如Carbopol′EMA、丙烯酸共聚物乳状液如Neocryl A640(例如美国专利No.5,047,238)、痘苗或动物痘病毒蛋白、亚病毒颗粒佐剂如霍乱毒素，或其混合物。
本发明的包含免疫治疗性组合物的药物组合物及免疫方法可给予任何动物，非限制性包括哺乳动物和人。
因此，本发明涵盖了兽医和医学治疗，这种治疗根据所要治疗的疾病或病变而治疗性和/或预防性给予。
参考如下非限制性实施例可容易地理解本发明并付诸于实践。
                         实施例
                       材料和方法
质粒：质粒pEF-tTA-IRESpuro由昆士兰大学的Rick Sturn惠赠，该质粒是pEFIRES-P(Hobbs et al，1998 Biochem Biophys Res Commun 252，368-72)的衍生物并含有编码四环素反式激活蛋白的序列(图1A)。编码在四环素诱导型启动子控制下的KUN CprME基因盒的质粒pTRE2CprME-IRESNeo(图1A)如下构建。用MluI和XbaI从pCIN1(Rees等，1996，BioTechniques 20 102-110)的衍生物pBS-CIN4IN切下EMCV内部核糖体进入位点(IRES)和新霉素基因的序列。该IRESNeo盒随后插入pTRE2载体(Clontech)的相应MluI/XbaI位点以产生中间质粒pTRE2IRESNeo。使用引物CprMEFor5′ATTTAGGTGACACTATAGAGTAGTTCGCCTGTGTGA   3′和CprMERev 5′GAGGAGATCTAAGCATGCACGTTCACGGAGAGA 3′通过高可靠性Pfu DNA聚合酶(Promega)从FLSDX质粒DNA模板(Khromykh et al.，1998，J.Virol.72 5967)经PCR扩增编码Kunjin(KUN)CprME基因盒的序列以产生在5’和3’末端具有BglII限制酶位点的片段。应注意的是该片段5’末端的BglII位点位于正向引物下游100个核苷酸处并恰好位于天然KUN翻译起始密码子紧邻上游。然后将该含有KUN CprME序列的BglII-BglII片段插入pTRE2IRESNeo载体中的位于IRESNeo序列上游的BamHI位点以产生pTRE2CprME-IRESNeo质粒(图1A)。
先前已经描述了用于不同复制子RNA体外转录的基于RNA的KUN复制子载体和其它编码不同异源基因的KUN复制子构建体(Khromykh & Westaway，1997，J.Virol.71 1497；Anraku et al.，2002，J.Virol.76 3791；Liu，2002#1264；Varnavski & Khromykh，1999，Virology255 366；Vamavski et al.，2000，J.Virol.74 4394)。通过将含有RSV M2cDNA序列的片段(其用合适引物逆转录(RT)和PCR扩增来自RSV感染细胞的RNA而制备)克隆进RNAleu载体(Anraku等，2002，文献同上)而构建编码呼吸道合胞病毒(RSV)的M2基因的KUN复制子。
2型登革病毒(DEN2)复制子构建体pDENCΔprME和MpDENΔprME通过在结构基因内产生大的同框缺失而衍生自质粒pDVWS601，该质粒含有相应于DEN-2新几内亚C株基因组的全长cDNA克隆。pDENΔCprME保留了C基因开始的81个核苷酸和E基因的最后72个核苷酸，而pDENΔprME保留了prM基因开始的21个核苷酸以及E基因的最后72个核苷酸。
细胞系、病毒和抗体：BHK21和Vero细胞系在37℃、5％CO2下在补加10％胎牛血清和青霉素/链霉素的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(Life Technologies)中培养。野生型(wt)KUN病毒株MRM61C如前所述在Vero细胞中生长(Westaway et al.，1997，J.Virol.71 6650)。如前所述在兔中产生抗KUN NS3多克隆抗体(Westaway et al.，1997，J文献同上)。抗KUN表位3.91D单克隆抗体(MAb)在小鼠中产生(Adams et al.，1995，Virology 206 49)。DNA转染：在60mm培养皿中培养BHK21细胞24小时，之后用2微克质粒DNA采用Lipofectamine Plus试剂(Life Technologies)如厂商所述进行转染。
产生病毒样颗粒(VLP)并确定其效价：用SP6RNA聚合酶体外转录KUN复制子RNA并基本上如先前所述(Khromykh & Westaway，1997，文献同上)电穿孔进tetKUNCprME细胞。常规地，将约30微克RNA电穿孔进3×106个细胞。然后将电穿孔的细胞接种进100mm培养皿并在不同体积培养基中于37℃保温至8天。在这一期间通常在3-5个时间点收集培养液(CF)并用同体积的新鲜培养基更换以多次收获VLP。通过用收集的CF的10倍系列稀释液感染Vero细胞并在感染后30-40小时用抗NS3抗体进行IF分析而计数NS3表达为阳性的细胞数来确定感染性VLP的效价。
免疫荧光：在用复制子RNA或VLP转染后28-48小时将培养细胞的盖玻片在4％低聚甲醛中固定，并通过间接免疫荧光(IF)分别使用抗NS3或抗E抗体分析KUN NS3或E蛋白的表达。Northern印迹分析：用Trizol试剂(Life Technologies)从用或未用强力霉素培养的tetKUNCprME细胞和从正常BHK21细胞中提取总RNA。将20微克RNA在1％甲酰胺-TAE琼脂糖凝胶上分离，然后通过用20xSSC经毛细管印迹转移至Hybond-N(Amersham-PharmaciaBiotech)上。使用分离自pTRE2INeoCprME的一个AflII-PstI片段作为模板制备标记探针。这一32P标记探针使用Redprime II试剂盒(Amersham-Pharmacia Biotech)如厂商所述制备。基本上如厂商所述用ExpressHyb溶液(Clontech)在68℃将RNA用32P标记DNA探针杂交。条带通过在X光胶片上曝光或通过磷成像仪观察，并用ImageQuant软件(Molecular Dynamics)量化。Western印迹分析：tetKUNCprME细胞在60mm培养皿中补加或不加强力霉素培养2天，用Trizol试剂如厂商所述提取细胞蛋白。还回收了BHK21细胞蛋白用作阴性对照。每一样品的蛋白质浓度用BioRad蛋白质分析(BioRad)根据厂商所述进行确定。5微克总细胞蛋白在12.5％凝胶上经SDS-PAGE分离并转移至Hybond-P膜(Amersham-Pharmacia Biotech，UK)上。膜在封闭缓冲液(含5％脱脂乳/0.1％Tween 20的磷酸盐缓冲盐水(PBS))中于4℃保温过夜。将KUN抗E MAb在封闭缓冲液中1∶10稀释并在室温与膜保温2小时。膜用0.1％Tween-20/PBS洗3次各5分钟，然后加入第二抗体。第二抗体山羊抗小鼠辣根过氧化物酶在封闭缓冲液中1∶2000稀释并与膜在室温保温2小时。再次用0.1％Tween-20/PBS洗膜，用ECL+Plus试剂盒(Amersham-Pharmacia Biotech)显色。然后膜以变化的时间间隔在X光胶片上曝光。
RT-PCR和测序：用Trizol从60mm培养皿中的tetKUNCprME细胞提取总RNA。用One-Step RT-PCR试剂盒(Invitrogen)将0.1微克RNA进行逆转录和扩增。所用寡核苷酸引物为针对KUN CprME区的正向引物CoreXbaI 5′GGCTCTAGACCATGTCTAAGAAACCAGGA3′和反向引物cprMERev 5′GAGGAGATCTAAGCATGCCGTTCACGGAGAGA3′。然后将该cDNA产物用作模板利用覆盖这一区域的全序列的6个不同引物经BigDye Terminator Mix(Applied Biosystem)进行测序。
KUN VLP和IL-2组合肿瘤疗法：将5×104个LLOva肿瘤细胞(Nelsonet al.，J Immunol.2001，166 5557-66)皮下注射在各组雌性C57BL/6J小鼠(6-8周龄，每组n＝3)的背上，每只小鼠4个肿瘤(每组n＝12个肿瘤)。一旦肿瘤可触知(＞1×1mm2)，2组小鼠用108pfu(于200微升中)KUN VLPMpt注射，另两组对照用PBS注射，它们均间隔10天腹膜内注射两次。在首次VLPMpt或PBS注射后4天，来自VLPMpt和对照的各1组腹膜内接受2剂2000IU鼠IL-2，两剂之间间隔2天。其它2组不接受IL-2。每天记录肿瘤大小，当肿瘤大小达到15×15mm2时对小鼠实行安乐死(Anraku et al.，2002，文献同上)。评估KUN复制子病毒样颗粒(VLP)在KUN tetKUNCprME复制子包装细胞系(A8细胞系)中扩增和传播的能力
细胞：正常BHK21细胞和KUN tetKUNCprME KUN复制子包装细胞(A8细胞系)(Harvey et al，J Virol.2004，78531-8，引入本文作参考)在补加10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco极限基本培养基(DMEM；Invitrogen，San Diego，Calif.)中于37℃在CO2温箱中生长。KUN复制子VLP：如(Harvey et al，J Virol.2004，文献同上)所述制备KUN repPAC/β-gal复制子VLP。简而言之，用编码使得易于比较基因表达的β-半乳糖苷酶基因和用于选择的嘌呤霉素抗性基因的体外转录的KUN repPAC/β-gal RNA电穿孔A8细胞。在RNA转染后不同时间点收集细胞培养液，收获的培养液中包含衣壳化的复制子KUN repPAC/β-gal RNA的VLP的效价通过感染Vero细胞并在感染后48小时用X-Gal染色而得的β-gal阳性细胞数而计算。KUN repPAC/β-gal复制子VLP感染、X-Gal染色和β-gal分析：在24孔板中的90％铺满的BHK21和KUN KUN复制子包装A8细胞用repPAC/β-gal VLP以感染复数(MOI)为1进行感染，并在不含强力霉素的培养基中保温。感染后48、96和144小时，用4％甲醛-磷酸盐缓冲盐水固定细胞并原位用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖吡喃糖苷(X-Gal)染色，或者将细胞胰蛋白酶化、计数并溶解以利用商购的β-gal检测试剂盒根据厂商指导(Promega，Madison WI)进行β-Gal分析。
                    结果
能包装KUN复制子RNA成VLP的四环素诱导型BHK细胞系tetKUNCprME的建立
据我们所知，目前尚未报道同时表达所有三个黄病毒结构病毒的稳定细胞系。我们先前产生了稳定表达KUN C蛋白的Vero细胞系，但是表达水平很低(Westaway et al.，1997.Virology.23431-41)。我们先前尝试用标准(非诱导型)DNA表达载体产生持续表达在独立启动子控制下的所有三个KUN结构基因(独立表达C和prM-E)的稳定细胞系，但是表达非常不稳定，在几次细胞传代后仅产生10-20％阳性表达细胞(未示出)。使用这些细胞系产生KUN复制子VLP的尝试仅获得了非常低的VLP效价(未示出)。
首先，用pEFIRES-P(Hobbs et al.，1998，Biochem Biophys ResCommun.252368-372)的衍生物即含有编码四环素反式激活蛋白的序列的pEF-tTA-IRESpuro质粒DNA(图1A)转染BHK21细胞，以建立稳定表达四环素反式激活蛋白的BHK细胞系BHK-Tet-Off。转染后2天加入浓度为10微克/ml的嘌呤霉素以选择细胞克隆。从这一转染中成功分离和培养了5个细胞克隆。然后通过用质粒pTRE2luciferase(Clontech)转染分析这些克隆在强力霉素(一种与四环素具有相同抗菌谱但具有更高的特异性和更长的半衰期的抗生素)的存在和不存在下的诱导表达。所有BHK-Tet-Off细胞克隆均证实有不同程度的诱导和背景水平(结果未示出)。用两个与未诱导细胞相比显示最高倍萤光素酶表达诱导的BHK-Tet-Off细胞克隆建立表达KUN结构蛋白即核心(C)、膜(prM)和包膜(E)的稳定BHK细胞系。细胞用pTRE2CprME-IRESNeo质粒DNA(图1A)转染，所述质粒通过将KUN CprME基因盒和脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点—新霉素磷酸转移酶基因盒(IRESNeo)亚克隆进pTRE2载体(Clontech，North Ryde，Australia)而构建。转染的细胞在还含有10μg/ml嘌呤霉素和0.5μg/ml强力霉素的培养基中用0.5mg/ml遗传霉素(G418)进行选择以建立稳定的包装细胞系。为了选择最有效的包装细胞系，将赋予对G418和嘌呤霉素的抗性的一些细胞克隆用KUN复制子RNA(RNAleu)电穿孔并在不含强力霉素条件下培养以确定它们是否能产生感染性KUN复制子VLP。在收获的培养液(CF)中存在的感染性VLP的效价(感染单位(IU)/ml)如先前所述(Khromykh et al.，1998，J Virol.72 7270-7279；Westaway et al.，1997，JVirol.71 6650-6661)通过感染Vero细胞随后用抗NS3抗体进行免疫荧光分析而确定。
4个细胞克隆即#A3、#A8、#E1和#E5能产生VLP，其效率在RNA转染后53小时为5×104至2×108IU/ml不等(表1)。产生2×108IU/ml的VLP的最有效的细胞克隆#A8被命名为tetKUNCprME，并用于所有进一步的研究。TetKUNCprME细胞中产生的mRNA所编码的KUN CprME序列与野生型KUN CprME序列的相同性通过在逆转录(RT)-PCR扩增分离自tetKUNCprME细胞的总RNA后测序完整CprME区而证实。在质粒DNA pTRE2CprME-IRESNeo中存在的序列中未发现核苷酸变化。
在tetKUNCprME细胞中的CprME表达和分泌的KUN复制子VLP的优化生产
为检查tetKUNCprME细胞的培养液中分泌的KUN蛋白和KUNVLP的水平，我们应用了先前描述的抗原捕获ELISA(Hunt et al.，2002，文献同上)。在分析前从培养48小时的诱导和未诱导的tetKUNCprME细胞收集的CF中，这两个CF样品中均没有可检测水平的KUN E蛋白(图1B)。但是当细胞用RNAleu复制子RNA电穿孔时，在电穿孔后45小时在来自诱导的细胞的CF样品中注意到大大增加的ELISA读数，而在来自未诱导的细胞的CF样品中仅检测到微小的ELISA读数增加(图1B)。当这些CF样品中的VLP在Vero细胞上滴定时，VLP的效价与ELISA结果的相关性很好。在收集自未诱导的细胞的CF样品中检测到的500IU VLP/ml产生约0.11的ELISA读数OD450，而在来自诱导的细胞的CF样品中的2.1×108IUVLP给出的ELISA读数约为0.63(图1B)。
为了检查tetKUNCprME细胞系中CprME mRNA转录水平和CprME基因的胞内表达水平，将细胞在培养基中在强力霉素存在和不存在下培养48小时。正常BHK21细胞用作阴性对照。CprMEmRNA转录通过总细胞RNA与32P标记CprME特异性cDNA探针的Northern印迹杂交而分析(图3A)，KUN蛋白的表达用KUN抗E抗体经Western印迹分析而分析(图3B)。结果显示在存在强力霉素时(未诱导的细胞)产生的CprME mRNA和KUN E蛋白非常少，相反，除去强力霉素导致CprME mRNA水平增加约30倍，这通过比较相应的标记条带中的相对磷成像仪计数而表明(图3A)。还检测到了KUN E蛋白产生水平的基本相似的增加(图3B)。
为了优化VLP产生，用在不同时间点收获培养液以及从培养基中除去强力霉素而进行研究。在KUN复制子RNA(RNAleu)电穿孔后，向细胞中加入含有强力霉素(0.5μg/ml)的培养基进一步培养16或30小时，然后用不含强力霉素的新鲜培养基更换。设立一个一直不含强力霉素的电穿孔细胞的60mm2培养皿作为对比。在电穿孔后53小时和68小时从每一培养皿中收获培养液并在Vero细胞上进行感染性分析检测。结果显示除去强力霉素以诱导CprME表达而进行VLP生产的最佳时间是在RNA电穿孔后立即除去(表2)。从培养基中除去强力霉素的延迟使得所产生的VLP量显著降低。
为了确定最佳VLP收获方案和tetKUNCprME细胞产生高水平编码各种异源基因的VLP的能力，将KUN复制子RNA RNAleu和编码不同异源基因如鼠多表位(RNAleuMpt)、HIV-1gag(KUNgag)、嘌呤霉素乙酰转移酶(repPAC)、嘌呤霉素乙酰转移酶和β-半乳糖苷酶(repPACβ-gal)以及绿色荧光蛋白(repGFP)的复制子RNA(Anraku etal.，2002，文献同上；Liu et al.，2002，J Virol.76 10766-10775；Varnavski& Khromykh，1999，Virology 255 366-375；Varnavski et al.，2000，J Virol.74 4394-4403)电穿孔进tetKUNCprME细胞。在RNA电穿孔后不同时间收获VLP并在每次收获VLP时用新鲜培养基更换原培养基以使得多次收获VLP(表3)。根据复制子RNA的性质和VLP收获方案，从电穿孔后第3天开始几乎所有VLP效价均在107至109IU/ml范围，并且甚至在直至转染后10天的第3次或第4次连续收获中仍保持很高效价(表3)。使用最佳VLP收获方案从最初转染的3×106个tetKUNCprME细胞产生的总VLP达到5.4×1010个感染性颗粒(表3中的repPACβ-gal RNA exp 2)，并且当使用其它收获方案和不同的KUN复制子RNA时总VLP产量在1.6×109至1.3×1010个感染性颗粒/3×106个电穿孔细胞的范围内(表3)。
为了检查KUN复制子VLP是否能通过在tetKUNCprME细胞中传播但不在正常BHK细胞中传播而扩增，将细胞用RNAleuMpt VLP以低MOI(0.1)进行感染并在不加强力霉素的培养基中温育。用KUN抗NS3抗体对感染的细胞进行IF分析表明在感染后第2天至第3天阳性细胞灶(foci)大小显著增加(图4，第1和2组)，从而证实了VLP在tetKUNCprME细胞中的扩增和传播。相反，在VLP感染后第2天和第3天在感染的正常BHK21细胞中仅检测到几个阳性细胞(图4，第3和4组)。在一独立的实验中，在用0.1MOI RNAleuMptVLP感染tetKUNCprME细胞后检测到VLP效价从保温第3天到第5天大约增加了10倍(结果未示出)，由此进一步证实VLP通过在包装细胞中传播而扩增。
所述结果令人信服地证实，与我们先前公开的使用致细胞病变性SFV复制子表达KUN结构基因的方案(Varnavski & Khromykh，1999，文献同上)相比，tetKUNCprME细胞系能产生大大增加(约1500倍)量的KUN复制子VLP。
这应该与所报道的稳定表达蜱传播脑炎(TBE)prME基因的CHO细胞系的产生及其在包装缺失了prME基因的TBE复制子RNA中的应用(Gehrke et al，2003，J.Virol.77 8924-8933)相比。在表达prME的CHO细胞中获得的分泌的TBE复制子VLP的最高效价是5×107IU/ml，这比在tetKUNCprME细胞中获得的KUN复制子VLP的最高效价(1.6×109IU/ml，表3)低约32倍。另外，每106个转染细胞产生的TBE复制子VLP的总最大量是约108IU，其比获得的KUN复制子VLP总最大量(5.4×1010IU，表3)低约540倍。然而，考虑到在所用细胞系(TBE用CHO，KUN用BHK)、复制子RNA(TBE具有核心基因，而KUN无核心基因)、电穿孔条件(即对于TBE RNA没有报道转染细胞数和RNA量及电穿孔仪设置)和收获VLP方案方面的差异，很难在这两个系统之间进行包装效率的进一步比较。
但是，很清楚本发明的tetKUNCprME细胞提供了诱导型表达的灵活性、明显更高的效价、连续的收获以及所产生的复制子VLP的更高的总量。另外，tetKUNCprME细胞能够包装来自不同黄病毒的复制子RNA(见下述)。
KUN结构蛋白在tetKUNCprME细胞中的稳定表达
为了确定KUN CprME基因表达的稳定性，将tetKUNCprME细胞在不含嘌呤霉素和G418的条件下培养传代12次，然后用KUN复制子RNA(RNAleu)电穿孔以确定VLP产生的效率。在传代过程中在培养基中存在强力霉素以保证抑制CprME表达。在所有三种抗生素即嘌呤霉素、G418和强力霉素存在下培养传代12代的tetKUNCprME细胞被平行电穿孔以比较VLP生产效率。在电穿孔复制子RNA后立即除去强力霉素以诱导CprME表达并使VLP产生。在复制子RNA转染后48小时从在传代过程中保持在嘌呤霉素和G418选择条件下的细胞收集的VLP的效价类似于同一时间从保持在没有嘌呤霉素和G418选择条件下的细胞收集的VLP的效价(分别为2.2×106IU/ml和1.7×106IU/ml)。尽管在这一实验中VLP效价低于其它大多数包装实验中的效价，但是所述结果清楚表明在未经抗生素选择而传代至少12代之后的tetKUNCprME细胞中KUN结构蛋白表达的稳定性，因此提示KUN结构基因盒稳定整合进细胞基因组内。
在复制子VLP制备物中不含感染性KUN病毒
在KUN复制子RNA的C基因的C-末端区和E基因的N-末端区与tetKUNCprME细胞中产生的CprME mRNA之间存在重叠序列可能潜在地促进同源重组，使得可能在VLP制备物中产生感染性KUN病毒。在先前开发的包装系统中，我们通过从SFV复制子载体产生的两个不同mRNA分别表达C基因和prM-E基因而消除了任何潜在重组的可能性。但是我们使用KUN RNA进行的无数互补实验(综述见Khromykh，2000，文献同上)以及用YF RNA进行的互补实验(Lindenbach & Rice，1997，J Virol.71 9608-17；Lindenbach & Rice，1999，J Virol.73 4611-21)(其中在缺陷和辅助RNA之间存在延长的互补区)未能检测到应该可以通过同源重组产生的任何重组感染性病毒。为了检查在用tetKUNCprME细胞产生KUN复制子VLP过程中是否产生了任何重组的复制型KUN病毒，将在用RNAleu RNA转染后2天收获的CF用于感染生长在盖玻片上的Vero细胞。感染的细胞温育5天，通过免疫荧光检查其E蛋白表达。来自感染的盖玻片的组织培养液随后在Vero细胞新鲜培养物上再次传代5天，并用抗E抗体经IF检查。在两代中均未检测到E阳性细胞(结果未示出)。用抗NS3抗体进行的平行标记显示在第1代中有许多阳性细胞，但是在第2代中没有阳性细胞(结果未示出)，证实VLP仅在第1轮感染中输送复制子RNA。类似地，尽管病毒基因组序列中在prM-E和复制子RNA之间存在重叠，在稳定表达prM-E基因的CHO细胞中包装TBE复制子RNA甚至在包装细胞系传代若干次后也不会产生任何感染性TBE病毒。
在VLP制备物中不含感染性KUN病毒的另外的证据通过病毒检测的最灵敏的方法即颅内注射哺乳幼鼠而检验。将10只一组的2-3日龄Balb/C哺乳幼鼠用4×106IU KUN-MPt VLP或用1pfu wt KUN病毒(毒株MRM61C)颅内接种作为阳性对照。用1pfu wt KUN病毒注射的全部10只小鼠在接种后4天均出现后肢麻痹并不得不处死。相反，所有VLP注射的小鼠在实验期间(21天)均保持健康并显示正常发育。这些用KUN复制子VLP进行的体外和体内结果以及用TBE复制子VLP进行的体外结果(Gehrke etal.，2003，文献同上)清楚表明在表达连续结构基因盒的包装细胞中生产黄病毒复制子VLP不会导致产生任何重组病毒。对比之下，在表达连续新培斯病毒结构基因盒的BHK包装细胞系中产生的108IU新培斯病毒复制子VLP含有约105pfu的由重组产生的感染性病毒(Polo et al.，1999，Proc NatlAcad Sci USA.964598-4603)。在包装细胞中将这些结构基因分成两个独立的表达盒似乎将感染性病毒污染降低至不可检测的水平，但是却同时将复制子VLP的效价降低至5×106至1×107VLP/ml(Poloetal.，1999，文献同上)。
在tetKUNCprME细胞中将西尼罗病毒和登革病毒复制子包装成分泌的感染性VLP
为了检查tetKUNCprME细胞能否用于包装来自其它黄病毒的复制子RNA，我们使用了来自紧密相关的西尼罗(WN)病毒和来自远缘相关的2型登革病毒(DEN2)的复制子RNA。仅保留了C基因开始的20个密码子和E基因的最后密码子的在结构区具有大缺失的WN复制子构建体“Replicon”先前有描述(Shi等，2002，Virology，296 210-233；Lo等，2003，J Virol 7710004-10014)。
2型登革病毒(DEN2)复制子构建体pDENΔCprME或pDENΔprME复制子RNA通过在结构基因内产生大的同框缺失而衍生自质粒pDVWS601，该质粒含有相应于DEN-2新几内亚C株基因组的全长cDNA克隆(Pryor等，2001，Am J Trop Med Hyg 65427-434)。pDENΔCprME保留了C基因开始的27个密码子和E基因的最后24个密码子，而pDENΔprME保留了完整的C基因、prM基因开始的7个密码子以及E基因的最后24个密码子。
为进行包装实验，将DENΔCME或DENΔME复制子RNA电穿孔进tetKUNCprME细胞中并在不含强力霉素的培养基中保温。实验中包括KUN复制子RNA(RNAleu)以用于比较VLP产量。用交叉反应性KUN抗NS3抗体在转染后2天进行的IF分析表明在用DENΔCME和DENΔME RNA转染后分别有约80％和95％的阳性细胞。KUN复制子RNARNAleu转染产生约95％NS3阳性细胞。在电穿孔后2天收集培养液，在Vero细胞上经感染性分析而滴定。从DENΔCME和DENΔME复制子RNA产生的感染性VLP效价分别是8×104IU/ml和1.8×105IU/ml。KUN复制子RNA在同一实验中产生的VLP的效价为2.2×107IU/ml。
在一个独立的实验中，将WN复制子RNA电穿孔进tetKUNCprME细胞导致在电穿孔后第4天检测到约70-80％的NS3阳性细胞和产生7×107IU/ml分泌的VLP。在同一实验中进行的KUN复制子RNA RNAleu的电穿孔导致在电穿孔后第4天检测到约80-90％的NS3阳性细胞和产生108U/ml VLP。
通过将一种病毒的结构基因用其它黄病毒的结构基因替换而成功产生嵌合黄病毒证实当一种黄病毒的结构蛋白从同一RNA分子顺式表达时能够包装另一种黄病毒的RNA。我们的结果首次证实用反式提供的KUN结构蛋白包装不同黄病毒复制子RNA。考虑到KUN与WN病毒的NY99株之间非常高的同源性(Lanciotti等，1999，Science 2862333-2337；Liu等，2003，文献同上)以及它们相对相似的复制效率，所观察到的KUN和WN复制子RNA的相似的包装效率并不令人吃惊。与KUN复制子RNA相比DEN2复制子RNA的包装效率低100倍可能由许多因素所致，包括这两种病毒之间的显著的序列差异以及登革病毒普遍的较低复制效率。用全长感染性DEN2cDNA进行的先前的实验显示在RNA转染进BHK细胞后产生分泌的DEN2病毒的效率相对较低(Gualano等，1998，J Gen Virol 79437-446)。尽管我们没有比较DEN2和KUN复制子RNA在tetKUNCprME细胞中的复制效率，但是很可能DEN2复制子RNA的复制会比KUN复制子RNA低，使得可供用于包装的RNA较少。优化的包装也可能需要RNA和同一病毒的核心蛋白之间的特异相互作用，但是还没有鉴定黄病毒RNA或核心蛋白中决定包装特异性的信号/基序。本发明的包装系统很可能对于未来包装信号的研究作出贡献，并增加对黄病毒组装和分泌过程的了解。
用在tetKUNCprME细胞中制备的高剂量KUN复制子VLP免疫接种改善了针对编码的免疫原的CD8+T细胞应答
包装细胞系使得能产生具有高100倍的效价的KUN复制子VLP，因此使得能在接种实验中测试增加剂量的VLP。通过体外(exvivo)IFNγELISPOT分析(图5A)测定，编码鼠多表位的KUN复制子VLP(KUN-Mpt VLP)剂量从106到107IU VLP的10倍增加诱导了多3-4倍的SIINFEKL表位特异性CD8T细胞。从107到108IUVLP的进一步的10倍增加仅微微增加了所诱导的SIINFEKL特异性CD8T细胞数(图5A)。在一个独立的实验中，用2.5×107IU编码呼吸道合胞病毒(RSV)M2基因的KUN VLP接种BALB/c小鼠1次。编码RSV M2基因的KUN复制子通过在RNAleu载体中克隆进一个含有RSV M2cDNA序列的DNA片段而构建，所述DNA片段通过逆转录(RT)和PCR扩增从用RSVA2分离株感染的细胞分离的RNA而制备。产生了特异于RSV M2表位SYIGSINNI的高强CD8+T细胞应答，ELISPOT分析表明每106个脾细胞平均有1400个斑点(图5B，KUN-M2VLP)，标准铬释放分析表明在效应子被稀释至效应子：靶比率为2∶1时有超过45％的特异性溶解(图5C，KUN-M2VLP)。这些应答超过了所报道的用编码RSV M2的复制型重组痘苗病毒接种后的应答(Aung et al，1999，J Virol 738944-8949；Kulkarni et al，1993，J Virol 67 4086-4092；Simmons et al，2001，J Immunol 1661106-1113)。
对照KUN VLP未能诱导显著的特异性应答(图5B和5C，KUNVLP对照)，用SYIGSINNI肽配制的肽疫苗诱导低了若干倍的应答(图5B和5C，SYIGSINNI/TT/M720)。
用于癌症的治疗性疫苗治疗的高效价KUN VLP
通过基于CD8T细胞的疗法治疗已建立的肿瘤需要非常大量的抗癌CD8T细胞(Overwijk et al，2003，J Exp Med 198 569-80)。我们在本文显示出通过增加VLP剂量诱导更多的CD8T细胞。因此，我们希望确定是否高剂量VLP接种可治疗性应用以传递显著的抗癌活性。这一模型中，编码含有卵清蛋白CD8T细胞表位SIINFEKL的鼠多表位(Mpt)的VLP被用作治疗剂以对抗表达模型肿瘤抗原卵清蛋白的Lewis肺细胞(LLOva；Nelson et al，2001，文献同上)。
在指示的时间(图6，箭头)用108 KUN VLPMpt(图6，VLPMpt)或PBS(图6，对照)、伴有或不伴有IL-2、腹膜内接种具有建立的LLOva肿瘤的各组小鼠两次。VLPMpt接种明显显示肿瘤的生长。IL-2单独或与VLP接种组合不明显影响肿瘤生长。
因此，可以得出如下结论：治疗性给予高效价的能诱导高水平SIINFEKL特异性CD8T细胞的VLPMpt疫苗能明显减慢预先存在的LLOva肿瘤的生长。IL-2单独或与VLP治疗组合均没有显著效应。
将在NS2A和NS5中具有适应性突变的KUN复制子RNA包装成病毒样颗粒
先前的报道显示在nsP2中具有一些适应性(非致细胞病变性)突变的新培斯病毒和SFV复制子RNA不能被有效包装成VLP，而在nsP2中具有其它适应性突变的RNA可以被包装成VLP(Perri et al，2002，J Virol 74 9802-9807)。
我们通过将KUN复制子RNA转染进我们最近报道的四环素诱导型包装BHK细胞系tetKUNCprME中检查了它们的包装能力。每2天收获分泌的VLP，共收获6-8天，并且如材料和方法部分所述确定VLP效价。具有NS2A/A30P突变的复制子RNA的包装效率与野生型RNA相似；其它的突变RNA在第2天的包装效率降低50至500倍，但是除了在NS2A中有组合突变的突变RNA之外所有突变RNA的包装效率在第6天均恢复到接近野生型的水平(表4)。在NS2A中有组合突变的RNA在第8天的包装效率仍比野生型RNA低40倍。总之，仅有NS2A/A30P突变不影响复制子RNA的包装效率，而其它突变均降低包装效率。
使用在tetKUNCprME细胞中获得的VLP产生稳定表达细胞系
我们检测了显示提供在仓鼠细胞系中建立持久复制这一优点的NS2A中的适应性突变是否也会在其它细胞系中、特别是在人细胞系中提供类似的优点。用含有包装的野生型和突变的复制子RNA的VLP分别以MOI为1和10(在Vero细胞上滴定的值)感染两个细胞系HEK293和Hep-2的单层，并在含有1μg/ml的嘌呤霉素的培养基中繁殖7天。对嘌呤霉素抗性集落的X-gal染色显示在HEK293和HEp-2细胞中，NS2A/A30P突变体的集落数相对于野生型复制子增加约50倍，NS2A/N101D突变体增加约20倍(图7)。在用0.01MOI的复制子VLP感染BHK细胞后观察到类似的野生型和NS2A突变的复制子RNA之间的集落数差异(图7)。令人感兴趣的是，感染HEK293和HEp-2细胞分别需要多10和100倍的VLP才能产生与在BHK21细胞中产生的类似数目的嘌呤霉素抗性集落(图5)。在野生型KUN病毒复制效率方面也观察到了这些细胞系之间的类似的差异(未示出)。在另外的实验中，在Vero细胞中观察到了比在BHK细胞中高约20倍的野生型KUN病毒的有效复制(结果未示出)。这些结果证实了在NS2A中具有适应性突变的亲代复制子RNA在不同细胞系中建立持久复制的能力这一优点。复制子VLP感染的BHK、Vero、HEK293和HEp-2细胞在具有嘌呤霉素的选择性培养基中的生长导致建立稳定表达野生型和NS2A突变的复制子RNA的细胞群，其中突变的保留通过测序证实(未示出)。在采用BHK、Vero、HEK293和HEp-2细胞的所有实验中，NS2A/A30P突变使得更有效更快速地建立稳定表达的细胞系(结果未示出)。与在BHK细胞中的结果一致，在HEp-2和293细胞中建立的嘌呤霉素抗性细胞系中RNA复制和β-gal表达的效率也是类似的(结果未示出)。
使用tetKUNCprME包装细胞增强Kunjin复制子载体表达异源基因
为了检测KUN复制子VLP能否通过在KUN包装A8细胞传播而扩增并且不在正常BHK细胞中扩增，将所述细胞用repPAC/β-galVLP以感染复数(MOI)为1进行感染，并在不含强力霉素的培养基中温育。X-gal染色分析感染的A8包装细胞显示从感染后第2天(48小时)至第6天(144小时)β-gal阳性细胞数显著增加(图8A)，表明β-gal VLP在A8细胞中扩增和传播。相反，在感染的正常BHK21细胞中仅检测到几个阳性细胞，并且在KUN复制子VLP感染后第2天至第6天细胞中β-gal阳性细胞数几乎没有改变(图8A)。另外，从感染后第2天起，在KUN repPAC/β-gal VLP感染的A8KUN包装细胞中的β-gal阳性细胞数比在正常BHK21细胞中的多很多(图8A)，表明复制子VLP的扩增和传播在早期第2天即存在。
β-gal分析溶解的KUN复制子VLP感染的细胞表明在感染A8细胞后从第2天至第6天感染保温期间β-gal表达有一约3倍的增加(图8B)，相比之下感染正常BHK21相比后从第2天至第6天感染保温期间β-gal表达仅增加1.3倍。从第2天至第6天repPAC/β-gal复制子VLP感染的A8包装细胞：正常BHK21细胞的β-gal表达的比率增加了2.3至5.2倍，因此进一步证实VLP通过在KUN复制子包装细胞中传播而扩增。从感染第2天至第6天观察到的相对不高的增加(3至5倍)可能是由于新感染的老龄(铺满后2-6天龄)A8包装细胞支持有效的KUN RNA复制的能力减弱所致，不是一定代表VLP的传播效率低下。研究人员先前在许多实验中已观察到相对于活跃分裂的BHK细胞在老龄BHK细胞中KUN RNA复制效率较低。总之，上述数据表明KUN RNA复制子VLP可以在复制子包装细胞(A8细胞系)中扩增和传播。
                        讨论
我们已在本文描述了一种用表达KUN病毒结构基因的四环素诱导型稳定包装细胞系tetKUNCprME将黄病毒复制子RNA衣壳化成病毒样颗粒的新的包装系统。高达约4×108VLP/ml的VLP高效价以及多达10天的多次VLP收获使得从单次初始电穿孔3×106个细胞的总收率达到约6.5×109VLP。这相对于先前开发的采用致细胞病变的SFV复制子RNA用于瞬时表达KUN结构基因的KUN复制子包装系统(Khromykh et al，1998，J Virol 72 5967-5977；Varnavski & Khromykh1999，文献同上)代表了一个大的进步，并且使得大规模商业生产KUN复制子VLP用于未来的疫苗和基因治疗应用变得可行。在包装细胞中产生的高效价KUN复制子VLP在疫苗中的用途通过在接种小鼠中产生针对来自呼吸道合胞病毒的编码的免疫原的强CD8+T细胞应答而得以证实。另外，tetKUNCprME细胞能够将登革病毒复制子包装成分泌的感染性VLP，表明可以应用tetKUNCprME细胞从远缘相关黄病毒生产衣壳化复制子的VLP。
本发明的诱导型包装构建体克服了结构蛋白显著的细胞毒性问题。另外，考虑到包括疫苗和/或蛋白质生产用途在内的KUN复制子VLP的目的用途，本发明的诱导型包装系统避免了在VLP制备物中存在抗生素。
在除去强力霉素时，在建立的tetKUNCprME细胞系中观察到约30倍的KUN CprME mRNA转录和CprME表达的诱导，并且在诱导表达时在tetKUNCprME细胞中产生的KUN结构蛋白的量足以在KUN复制子RNA转染后获得高效价的分泌的感染性VLP。每毫升获得了高达约4×108VLP的效价，这一收率等于或高于野生型KUN病毒在BHK细胞中的感染峰值时获得的病毒效价(Khromykh &Westaway，1994 J Virol 68 4580-4588)。
重要的是，通过颅内注射哺乳幼鼠而进行的最灵敏的检测KUN病毒的方法清楚显示在来自tetKUNCprME细胞的VLP制备物中不存在感染性KUN病毒。相比之下，表达新培斯病毒结构蛋白盒的BHK包装细胞系每毫升产生1-5×108个新培斯病毒或SFV复制子VLP(Polo et al，1999，文献同上)。这些α病毒复制子VLP制备物含有约105pfu/ml重组产生的感染性病毒。将结构蛋白分在包装细胞系的两个表达盒中看起来从这些病毒复制子VLP制备物中除去了污染使得感染性病毒呈不可检出的水平，但是同时使复制子VLP的效价降至5×106-1×107VLP/ml(Polo et al，1999，文献同上)。
在tetKUNCprME细胞中还实现了将DEN2复制子RNA包装成分泌的VLP。
为了显示高效价KUN复制子VLP在接种中的用途，在不同的小鼠株系中测试了两种VLP。先前的研究显示以每只小鼠至多106IU的剂量注射的KUN复制子VLP足以诱导能保护动物免受实验性病毒和肿瘤攻击的免疫应答(Anraku et al，2002，文献同上)。使用在新的包装细胞系中产生的VLP，在C57BL/6小鼠中证实了SIINFEKL特异性CD8T细胞对于KUN-Mpt VLP的剂量反应，其中增加剂量的VLP导致诱导的CD8T细胞的数目增加。另外，用2.5×107IU的编码RSV M2基因的tetKUNCprME衍生的KUN复制子VLP单次接种免疫BALB/c小鼠，用体外(ex vivo)IFNγELISPOT分析测得每106个脾细胞诱导出1400个SYIGSINNI特异性CD8T细胞，在铬释放分析中在效应子∶靶细胞比率为2∶1时测得＞45％的溶解。
总之，本发明提供了一种能够产生大量的、高效价的不含感染性病毒的分泌的KUN复制子病毒样颗粒的包装系统，并证实用这些颗粒免疫接种诱导了针对所编码的免疫原的强免疫应答。因此证明所述包装细胞系应该能够用于制造基于KUN复制子的疫苗。另外，所述的包装细胞系也能够包装其它黄病毒复制子，应该可以用于对黄病毒RNA包装和病毒组装的基础研究中以及用于开发基于不同黄病毒复制子的基因表达系统。
本说明书的目的是描述本发明的优选实施方案，而不是限制本发明于任何一个实施方案或特征的具体组合。因此，本领域技术人员应该理解在说明书的基础上可以对举例示出的特定实施方案进行各种修饰和改变而不偏离本发明的范围。
本说明书中引用的每一专利和科学文章、计算机程序和算法以其全文引入本文作参考。
表1  不同的tetKUNCprME细胞克隆的步骤效率
  细胞克隆   VLP效价*(IU/ml)
  A3   5.7×105
  A8   2.1×108
  E1   2×107
  E5   5.3×104
*2×106个细胞用约15微克的KUN复制子RNA即RNALeu电穿孔，电穿孔后53小时收获的分泌的VLP的效价通过在Vero细胞上滴定而确定。
表2  CprME表达诱导时间对VLP生产的作用
 诱导时间a  电穿孔后如下时间时的VLP产量(IU/ml)
  53小时   68小时
  0小时   2.1×108   3×107
  16小时   ＜100   2.9×106
  30小时   ＜100   5×105
*CprME表达的诱导通过在用RNALeu RNA电穿孔后所示时间除去强力霉素而起始。
表3  在tetKUNCprME包装细胞系中编码不同异源基因的分泌的KUN复制子VLP的产量
  VLP类型   VLP效价(IU/ml)   每3×106个细胞的总VLP产量
  2d   3d   4d   5d   6d   8d   10d
  RNAleuMPtaKUNgagaRNAleuarepGFPbrepPACcrepPACβ-galdexp1repPACβ-galeexp2repPACβ-galeexp3   3.1×1071×1071.8×1081.6×108-4×1051.2×1065×106   5.5×1073.9×1071.9×1082.6×108----   3.8×1081.2×108-3.7×1081.6×1081.1×1081.6×1091.3×108   -1.6×1072.5×1062×108----   2.9×108---2.2×1082.3×1081.1×1091.8×108   1.3×108------3.3×108   ----1.9×108---   6.5×1099.5×1081.6×1095.2×1096.5×1093.4×1095.4×10101.3×1010
a-d3×106个细胞用约20微克RNA电穿孔，接种于1个10cm培养皿上，并在不同体积的培养基中温育不同时间，之后收获VLP。在每一培养皿中6mla、5mlb、10mld培养基用于最初VLP收获并替换收获的VLP以允许进一步的VLP生产和收获。c10ml培养基在第4天和第6天收获，15ml培养基在第10天收获。
e3×106个电穿孔细胞接种在两个10cm培养皿上，每一培养皿的细胞在10ml培养基中温育，在每一指明的收获日期用10ml新鲜培养基替换原培养基。通过组合每次收获获得的VLP量来计算总VLP产量。“-”表明在此时没有收获VLP，并且培养基保持不变至下一次收获。
表4  在tetKUNCprME包装细胞中具有不同细胞适应性突变的KUN复制子RNA包装成VLP的包装效率(pfu/ml)
  第2天   第4天   第6天   第8天
  WtNS2A/A30PNS2A/N101DNS 5/P270SNS2A/A30P/N101D   5×1064×1064.4×1041.0×1051×104   1.3×1081×1081.3×1076×1071.1×105   1.8×1083.4×1084×1071.3×1081.2×106   3.3×1086×108n.d.n.d.9×106

Claims (29)

1.一种用于在动物细胞中调控型表达黄病毒结构蛋白的包装构建体，所述载体包含一种与一种核苷酸序列可操纵地连接的可调控启动子，所述核苷酸序列编码一种包含C蛋白、prM蛋白和E蛋白的黄病毒结构蛋白翻译产物。
2.权利要求1的包装构建体，其中所述可调控启动子是四环素阻抑型的。
3.权利要求2的包装构建体，其中所述可调控启动子是四环素阻抑型的CMV启动子。
4.权利要求1的包装构建体，其中所述核苷酸序列编码一或多种分别与C蛋白、prM蛋白或E蛋白有至少80％氨基酸序列相同性的变异的或突变的黄病毒结构蛋白。
5.权利要求1的包装构建体，进一步包含一种IRESNeo选择标记核苷酸序列。
6.权利要求1的包装构建体，其中所述C蛋白、prM蛋白和E蛋白是Kunjin病毒的结构蛋白。
7.一种包含权利要求1的包装构建体的包装细胞。
8.一种包含权利要求2的包装构建体和一种四环素反式激活蛋白构建体的包装细胞。
9.权利要求7或8的包装细胞，其是BHK21细胞。
10.一种黄病毒包装系统，其包含：
(i)权利要求1的包装构建体；和
(ii)一种黄病毒表达构建体，其包含
(a)一种黄病毒复制子；
(b)一种异源核酸；和
(c)一种与所述复制子可操纵连接的启动子。
11.权利要求10的黄病毒包装系统，其中所述黄病毒复制子是Kunjin病毒复制子、登革病毒复制子或西尼罗病毒复制子。
12.权利要求10的黄病毒包装系统，其中所述异源核酸编码一或多种可在动物细胞中表达的蛋白质。
13.权利要求12的黄病毒包装系统，其中所述一或多种蛋白质是免疫原性的。
14.权利要求10的黄病毒包装系统，其中所述复制子编码一或多种突变的结构蛋白。
15.权利要求14的黄病毒包装系统，其中所述突变的结构蛋白包含选自如下一组的一种突变：
(i)NS1非结构蛋白中亮氨酸残基250被脯氨酸取代；
(ii)非结构蛋白NS2A中丙氨酸30被脯氨酸取代；
(iii)非结构蛋白NS2A中天冬酰胺101被天冬氨酸取代；和
(iv)非结构蛋白NS5中脯氨酸270被丝氨酸取代。
16.权利要求10的黄病毒包装系统，其中所述可调控启动子是四环素阻抑型的。
17.权利要求16的黄病毒包装系统，其中所述可调控启动子是四环素阻抑型的CMV启动子。
18.一种包含权利要求10的黄病毒包装系统的包装细胞。
19.一种包含权利要求17的黄病毒包装系统的包装细胞。
20.权利要求10的包装细胞，其是BHK21细胞。
21.一种产生黄病毒VLP的方法，包括如下步骤：
(i)将权利要求1的包装构建体导入一种宿主细胞以产生包装细胞；
(ii)向所述包装细胞中导入一种黄病毒表达构建体，所述黄病毒表达构建体包含：
(a)一种黄病毒复制子；
(b)一种异源核酸；和
(c)一种与所述复制子可操纵连接的启动子；以及
(iii)诱导所述包装细胞产生一或多种VLP。
22.由权利要求21的方法产生的黄病毒VLP。
23.一种免疫治疗组合物，其包含权利要求22的VLP和一种药物学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
24.权利要求23的免疫治疗组合物，其是疫苗。
25.一种生产重组蛋白的方法，包括用权利要求21的VLP感染宿主细胞的步骤，由此编码所述蛋白质的所述异源核酸在所述宿主细胞中表达。
26.权利要求25的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
27.一种免疫接种动物的方法，包括将权利要求23的免疫治疗组合物给予动物以在所述动物中诱导免疫应答。
28.权利要求27的方法，其中所述动物是哺乳动物。
29.权利要求28的方法，其中所述哺乳动物是人。
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