KR20200101327A - 키메릭 황열 지카 바이러스 균주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 키메릭 황열 - 지카 균주 및 이의 약독화된 버전에 관한 것이고, 여기서, 상기 황열 바이러스의 신호 서열 및 prME 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 지카 바이러스의 신호 서열 및 prME 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 대체된다.

Description

키메릭 황열 지카 바이러스 균주

최근 아메리카에서의 지카의 발발(outbreak)은 심신쇠약 질병(debilitating disease)을 억제하거나 예방하기 위한 치료제의 연구를 이끌었다. 현재로서, 지카 바이러스(ZIKV)에 대한 활성을 보여주는 많은 항바이러스 및 백신 후보물질이 보고되었으나, 어느 것도 심지어 응급 시에도 승인이 나지 않았다. 황열(YF; yellow fever) 바이러스 및 지카 바이러스는 뎅기열(Dengue), 일본 뇌염, 웨스트 나일(West Nile), 진드기 매개 뇌염(Tick borne encephalitis) 바이러스와 더불어 플라비바이러스(Flavivirus)라고 하는 속(genus)에 속한다.

정착된 약독화된(attenuated) YF17D 황열 백신과 같은 플라비바이러스에 대한 백신이 개발되었다.

또한, 하나의 플라비바이러스의 prM/E 유전자가 또 다른 플라비바이러스의 prM/E 유전자에 삽입되거나 대체되는 키메릭(chimeric) 백신이 개발되었다. ChimeriVax 바이러스가 가장 잘 알려진 예이다(문헌[Guirakhoo et al. (1999) Virology 257,　363-372]).

C 단백질의 C 말단부는 신호 펩타이드로서 작용하고 이것이 바이러스 단백질의 적절한 단백질 분해 프로세싱(proteolytic processing)에 중요한 것으로 밝혀졌다. 최적의 프로세싱 및 바이러스 적합도(fitness)는 상관관계가 없으므로, 키메릭 구축물이 부모 바이러스의 신호 서열 또는 삽입물로부터의 신호 서열을 어느 정도까지 함유해야 하는지는 예측 불가능하다(문헌[Lee et al. (2000) J. Virol. 74, 24-32 및 Lobigs & Lee (2004) J. Virol. 78, 178-86] 참조).

문헌[Xie et al. (2017) mbio 8, e02134-16]은 뎅기열 바이러스 및 지카 바이러스의 키메릭 구축물을 개시하고 있다. Vero 세포의 계대배양 중 늘어난 정확한 돌연변이 과정은 아직까지 알려져 있지 않다.

약독화된 YF 바이러스 생백신인 YFV 17D를 사용하여, 본 발명자들은 2007년 상기 바이러스의 구조 유전자를 야프섬(Yap Island)에서 분리한 ZIKV 균주의 구조 유전자로 대체하여 키메라를 제작하였다[서열은 GB 기탁 EU545988로 입수 가능함].

생성된 키메릭 바이러스는 세포 배양물에서 효과적으로 증식(propagate)하지 못했으며 이러한 고도로 약독화된 바이러스를 증식시키기 위한 프로토콜이 필요했다. (a) 조직 배양으로 세포외 재조합 바이러스 입자의 연속적 계대배양 또는 (b) 마우스 뇌의 두개내 접종 후 재조합 바이러스를 얻는 고전적인 접근법으로는 측정 가능한 바이러스 자손을 수득하는데 실패했다(도 8a, 도 8b 참조). 당업계의 본질적인 특징으로서, 본 발명자들은 세포외 자손의 연속적 계대배양 전에, 상기 키메릭 바이러스 게놈을 발현하는 DNA-기반 구축물로 형질감염된 세포의 지속적 계대배양의 필수 단계(essential phase)를 시행하고 이의 지속적 복제를 도왔다(도 8c 참조). 세포 배양으로 바이러스를 증식시키기 위한 강제적 시도로, 본 발명자들은 실험 동물 모델 및 백신 생성에 사용하기 위해, 1 mL 당 10³개[또는 10^4.5 바이러스 RNA 복사체 수(copy number)/mL] 초과의 플라크 형성 단위(PFU; plaque forming unit), 바람직하게는 10⁵ PFU/mL[또는 10^6.5 바이러스 RNA 복사체 수/mL] 초과의 높은 역가(titre)까지 바이러스 복제를 가능하게 하는 프로토콜을 개발하였다.

이러한 방법으로 생성된 키메릭 바이러스는 미접촉(naive) Vero 세포를 감염시키고 세포내 계대배양 없이 감염을 증식시키는 능력이 획득된 것으로 나타났다. 본 발명자들의 결과는, YF17D-prME-ZIK가 복제 적격(competent)이고 약독화되어, ZIKV 감염의 예방을 위한 백신으로서 사용될 수 있음을 보여준다.

본 발명은, YF의 캡시드 신호 서열을 포함하는 프리-막 및 외피(prME; pre-Membrane and Envelope) 유전자가 이종성 ZIKV의 유전자로 대체된 키메릭 바이러스를 생성하기 위한 벡터로서의 YF의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 YF의 구조 유전자를 이종성 ZIKV의 구조 유전자로 대체함으로써 키메릭 바이러스가 생성됨을 보여준다. 꽤 고도로 약독화된[이의 각각의 mCherry 태깅된 리포터 변이체의 확산(spread)의 부재에 의해 예시된 바와 같이, 도 6a 참조] 키메릭 바이러스의 증식을 가능하게 하는 세포외 자손 바이러스의 연속적 계대배양 전에 cDNA 구축물로 형질감염된 세포 내에서 초기 세포내 계대배양을 이용하는 프로토콜을 설계함으로써, 본 발명자들은 분열중인(dividing) 세포에서 (세포내) 계대배양으로 바이러스를 10³ PFU/mL 또는 10⁵개 바이러스 RNA 복사체 수/mL 초과의 역가(도 10a 참조)까지 성공적으로 성장시킬 수 있었다. 이렇게 해서 생성된 바이러스는 부모 YF17D에 의해 형성되는 플라크보다 뚜렷하게 더 작은 플라크를 형성하였다(도 10b P1 참조). 세포외 자손 바이러스의 연속적 계대배양 후, 플라크 직경은 계대배양 1(P1)로부터 P5까지 약 2배만큼 증가하였다. 또한, P5에서 플라크는 부모 YF17D에 의해 형성된 플라크보다 작은 채로 남아 있었으며, 이는 바이러스가 시험관내에서 약독화된 것을 시사한다. 플라크 크기의 상대적 증가는 P1로부터 P5까지 복제 적합도에서 획득(gain)을 나타낸다.

나아가, 본 발명은 하기 항목으로 요약된다:

1. 생(live), 감염성, 약독화된 황열 - 지카 키메릭 바이러스의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 여기서, 상기 황열 바이러스의 신호 서열 및 prME 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 지카 바이러스의 신호 서열 및 prME 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 대체되어 상기 지카의 상기 신호 서열 및 prME 단백질이 발현되고, 지카 바이러스의 prME 단백질의 인코딩된 아미노산은 SEQ ID NO:2로 제시된 바와 같이 Ser742Leu 치환으로 야생형 서열과는 다른 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드. 따라서, 이러한 돌연변이(밑줄 표시)가 위치한 prME 단백질의 단편은 서열 IHQIFGAAFKLLFGGMSWFSQ[SEQ ID NO: 6]를 가진다.

2. SEQ ID NO:2로 제시된 바와 같이 Ala327Thr 치환으로 야생형 서열과 추가적으로 상이한, 폴리뉴클레오타이드.

3. 항목 1 또는 2에 있어서, 지카 바이러스의 인코딩된 신호 서열 및 prME 단백질은 하기의 아미노산 서열을 갖는, 폴리뉴클레오타이드:

4. 항목 1 내지 3 중 어느 한 항목에 있어서, 황열 바이러스의 NS2A 단백질의 인코딩된 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2로 제시된 바와 같이 Val1318Met 치환을 갖고/갖거나,

황열 바이러스의 NS4B 단백질의 인코딩된 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2로 제시된 바와 같이 Glu2416Lys 치환을 갖는, 폴리뉴클레오타이드.

5. 항목 1 내지 4 중 어느 한 항목에 있어서, 황열 바이러스 백본은 YFV 17D의 서열과 비교하여, SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 넘버링을 참조로 돌연변이 g4070a, t7333a, g7364a를 가져서, 하기 언급된 Arroyo의 ChimeriVax JE 구축물의 백본을 나타내는, 폴리뉴클레오타이드.

항목 1 내지 5 중 어느 한 항목에 있어서, SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 인코딩하고, 아미노산 327은 Thr(선택적으로 Ala)인, 폴리뉴클레오타이드.

6. 항목 1 내지 6 중 어느 한 항목에 있어서, SEQ ID NO:1로 나타낸 뉴클레오타이드 119 내지 10393의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 포함하고, 정지코돈은 배제되는, 폴리뉴클레오타이드.

7. 항목 1 내지 7 중 어느 한 항목에 있어서, SEQ ID NO:1로 나타낸 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.

8. 황열 바이러스의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 황열 바이러스의 신호 서열 및 prME 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 지카 바이러스의 신호 서열 및 prME 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 대체되어 상기 지카의 상기 신호 서열 및 prME 단백질이 발현되고, 지카 바이러스의 신호 펩타이드의 뉴클레오타이드 서열은 아미노산 서열 GTDTSVGIVGLLLTTAMA[SEQ ID NO:4]를 인코딩하는, 폴리뉴클레오타이드.

9. 항목 9에 있어서, 지카 바이러스는 기탁 번호 EU545988을 갖는 Yap 균주인, 폴리뉴클레오타이드.

10. 항목 9 또는 10에 있어서, 황열 바이러스는 YFV 17D 약독화된 바이러스인, 폴리뉴클레오타이드.

11. 항목 9 내지 11 중 어느 한 항목에 있어서, 황열 바이러스 백본은 YFV 17D의 서열과 비교하여, SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 넘버링을 참조로 돌연변이 g4070a, t7333a, g7364a를 가져서, 하기 언급된 Arroyo의 ChimeriVax JE 구축물의 백본에서 돌연변이를 나타내는, 폴리뉴클레오타이드.

항목 9 내지 12 중 어느 한 항목에 있어서, 지카 바이러스 삽입물은 지카 YAP 서열의 서열과 비교하여, SEQ ID NO:2로 제시된 바와 같이 돌연변이 Ala327Thr 및/또는 Ser742Leu을 갖는, 폴리뉴클레오타이드.

12. 항목 9 내지 13 중 어느 한 항목에 있어서, YF의 C 단백질 및 지카 바이러스의 신호 펩타이드의 연접부(junction)에서의 서열은 MRGLSSRKRR GTDTSVGIVG[SEQ ID NO:3]를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는, 폴리뉴클레오타이드.

13. 항목 1 내지 14 중 어느 한 항목에 있어서, 인공 박테리아 염색체(Artificial Bacterial Chromosome, BAC)인, 폴리뉴클레오타이드.

14. 항목 15에 있어서, 인공 박테리아 염색체는

상기 인공 박테리아 염색체를 1개 박테리아 세포 당 10개 초과의 복사체(copy)까지 증폭시키기 위한 유도성 박테리아 ori 서열, 및

상기 황열 지카 키메릭 바이러스의 cDNA를 포함하고, 포유류 세포에서 상기 바이러스 cDNA의 전사를 위해 그리고 감염성 RNA 바이러스 내로의 전사된 RNA의 프로세싱(processing)을 위해 cis-조절 요소를 포함하는 바이러스 발현 카세트

를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.

15. 항목 1 내지 8 중 어느 한 항목에 있어서, 백신으로서 사용하기 위한, 폴리뉴클레오타이드.

16. 항목 17에 있어서, 지카 바이러스 감염에 대한 예방 백신으로서 사용하기 위한, 폴리뉴클레오타이드.

17. 지카 감염에 대한 백신을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:

a) 하기를 포함하는 인공 박테리아 염색체를 제공하는 단계:

상기 인공 박테리아 염색체를 1개 박테리아 세포 당 10개 초과의 복사체까지 증폭시키기 위한 유도성 박테리아 ori 서열, 및

항목 9 내지 12 중 어느 한 항목에 따른 황열 지카 키메릭 바이러스의 cDNA를 포함하고, 포유류 세포에서 상기 바이러스 cDNA의 전사를 위해 그리고 감염성 RNA 바이러스 내로의 전사된 RNA의 프로세싱을 위해 cis-조절 요소를 포함하는 바이러스 발현 카세트

b) 포유류 세포를 단계 a)의 인공 박테리아 염색체로 형질감염시키고, 감염된 세포를 계대배양하는 단계

c) 단계 b)의 형질감염된 세포에서 복제된 바이러스의 병독성(virulence) 및 지카 바이러스 감염에 대한 항체를 발생시키고 지카 바이러스 감염에 대한 보호를 유도하는 능력을 입증하는 단계

d) 단계 c에서 입증된 바이러스를 벡터 내로 클로닝하는 단계,

e) 벡터를 백신 제제로 제제화하는 단계.

18. 항목 17에 있어서, 벡터는 상기 인공 박테리아 염색체를 1개 박테리아 세포 당 10개 초과의 복사체까지 증폭시키기 위해 유도성 박테리아 ori 서열을 포함하는 인공 박테리아 염색체인, 방법.

19. 생, 감염성, 약독화된 황열 - 지카 키메릭 바이러스의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 여기서, 상기 황열 바이러스의 신호 서열 및 prME 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 지카 바이러스의 신호 서열 및 prME 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 대체되어 상기 지카의 상기 신호 서열 및 prME 단백질이 발현되고, 지카 바이러스의 prME 단백질의 인코딩된 아미노산은 SEQ ID NO:2로 제시된 바와 같이 Ser742Leu 치환으로 야생형 지카 서열과는 다른 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.

본원에서, 신호 서열은 캡시드 단백질의 C-말단부를 지칭한다.

20. 항목 19에 있어서, 지카 E 단백질의 인코딩된 아미노산 서열은 서열 IHQIFGAAFKLLFGGMSWFSQ[SEQ ID NO: 6]를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.

21. 항목 19 또는 20에 있어서, SEQ ID NO:2로 제시된 바와 같이 Ala327Thr 치환으로 야생형 서열과 추가적으로 상이한, 폴리뉴클레오타이드.

22. 항목 19 내지 21 중 어느 한 항목에 있어서, 지카 E 단백질의 인코딩된 아미노산 서열은 서열 CVTVMAQDKPTVDIELVTTTV[SEQ ID NO: 7]를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.

23. 항목 19 내지 22 중 어느 한 항목에 있어서, 지카 바이러스의 인코딩된 신호 서열 및 prME 단백질은 SEQ ID NO: 5로 나타낸 아미노산 서열을 갖는, 폴리뉴클레오타이드.

24. 항목 19 내지 23 중 어느 한 항목에 있어서, 황열 바이러스의 NS2A 단백질의 인코딩된 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2로 제시된 바와 같이 Val1318Met 치환을 갖고/갖거나,

황열 바이러스의 NS4B 단백질의 인코딩된 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2로 제시된 바와 같이 Glu2416Lys 치환을 갖는, 폴리뉴클레오타이드.

25. 항목 19 내지 24 중 어느 한 항목에 있어서, 황열 바이러스 백본은 YFV 17D의 서열과 비교하여, SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 넘버링을 참조로 돌연변이 g4070a, t7333a, g7364a를 갖는, 폴리뉴클레오타이드.

26. 항목 19 내지 25 중 어느 한 항목에 있어서, 황열 바이러스는 YFV 17D 약독화된 바이러스인, 폴리뉴클레오타이드.

27. 항목 19 내지 26 중 어느 한 항목에 있어서, 지카 바이러스는 기탁 번호 EU545988을 갖는 Yap 균주인, 폴리뉴클레오타이드.

28. 항목 19 내지 27 중 어느 한 항목에 있어서, SEQ ID NO:1(정지코돈은 배제됨)로 나타낸 뉴클레오타이드 119 내지 10393의 오픈 리딩 프레임을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.

29. 항목 19 내지 28 중 어느 한 항목에 있어서, SEQ ID NO:1로 나타낸 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.

30. 항목 19 내지 29 중 어느 한 항목에 있어서, 지카 바이러스의 신호 펩타이드의 뉴클레오타이드 서열은 아미노산 서열 GTDTSVGIVGLLLTTAMA[SEQ ID NO:4]를 인코딩하는, 폴리뉴클레오타이드.

31. 항목 19 내지 30 중 어느 한 항목에 있어서, YF의 C 단백질 및 지카 바이러스의 신호 펩타이드의 연접부에서의 인코딩된 서열은 MRGLSSRKRR GTDTSVGIVG[SEQ ID NO:3]를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는, 폴리뉴클레오타이드.

32. 항목 19 내지 31 중 어느 한 항목에 있어서, 인공 박테리아 염색체인, 폴리뉴클레오타이드.

33. 항목 32에 있어서, 인공 박테리아 염색체는

상기 인공 박테리아 염색체를 1개 박테리아 세포 당 10개 초과의 복사체까지 증폭시키기 위한 유도성 박테리아 ori 서열, 및

상기 황열 지카 키메릭 바이러스의 cDNA를 포함하고, 포유류 세포에서 상기 바이러스 cDNA의 전사를 위해 그리고 감염성 RNA 바이러스 내로의 전사된 RNA의 프로세싱을 위해 cis-조절 요소를 포함하는 바이러스 발현 카세트

를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.

34. 생, 감염성, 약독화된 황열 - 지카 키메릭 바이러스로서, 여기서, 상기 황열 바이러스의 신호 서열 및 prME 단백질은 지카 바이러스의 신호 서열 및 prME 단백질로 대체되고, 지카 바이러스의 prME 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2로 제시된 바와 같이 Ser742Leu 치환으로 야생형 지카 서열과는 다른 것을 특징으로 하는, 황열 - 지카 키메릭 바이러스.

본원에서, 신호 서열은 캡시드 단백질의 C-말단부를 지칭한다.

35. 항목 34에 있어서, 지카 E 단백질에 서열 IHQIFGAAFKLLFGGMSWFSQ[SEQ ID NO: 6]를 포함하는, 황열 - 지카 키메릭 바이러스.

36. 항목 34 또는 35에 있어서, SEQ ID NO:2로 제시된 바와 같이 Ala327Thr 치환으로 야생형 서열과 추가적으로 상이한, 황열 - 지카 키메릭 바이러스.

37. 항목 34 내지 36 중 어느 한 항목에 있어서, 지카 E 단백질에 서열 CVTVMAQDKPTVDIELVTTTV[SEQ ID NO: 7]를 포함하는, 황열 - 지카 키메릭 바이러스.

38. 항목 34 내지 37 중 어느 한 항목에 있어서, 지카 바이러스의 신호 서열 및 prME 단백질은 SEQ ID NO: 5로 나타낸 아미노산 서열을 갖거나 포함하는, 황열 - 지카 키메릭 바이러스.

39. 항목 34 내지 38 중 어느 한 항목에 있어서, 황열 바이러스의 NS2A 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2로 제시된 바와 같이 Val1318Met 치환을 갖고/갖거나, 황열 바이러스의 NS4B 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2로 제시된 바와 같이 Glu2416Lys 치환을 갖는, 황열 - 지카 키메릭 바이러스.

40. 항목 34 내지 39 중 어느 한 항목에 있어서, 황열 바이러스는 YFV 17D 약독화된 바이러스인, 황열 - 지카 키메릭 바이러스.

41. 항목 34 내지 40 중 어느 한 항목에 있어서, 지카 바이러스는 기탁 번호 EU545988을 갖는 Yap 균주인, 황열 - 지카 키메릭 바이러스.

42. 항목 34 내지 41 중 어느 한 항목에 있어서, 아미노산 서열 GTDTSVGIVGLLLTTAMA[SEQ ID NO:4]를 포함하는, 황열 - 지카 키메릭 바이러스.

43. 항목 34 내지 42 중 어느 한 항목에 있어서, 황열 바이러스의 C 단백질 및 지카 바이러스의 신호 펩타이드의 연접부에서의 아미노산 서열은 아미노산 서열 MRGLSSRKRR GTDTSVGIVG[SEQ ID NO:3]를 갖는, 황열 - 지카 키메릭 바이러스.

44. 항목 34 내지 43 중 어느 한 항목에 있어서, 백신으로서 사용하기 위한, 황열 - 지카 키메릭 바이러스.

45. 항목 44에 있어서, 지카 바이러스 감염에 대한 예방 백신으로서 사용하기 위한, 황열 - 지카 키메릭 바이러스.

46. 항목 19 내지 33 중 어느 한 항목에 있어서, 백신으로서 사용하기 위한 황열 - 지카 키메릭 바이러스를 인코딩하는, 폴리뉴클레오타이드.

47. 항목 46에 있어서, 지카 바이러스 감염에 대한 예방 백신으로서 사용하기 위한, 폴리뉴클레오타이드.

48. 항목 19 내지 43 중 어느 한 항목에 따른 황열 - 지카 키메릭 바이러스를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.

49. 항목 34 내지 43 중 어느 한 항에 따른 황열 - 지카 키메릭 바이러스 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.

50. 지카 감염에 대한 백신을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:

a) 하기를 포함하는 인공 박테리아 염색체를 제공하는 단계:

상기 인공 박테리아 염색체를 1개 박테리아 세포 당 10개 초과의 복사체까지 증폭시키기 위한 유도성 박테리아 ori 서열, 및

항목 19 내지 33 중 어느 한 항목에 따른 황열 지카 키메릭 바이러스의 cDNA를 포함하고, 포유류 세포에서 상기 바이러스 cDNA의 전사를 위해 그리고 감염성 RNA 바이러스 내로의 전사된 RNA의 프로세싱을 위해 cis-조절 요소를 포함하는 바이러스 발현 카세트

b) 포유류 세포를 단계 a)의 인공 박테리아 염색체로 형질감염시키고, 감염된 세포를 계대배양하는 단계

c) 단계 b)의 형질감염된 세포의 복제된 바이러스에서 병독성 및 지카 바이러스 감염에 대한 항체를 발생시키고 보호를 유도하는 능력을 입증하는 단계

d) 단계 c에서 입증된 바이러스를 벡터 내로 클로닝하는 단계,

e) 벡터를 백신 제제로 제제화하는 단계.

51. 항목 51에 있어서, 벡터는 상기 인공 박테리아 염색체를 1개 박테리아 세포 당 10개 초과의 복사체까지 증폭시키기 위해 유도성 박테리아 ori 서열을 포함하는 인공 박테리아 염색체인, 방법.

52. 대상체에서 지카 바이러스에 대한 중화 항체 반응을 유도함으로써 지카 바이러스에 의한 감염을 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 항목 34 내지 43 중 어느 한 항목에 따른 황열 - 지카 키메릭 바이러스를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.

53. 대상체에서 지카 바이러스에 대한 중화 항체 반응을 유도함으로써 지카 바이러스에 의한 감염을 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 항목 19 내지 43 중 어느 한 항목에 따른 제1 플라비바이러스 및 제2 플라비바이러스의 키메릭 생 감염성 약독화된 플라비바이러스를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.

도 1은 키메릭 YF-ZIKprME 백신 바이러스의 뉴클레오타이드 및 예측된 폴리단백질 서열이다.
- 강조된 글자의 넘버링은 도 5에서 보고된 뉴클레오타이드 변화에 상응한다. 괄호 안의 숫자는 SEQ ID NO: 1에서의 넘버링을 지칭한다.
- 소문자는 ZIKV 앵커 도메인을 나타내는 볼드체/밑줄 표시된 서열과 함께 ZIKV-Yap 2007 prME에 상응한다.
- 대문자는 YFV 17D 서열에 상응한다.
- n은 G 또는 A(A가 우세한 피크임)이므로, Thr(또는 Ala)이 된다.
도 2는 YFV 게놈 및 이의 키메릭 유도체의 도식도이다. YFV의 prME 및 이의 캡시드 앵커(C-신호) 서열은 ZIKV의 것들로 대체되어, 약독화되었으나 아직 복제 적격인 바이러스를 생성하였다. 상단 패널은 YFV 플라스미드 벡터 내로 직접적으로 클로닝하기 위한 제한 부위와 함께 중첩(overlapping) 서열을 함유하는 ZIKV 유전자 블록을 도시한다. ZIK 5'A는 YFV의 캡시드 앵커(C-신호 서열)를 함유한 한편, ZIK 5'B는 ZIKV의 것을 함유한다. 하단 패널은, 생성된 키메릭 바이러스, 및 다른 이종성 플라비바이러스의 prME에도 불구하고, 동일한 접근법을 이용하는 다른 키메릭 기술을 보여준다.
도 3은 pShuttle/ChimeriVax-ZIK-ZIKCanch의 구축을 위한 클로닝 전략의 도식도이다. 지카 바이러스-Yap(2007) 폴리단백질 ORF nt 313..2382를 각각 YF17D-ATCC 내 뉴클레오타이드 1..421과 2452..10862 사이로 클로닝하였다. KasI 제한 엔도뉴클레아제 부위(세린-알라닌으로부터 글리신-알라닌으로의 아미노산 변화를 초래함)를 발생시키기 위해 돌연변이화된 곳은 ZIKV E 유전자의 마지막 2개 코돈이다. 이 연구에서 사용된 부모 유도성 BAC 플라스미드는 pShuttle/ChimeriVax-JE로서, 이는 Arroyo et al. 2001에 의해 제조된 구축물과 유사한 ChimeriVax-JE 바이러스를 발현하도록 WO2014174078로부터의 합성 구축물 #1로부터 유래된 유도성 BAC이다. pSYF17D-ZIK-prME: 키메릭 YF-ZIKprME를 발현하는 유도성 BAC이다. 도트(dot) **는 ChimeriVax-JE 백본에 이미 존재하는 돌연변이를 나타낸다.
도 4는 천연 플라비바이러스 및 합성 키메릭 플라비바이러스에서 C-prM 연접부의 구조이다. C 앵커 도메인(= prM 신호 펩타이드)의 업스트림 및 다운스트림의 아미노산 서열은 단일 글자 SI 약어로 제시된다. 범례: (2a/3) - NS2b/3 프로테아제 절단 부위; (사인(sign)) - 신호 펩티다제 절단 부위; *는 서열 정렬을 용이하게 하도록 도입된 갭이다.
도 5는 합성 키메릭 플라비바이러스 Chimerivax-JE(선행 기술) 및 신규 YF-ZIKprME(YF/ZIKV-ZIK-Canch)의 돌연변이 패턴이다. 도 5는 다양한 키메릭 구축물 I 내지 V에서 뉴클레오타이드 및 아미노산 변형의 개요를 보여준다. 변형의 넘버링은 표 2 및 첨부된 설명에 설명되어 있다. 부모 바이러스 YFV-17D (I)의 복사체 DNA는 문헌[Arroyo et al. (2001) J. Virol. 75, 934-942]에 의해 JE SA14-14-2 백신의 prME 서열을 운반(carry)하도록 변형되었다. 각각의 Chimerivax-JE 바이러스 (II)는 완전(full) 복제 적합도를 위해 적응(adaptive) 돌연변이 1 및 2를 필요로 하였다. ZIKV-Yap 2008 균주의 prME 서열에 더하여, 부가적으로 조작된[번역 침묵(translationally silent)] 돌연변이 3(Xho1 제한 부위)를 갖는, PCT/EP2014/058459(WO2014174078)에 기재된 (I)을 기반으로 하는 구축물 (III)은 생존 가능하지 않았다. (III)의 백본 내로의 돌연변이 1(번역 침묵 BstE2 제한 부위; 이중 뉴클레오타이드 돌연변이 4가 동반됨) 및 돌연변이 2(번역 침묵 Nhe1 제한 부위; 돌연변이 5가 동반됨)의 도입은 아직까지는 복제 적합도가 불량하지만 생존 가능한 YFV/ZIKV 키메라를 산출하였다. 세포내 및 세포외 계대배양은 계대배양 5(재조합 바이러스 V)에서 돌연변이 6 내지 9(삼각형)의 고정을 야기한다.
도 6은 mCherry YF-ZIK 키메릭 바이러스의 성장 및 증식을 나타낸 도이다. WO2014174078에 기재된 YFV 17D 백본(도 3에서 구축물 I을 또한 참조)을 기반으로, 본 발명자들은 문헌[Fischl & Bartenschlager (2013) Methods. Mol. Biol. 1030, 205-219]에 의해 기재된 바와 같이 본질적으로 YFV 17D 폴리단백질로의 N-말단 번역 융합으로서 발현되는, 발현된 mCherry 유전자로 태깅된 YF-ZIK 키메릭 바이러스를 발현하는 BACS를 구축하였다. 비교자로서, mCherry를 함유하는 YFV 17D는 동일한 백본 내에서 구축되었다. (a) 상단 패널은 바이러스의 복제는 거의 없으나 증폭 또는 확산은 전혀 없는 mCherry YF-ZIK 키메릭 바이러스(하위 패널)와 대조적으로 YFV mCherry의 성장 및 대량(massive) 증폭을 보여준다. (b) 이의 복제를 입증하기 위한, 모노클로날 Ab, 4G2를 이용한 YF-ZIKprME 바이러스(지시된 시점에서)의 염색이다. 도면은 여전히 확산 없이 바이러스 복제를 나타내는 4G2를 이용한 mCherry 및 외피 단백질 염색의 공동-국소화(co-localization)를 보여준다[분리된 염색 세포는 화살표로 표시됨].
도 7은 마우스에서 두개내 계대배양에 의해 키메릭 YF ZIK 바이러스를 적응시키려는 시도를 나타낸 도이다. YFV 또는 ZIKV의 캡시드 앵커 (C-신호 서열)와 더불어 변이체(원형(상위 라인) 및 정사각형(하위 라인)) 중 어느 것도, 조직 배양물에서 바이러스 계대배양 및 더 활발한 성장에의 적응 전에, 형질감염된 세포의 상층액의 두개내 접종 후 마우스(체중 손실)에서 임의의 질병률(morbidity) 또는 사망률(mortality)을 유발하지 않았다.
도 8은 (a) 재조합 플라비바이러스를 생성하고 적응시키는 전형적인 수단(예를 들어 상기 인용된 Arroyo et al. 2001)과 신규의 단계적 접근법(staged approach)(c)의 비교를 나타낸 도이다. (a)에 대해 대안적으로, 감염성 재조합 자손은 마우스 또는 마우스 새끼(mouse pup)의 뇌 내로 두개내 접종에 의해 증폭되었다(b). IVT - 시험관내 전사; TFXN - 형질감염.
도 9는 YF17D-ZIKprME의 세포내 계대배양 중 선택된 시점에서 면역형광 검정 결과를 나타낸 도이다. 세포의 분할 및 재현탁 후, 300 μl의 세포 현탁액을 Lab-tek 8웰 챔버 슬라이드에 접종(seed)하고, 밤새 인큐베이션한 후, 지시된 시점에서 IFA 염색 및 현미경 검사를 수행하였다. 팬(pan)-플라비바이러스 모노클로날 항체(mAb) 4G2를, 바이러스 번역 및 복제에 대한 대리물(surrogate)로서 역할을 하는 바이러스 외피 단백질을 염색하는 데 사용하였다. 형질감염 후 7일째(dpt) 전에, IFA 염색은 단일 세포에서 양성 신호를 거의 검출할 수 없었다. 7 dpt에서, 단지 1개 그룹(포커스)의 세포만 4G2로 양성으로 염색되었고(몇몇 단일 감염된 세포와 함께), 13일째까지, 포커스의 수는 20 초과까지 증가하였다. 포커스: E 단백질에 대해 양성으로 염색된 세포 그룹. c) 계대배양 시, 낮은 역가의 키메릭 바이러스는 1.25 X 10³ PFU/mL(P1)로부터 1.75 × 10⁶ PFU/mL(P3)까지 유의하게 높은 역가까지 성장할 수 있었다. d) YF17D 및 이의 약독화된 유도체 YF-ZIKprME의 플라크 표현형은, YF17D가 YF-ZIKprME보다 확연히 큰 플라크를 형성하였음을 보여주었으며, 이는 키메릭 바이러스가 약독화된 것을 시사한다. pShuttle/ChimeriVax-ZIK-YFCanch로 형질감염된 세포의 분석은 임의의 바이러스 증폭을 보여주지 않았다.
도 10은 계대배양 시 YF-ZIKprME 바이러스 역가 및 플라크 표현형을 나타낸 도이다. (a) YF-ZIKprME의 세포외 계대배양 시, 적당한 바이러스 수율이 달성될 수 있었다. RNA-qPCR 값은 계대배양 1 내지 3에서 세포외 바이러스 RNA에서 약 1.5 내지 1.7 로그(log) 증가를 보여주며, 이는 추가의 계대배양 시 꽤 일정하게 정체되었다. (b) YF-ZIKprME 키메릭 바이러스는 이의 부모 YFV와 비교하여 더 작은 플라크를 형성하였으며, 이는 시험관내에서 상기 YF-ZIKprME 키메릭 바이러스의 약독화를 시사한다. YF-ZIKprME의 추가 계대배양은 더 크고 다소 이종성인 플라크 표현형을 산출하였다[시퀀싱(nt 위치 1097에서의 이종성)으로 입증될 수 있었던 이종성 바이러스 집단의 존재를 시사함]. 비교를 위해 ChimeriVax-JE로 플라크를 형성하였다. 요약하자면, YFV 17D는 JEV 및 ZIKV 키메릭 바이러스보다 확연히 큰 플라크를 형성하였으며, 이때, 2가지 키메릭 바이러스 사이에서 플라크 크기 및 형태에서 확연한 차이는 없었으며, 이는 YF-ZIKprME가 이의 시스터(sister) 키메라 ChimeriVax-JE(YF-JEprME)로서 약독화된 것을 시사한다.
도 11은 세포내 계대배양 후 pShuttle/ChimeriVax-ZIK-ZIKCanch로부터의 감염성 자손의 생성을 나타낸 도이다. 배지 이전(transfer) 및 미접촉 Vero 세포의 감염에 의한 pShuttle/ChimeriVax-ZIK-ZIKCanch으로 형질감염 후 22일째에 조직 배양 상층액 내의 감염성 YF-ZIKprME이다. 후속적인 감염은 E 단백질(mAb 4G2)에 대한 IFA 염색에 의해 검출될 수 있었다. pShuttle/ChimeriVax-ZIK-YFCanch에 의한 형질감염은 임의의 감염성 바이러스를 산출하지 않았다.
도 12는 YF-ZIKprME의 새로운 항원성을 나타낸 도이다. YFV 17D, ZIKV BeH819015의 필드(field) 분리주, 또는 YF-ZIKprME로 감염된 세포는, YFV E 단백질과는 아니지만 ZIKV E와만 교차-반응하는 JEV 특이적 mAb(Biosource) 또는 팬-플라비(pan-flavi) mAb 4G2(좌측)를 사용하여 E 항원 발현에 대해, 그리고 mAB 1A5를 사용하여 YFV NS1에 대해 염색하였다(문헌[Schlesinger et al. (1983) Virology 125, 8-17]). YF-ZIKprME 감염된 세포는, E 단백질에 관하여 ZIKV BeH819015 감염된 세포와 같이 염색되고; NS1 단백질에 관하여 YFV 17D 감염된 세포와 같이 염색된다. 이는, YF-ZIKprME가 ZIKV와 YFV 둘 모두로부터의 항원을 발현하는 참(true) 키메라임을 나타낸다.
도 13은 포유류 및 모기 세포주 상에서 YF17D 및 이의 키메릭 유도체 YF-ZIKprME의 성장 동역학(growth kinetics)을 나타낸 도이다. (a) 예상된 바와 같이, YF17D는 C6/36 모기 세포(Vero 세포에서 이의 성장과 비교하여)에서 감소된 바이러스 성장 동역학을 보여주었으며, 이와는 대조적으로, (b) YF-ZIKprME는 동일한 모기 세포주에서 복제가 무효화되어, 백신화된 집단에서 모기 전파(transmission)에 대한 후자의 바이러스의 안전성 경계(margin)를 상승시킨다.
도 14는 YF-ZIKprME에 의해 유도되는 면역원성(혈청전환) 및 보호 효능(치사 챌린지(lethal challenge)의 생존율)을 나타낸 도이다. (a) YF-ZIKprME로 백신화된 마우스로부터의 혈청의 간접 면역형광 검정법(IIFA)은 10⁵ PFU의 YF-ZIKprME를 이용한 백신화 후 21일째에 높은 역가 항체의 존재를 나타내었다. 백신화된 마우스(#770-772)는 높은 역가(>1:100)의 ZIKV 특이적 항체로 혈청전환된다. 이러한 고용량의 백신화는 안전하고, AG129 마우스에서 임의의 명시적인 부작용을 유발하지 않는다[YFV 17D의 유사하게 높은 접종물은 10,000-배 치사 용량을 나타내고 AG129 마우스에서 균일하게 치명적임]. (b) 백신화된 마우스 및 비-백신화된 마우스는 21일 후에 챌린지되었고, 백신화된 마우스와 비-백신화된 마우스 사이에서 유의한 차이(p=0.008)와 함께 체중 손실 및 질병 징후에 대해 매일 모니터링되었다. (c) 챌린지 시, 비-백신화된 마우스는 안락사까지 평균 일수 14±1로 챌린지 바이러스에 굴복한 한편, 백신화된 마우스는 임의의 유의한 체중 손실 또는 다른 질병 증후군 중 어느 것도 보여주지 않았다. 백신화된 마우스는 28일 동안 모니터링되었지만, 사망이 기록되지 않았다.
도 15는 YF-ZIKprME를 사용한 백신화에 의한 바이러스혈증(viremia) 및 표적 기관으로의 바이러스 확산(dissemination)으로부터의 보호를 나타낸 도이다. 챌린지 후 5일째 및 10일째에 수합된 혈액 (a) 및 기관 (b)은 5일째(p=0.0003) 및 10일째에 백신화된 마우스와 비-백신화된 마우스 사이에서 바이러스 역가의 확연한 차이를 나타내었다.
도 16은 저용량 접종물을 이용한 백신화에 의한 치사 챌린지로부터의 보호를 나타낸 도이다. (a) 저용량 접종물을 이용한 백신화 후 보호를 보여주기 위한 연구 설계이다. 1 × 10² PFU YF17D-ZIKprME로 ip 백신화된 마우스는 혈청전환되었고 (b), 10⁴ PFU MR766으로 챌린지 시, 바이러스 유도 체중 손실 (c) 및 사망률 (d)로부터 보호되었다. 백신화 후 14일째의 부스팅(boosting)은 완전 보호를 부여하는 데는 필요하지 않지만, 체액성 면역 반응의 규모에 관하여 부가적인 이익을 가진다(b, 중간 패널 대 하위 패널).

플라비바이러스는 대략 11,000개 뉴클레오타이드 길이의 양성 단일-가닥 RNA 게놈을 가진다. 상기 게놈은 5' 비번역 영역(UTR), 길이가 긴(long) 오픈-리딩 프레임(ORF; open-reading frame), 및 3' UTR을 함유한다. ORF는 3개의 구조 단백질(캡시드[C], 전구체 막[prM], 및 외피[E]) 및 7개의 비-구조 단백질(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5)을 인코딩한다. 게놈 RNA와 더불어, 구조 단백질은 바이러스 입자를 형성한다. 비-구조 단백질은 바이러스 폴리단백질 프로세싱, 복제, 비리온 조립, 및 숙주 면역 반응의 회피(evasion)에 참여한다. C 단백질의 C 말단에서 신호 펩타이드(C-신호 펩타이드; C-앵커 도메인("canch")으로도 지칭됨)는 C 단백질의 C 말단부의 신호 펩타이드 서열의 N 말단(세포질에서 바이러스 NS2B/NS3 프로테아제에 의해) 및 C 말단(소포체[ER] 내강에서 숙주 시그날라제(signalase)에 의해)에서 순차적인 절단의 조화를 통해 플라비바이러스 패키징(packaging)을 조절한다.

신호 서열에서 돌연변이는 플라비바이러스의 조립에 상당한 효과를 가질 수 있다. 동일한 맥락에서, 플라비바이러스의 조립은 키메릭 플라비바이러스에서 매우 영향을 받을 수 있으며, 여기서, 제2 플라비바이러스의 prME 유전자는 제1 플라비바이러스의 C-신호 펩타이드와 프레임(frame) 내에서 클로닝된다. 제1 바이러스의 C-신호 펩타이드가 보존되거나 제1 바이러스의 C-신호 펩타이드가 제2 바이러스의 C-신호 펩타이드로 대체되는 키메릭 플라비바이러스가 제조되어 왔다. 또한, 신호 펩타이드에서의 돌연변이는 절단 효율 및 후속적인 바이러스 복제의 효과를 평가하기 위해 도입되어 왔다.

플라비바이러스 속은 뎅기열, 황열, 웨스트 나일, 일본 뇌염, 진드기 매개 뇌염 및 지카 바이러스와 같이 의학적으로 중요한 바이러스를 포함한다. 의학적으로 중요한 플라비바이러스 중에서, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 옴스크 출혈열 바이러스(Omsk hemorrhagic fever) 바이러스, 캬사늘숲 질병(Kyasanur forest disease) 바이러스 및 알크후르마 출혈열(Alkhurma hemorrhagic fever) 바이러스만 진드기에 의해 전파되고, 다른 것들은 주로 애데스 종(Aedes spp.) 및 쿨렉스 종(Culex spp)의 모기 벡터에 의해 전파된다. 플라비바이러스의 게놈은 잘 특징화되었으며, 이때, 각각의 구성원(member)은 유전자가 각각 5' 및 3' 말단에서 비번역 영역에 의해 측면에 존재하는 동일한 게놈 배열을 갖는다. 양성-센스 단일-가닥 게놈은 단일 폴리단백질 내로 공동- 및 번역후 변형되며, 상기 폴리단백질은 이후에 바이러스 및 숙주 단백질에 의해 3개의 구조 단백질[캡시드(C), 프리막(prM), 외피(E)] 및 7개의 비-구조 단백질(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5)로 절단된다. 구조 단백질은 비리온의 (구체) 구조를 형성하며, 세포 내로의 비리온 접착, 내재화 및 방출을 개시함으로써 바이러스 수명 주기를 조직화하는 데 책임이 있다. 한편, 비-구조 단백질은 감염된 세포에서 바이러스 복제, 면역 반응의 조정 및 회피, 및 모기로의 바이러스 전파에 책임이 있다. 구조 단백질과 비-구조 단백질 사이에서 분자내 및 분자간 상호작용은 바이러스 감염 및 발병(pathogenesis)에 주된 역할을 한다. 외피 단백질은 잘 특징화되었고 항원성 및 체액성 면역 반응의 주요 결정인자인 것으로 나타났다. prM 유전자는 세포질 내로의 바이러스 입자의 부착 및 방출 동안 큰 역할을 하여, RNA 복제 및 바이러스 증식을 가능하게 하는 것으로 나타났다. 상기 언급된 과정에서 prM의 중요성을 실증하기 위해, 다양한 그룹은 prM이 있는 외피 (E) 단백질 또는 prM이 없는 외피 (E) 단백질을 플라스미드 벡터 내로 클로닝하고, 서브바이러스(subvirus) 입자의 생성에 대해 모니터링하였다. 이들 연구의 결과는, 서브바이러스 입자의 생성 및 면역 반응의 도출(elicitation)에서 prM 영역의 중요성을 강조한다. 본원에서, 본 발명자들은 잘 특징화된 YFV 17D의 prM 및 E를 2007년에 야프섬에서 분리된 지카 바이러스의 유행(epidemic) 균주로 대체함으로써 발생된 키메릭 바이러스 백신 후보물질을 기재한다. 합리적으로 설계된 키메릭 바이러스 백신은 YF17D 벡터의 안전성 및 prME 유전자의 면역원성을 탐색하여, 상기 백신을 추가의 개발을 위한 적합한 후보물질이 되게 한다. 최근의 증거는, 이후에 유행하는 ZIKV 분리주가 선천성 기형의 더 높은 위험도를 초래하는 아미노산 치환을 함유하고(문헌[Yuan et al. (2017) Science 358, 933-936]), 따라서 이들의 prME 유전자는 심각한 유해 효과의 고유한 위험도로 인해 약독화된 생백신의 개발을 위해 선택된 바람직한 항원이 아닐 수 있음을 보여준다.

본 발명의 제1 양태는, 복제 적격이며 지카 바이러스 감염 및 상기 지카 바이러스 감염의 경태반(transplacental)(모자(mother-to-child)) 전파에 의해 유발되는 이의 후유증, 예컨대 선천성 기형으로부터 보호하기 위해 약독화된 생백신으로서 사용될 수 있는 신규 키메릭 재조합 플라비바이러스가 발생되게 하는 황열 플라비바이러스와 지카 바이러스 사이에서의 키메릭 구축물에 관한 것이다. 키메릭 구축물을 백신으로서 사용하는, ZIKV 감염으로부터의 보호는 놀랍게도, 이전에 본 발명자들에 의해 매우 상세하게 기재되었던(문헌[Zmurko et al. (2016) PLoS Negl. Trop. Dis. 10, e0004695]) 가장 엄격한 AG129 마우스 지카 바이러스 감염 모델에서 백신 챌린지로부터의 강력하게 예시된다. 흥미롭게는, 이러한 엄격한 모델에서, 보호는 단일 백신 용량으로부터 달성되고 매우 고용량의 챌린지 바이러스(10⁴-배 치사 용량에 상응하는 10⁴ PFU의 ZIKV 균주 MR766)에 대해 보호되었다. 이러한 보호는 첫째, 챌린지 바이러스 바이러스혈증으로부터의 보호까지 연장되고, 이때, 감염 후 바이러스혈증 5의 피크에서 비-백신화된 개체와 비교하여 바이러스 RNA 복사체 수에서 적어도 5 Log10만큼; 비-검출 가능한 수준까지 하향) 감소된다. 둘째, 백신화는 뇌 및 고환을 포함하는 몇몇 관련 기관에서 바이러스 부하(load)의 가장 확연한 감소를 초래한다. 어느 사례이든지, 감소는 불임 면역(sterilizing immunity)을 부여할 수 있는 구축물을 나타내는 비-검출 가능한 수준에 도달할 수 있다.

보호를 부여하기 위해서는 단지 단일 용량의 구축물이 충분하였다. 일반적으로, 백신화를 위한 생-약독화된 지카 바이러스를 사용하는 경우 10⁴ PFU의 용량이 고려되었다(예를 들어 문헌[Shan et al. (2017) Nat. Commun. 8, 676)] 참조). 본 발명자들의 구축물에 대해, 본 발명자들은 부스터 백신을 할 필요 없이 AG129 마우스에서 치사 챌린지로부터 100% 보호를 부여하기 위해 훨씬 더 낮은(10² PFU까지 낮춰진) 용량이 충분하였음을 보여준다.

본 발명자들의 구축물은 모기 세포에서 더 이상 복제하지 않는다. YFV 17D에서, 모기 세포에서 이의 감소된 복제 적격은 필드(환경적 안전성)에서 비조절된 백신 바이러스 확산을 억제시키는 중요한 안전성 특징인 것으로 여겨진다. 더불어, 본 발명자들의 구축물은 환경적으로 매우 안전한 것으로 여겨질 수 있다.

본 발명자들의 구축물에서, YF 바이러스의 prME 유전자는 지카 바이러스의 prME 유전자로 대체된다. 또한, YF 바이러스의 신호 펩타이드는 지카 바이러스의 신호 펩타이드로 대체되었다. 실시예에 의해 예시된 바와 같이, 신호 펩타이드의 정확한 서열은 키메릭 구축물의 복제에 상당한 영향을 미친다.

뎅기열 백본 및 지카 prME를 갖는 키메릭 플라비바이러스는 Xie에 의해 기재되었다. 이러한 키메라를 발생시키기 위해 사용되는 DENV-2 감염성 클론은 DENV-2 균주 D2Y98P의 cDNA 서열을 함유한다. 이러한 특정 DENV-2 균주는, 마우스에서 특히 병독성이어서 기관 손상 또는 기능장애(dysfunction)(문헌[Grant et al. (2011) J. Virol. 85, 7775-7787]에 의해 기재되었음) 및 환자에서 중증 DENV 감염의 특징인 증가된 혈관 투과성(문헌[Tan et al. (2010) PLoS Negl. Trop. Dis. 4, e672])을 초래하는 비-약독화된 필드 분리주이다. 따라서, DENV-2 균주 D2Y98P는 특히 병독성인 DENV-2 균주인 것으로 여겨질 수 있다.

일반적으로, 바이러스는 숙주 세포를 감염시키며, 감염성 자손을 증폭시키고 생성하는 능력(potency)을 갖는 경우 살아 있는 것으로 여겨진다. 바이러스는, 이것이 이의 병독성을, 유사한 용량의 원래 병원성인 부모 바이러스가 이러한 질병을 유도하는 것으로 예상될 수 있는 취약한 숙주에서 더 이상 명백한 질병을 유발할 수 없는 정도까지 상실하는 경우 약독화된 것으로 여겨진다.

약독화 전 키메릭 구축물의 증식, 뿐만 아니라 약독화 후 구축물의 cDNA는 상기 구축물의 에러 프루프(error proof) 복제를 필요로 한다. 인공 박테리아 염색체의 사용, 및 특히 WO2014174078에서 본 발명자들에 의해 개시된 바와 같이 유도성 BACS의 사용은 본 발명의 키메릭 구축물과 같은 RNA 바이러스의 cDNA의 고수율, 고품질 증폭에 특히 적합하다.

본 공보 BAC(인공 박테리아 염색체)에서 기재된 바와 같이, BAC는 하기를 포함한다:

- 상기 BAC를 1개 박테리아 세포 당 10개 초과의 복사체까지 증폭시키기 위한 유도성 박테리아 ori 서열, 및

- RNA 바이러스 게놈의 cDNA를 포함하고, 포유류 세포에서 상기 바이러스 cDNA의 전사를 위해 그리고 감염성 RNA 바이러스 내로의 전사된 RNA의 프로세싱을 위해 cis-조절 요소를 포함하는 바이러스 발현 카세트.

본 발명의 경우에서와 같이, RNA 바이러스 게놈은 2개 RNA 바이러스 게놈의 키메릭 바이러스 cDNA 구축물이다.

이들 BACS에서, 바이러스 발현 카세트는 양성-가닥 RNA 바이러스 게놈의 cDNA, 전형적으로

- 상기 cDNA의 전사를 개시하기 위해 상기 cDNA의 5' 말단에 선행하는(preceding) RNA 폴리머라제 구동(driven) 프로모터, 및

- 설정된 위치에서 상기 바이러스 cDNA의 RNA 전사체를 절단하기 위해 상기 cDNA의 3' 말단에 후행하는(following) RNA 자가-절단을 위한 요소

를 포함한다.

BAC는 효모에서 상기 인공 박테리아 염색체로의 셔플링 및 유지를 위해 효모 자가 복제(autonomously replicating) 서열을 추가로 포함할 수 있다. 효모 ori 서열의 일례는 2 μ 플라스미드 기원 또는 ARS1(자가 복제 서열 1) 또는 이들의 기능적으로 상동성 유도체이다.

본 발명의 이러한 제1 양태의 RNA 폴리머라제 구동 프로모터는 RNA 폴리머라제 II 프로모터, 예컨대 사이토메갈로바이러스 즉각적인 초기(Immediate Early)(CMV-IE) 프로모터, 시미안(Simian) 바이러스 40 프로모터 또는 이들의 기능적으로 상동성 유도체일 수 있다.

RNA 폴리머라제 구동 프로모터는 동등하게는 RNA 폴리머라제 I 또는 III 프로모터일 수 있다.

BAC는 또한, RNA 자가-절단을 위한 요소, 예컨대 델타 간염 바이러스의 게놈 리보자임(ribozyme)의 cDNA 또는 기능적으로 상동성 RNA 요소를 포함할 수 있다.

백신 조제물로의 DNA의 제제화는 당업계에 알려져 있고, 예를 들어 문헌["DNA Vaccines" Methods in Molecular Medicine Vol 127, (2006) Springer Saltzman, Shen and Brandsma (Eds.) Humana Press. Totoma, N.J.]의 챕터 6 내지 10 및 문헌[Alternative vaccine delivery methods, Pages 1200-1231, of Vaccines (6th Edition) (2013) (Plotkin et al. Eds.)]의 챕터 61에 상세히 기재되어 있다. DNA 백신의 제조에 적합한 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 및 보조제에 대한 세부사항은 또한, 하기 나타낸 바와 같이 WO2005042014에서 확인할 수 있다.

"허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제"는 인간 의학 및/또는 수의학에서, 특히 면역치료법의 측면에서 사용하기에 허용 가능한 부가적인 성분을 지칭한다.

예로서, 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제는 전신 또는 국소 투여에 안전하게 사용될 수 있는 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 성분일 수 있다. 특정 투여 경로에 따라, 당업계에 잘 알려진 여러 가지 담체가 사용될 수 있다. 이들 담체는 당(sugar), 전분, 셀룰로스 및 이의 유도체, 맥아, 젤라틴, 탈크(talc), 칼슘 설페이트 및 카르보네이트, 식물성 오일, 합성 오일, 폴리올, 알긴산, 포스페이트 완충액, 유화제, 등장성 식염수 및 염, 예컨대 하이드로클로라이드, 브로마이드 및 설페이트를 포함한 무기산(mineral acid) 염, 유기산, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트 및 말로네이트 및 발열원-무함유 물(water)을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.

약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및 부형제를 설명하는 유용한 참조문헌은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N. J. USA, (1991))]이며, 이는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.

임의의 안전한 투여 경로는 환자에게 DNA 백신을 제공하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장, 비경구, 설하, 협측, 정맥내, 관절내, 근육내, 피부내, 피하, 흡입, 안내(intraocular), 복강내, 뇌실내(intracerebroventricular), 경피 등이 이용될 수 있다. 근육내 및 피하 주사는 예를 들어, 면역치료 조성물, 단백질성 백신 및 핵산 백신의 투여에 적절할 수 있다. 또한, 미세입자 충격(microparticle bombardment) 또는 전기천공이 핵산 백신의 전달에 특히 유용할 수 있는 것으로 고려된다.

투여 형태(dosage form)는 정제, 분산액, 현탁액, 주사액, 용액, 시럽, 트로키(troche), 캡슐, 좌제, 에어로졸, 경피 패치 등을 포함한다. 이들 투여 형태는 또한, 이러한 목적을 위해 특이적으로 설계된 주사형 또는 이식형 조절된 방출 장치 또는 이러한 방식으로 부가적으로 작용하도록 변형된 다른 형태의 이식물을 포함할 수 있다. 치료제의 조절된 방출은 상기 치료제를 예를 들어 아크릴 수지, 왁스, 고급 지방족 알코올, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 소정의 셀룰로스 유도체, 예컨대 하이드록시프로필메틸 셀룰로스를 포함하는 소수성 중합체로 코팅함으로써 수행될 수 있다. 또한, 조절된 방출은 다른 중합체 매트릭스, 리포좀 및/또는 미소구체(microsphere)를 사용함으로써 수행될 수 있다.

경구 또는 비경구 투여에 적합한 DNA 백신은 각각의 예정된 양의 플라스미드 DNA를 분말 또는 과립으로서 별개의 단위, 예컨대 캡슐, 사세(sachet) 또는 정제로서 제시될 수 있으며, 또는 수성 액체, 비-수성 액체, 수-중-유 에멀젼 또는 유-중-수 액체 에멀젼 중 용액 또는 현탁액으로서 함유한다. 이러한 조성물은 임의의 약제학 방법에 의해 제조될 수 있으나, 모든 방법은 상기 기재된 바와 같이 하나 이상의 작용제를, 하나 이상의 필수 성분을 이루는 담체와 조합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 조성물은 DNA 플라스미드를 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하게 그리고 친밀하게 혼합한 다음, 필요하다면 생성물을 요망되는 제시물로 형상화함으로써 제조된다.

상기 조성물은 투여량 제제와 융화 가능한 방식으로, 그리고 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 환자에게 투여되는 용량은 적절한 기간에 걸쳐 환자에서 유익한 반응을 발휘하기에 충분해야 한다. 투여되는 작용제(들)의 양은 치료받는 대상체의 연령, 성별, 체중 및 일반적인 건강 상태를 포함하여 상기 대상체, 의사의 판단에 따라 달라질 인자에 따라 다를 수 있다.

더욱이, DNA 백신은 참조로서 주어진 문헌[Darji et al. (2000) FEMS Immunol. Med. Microbiol. 27, 341-349 및 Cicin-Sain et al. (2003) J. Virol. 77, 8249-8255]에 의해 예시된 바와 같이 상기 DNA 플라스미드로 형질전환된 살모넬라(Salmonella)의 약독화된 생균주를 사용하는 것과 같이 박테리아 형질도입(transduction)에 의해 운반될 수 있다.

전형적으로, DNA 백신은 인간의 예방적 또는 치료적 면역화에 사용되지만, 소정의 바이러스의 경우 가축 및 애완 동물과 같은 가정용 동물(domestic animal)을 포함하여 척추동물(전형적으로 포유류, 조류 및 어류)에도 적용될 수 있다. 백신화는 원숭이, 마우스, 래트, 조류 및 박쥐와 같이 바이러스의 살아있는 저장고(인수공통감염(zoonosis))인 동물에서 예상된다.

소정의 구현예에서, 백신은 보조제, 즉, 백신 조성물의 면역원성 및/또는 효능을 증강시키는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 그러나, 생백신은 결국, 바이러스 복제와 독립적으로 내재(innate) 면역 반응을 자극할 수 있는 보조제에 의해 손상될 수 있다. 적합한 보조제의 비제한적인 예는 스쿠알란 및 스쿠알렌(또는 동물 기원의 다른 오일); 블록 공중합체; 세제, 예컨대 Tween-80; Quill A, 미네랄 오일, 예컨대 Drakeol 또는 Marcol, 식물성 오일, 예컨대 땅콩유; 코리네박테리움(Corynebacterium)-유래 보조제, 예컨대 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum); 프로피오니박테리움(Propionibacterium)-유래 보조제, 예컨대 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acne); 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)(바실레 칼메테(Bacille Calmette) 및 구에린(Guerin) 또는 BCG); 인터루킨, 예컨대 인터루킨 2 및 인터루킨 12; 모노카인(monokine), 예컨대 인터루킨 1; 종양 괴사 인자; 인터페론, 예컨대 감마 인터페론; 조합, 예컨대 사포닌-알루미늄 하이드록사이드 또는 Quil-A 알루미늄 하이드록사이드; 리포솜; ISCOMt) 및 ISCOMATRIX (B) 보조제; 미코박테리아 세포벽 추출물; 합성 글리코펩타이드, 예컨대 무라밀(muramyl) 디펩타이드 또는 다른 유도체; 아브리딘(Avridine); 지질 A 유도체; 덱스트란 설페이트; DEAE-덱스트란 또는 알루미늄 포스페이트; 카르복시폴리메틸렌, 예컨대 Carbopol'EMA; 아크릴 공중합체 에멀젼, 예컨대 Neocryl A640; 백시니아(vaccinia) 또는 동물 폭스바이러스 단백질; 하위-바이러스 입자 보조제, 예컨대 콜레라 독소, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.

실시예

실시예 1. 플라스미드 구축

플라스미드 pShuttle/ChimeriVax-JE는 표준 재조합 DNA 방법을 사용하여 구축된 WO2014174078에 개시된 바와 같은 유도성 BAC 및 합성 구축물 #1의 유도체이다. 플라스미드 pShuttle/ChimeriVax-JE를, 문헌[Arroyo et al. (2001) J. Virol. 75, 934-942]에 의해 ChimeriVax-JE에 대해 기재된 바와 같이 YFV 17D NS2A 및 NS4B 영역에 일본 뇌염 백신 SA14-14-2의 prME 서열에 더하여, 2개의 부가적인 적응성(미스센스) 코돈 변화를 함유하도록 설계하였다. 상기 ChimeriVax-JE의 전체 구조는 도 5에서 '구축물 II'로서 도시되고, 상기 코돈 변화는 '돌연변이 1' 및 '돌연변이 2'로서 명시된다. 또한, Arroyo et al. 2001에 기재된 바와 같이, Kas1 부위를 prME 코딩 서열의 말단에 도입하였다.

Arroyo et al. 2001과는 별개로, 플라스미드 pShuttle/ChimeriVax-JE를, 원래의 ChimeriVax-JE에 존재하지 않는, 부가적인 침묵 Xho1, BstE2 및 Nhe1 제한 부위를 YFV 17D 서열에 함유하여, 유전자 마커로서 역할을 하고 클로닝이 용이하도록 구축하였다(도 5에서 '구축물 IV'에서 '돌연변이 3', '돌연변이 4' 및 '돌연변이 5'로서 명시됨).

폴리단백질 오픈 리딩(ORF) nt 313 내지 2382에 상응하는 Yap(EU545988 Genbank 기탁(30.07.2008)) ZIKV 분리주의 prME 영역을, YFV의 5' 말단 및 NS1 서열의 측면에 존재하는 커스텀 DNA 합성(IDT Integrated DNA Technologies, Haasrode)에 의해 제조된 유전자 블록, 즉; ZIK-5'A(YFV 캡시드 앵커), ZIK 5'B(ZIKV 캡시드 앵커), ZIK-Mid, 및 ZIK-3'으로 제조하였다. 특히, ZIK-5'A 및 ZIK 5'B는 이미, YFV 캡시드 앵커 및 ZIKV 캡시드 앵커를 각각 인코딩하기 위해 신호 펩타이드 연접부에서 YF 지카의 특이적인 융합을 가진다.

유전자 블록은, 이들이 프라이머 YF17D(+) 319(gttgtggaaaatgctggacccaagacaaggcttggctgttctaaggaaagtcaagagagt)[SEQ ID NO: 8] 및 YF17D(-) 2521(tctaaatatgaagataccatctccgcacttgagctctctcttgccaaagttgatggcgca)[SEQ ID NO:9]를 사용하여 융합 PCR을 위한 주형으로서 직접적으로 사용될 수 있게 하는 중첩 서열을 함유하였다. 발생된 융합 앰플리콘은, 제한 분해에 의한 플라스미드 pShuttle/ChimeriVax-JE 내로의 직접적인 결찰 및 이의 각각의 Xho1 및 근위부(proximal) Kas1 부위 내로의 결찰을 가능하게 하는 말단 XhoI 및 KasI 부위를 함유하였다. 도 3은 YF-ZIKprME로 지칭되는 YF17D-prME-ZIKCanch 키메릭 바이러스(합성 유전자블록 ZIK 5'B(ZIKV 캡시드 앵커)를 혼입함)를 발생시키기 위해 황열 백본에서 전반적인 클로닝 전략 및 삽입 부위를 보여준다. ZIK-5'A(YFV 캡시드 앵커)를 혼입하는 YF17D-prME-YFanch 키메릭 바이러스를 이에 따라 구축하였다. 각각의 cDNA 구축물 pShuttle/YF17D-prME-ZIKCanch 및 pShuttle/YF17D-prME-YFCanch는 WO2014174078에 따른 유도성 BAC이다.

실시예 2. 바이러스 생성

이 연구에 사용된 세포를 ATCC로부터 구매하고, 10% FBS, 1% Anti-Anti(1% 스트렙토마이신 및 암포테라신 B; Invitrogen), 1% 소듐 바이카보네이트(Gibco, Belgium), 1% 글루타민(Gibco, Belgium)이 보충된 Minimum Essential 배지(MEM-Rega-3, Invitrogen Life Technologies)에 37℃, 5% CO₂에서 인큐베이션시켰다. 바이러스를, 백신 용도용의 플라비바이러스의 생성을 위해 사용되는 일반적으로 허용된 기질인 Vero E6 세포에서 발생시키고 증식시켰다. (i) 형질감염 프로토콜에 따른 풀-블로운(full-blown) 감염을 구조화하거나, (ii) 마우스 뇌에서 두개내 접종 후 복제를 개시하기에 충분한 자손을 생성할 수 있는 감염성 바이러스를 발생시킬 수 있는 감염성 바이러스를 생산하지 못하는 본 발명자들의 불능으로 인해, 고도로 약독화된 YF-ZIKprME 키메릭 바이러스의 인 시추(in situ) 복제를 가능하게 하는 프로토콜을 설계하였다. 이를 위해, TransIT®-LT1 형질감염 시약(Mirrus Bio LLC, Belgium)을 제조업체의 설명에 따라 사용하여, 2.5 μg의 플라스미드 pShuttle/YF17D-prME-ZIKCanch 또는 플라스미드 pShuttle/YF17D-prME-YFCanch를 6웰 플레이트에서 5 × 10⁵개의 Vero E6 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 후 2일째에(dpt), 세포를 PBS로 2회 세척하고, 트립신처리하고, 총 부피 5ml의 1% Anti-Anti(1% 스트렙토마이신 및 암포테리신 B; Invitrogen)를 함유하는 2% FBS 배지가 있는 25 cm³ 플라스크로 옮겼다. 이 사이클을 형질감염 후 8일째, 14일째 및 20일째에 3회 더 반복하였으며, 각각의 횟수는 점점 더 큰 조직 배양 용기를 제공함으로써 세포 기질을 소모하였다. 총 22일 후 세포 배양을 종료하였다.

유도성 BACS로부터 시작된 키메릭 바이러스의 세포내 복제는 조직 배양 상층액 내로의 완전 감염성 자손 바이러스 입자의 생성 및 방출을 야기할 수 있다. 이러한 키메릭 바이러스가 출현하자마자 이의 증폭을 가능하게 하기 위해, 형질감염된 세포의 상층액의 일부 또한, 각각의 다음 세포 계대배양으로 옮겼다. 세포내 계대배양의 경과 동안 YF17D-prME-YFCanch 자손(pShuttle/YF17D-prME-YFCanch 형질감염으로부터 개시됨)의 증폭이 IFA에 의해 관찰되지 않았기 때문에, 키메라 YF17D-prME-YFCanch를 적응시키기 위한 임의의 추가의 시도가 중단되었다. 형질감염된 pShuttle/YF17D-prME-ZIKCanch로부터 유래된 YF17D-prME-ZIKCanch 키메릭 바이러스(YF-ZIKprME)를 Vero 세포에서 계대배양하고, 계대배양 3 및 5를 추가의 연구에 사용하였다.

표 1 고도로 약독화된 키메릭 바이러스의 증식을 위한 작업흐름:

면역형광 검정법(IFA)을 지시된 시점에서 사용하여, 바이러스의 감염성 및 확산을 모니터링하였다.

동물. 문헌[Zmurko et al. (2016) PLoS Negl. Trop. Dis. 10, e0004695]에 기재된 바와 같이 인터페론 알파 및 감마 수용체 둘 모두가 결핍된 마우스인 IFNAGR^-/-(AG129; B&K Universal, Marshall Bio resources, UK)를 하우스에서 사육하고, 5 × 10² 내지 1 × 10⁵ PFU의 YF-ZIKprME로 백신화한 후, 1 × 10⁴ PFU 내지 1 × 10⁵ PFU의 이종성 균주 MR766으로 챌린지하였다. 마우스를 체중 변화 및 바이러스 유도 질병에 대해 모니터링하였다.

바이러스 챌린지. 6 내지 8주령 마우스의 6개 그룹(n=5/그룹)을 200 μl의 1 × 10⁵ PFU의 백신 바이러스로 복강내(i.p) 백신화하고, 백신화 후 21일째에 챌린지하였다. 챌린지 후 바이러스혈증 및 기관으로의 바이러스 확산을 측정하기 위해, 백신화된 마우스(n=5) 및 비-백신화된 마우스(n=5)를 5일째 및 14일째(사망시)에 안락사시켰다. 심장 천자(heart puncture)를 통해 혈액을 채혈하는 한편, 기관을 풍부하게 관류시키고 2개 튜브에 수합하였다; 하나의 튜브는 RNA 고정 및 추출을 위해 RNAlater(Thermofischer, USA)에 4℃에서 밤새 두고, 1.5mL 튜브에 담아 -80℃ 드라이 아이스 상에서 저장하였다. 채혈 시, 바이러스혈증에 대한 혈액 시료를 얼음 상에 저장하고, 2500 rpm에서 15분 동안 원심분리하고, RNA 추출 및 qRT-PCR을 위해 -80℃에 저장하였다. 보호를 부여하는 데 필요한 백신화 동역학 및 시간을 측정하기 위해, 마우스를 5개 그룹(n=5)으로 케이지에 무작위로 나누고, 다양한 시점(-d21, -d14, -d10 및 -d7)에서 백신화한 후, 1 × 10⁵ PFU MR766을 챌린지하였다. 마우스를 질병의 징후 및 사망률에 대해 매일 모니터링하였다.

RNA 추출 및 qRT-PCR. 시료를 재료 및 방법 하에 문헌[Zmurko et al. (2016) PLoS Negl. Trop. Dis. 10, e0004695]에 기재된 바와 같이 처리하였다.

플라크 검정법 및 플라크 감소 중화 시험(PRNT). 혈청 및 기관 내 바이러스 역가를 플라크 검정법에 의해 측정하였다. 간략하게는, BHK-21J 세포를 6-웰 플레이트에서 1개 웰 당 1 × 10⁶개 세포로 밤새 접종하였다. 바이러스 스톡(stock)을 2% 검정법 배지에 10^-1 내지 10^-5로 희석시키고, 각각의 희석물 1 mL를 PBS로 2회 세척한 6-웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 이후에 바이러스를 제거하였다. 2% FBS에서 0.5% 농도로 제조된 한천 오버레이(agar overlay)를 각각의 웰에 첨가하고, 한천을 실온에서 고형화하도록 놔둔 후, 37℃에서 7일 동안 인큐베이션하였다. 세포를 4% 포름알데하이드로 고정하고, 세척하고, 1% 크리스탈 바이올렛으로 5분 동안 염색함으로써 플라크를 시각화하였다. 상기 플라크를 카운팅하고, PFU/mL 바이러스 스톡으로서 보고하였다.

면역형광 검정법(IFA)

바이러스 복제 및 확산을 인-하우스 개발된 IFA를 사용하여 모니터링하였다. 이를 달성하기 위해, 트립신처리 및 적절한 부피의 성장 배지에서의 재현탁(형질감염된 세포의) 후 유래된 300 μl의 세포 현탁액을 8웰 Lab-tek 챔버 슬라이드의 웰로 옮기고, 지시된 시점에서 염색하였다. 간략하게는, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 4% 파라포름알데하이드(PFA)로 20분 동안 고정한 후, 2회 세척하고, 0.1 % Triton X-100으로 5분 동안 투과시켰다. 그 후에, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 블라킹 완충제(PBS 중 1% FBS 및 0.05% Tween-20)로 커버(cover)하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 후, 블라킹 완충제를 제거하고, 블라킹 완충제에 희석된 200 μl의 팬-플라비바이러스 마우스 모노클로날 항체 4G2(EMD-Millipore)를 첨가하고, 슬라이드를 쉐이커 상에서 300 rpm에서 1시간 동안 진탕시켰다(rock). 세포를 세척 완충제(PBS + 0.05% Tween-20)로 3회(쉐이커 상에서 1회 세척 당 5분) 세척하고, 여기(excitation)시 형광 현미경 하에 시각화를 가능하게 하는 형광 프로브, Alexa 488과 결합한 염소 항-마우스 2차 항체로 대조 염색하였다. 2차 항체를 제거하고, 세포를 세척 완충제로 다시 3회(쉐이커 상에서 1회 세척 당 5분) 세척하였다. 마지막으로, 세포를, 핵 염색(청색)용 DAPI 염색을 함유한 마운팅 배지로 커버하고, 형광 현미경(Floid Cell Imaging Station, ThermoFisher, Germany)으로 관찰하였다.

혈청전환(seroconversion)을 측정하기 위해, 인-하우스 IIFA를 발생시켰다. 이를 위해, Vero E6 세포를 키메릭 백신 바이러스로 감염시키고, 95% 초과의 세포 감염이 가능하도록 3일 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 상기 세포를 세척하고, 트립신처리하고, 2% FBS 배지에 재현탁시켰다. 이백(200) μl의 세포 현탁액을 8-웰 Lab-tek 챔버 슬라이드로 옮기고, 실험 전에 6시간 동안 또는 밤새 인큐베이션하였다. 감염된 세포는 백신화된 마우스의 혈청에서 항체의 검출을 위한 항원으로서 역할을 하였다. 모든 혈청전환 연구를 마우스를 챌린지하기 직전 백신화 후 21일째에 수행하였다.

통계학적 분석. 데이터를 GraphPadPrism 소프트웨어를 사용하여 분석하고 평균 ± 표준 편차로서 표현하였다. 그룹의 비교를 일원(one-way) ANOVA를 사용하여 수행하였으며, 이때, 0.05 미만의 p 값은 그룹들 사이에서 통계학적 차이를 나타낸다.

실시예 4. AG129 마우스에서 면역원성 및 백신 효능 결과

마우스를 5개 그룹(n=5)에서 2개 케이지로 무작위로 할당하였다. 챌린지 전 21일째에, 하나의 그룹을 2 × 10⁴ PFU의 YF-ZIKprME로 복강내(i.p) 백신화하고, 체중 손실 및 질병 징후에 대해 매일 모니터링하였다. 챌린지 전에 어떠한 체중 손실도 관찰되지 않았다. 백신화 후 21일째에, 백신화된 마우스 및 비-백신화된 마우스에게 2 × 10⁴ PFU의 MR766를 i.p 챌린지하고, 체중 손실 및 질병의 시각적인 징후에 대해 매일 모니터링하였다. 백신화된 마우스는 치사 챌린지로부터 완전히 보호되었고, 챌린지 후 28일 동안 모니터링되었다. 한편, 비-백신화된 마우스는 감염에 굴복하였고, 안락사되었으며, 안락사까지 평균 일수(MDE)는 14±1이었다. 마우스는 플라비바이러스 감염의 특징적인 징후, 즉: 구부린 자세, 쑥 들어간 눈, 뒷다리 마비가 나타났고, 따라서 안락사되었다.

모든 백신화된 마우스는 혈청전환되었고, 2 × 10⁴ PFU의 MR766을 이용한 치사 챌린지로부터 완전히 보호되었다. 비-백신화된 마우스는 점진적인 체중 손실 및 질병 징후를 보여준 한편, 백신화된 마우스는 체중 손실로부터 보호되었고 치사 챌린지로부터 생존하였다. 본 발명자들은 백신화된 마우스와 비-백신화된 마우스 사이에서 평균 체중 손실(p=0.008) 및 생존율(p=0.0019)에서 유의한 차이를 관찰하였으며, 이는 YF-ZIKprME 백신 후보물질에 의해 마우스에게 부여된 보호 효능덕분이었다(도 14).

바이러스혈증 및 기관으로의 바이러스 확산에 대해 보호하는 백신 후보물질의 능력을 평가하기 위해, 2개 마우스 그룹(n=5/그룹)을 챌린지 후 21일째에 백신화하였다. 21일째에, 마우스를 2 × 10⁴ PFU의 MR766으로 챌린지하고, 2개의 비-백신화된 마우스 대조군(n=5/그룹)을 동일한 용량의 MR766으로 동일하게 챌린지하였다. 챌린지 후 5일째 및 10일째에, 마우스를 안락사시키고, RNA 분리 및 qRT-PCR에 의한 정량화를 위해 기관을 수합하였다. RT 추출 및 바이러스혈증 결정을 위해 혈액을 심장 천자에 의해 채혈하고, 원심분리하고, -80℃에서 저장하였다. 챌린지 후 5일째까지 5 마리의 백신화된 마우스 중 4 마리에서 어떠한 바이러스혈증도 검출되지 않은 한편, 비-백신화된 마우스는 피크 바이러스혈증을 보여주었다. 바이러스혈증을 갖는 마우스는 <1:2000 항체 역가를 갖는 것으로 나타났으며, 이와는 대조적으로 바이러스혈증을 갖지 않는 마우스에서는 >1:4000 항체 역가가 나타났다. 백신화된 마우스의 평균 바이러스 역가는 비-백신화된 마우스보다 유의하게(p=0.0003) 더 낮았다. 챌린지 후 10일째에, 5 마리의 백신화된 마우스 중 단지 1 마리만 비-백신화된 마우스와 유사하게 높은 바이러스혈증을 보여주었다. 잔여 4 마리의 백신화된 마우스는 검출 불가능한 바이러스혈증을 가졌다. 높은 바이러스혈증을 갖는 마우스는 혈청에 항체를 갖지 않는 것으로 나타났으며, 그 결과 챌린지 바이러스를 중화시킬 수 없었다. 이러한 마우스에서 항체의 부재는 실패된 백신화 또는 백신화의 생략으로 인한 것일 수 있었으며, 백신화 생략이 더 가망성 있다. 마찬가지로, 성공적으로 백신화된 마우스는 챌린지 후 5일째까지 바이러스혈증 및 기관으로의 바이러스 확산으로부터 완전히 보호된 한편, 비-백신화된 마우스는 바이러스혈증 및 다수의 기관 감염을 나타내었다. 챌린지 후 10일째까지, 5 마리의 백신화된 마우스 중 3 마리는 혈액 및 기관에 바이러스를 갖지 않은 한편, 1 마리의 마우스는 일부 기관에 바이러스를 가졌다. 초기에 보고된 바와 같이 혈청전환을 갖지 않는 잔여 마우스는 비-백신화된 마우스와 유사한 바이러스 역가를 혈청 및 기관에 가졌다. 종합하면, 본 발명자들의 결과는, 항체가 보호 및 바이러스 중화에 주된 역할을 하고, 바이러스 중화는 항체 역가에 확연히 의존적임을 입증한다(도 15 참조).

실시예 5. 플라크 검정법

플라크 검정법을 6웰 플레이트에서 BHK-21J 세포 상에서 수행하였다. 이를 위해, BHK-21J 세포를 1개 웰 당 1 × 10⁶개 세포로 접종하고, 37℃, 5% CO₂에서 밤새 인큐베이션하였다. 10^-1 내지 10^-5 까지 일련의 바이러스 희석물을 제조하였다. 비교자로서, YF17D 및 YF-JE(ChimeriVax-JE, YFV와 일본 뇌염 바이러스, JEV의 prME 사이의 키메라)를 사용하여, YF-ZIKprME 바이러스의 약독화를 표현형적으로 해독하였다. 결과는, YF17D와 비교한 경우 YF-ZIKprME가 확연히 더 작은 플라크를 형성함을 드러내었으나, 약독화된 YF-JEprME 바이러스와 비교한 경우 확연한 차이를 보여주지 않았다.

플라크 표현형은 약독화를 위한 대용물(proxy)로서 사용될 수 있으며; 다시 말해, 너무 약한 약독화는 약독화된 생백신으로서 사용하는 데 있어서 중요한 안전성 쟁점을 제기한다. 그러한 점에서, YF-ZIKprME는 플라크 표현형(도 10b 참조)에 의해 판단되는 바와 같이 안전하고 강력한 키메릭 ChimeriVax-JE(호주 및 동남아시아에서 Imojev®로서 판매됨)와 유사한 약독화 정도를 보여준다. 또한, 새로운 구축물은 모체인 YFV 17D를 능가하는 명백히 증강된 세포병원성(cytopathogenicity)을 획득하지 않는다는 것이 유익하다. 생 YFV 17D는 백신으로서 안전한 것으로 여겨지며, 문헌[Seligman Vaccine 32:5769-5775]에 의해 고찰된 바와 같이 매우 희귀하고(약 0.1:100,000) 주로 소정의 위험군으로 국한되는 질환인 주로 황열 백신-연관 내장향성 질병(YEL-AVD)에 대해 중증 유해 부작용을 최소 잔존 위험도(minimal residual risk)로 가진다. 플라크 표현형에 의해 판단되는 바와 같이, YF-ZIKprME는 YFV 17D보다 덜 공격적으로 성장하므로, YFV 17D보다 비교적 더 안전한 것으로 여겨질 수 있다. 이러한 선호할 만한 안전성 프로파일은, YFV 17D 백신의 접종이 금지된 어린 유아, 노인 및 임산부와 같은 더 취약한 집단에서도 YF-ZIKprME를 사용할 수 있게 할 것이다.

표 2 합성 키메릭 플라비바이러스 ChimeriVax-JE 및 신규 YF-ZIKprME(YF/ZIKV-ZIK-Canch)의 돌연변이 패턴:

바이러스 [도 5에서의 구축물]	YFV에서의 뉴클레오타이드 위치
	409	1097*	2343*	3979	3985	4025	5641	7288	7319	10454
SEQ ID NO　:1에서의 상응하는 위치	409	1097	2343	4024	4030	4070	5686	7333	7364	10499
도 5에서의 돌연변이 #	3	6	7	4	4	1	8	5	2	9
YFV-17D [I] (WO2014174078)	A			T	T	G	A	T	G	G
ChimeriVax-JE [II] (Arroyo et al. 2001)	A			T	T	A	A	A	A	G
YF/ZIKprME [IV] (분자 cDNA 구축물)	G	G	C	G	C	A	A	A	A	G
YF/ZIKprME 계대배양 5 [V]	G	R (A,G)#	T	G	C	A	G	A	A	A
아미노산 변화	-	Ala> Thr	Ser> Leu	-	-	Val> Met	-	-	Glu> Lys	-
SEQ ID NO:2에서의 코돈	97	327	742	1302	1304	1318	1856	2405	2416	-
게놈 영역	C	E	E	NS2A	NS2A	NS2A	NS2B	NS4A	NS4B	3' UTR

도 5 및 표 2는 본 발명에서 개시된 상이한 구축물에 도입된 변형을 예시한다.구축물 I은 백신에 사용되는 YFV 17D 약독화된 균주이다.

구축물 II는 상업적인 ChimeriVax 균주로서, 여기서, YFV의 prME 유전자는 일본 뇌염의 prME 유전자로 대체된다. 여기서, 변형 1 및 변형 2는 복제 적합도를 증가시키기 위해 도입되었다.

구축물 (III)은 WO2014174078에 기재된 바와 같은 (I)을 기반으로 하며, ZIKV-Yap 2008 균주의 prME 서열에 더하여, 클로닝을 위한 Xho1 제한 부위 발생을 위해 부가적으로 조작된(번역 침묵) 돌연변이 3을 가졌다. 이 구축물은 생존 불가능하였다.

구축물 (IV)는 ChimeriVax 균주의 돌연변이 1 및 2 뿐만 아니라, XhoI 부위(돌연변이 3)도 함유한다. 돌연변이 1의 도입은 부가적인 돌연변이 4와 동반되어, 침묵 BstE2 제한 부위를 발생시킨다.

돌연변이 2의 도입은 부가적인 돌연변이 5와 동반되어, 침묵 Nhe1 제한 부위를 발생시킨다. 구축물은 생존 가능하지만 여전히 불량한 복제 적합도를 가진다.

세포내 및 세포외 계대배양은 계대배양 5(재조합 바이러스 V)에서 돌연변이 6 내지 9(삼각형)의 고정을 야기한다. 이는 침묵 뉴클레오타이드 치환 뿐만 아니라 지카 삽입물의 외피 단백질에서 아미노산 변형을 야기한다.

표의 상단 및 도 1에서의 넘버링은 당업계에서 일반적으로 기재되는 바와 같은 황열 구축물의 뉴클레오타이드를 지칭한다. 45개 뉴클레오타이드의 지카 prME 삽입물의 길이 차이로 인해, 넘버링은 상이하다. SEQ ID NO:1 및 2의 키메릭 구축물에서 발생하는 바와 같은 뉴클레오타이드의 넘버링은 상기 표에서 표시되고, 또한, 도 1에서 [] 정사각형 괄호 내에 표시된다.

시퀀싱 시, 코돈 327이 일반적으로 돌연변이화되어, Ala으로부터 Thr으로의 치환을 야기하는 것이 발생하였다. 이러한 치환이 바람직한 구현예이긴 하지만, Ala 327이 비변형된 균주는 동등하게 예상된다.

결론적으로, 키메릭 바이러스는 YF의 구조 유전자를 이종성 ZIKV의 구조 유전자로 대체함으로써 발생되었다. 보다 고도로 약독화된(과다-약독화된) 키메릭 바이러스의 증식을 가능하게 하는 프로토콜을 설계함으로써, 본 발명자들은 분열중인 세포에서 (세포내) 계대배양에 의해 바이러스를 더 높은 역가까지 성공적으로 성장시킬 수 있었다. 이렇게 해서 발생된 바이러스는 부모 YFV 17D에 의해 형성되는 플라크보다 확연히 더 작은 플라크를 형성하였으며, 이는 바이러스가 시험관내에서 약독화됨을 시사한다. 키메릭 바이러스는 또한, 모기 세포에서 확연히 불량한 성장을 보여주며, 이는 상기 키메릭 바이러스가 환경적으로 안전할 것이며 모기 벡터를 통해 확산되기에는 매우 낮은 위험도를 가짐을 시사한다. 키메릭 바이러스는 YFV 17D 및 ZIKV 바이러스 감염의 치사 마우스 모델에서 더 이상 오우버트(ouvert) 질병의 임의의 징후를 유발하지 않으며, 이는 바이러스가 생체내에서 약독화되고 생백신으로서 사용하기에 안전함을 시사한다. 단일 용량의 키메릭 바이러스는 ZIKV 특이적 항체로의 혈청전환을 유도하고, 바이러스혈증의 부재(absence) 및 뇌 및 고환을 포함한 관련 표적 기관의 감염에 대한 증거에 대해 점수를 매길 때, 백신화 후 최대 21일 이내에 10,000-배 초과의 치사 ZIKV 챌린지로부터 완전한 보호를 부여한다. 따라서, 발생된 키메릭 YFV ZIKV 바이러스는 고도로 면역원성이고, 지카 바이러스 감염의 예방을 위한 안전하고 효율적인 약독화된 생백신으로서 사용될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Katholieke Universiteit Leuven <120> CHIMERIC YELLOW FEVER ZIKA VIRUS STRAIN <130> zl917149-IDBsv <150> GB1716307.2 <151> 2018-10-05 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10907 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yellow Fever Zika chimer <220> <221> CDS <222> (119)..(10399) <220> <221> misc_feature <222> (1097)..(1097) <223> r = a or g (leading to Thr or Ala at amino acid 327) <400> 1 agtaaatcct gtgtgctaat tgaggtgcat tggtctgcaa atcgagttgc taggcaataa 60 acacatttgg attaatttta atcgttcgtt gagcgattag cagagaactg accagaac 118 atg tct ggt cgt aaa gct cag gga aaa acc ctg ggc gtc aat atg gta 166 Met Ser Gly Arg Lys Ala Gln Gly Lys Thr Leu Gly Val Asn Met Val 1 5 10 15 cga cga gga gtt cgc tcc ttg tca aac aaa ata aaa caa aaa aca aaa 214 Arg Arg Gly Val Arg Ser Leu Ser Asn Lys Ile Lys Gln Lys Thr Lys 20 25 30 caa att gga aac aga cct gga cct tca aga ggt gtt caa gga ttt atc 262 Gln Ile Gly Asn Arg Pro Gly Pro Ser Arg Gly Val Gln Gly Phe Ile 35 40 45 ttt ttc ttt ttg ttc aac att ttg act gga aaa aag atc aca gcc cac 310 Phe Phe Phe Leu Phe Asn Ile Leu Thr Gly Lys Lys Ile Thr Ala His 50 55 60 cta aag agg ttg tgg aaa atg ctg gac cca aga caa ggc ttg gct gtt 358 Leu Lys Arg Leu Trp Lys Met Leu Asp Pro Arg Gln Gly Leu Ala Val 65 70 75 80 cta agg aaa gtc aag aga gtg gtg gcc agt ttg atg aga gga ttg tcc 406 Leu Arg Lys Val Lys Arg Val Val Ala Ser Leu Met Arg Gly Leu Ser 85 90 95 tcg agg aaa cgc cgt ggc aca gat act agt gtc gga att gtt ggc ctc 454 Ser Arg Lys Arg Arg Gly Thr Asp Thr Ser Val Gly Ile Val Gly Leu 100 105 110 ctg ctg acc aca gcc atg gca gtg gag gtc act aga cgt ggg agt gca 502 Leu Leu Thr Thr Ala Met Ala Val Glu Val Thr Arg Arg Gly Ser Ala 115 120 125 tac tat atg tac ttg gac aga agc gat gct ggg gag gcc ata tct ttt 550 Tyr Tyr Met Tyr Leu Asp Arg Ser Asp Ala Gly Glu Ala Ile Ser Phe 130 135 140 cca acc aca ctg ggg atg aac aag tgt tac ata cag atc atg gat ctt 598 Pro Thr Thr Leu Gly Met Asn Lys Cys Tyr Ile Gln Ile Met Asp Leu 145 150 155 160 gga cac atg tgt gat gcc acc atg agc tat gaa tgc cct atg ttg gat 646 Gly His Met Cys Asp Ala Thr Met Ser Tyr Glu Cys Pro Met Leu Asp 165 170 175 gag ggg gta gaa cca gat gac gtc gat tgt tgg tgc aac acg aca tca 694 Glu Gly Val Glu Pro Asp Asp Val Asp Cys Trp Cys Asn Thr Thr Ser 180 185 190 act tgg gtt gtg tac gga acc tgc cac cac aaa aaa ggt gaa gca cgg 742 Thr Trp Val Val Tyr Gly Thr Cys His His Lys Lys Gly Glu Ala Arg 195 200 205 aga tct aga aga gct gtg acg ctc ccc tcc cat tcc act agg aag ctg 790 Arg Ser Arg Arg Ala Val Thr Leu Pro Ser His Ser Thr Arg Lys Leu 210 215 220 caa acg cgg tcg cag acc tgg ttg gaa tca aga gaa tat aca aag cac 838 Gln Thr Arg Ser Gln Thr Trp Leu Glu Ser Arg Glu Tyr Thr Lys His 225 230 235 240 ctg att aga gtc gaa aat tgg ata ttc agg aac cct ggc ttc gcg tta 886 Leu Ile Arg Val Glu Asn Trp Ile Phe Arg Asn Pro Gly Phe Ala Leu 245 250 255 gca gca gct gcc atc gcc tgg ctt ttg gga agt tca acg agc caa aaa 934 Ala Ala Ala Ala Ile Ala Trp Leu Leu Gly Ser Ser Thr Ser Gln Lys 260 265 270 gtc ata tac ttg gtc atg ata ctg ctg att gcc ccg gca tac agc atc 982 Val Ile Tyr Leu Val Met Ile Leu Leu Ile Ala Pro Ala Tyr Ser Ile 275 280 285 agg tgc ata gga gtc agc aat agg gac ttt gtg gaa ggt atg tca ggt 1030 Arg Cys Ile Gly Val Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Met Ser Gly 290 295 300 ggg act tgg gtt gat gtt gtc ttg gaa cat gga ggt tgt gtt acc gta 1078 Gly Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr Val 305 310 315 320 atg gca cag gac aaa ccg rct gtc gac ata gag ctg gtt aca aca aca 1126 Met Ala Gln Asp Lys Pro Xaa Val Asp Ile Glu Leu Val Thr Thr Thr 325 330 335 gtc agc aac atg gcg gag gta aga tcc tat tgc tat gag gca tca ata 1174 Val Ser Asn Met Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu Ala Ser Ile 340 345 350 tcg gac atg gct tcg gac agc cgc tgc cca aca caa ggt gaa gcc tac 1222 Ser Asp Met Ala Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala Tyr 355 360 365 ctt gac aag cag tca gac act caa tat gtc tgc aaa aga acg tta gtg 1270 Leu Asp Lys Gln Ser Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg Thr Leu Val 370 375 380 gac aga ggc tgg gga aat gga tgt gga ctt ttt ggc aaa ggg agc ctg 1318 Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Leu 385 390 395 400 gtg aca tgc gct aag ttt gca tgc tcc aag aaa atg acc ggg aag agc 1366 Val Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Lys Lys Met Thr Gly Lys Ser 405 410 415 atc cag cca gag aat ctg gag tac cgg ata atg ctg tca gtt cat ggc 1414 Ile Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Arg Ile Met Leu Ser Val His Gly 420 425 430 tcc cag cac agt ggg atg atc gtt aat gac aca gga cat gaa act gat 1462 Ser Gln His Ser Gly Met Ile Val Asn Asp Thr Gly His Glu Thr Asp 435 440 445 gag aat aga gcg aag gtt gag ata acg ccc aat tca cca aga gct gaa 1510 Glu Asn Arg Ala Lys Val Glu Ile Thr Pro Asn Ser Pro Arg Ala Glu 450 455 460 gcc acc ctg ggg ggt ttt gga agc cta gga ctt gat tgt gaa ccg agg 1558 Ala Thr Leu Gly Gly Phe Gly Ser Leu Gly Leu Asp Cys Glu Pro Arg 465 470 475 480 aca ggc ctt gac ttt tca gat ttg tat tac ttg act atg aat aac aag 1606 Thr Gly Leu Asp Phe Ser Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Met Asn Asn Lys 485 490 495 cac tgg ttg gtt cac aag gag tgg ttc cac gac att cca tta cct tgg 1654 His Trp Leu Val His Lys Glu Trp Phe His Asp Ile Pro Leu Pro Trp 500 505 510 cat gct ggg gca gac acc gga act cca cat tgg aac aac aaa gaa gca 1702 His Ala Gly Ala Asp Thr Gly Thr Pro His Trp Asn Asn Lys Glu Ala 515 520 525 ttg gta gag ttc aag gac gca cat gcc aaa agg caa act gtc gtg gtt 1750 Leu Val Glu Phe Lys Asp Ala His Ala Lys Arg Gln Thr Val Val Val 530 535 540 cta ggg agt caa gaa gga gca gtt cac acg gcc ctt gct gga gct ctg 1798 Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Val His Thr Ala Leu Ala Gly Ala Leu 545 550 555 560 gag gct gag atg gat ggt gca aag gga agg ctg tcc tct ggc cac ttg 1846 Glu Ala Glu Met Asp Gly Ala Lys Gly Arg Leu Ser Ser Gly His Leu 565 570 575 aaa tgt cgc ctg aaa atg gat aaa ctt aga ttg aag ggc gtg tca tac 1894 Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Arg Leu Lys Gly Val Ser Tyr 580 585 590 tcc ttg tgt acc gca gcg ttc aca ttc acc aag atc ccg gct gaa aca 1942 Ser Leu Cys Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu Thr 595 600 605 ctg cac ggg aca gtc aca gtg gag gta cag tac gca ggg aca gat gga 1990 Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp Gly 610 615 620 ccc tgc aag gtt cca gct cag atg gcg gtg gac atg caa act ctg acc 2038 Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln Met Ala Val Asp Met Gln Thr Leu Thr 625 630 635 640 cca gtt ggg agg ctg ata acc gct aac cct gta atc act gaa agc act 2086 Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr Glu Ser Thr 645 650 655 gag aac tct aag atg atg ctg gaa ctt gat cca cca ttt ggg gac tct 2134 Glu Asn Ser Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe Gly Asp Ser 660 665 670 tac att gtc ata gga gtc ggg gag aag aag atc acc cat cac tgg cac 2182 Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Glu Lys Lys Ile Thr His His Trp His 675 680 685 agg agt ggc agc acc att gga aaa gca ttt gaa gcc act gtg aga ggt 2230 Arg Ser Gly Ser Thr Ile Gly Lys Ala Phe Glu Ala Thr Val Arg Gly 690 695 700 gcc aag aga atg gca gtc ttg gga gac aca gcc tgg gat ttt gga tca 2278 Ala Lys Arg Met Ala Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser 705 710 715 720 gtt gga ggt gct ctc aac tca ttg ggc aag ggc atc cat caa att ttt 2326 Val Gly Gly Ala Leu Asn Ser Leu Gly Lys Gly Ile His Gln Ile Phe 725 730 735 gga gca gct ttc aaa tta ttg ttt gga gga atg tcc tgg ttc tca caa 2374 Gly Ala Ala Phe Lys Leu Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Phe Ser Gln 740 745 750 att ctc att gga acg ttg ctg gtg tgg ttg ggt ctg aat aca aag aat 2422 Ile Leu Ile Gly Thr Leu Leu Val Trp Leu Gly Leu Asn Thr Lys Asn 755 760 765 gga tct att tcc ctt acg tgc ttg gcc tta ggg gga gtg ttg atc ttt 2470 Gly Ser Ile Ser Leu Thr Cys Leu Ala Leu Gly Gly Val Leu Ile Phe 770 775 780 tta tcc aca gcc gtc tct gcg ggc gcc gat caa gga tgc gcc atc aac 2518 Leu Ser Thr Ala Val Ser Ala Gly Ala Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn 785 790 795 800 ttt ggc aag aga gag ctc aag tgc gga gat ggt atc ttc ata ttt aga 2566 Phe Gly Lys Arg Glu Leu Lys Cys Gly Asp Gly Ile Phe Ile Phe Arg 805 810 815 gac tct gat gac tgg ctg aac aag tac tca tac tat cca gaa gat cct 2614 Asp Ser Asp Asp Trp Leu Asn Lys Tyr Ser Tyr Tyr Pro Glu Asp Pro 820 825 830 gtg aag ctt gca tca ata gtg aaa gcc tct ttt gaa gaa ggg aag tgt 2662 Val Lys Leu Ala Ser Ile Val Lys Ala Ser Phe Glu Glu Gly Lys Cys 835 840 845 ggc cta aat tca gtt gac tcc ctt gag cat gag atg tgg aga agc agg 2710 Gly Leu Asn Ser Val Asp Ser Leu Glu His Glu Met Trp Arg Ser Arg 850 855 860 gca gat gag atc aat gcc att ttt gag gaa aac gag gtg gac att tct 2758 Ala Asp Glu Ile Asn Ala Ile Phe Glu Glu Asn Glu Val Asp Ile Ser 865 870 875 880 gtt gtc gtg cag gat cca aag aat gtt tac cag aga gga act cat cca 2806 Val Val Val Gln Asp Pro Lys Asn Val Tyr Gln Arg Gly Thr His Pro 885 890 895 ttt tcc aga att cgg gat ggt ctg cag tat ggt tgg aag act tgg ggt 2854 Phe Ser Arg Ile Arg Asp Gly Leu Gln Tyr Gly Trp Lys Thr Trp Gly 900 905 910 aag aac ctt gtg ttc tcc cca ggg agg aag aat gga agc ttc atc ata 2902 Lys Asn Leu Val Phe Ser Pro Gly Arg Lys Asn Gly Ser Phe Ile Ile 915 920 925 gat gga aag tcc agg aaa gaa tgc ccg ttt tca aac cgg gtc tgg aat 2950 Asp Gly Lys Ser Arg Lys Glu Cys Pro Phe Ser Asn Arg Val Trp Asn 930 935 940 tct ttc cag ata gag gag ttt ggg acg gga gtg ttc acc aca cgc gtg 2998 Ser Phe Gln Ile Glu Glu Phe Gly Thr Gly Val Phe Thr Thr Arg Val 945 950 955 960 tac atg gac gca gtc ttt gaa tac acc ata gac tgc gat gga tct atc 3046 Tyr Met Asp Ala Val Phe Glu Tyr Thr Ile Asp Cys Asp Gly Ser Ile 965 970 975 ttg ggt gca gcg gtg aac gga aaa aag agt gcc cat ggc tct cca aca 3094 Leu Gly Ala Ala Val Asn Gly Lys Lys Ser Ala His Gly Ser Pro Thr 980 985 990 ttt tgg atg gga agt cat gaa gta aat ggg aca tgg atg atc cac acc 3142 Phe Trp Met Gly Ser His Glu Val Asn Gly Thr Trp Met Ile His Thr 995 1000 1005 ttg gag gca tta gat tac aag gag tgt gag tgg cca ctg aca cat 3187 Leu Glu Ala Leu Asp Tyr Lys Glu Cys Glu Trp Pro Leu Thr His 1010 1015 1020 acg att gga aca tca gtt gaa gag agt gaa atg ttc atg ccg aga 3232 Thr Ile Gly Thr Ser Val Glu Glu Ser Glu Met Phe Met Pro Arg 1025 1030 1035 tca atc gga ggc cca gtt agc tct cac aat cat atc cct gga tac 3277 Ser Ile Gly Gly Pro Val Ser Ser His Asn His Ile Pro Gly Tyr 1040 1045 1050 aag gtt cag acg aac gga cct tgg atg cag gta cca cta gaa gtg 3322 Lys Val Gln Thr Asn Gly Pro Trp Met Gln Val Pro Leu Glu Val 1055 1060 1065 aag aga gaa gct tgc cca ggg act agc gtg atc att gat ggc aac 3367 Lys Arg Glu Ala Cys Pro Gly Thr Ser Val Ile Ile Asp Gly Asn 1070 1075 1080 tgt gat gga cgg gga aaa tca acc aga tcc acc acg gat agc ggg 3412 Cys Asp Gly Arg Gly Lys Ser Thr Arg Ser Thr Thr Asp Ser Gly 1085 1090 1095 aaa gtt att cct gaa tgg tgt tgc cgc tcc tgc aca atg ccg cct 3457 Lys Val Ile Pro Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Met Pro Pro 1100 1105 1110 gtg agc ttc cat ggt agt gat ggg tgt tgg tat ccc atg gaa att 3502 Val Ser Phe His Gly Ser Asp Gly Cys Trp Tyr Pro Met Glu Ile 1115 1120 1125 agg cca agg aaa acg cat gaa agc cat ctg gtg cgc tcc tgg gtt 3547 Arg Pro Arg Lys Thr His Glu Ser His Leu Val Arg Ser Trp Val 1130 1135 1140 aca gct gga gaa ata cat gct gtc cct ttt ggt ttg gtg agc atg 3592 Thr Ala Gly Glu Ile His Ala Val Pro Phe Gly Leu Val Ser Met 1145 1150 1155 atg ata gca atg gaa gtg gtc cta agg aaa aga cag gga cca aag 3637 Met Ile Ala Met Glu Val Val Leu Arg Lys Arg Gln Gly Pro Lys 1160 1165 1170 caa atg ttg gtt gga gga gta gtg ctc ttg gga gca atg ctg gtc 3682 Gln Met Leu Val Gly Gly Val Val Leu Leu Gly Ala Met Leu Val 1175 1180 1185 ggg caa gta act ctc ctt gat ttg ctg aaa ctc aca gtg gct gtg 3727 Gly Gln Val Thr Leu Leu Asp Leu Leu Lys Leu Thr Val Ala Val 1190 1195 1200 gga ttg cat ttc cat gag atg aac aat gga gga gac gcc atg tat 3772 Gly Leu His Phe His Glu Met Asn Asn Gly Gly Asp Ala Met Tyr 1205 1210 1215 atg gcg ttg att gct gcc ttt tca atc aga cca ggg ctg ctc atc 3817 Met Ala Leu Ile Ala Ala Phe Ser Ile Arg Pro Gly Leu Leu Ile 1220 1225 1230 ggc ttt ggg ctc agg acc cta tgg agc cct cgg gaa cgc ctt gtg 3862 Gly Phe Gly Leu Arg Thr Leu Trp Ser Pro Arg Glu Arg Leu Val 1235 1240 1245 ctg acc cta gga gca gcc atg gtg gag att gcc ttg ggt ggc gtg 3907 Leu Thr Leu Gly Ala Ala Met Val Glu Ile Ala Leu Gly Gly Val 1250 1255 1260 atg ggc ggc ctg tgg aag tat cta aat gca gtt tct ctc tgc atc 3952 Met Gly Gly Leu Trp Lys Tyr Leu Asn Ala Val Ser Leu Cys Ile 1265 1270 1275 ctg aca ata aat gct gtt gct tct agg aaa gca tca aat acc atc 3997 Leu Thr Ile Asn Ala Val Ala Ser Arg Lys Ala Ser Asn Thr Ile 1280 1285 1290 ttg ccc ctc atg gct ctg ttg aca ccg gtc acc atg gct gag gtg 4042 Leu Pro Leu Met Ala Leu Leu Thr Pro Val Thr Met Ala Glu Val 1295 1300 1305 aga ctt gcc gca atg ttc ttt tgt gcc atg gtt atc ata ggg gtc 4087 Arg Leu Ala Ala Met Phe Phe Cys Ala Met Val Ile Ile Gly Val 1310 1315 1320 ctt cac cag aat ttc aag gac acc tcc atg cag aag act ata cct 4132 Leu His Gln Asn Phe Lys Asp Thr Ser Met Gln Lys Thr Ile Pro 1325 1330 1335 ctg gtg gcc ctc aca ctc aca tct tac ctg ggc ttg aca caa cct 4177 Leu Val Ala Leu Thr Leu Thr Ser Tyr Leu Gly Leu Thr Gln Pro 1340 1345 1350 ttt ttg ggc ctg tgt gca ttt ctg gca acc cgc ata ttt ggg cga 4222 Phe Leu Gly Leu Cys Ala Phe Leu Ala Thr Arg Ile Phe Gly Arg 1355 1360 1365 agg agt atc cca gtg aat gag gca ctc gca gca gct ggt cta gtg 4267 Arg Ser Ile Pro Val Asn Glu Ala Leu Ala Ala Ala Gly Leu Val 1370 1375 1380 gga gtg ctg gca gga ctg gct ttt cag gag atg gag aac ttc ctt 4312 Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Phe Gln Glu Met Glu Asn Phe Leu 1385 1390 1395 ggt ccg att gca gtt gga gga ctc ctg atg atg ctg gtt agc gtg 4357 Gly Pro Ile Ala Val Gly Gly Leu Leu Met Met Leu Val Ser Val 1400 1405 1410 gct ggg agg gtg gat ggg cta gag ctc aag aag ctt ggt gaa gtt 4402 Ala Gly Arg Val Asp Gly Leu Glu Leu Lys Lys Leu Gly Glu Val 1415 1420 1425 tca tgg gaa gag gag gcg gag atc agc ggg agt tcc gcc cgc tat 4447 Ser Trp Glu Glu Glu Ala Glu Ile Ser Gly Ser Ser Ala Arg Tyr 1430 1435 1440 gat gtg gca ctc agt gaa caa ggg gag ttc aag ctg ctt tct gaa 4492 Asp Val Ala Leu Ser Glu Gln Gly Glu Phe Lys Leu Leu Ser Glu 1445 1450 1455 gag aaa gtg cca tgg gac cag gtt gtg atg acc tcg ctg gcc ttg 4537 Glu Lys Val Pro Trp Asp Gln Val Val Met Thr Ser Leu Ala Leu 1460 1465 1470 gtt ggg gct gcc ctc cat cca ttt gct ctt ctg ctg gtc ctt gct 4582 Val Gly Ala Ala Leu His Pro Phe Ala Leu Leu Leu Val Leu Ala 1475 1480 1485 ggg tgg ctg ttt cat gtc agg gga gct agg aga agt ggg gat gtc 4627 Gly Trp Leu Phe His Val Arg Gly Ala Arg Arg Ser Gly Asp Val 1490 1495 1500 ttg tgg gat att ccc act cct aag atc atc gag gaa tgt gaa cat 4672 Leu Trp Asp Ile Pro Thr Pro Lys Ile Ile Glu Glu Cys Glu His 1505 1510 1515 ctg gag gat ggg att tat ggc ata ttc cag tca acc ttc ttg ggg 4717 Leu Glu Asp Gly Ile Tyr Gly Ile Phe Gln Ser Thr Phe Leu Gly 1520 1525 1530 gcc tcc cag cga gga gtg gga gtg gca cag gga ggg gtg ttc cac 4762 Ala Ser Gln Arg Gly Val Gly Val Ala Gln Gly Gly Val Phe His 1535 1540 1545 aca atg tgg cat gtc aca aga gga gct ttc ctt gtc agg aat ggc 4807 Thr Met Trp His Val Thr Arg Gly Ala Phe Leu Val Arg Asn Gly 1550 1555 1560 aag aag ttg att cca tct tgg gct tca gta aag gaa gac ctt gtc 4852 Lys Lys Leu Ile Pro Ser Trp Ala Ser Val Lys Glu Asp Leu Val 1565 1570 1575 gcc tat ggt ggc tca tgg aag ttg gaa ggc aga tgg gat gga gag 4897 Ala Tyr Gly Gly Ser Trp Lys Leu Glu Gly Arg Trp Asp Gly Glu 1580 1585 1590 gaa gag gtc cag ttg atc gcg gct gtt cca gga aag aac gtg gtc 4942 Glu Glu Val Gln Leu Ile Ala Ala Val Pro Gly Lys Asn Val Val 1595 1600 1605 aac gtc cag aca aaa ccg agc ttg ttc aaa gtg agg aat ggg gga 4987 Asn Val Gln Thr Lys Pro Ser Leu Phe Lys Val Arg Asn Gly Gly 1610 1615 1620 gaa atc ggg gct gtc gct ctt gac tat ccg agt ggc act tca gga 5032 Glu Ile Gly Ala Val Ala Leu Asp Tyr Pro Ser Gly Thr Ser Gly 1625 1630 1635 tct cct att gtt aac agg aac gga gag gtg att ggg ctg tac ggc 5077 Ser Pro Ile Val Asn Arg Asn Gly Glu Val Ile Gly Leu Tyr Gly 1640 1645 1650 aat ggc atc ctt gtc ggt gac aac tcc ttc gtg tcc gcc ata tcc 5122 Asn Gly Ile Leu Val Gly Asp Asn Ser Phe Val Ser Ala Ile Ser 1655 1660 1665 cag act gag gtg aag gaa gaa gga aag gag gag ctc caa gag atc 5167 Gln Thr Glu Val Lys Glu Glu Gly Lys Glu Glu Leu Gln Glu Ile 1670 1675 1680 ccg aca atg cta aag aaa gga atg aca act gtc ctt gat ttt cat 5212 Pro Thr Met Leu Lys Lys Gly Met Thr Thr Val Leu Asp Phe His 1685 1690 1695 cct gga gct ggg aag aca aga cgt ttc ctc cca cag atc ttg gcc 5257 Pro Gly Ala Gly Lys Thr Arg Arg Phe Leu Pro Gln Ile Leu Ala 1700 1705 1710 gag tgc gca cgg aga cgc ttg cgc act ctt gtg ttg gcc ccc acc 5302 Glu Cys Ala Arg Arg Arg Leu Arg Thr Leu Val Leu Ala Pro Thr 1715 1720 1725 agg gtt gtt ctt tct gaa atg aag gag gct ttt cac ggc ctg gac 5347 Arg Val Val Leu Ser Glu Met Lys Glu Ala Phe His Gly Leu Asp 1730 1735 1740 gtg aaa ttc cac aca cag gct ttt tcc gct cac ggc agc ggg aga 5392 Val Lys Phe His Thr Gln Ala Phe Ser Ala His Gly Ser Gly Arg 1745 1750 1755 gaa gtc att gat gcc atg tgc cat gcc acc cta act tac agg atg 5437 Glu Val Ile Asp Ala Met Cys His Ala Thr Leu Thr Tyr Arg Met 1760 1765 1770 ttg gaa cca act agg gtt gtt aac tgg gaa gtg atc att atg gat 5482 Leu Glu Pro Thr Arg Val Val Asn Trp Glu Val Ile Ile Met Asp 1775 1780 1785 gaa gcc cat ttt ttg gat cca gct agc ata gcc gct aga ggt tgg 5527 Glu Ala His Phe Leu Asp Pro Ala Ser Ile Ala Ala Arg Gly Trp 1790 1795 1800 gca gcg cac aga gct agg gca aat gaa agt gca aca atc ttg atg 5572 Ala Ala His Arg Ala Arg Ala Asn Glu Ser Ala Thr Ile Leu Met 1805 1810 1815 aca gcc aca ccg cct ggg act agt gat gaa ttt cca cat tca aat 5617 Thr Ala Thr Pro Pro Gly Thr Ser Asp Glu Phe Pro His Ser Asn 1820 1825 1830 ggt gaa ata gaa gat gtt caa acg gac ata ccc agt gag ccc tgg 5662 Gly Glu Ile Glu Asp Val Gln Thr Asp Ile Pro Ser Glu Pro Trp 1835 1840 1845 aac aca ggg cat gac tgg atc ctg gct gac aaa agg ccc acg gca 5707 Asn Thr Gly His Asp Trp Ile Leu Ala Asp Lys Arg Pro Thr Ala 1850 1855 1860 tgg ttc ctt cca tcc atc aga gct gca aat gtc atg gct gcc tct 5752 Trp Phe Leu Pro Ser Ile Arg Ala Ala Asn Val Met Ala Ala Ser 1865 1870 1875 ttg cgt aag gct gga aag agt gtg gtg gtc ctg aac agg aaa acc 5797 Leu Arg Lys Ala Gly Lys Ser Val Val Val Leu Asn Arg Lys Thr 1880 1885 1890 ttt gag aga gaa tac ccc acg ata aag cag aag aaa cct gac ttt 5842 Phe Glu Arg Glu Tyr Pro Thr Ile Lys Gln Lys Lys Pro Asp Phe 1895 1900 1905 ata ttg gcc act gac ata gct gaa atg gga gcc aac ctt tgc gtg 5887 Ile Leu Ala Thr Asp Ile Ala Glu Met Gly Ala Asn Leu Cys Val 1910 1915 1920 gag cga gtg ctg gat tgc agg acg gct ttt aag cct gtg ctt gtg 5932 Glu Arg Val Leu Asp Cys Arg Thr Ala Phe Lys Pro Val Leu Val 1925 1930 1935 gat gaa ggg agg aag gtg gca ata aaa ggg cca ctt cgt atc tcc 5977 Asp Glu Gly Arg Lys Val Ala Ile Lys Gly Pro Leu Arg Ile Ser 1940 1945 1950 gca tcc tct gct gct caa agg agg ggg cgc att ggg aga aat ccc 6022 Ala Ser Ser Ala Ala Gln Arg Arg Gly Arg Ile Gly Arg Asn Pro 1955 1960 1965 aac aga gat gga gac tca tac tac tat tct gag cct aca agt gaa 6067 Asn Arg Asp Gly Asp Ser Tyr Tyr Tyr Ser Glu Pro Thr Ser Glu 1970 1975 1980 aat aat gcc cac cac gtc tgc tgg ttg gag gcc tca atg ctc ttg 6112 Asn Asn Ala His His Val Cys Trp Leu Glu Ala Ser Met Leu Leu 1985 1990 1995 gac aac atg gag gtg agg ggt gga atg gtc gcc cca ctc tat ggc 6157 Asp Asn Met Glu Val Arg Gly Gly Met Val Ala Pro Leu Tyr Gly 2000 2005 2010 gtt gaa gga act aaa aca cca gtt tcc cct ggt gaa atg aga ctg 6202 Val Glu Gly Thr Lys Thr Pro Val Ser Pro Gly Glu Met Arg Leu 2015 2020 2025 agg gat gac cag agg aaa gtc ttc aga gaa cta gtg agg aat tgt 6247 Arg Asp Asp Gln Arg Lys Val Phe Arg Glu Leu Val Arg Asn Cys 2030 2035 2040 gac ctg ccc gtt tgg ctt tcg tgg caa gtg gcc aag gct ggt ttg 6292 Asp Leu Pro Val Trp Leu Ser Trp Gln Val Ala Lys Ala Gly Leu 2045 2050 2055 aag acg aat gat cgt aag tgg tgt ttt gaa ggc cct gag gaa cat 6337 Lys Thr Asn Asp Arg Lys Trp Cys Phe Glu Gly Pro Glu Glu His 2060 2065 2070 gag atc ttg aat gac agc ggt gaa aca gtg aag tgc agg gct cct 6382 Glu Ile Leu Asn Asp Ser Gly Glu Thr Val Lys Cys Arg Ala Pro 2075 2080 2085 gga gga gca aag aag cct ctg cgc cca agg tgg tgt gat gaa agg 6427 Gly Gly Ala Lys Lys Pro Leu Arg Pro Arg Trp Cys Asp Glu Arg 2090 2095 2100 gtg tca tct gac cag agt gcg ctg tct gaa ttt att aag ttt gct 6472 Val Ser Ser Asp Gln Ser Ala Leu Ser Glu Phe Ile Lys Phe Ala 2105 2110 2115 gaa ggt agg agg gga gct gct gaa gtg cta gtt gtg ctg agt gaa 6517 Glu Gly Arg Arg Gly Ala Ala Glu Val Leu Val Val Leu Ser Glu 2120 2125 2130 ctc cct gat ttc ctg gct aaa aaa ggt gga gag gca atg gat acc 6562 Leu Pro Asp Phe Leu Ala Lys Lys Gly Gly Glu Ala Met Asp Thr 2135 2140 2145 atc agt gtg ttc ctc cac tct gag gaa ggc tct agg gct tac cgc 6607 Ile Ser Val Phe Leu His Ser Glu Glu Gly Ser Arg Ala Tyr Arg 2150 2155 2160 aat gca cta tca atg atg cct gag gca atg aca ata gtc atg ctg 6652 Asn Ala Leu Ser Met Met Pro Glu Ala Met Thr Ile Val Met Leu 2165 2170 2175 ttt ata ctg gct gga cta ctg aca tcg gga atg gtc atc ttt ttc 6697 Phe Ile Leu Ala Gly Leu Leu Thr Ser Gly Met Val Ile Phe Phe 2180 2185 2190 atg tct ccc aaa ggc atc agt aga atg tct atg gcg atg ggc aca 6742 Met Ser Pro Lys Gly Ile Ser Arg Met Ser Met Ala Met Gly Thr 2195 2200 2205 atg gcc ggc tgt gga tat ctc atg ttc ctt gga ggc gtc aaa ccc 6787 Met Ala Gly Cys Gly Tyr Leu Met Phe Leu Gly Gly Val Lys Pro 2210 2215 2220 act cac atc tcc tat gtc atg ctc ata ttc ttt gtc ctg atg gtg 6832 Thr His Ile Ser Tyr Val Met Leu Ile Phe Phe Val Leu Met Val 2225 2230 2235 gtt gtg atc ccc gag cca ggg caa caa agg tcc atc caa gac aac 6877 Val Val Ile Pro Glu Pro Gly Gln Gln Arg Ser Ile Gln Asp Asn 2240 2245 2250 caa gtg gca tac ctc att att ggc atc ctg acg ctg gtt tca gcg 6922 Gln Val Ala Tyr Leu Ile Ile Gly Ile Leu Thr Leu Val Ser Ala 2255 2260 2265 gtg gca gcc aac gag cta ggc atg ctg gag aaa acc aaa gag gac 6967 Val Ala Ala Asn Glu Leu Gly Met Leu Glu Lys Thr Lys Glu Asp 2270 2275 2280 ctc ttt ggg aag aag aac tta att cca tct agt gct tca ccc tgg 7012 Leu Phe Gly Lys Lys Asn Leu Ile Pro Ser Ser Ala Ser Pro Trp 2285 2290 2295 agt tgg ccg gat ctt gac ctg aag cca gga gct gcc tgg aca gtg 7057 Ser Trp Pro Asp Leu Asp Leu Lys Pro Gly Ala Ala Trp Thr Val 2300 2305 2310 tac gtt ggc att gtt aca atg ctc tct cca atg ttg cac cac tgg 7102 Tyr Val Gly Ile Val Thr Met Leu Ser Pro Met Leu His His Trp 2315 2320 2325 atc aaa gtc gaa tat ggc aac ctg tct ctg tct gga ata gcc cag 7147 Ile Lys Val Glu Tyr Gly Asn Leu Ser Leu Ser Gly Ile Ala Gln 2330 2335 2340 tca gcc tca gtc ctt tct ttc atg gac aag ggg ata cca ttc atg 7192 Ser Ala Ser Val Leu Ser Phe Met Asp Lys Gly Ile Pro Phe Met 2345 2350 2355 aag atg aat atc tcg gtc ata atg ctg ctg gtc agt ggc tgg aat 7237 Lys Met Asn Ile Ser Val Ile Met Leu Leu Val Ser Gly Trp Asn 2360 2365 2370 tca ata aca gtg atg cct ctg ctc tgt ggc ata ggg tgc gcc atg 7282 Ser Ile Thr Val Met Pro Leu Leu Cys Gly Ile Gly Cys Ala Met 2375 2380 2385 ctc cac tgg tct ctc att tta cct gga atc aaa gcg cag cag tca 7327 Leu His Trp Ser Leu Ile Leu Pro Gly Ile Lys Ala Gln Gln Ser 2390 2395 2400 aag cta gca cag aga agg gtg ttc cat ggc gtt gcc aag aac cct 7372 Lys Leu Ala Gln Arg Arg Val Phe His Gly Val Ala Lys Asn Pro 2405 2410 2415 gtg gtt gat ggg aat cca aca gtt gac att gag gaa gct cct gaa 7417 Val Val Asp Gly Asn Pro Thr Val Asp Ile Glu Glu Ala Pro Glu 2420 2425 2430 atg cct gcc ctt tat gag aag aaa ctg gct cta tat ctc ctt ctt 7462 Met Pro Ala Leu Tyr Glu Lys Lys Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Leu 2435 2440 2445 gct ctc agc cta gct tct gtt gcc atg tgc aga acg ccc ttt tca 7507 Ala Leu Ser Leu Ala Ser Val Ala Met Cys Arg Thr Pro Phe Ser 2450 2455 2460 ttg gct gaa ggc att gtc cta gca tca gct gcc tta ggg ccg ctc 7552 Leu Ala Glu Gly Ile Val Leu Ala Ser Ala Ala Leu Gly Pro Leu 2465 2470 2475 ata gag gga aac acc agc ctt ctt tgg aat gga ccc atg gct gtc 7597 Ile Glu Gly Asn Thr Ser Leu Leu Trp Asn Gly Pro Met Ala Val 2480 2485 2490 tcc atg aca gga gtc atg agg ggg aat cac tat gct ttt gtg gga 7642 Ser Met Thr Gly Val Met Arg Gly Asn His Tyr Ala Phe Val Gly 2495 2500 2505 gtc atg tac aat cta tgg aag atg aaa act gga cgc cgg ggg agc 7687 Val Met Tyr Asn Leu Trp Lys Met Lys Thr Gly Arg Arg Gly Ser 2510 2515 2520 gcg aat gga aaa act ttg ggt gaa gtc tgg aag agg gaa ctg aat 7732 Ala Asn Gly Lys Thr Leu Gly Glu Val Trp Lys Arg Glu Leu Asn 2525 2530 2535 ctg ttg gac aag cga cag ttt gag ttg tat aaa agg acc gac att 7777 Leu Leu Asp Lys Arg Gln Phe Glu Leu Tyr Lys Arg Thr Asp Ile 2540 2545 2550 gtg gag gtg gat cgt gat acg gca cgc agg cat ttg gcc gaa ggg 7822 Val Glu Val Asp Arg Asp Thr Ala Arg Arg His Leu Ala Glu Gly 2555 2560 2565 aag gtg gac acc ggg gtg gcg gtc tcc agg ggg acc gca aag tta 7867 Lys Val Asp Thr Gly Val Ala Val Ser Arg Gly Thr Ala Lys Leu 2570 2575 2580 agg tgg ttc cat gag cgt ggc tat gtc aag ctg gaa ggt agg gtg 7912 Arg Trp Phe His Glu Arg Gly Tyr Val Lys Leu Glu Gly Arg Val 2585 2590 2595 att gac ctg ggg tgt ggc cgc gga ggc tgg tgt tac tac gct gct 7957 Ile Asp Leu Gly Cys Gly Arg Gly Gly Trp Cys Tyr Tyr Ala Ala 2600 2605 2610 gcg caa aag gaa gtg agt ggg gtc aaa gga ttt act ctt gga aga 8002 Ala Gln Lys Glu Val Ser Gly Val Lys Gly Phe Thr Leu Gly Arg 2615 2620 2625 gac ggc cat gag aaa ccc atg aat gtg caa agt ctg gga tgg aac 8047 Asp Gly His Glu Lys Pro Met Asn Val Gln Ser Leu Gly Trp Asn 2630 2635 2640 atc atc acc ttc aag gac aaa act gat atc cac cgc cta gaa cca 8092 Ile Ile Thr Phe Lys Asp Lys Thr Asp Ile His Arg Leu Glu Pro 2645 2650 2655 gtg aaa tgt gac acc ctt ttg tgt gac att gga gag tca tca tcg 8137 Val Lys Cys Asp Thr Leu Leu Cys Asp Ile Gly Glu Ser Ser Ser 2660 2665 2670 tca tcg gtc aca gag ggg gaa agg acc gtg aga gtt ctt gat act 8182 Ser Ser Val Thr Glu Gly Glu Arg Thr Val Arg Val Leu Asp Thr 2675 2680 2685 gta gaa aaa tgg ctg gct tgt ggg gtt gac aac ttc tgt gtg aag 8227 Val Glu Lys Trp Leu Ala Cys Gly Val Asp Asn Phe Cys Val Lys 2690 2695 2700 gtg tta gct cca tac atg cca gat gtt ctt gag aaa ctg gaa ttg 8272 Val Leu Ala Pro Tyr Met Pro Asp Val Leu Glu Lys Leu Glu Leu 2705 2710 2715 ctc caa agg agg ttt ggc gga aca gtg atc agg aac cct ctc tcc 8317 Leu Gln Arg Arg Phe Gly Gly Thr Val Ile Arg Asn Pro Leu Ser 2720 2725 2730 agg aat tcc act cat gaa atg tac tac gtg tct gga gcc cgc agc 8362 Arg Asn Ser Thr His Glu Met Tyr Tyr Val Ser Gly Ala Arg Ser 2735 2740 2745 aat gtc aca ttt act gtg aac caa aca tcc cgc ctc ctg atg agg 8407 Asn Val Thr Phe Thr Val Asn Gln Thr Ser Arg Leu Leu Met Arg 2750 2755 2760 aga atg agg cgt cca act gga aaa gtg acc ctg gag gct gac gtc 8452 Arg Met Arg Arg Pro Thr Gly Lys Val Thr Leu Glu Ala Asp Val 2765 2770 2775 atc ctc cca att ggg aca cgc agt gtt gag aca gac aag gga ccc 8497 Ile Leu Pro Ile Gly Thr Arg Ser Val Glu Thr Asp Lys Gly Pro 2780 2785 2790 ctg gac aaa gag gcc ata gaa gaa agg gtt gag agg ata aaa tct 8542 Leu Asp Lys Glu Ala Ile Glu Glu Arg Val Glu Arg Ile Lys Ser 2795 2800 2805 gag tac atg acc tct tgg ttt tat gac aat gac aac ccc tac agg 8587 Glu Tyr Met Thr Ser Trp Phe Tyr Asp Asn Asp Asn Pro Tyr Arg 2810 2815 2820 acc tgg cac tac tgt ggc tcg tac gtc aca aaa acc tca gga agt 8632 Thr Trp His Tyr Cys Gly Ser Tyr Val Thr Lys Thr Ser Gly Ser 2825 2830 2835 gcg gcg agc atg gta aat ggt gtt att aaa att ctg aca tat cca 8677 Ala Ala Ser Met Val Asn Gly Val Ile Lys Ile Leu Thr Tyr Pro 2840 2845 2850 tgg gac agg ata gag gag gtc aca aga atg gca atg act gac aca 8722 Trp Asp Arg Ile Glu Glu Val Thr Arg Met Ala Met Thr Asp Thr 2855 2860 2865 acc cct ttt gga cag caa aga gtg ttt aaa gaa aaa gtt gac acc 8767 Thr Pro Phe Gly Gln Gln Arg Val Phe Lys Glu Lys Val Asp Thr 2870 2875 2880 aga gca aag gat cca cca gcg gga act agg aag atc atg aaa gtt 8812 Arg Ala Lys Asp Pro Pro Ala Gly Thr Arg Lys Ile Met Lys Val 2885 2890 2895 gtc aac agg tgg ctg ttc cgc cac ctg gcc aga gaa aag aac ccc 8857 Val Asn Arg Trp Leu Phe Arg His Leu Ala Arg Glu Lys Asn Pro 2900 2905 2910 aga ctg tgc aca aag gaa gaa ttt att gca aaa gtc cga agt cat 8902 Arg Leu Cys Thr Lys Glu Glu Phe Ile Ala Lys Val Arg Ser His 2915 2920 2925 gca gcc att gga gct tac ctg gaa gaa caa gaa cag tgg aag act 8947 Ala Ala Ile Gly Ala Tyr Leu Glu Glu Gln Glu Gln Trp Lys Thr 2930 2935 2940 gcc aat gag gct gtc caa gac cca aag ttc tgg gaa ctg gtg gat 8992 Ala Asn Glu Ala Val Gln Asp Pro Lys Phe Trp Glu Leu Val Asp 2945 2950 2955 gaa gaa agg aag ctg cac caa caa ggc agg tgt cgg act tgt gtg 9037 Glu Glu Arg Lys Leu His Gln Gln Gly Arg Cys Arg Thr Cys Val 2960 2965 2970 tac aac atg atg ggg aaa aga gag aag aag ctg tca gag ttt ggg 9082 Tyr Asn Met Met Gly Lys Arg Glu Lys Lys Leu Ser Glu Phe Gly 2975 2980 2985 aaa gca aag gga agc cgt gcc ata tgg tat atg tgg ctg gga gcg 9127 Lys Ala Lys Gly Ser Arg Ala Ile Trp Tyr Met Trp Leu Gly Ala 2990 2995 3000 cgg tat ctt gag ttt gag gcc ctg gga ttc ctg aat gag gac cat 9172 Arg Tyr Leu Glu Phe Glu Ala Leu Gly Phe Leu Asn Glu Asp His 3005 3010 3015 tgg gct tcc agg gaa aac tca gga gga gga gtg gaa ggc att ggc 9217 Trp Ala Ser Arg Glu Asn Ser Gly Gly Gly Val Glu Gly Ile Gly 3020 3025 3030 tta caa tac cta gga tat gtg atc aga gac ctg gct gca atg gat 9262 Leu Gln Tyr Leu Gly Tyr Val Ile Arg Asp Leu Ala Ala Met Asp 3035 3040 3045 ggt ggt gga ttc tac gcg gat gac acc gct gga tgg gac acg cgc 9307 Gly Gly Gly Phe Tyr Ala Asp Asp Thr Ala Gly Trp Asp Thr Arg 3050 3055 3060 atc aca gag gca gac ctt gat gat gaa cag gag atc ttg aac tac 9352 Ile Thr Glu Ala Asp Leu Asp Asp Glu Gln Glu Ile Leu Asn Tyr 3065 3070 3075 atg agc cca cat cac aaa aaa ctg gca caa gca gtg atg gaa atg 9397 Met Ser Pro His His Lys Lys Leu Ala Gln Ala Val Met Glu Met 3080 3085 3090 aca tac aag aac aaa gtg gtg aaa gtg ttg aga cca gcc cca gga 9442 Thr Tyr Lys Asn Lys Val Val Lys Val Leu Arg Pro Ala Pro Gly 3095 3100 3105 ggg aaa gcc tac atg gat gtc ata agt cga cga gac cag aga gga 9487 Gly Lys Ala Tyr Met Asp Val Ile Ser Arg Arg Asp Gln Arg Gly 3110 3115 3120 tcc ggg cag gta gtg act tat gct ctg aac acc atc acc aac ttg 9532 Ser Gly Gln Val Val Thr Tyr Ala Leu Asn Thr Ile Thr Asn Leu 3125 3130 3135 aaa gtc caa ttg atc aga atg gca gaa gca gag atg gtg ata cat 9577 Lys Val Gln Leu Ile Arg Met Ala Glu Ala Glu Met Val Ile His 3140 3145 3150 cac caa cat gtt caa gat tgt gat gaa tca gtt ctg acc agg ctg 9622 His Gln His Val Gln Asp Cys Asp Glu Ser Val Leu Thr Arg Leu 3155 3160 3165 gag gca tgg ctc act gag cac gga tgt gac aga ctg aag agg atg 9667 Glu Ala Trp Leu Thr Glu His Gly Cys Asp Arg Leu Lys Arg Met 3170 3175 3180 gcg gtg agt gga gac gac tgt gtg gtc cgg ccc atc gat gac agg 9712 Ala Val Ser Gly Asp Asp Cys Val Val Arg Pro Ile Asp Asp Arg 3185 3190 3195 ttc ggc ctg gcc ctg tcc cat ctc aac gcc atg tcc aag gtt aga 9757 Phe Gly Leu Ala Leu Ser His Leu Asn Ala Met Ser Lys Val Arg 3200 3205 3210 aag gac ata tct gaa tgg cag cca tca aaa ggg tgg aat gat tgg 9802 Lys Asp Ile Ser Glu Trp Gln Pro Ser Lys Gly Trp Asn Asp Trp 3215 3220 3225 gag aat gtg ccc ttc tgt tcc cac cac ttc cat gaa cta cag ctg 9847 Glu Asn Val Pro Phe Cys Ser His His Phe His Glu Leu Gln Leu 3230 3235 3240 aag gat ggc agg agg att gtg gtg cct tgc cga gaa cag gac gag 9892 Lys Asp Gly Arg Arg Ile Val Val Pro Cys Arg Glu Gln Asp Glu 3245 3250 3255 ctc att ggg aga gga agg gtg tct cca gga aac ggc tgg atg atc 9937 Leu Ile Gly Arg Gly Arg Val Ser Pro Gly Asn Gly Trp Met Ile 3260 3265 3270 aag gaa aca gct tgc ctc agc aaa gcc tat gcc aac atg tgg tca 9982 Lys Glu Thr Ala Cys Leu Ser Lys Ala Tyr Ala Asn Met Trp Ser 3275 3280 3285 ctg atg tat ttt cac aaa agg gac atg agg cta ctg tca ttg gct 10027 Leu Met Tyr Phe His Lys Arg Asp Met Arg Leu Leu Ser Leu Ala 3290 3295 3300 gtt tcc tca gct gtt ccc acc tca tgg gtt cca caa gga cgc aca 10072 Val Ser Ser Ala Val Pro Thr Ser Trp Val Pro Gln Gly Arg Thr 3305 3310 3315 aca tgg tcg att cat ggg aaa ggg gag tgg atg acc acg gaa gac 10117 Thr Trp Ser Ile His Gly Lys Gly Glu Trp Met Thr Thr Glu Asp 3320 3325 3330 atg ctt gag gtg tgg aac aga gta tgg ata acc aac aac cca cac 10162 Met Leu Glu Val Trp Asn Arg Val Trp Ile Thr Asn Asn Pro His 3335 3340 3345 atg cag gac aag aca atg gtg aaa aaa tgg aga gat gtc cct tat 10207 Met Gln Asp Lys Thr Met Val Lys Lys Trp Arg Asp Val Pro Tyr 3350 3355 3360 cta acc aag aga caa gac aag ctg tgc gga tca ctg att gga atg 10252 Leu Thr Lys Arg Gln Asp Lys Leu Cys Gly Ser Leu Ile Gly Met 3365 3370 3375 acc aat agg gcc acc tgg gcc tcc cac atc cat tta gtc atc cat 10297 Thr Asn Arg Ala Thr Trp Ala Ser His Ile His Leu Val Ile His 3380 3385 3390 cgt atc cga acg ctg att gga cag gag aaa tac act gac tac cta 10342 Arg Ile Arg Thr Leu Ile Gly Gln Glu Lys Tyr Thr Asp Tyr Leu 3395 3400 3405 aca gtc atg gac agg tat tct gtg gat gct gac ctg caa ctg ggt 10387 Thr Val Met Asp Arg Tyr Ser Val Asp Ala Asp Leu Gln Leu Gly 3410 3415 3420 gag ctt atc tga aacaccatct aacaggaata accgggatac aaaccacggg 10439 Glu Leu Ile 3425 tggagaaccg gactccccac aacctgaaac cgggatataa accacggctg gagaaccgga 10499 ctccgcactt aaaatgaaac agaaaccggg ataaaaacta cggatggaga accggactcc 10559 acacattgag acagaagaag ttgtcagccc agaaccccac acgagttttg ccactgctaa 10619 gctgtgaggc agtgcaggct gggacagccg acctccaggt tgcgaaaaac ctggtttctg 10679 ggacctccca ccccagagta aaaagaacgg agcctccgct accaccctcc cacgtggtgg 10739 tagaaagacg gggtctagag gttagaggag accctccagg gaacaaatag tgggaccata 10799 ttgacgccag ggaaagaccg gagtggttct ctgcttttcc tccagaggtc tgtgagcaca 10859 gtttgctcaa gaataagcag acctttggat gacaaacaca aaaccact 10907 <210> 2 <211> 3426 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (327)..(327) <223> The 'Xaa' at location 327 stands for Ala, or Thr. <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Met Ser Gly Arg Lys Ala Gln Gly Lys Thr Leu Gly Val Asn Met Val 1 5 10 15 Arg Arg Gly Val Arg Ser Leu Ser Asn Lys Ile Lys Gln Lys Thr Lys 20 25 30 Gln Ile Gly Asn Arg Pro Gly Pro Ser Arg Gly Val Gln Gly Phe Ile 35 40 45 Phe Phe Phe Leu Phe Asn Ile Leu Thr Gly Lys Lys Ile Thr Ala His 50 55 60 Leu Lys Arg Leu Trp Lys Met Leu Asp Pro Arg Gln Gly Leu Ala Val 65 70 75 80 Leu Arg Lys Val Lys Arg Val Val Ala Ser Leu Met Arg Gly Leu Ser 85 90 95 Ser Arg Lys Arg Arg Gly Thr Asp Thr Ser Val Gly Ile Val Gly Leu 100 105 110 Leu Leu Thr Thr Ala Met Ala Val Glu Val Thr Arg Arg Gly Ser Ala 115 120 125 Tyr Tyr Met Tyr Leu Asp Arg Ser Asp Ala Gly Glu Ala Ile Ser Phe 130 135 140 Pro Thr Thr Leu Gly Met Asn Lys Cys Tyr Ile Gln Ile Met Asp Leu 145 150 155 160 Gly His Met Cys Asp Ala Thr Met Ser Tyr Glu Cys Pro Met Leu Asp 165 170 175 Glu Gly Val Glu Pro Asp Asp Val Asp Cys Trp Cys Asn Thr Thr Ser 180 185 190 Thr Trp Val Val Tyr Gly Thr Cys His His Lys Lys Gly Glu Ala Arg 195 200 205 Arg Ser Arg Arg Ala Val Thr Leu Pro Ser His Ser Thr Arg Lys Leu 210 215 220 Gln Thr Arg Ser Gln Thr Trp Leu Glu Ser Arg Glu Tyr Thr Lys His 225 230 235 240 Leu Ile Arg Val Glu Asn Trp Ile Phe Arg Asn Pro Gly Phe Ala Leu 245 250 255 Ala Ala Ala Ala Ile Ala Trp Leu Leu Gly Ser Ser Thr Ser Gln Lys 260 265 270 Val Ile Tyr Leu Val Met Ile Leu Leu Ile Ala Pro Ala Tyr Ser Ile 275 280 285 Arg Cys Ile Gly Val Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Met Ser Gly 290 295 300 Gly Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr Val 305 310 315 320 Met Ala Gln Asp Lys Pro Xaa Val Asp Ile Glu Leu Val Thr Thr Thr 325 330 335 Val Ser Asn Met Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu Ala Ser Ile 340 345 350 Ser Asp Met Ala Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala Tyr 355 360 365 Leu Asp Lys Gln Ser Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg Thr Leu Val 370 375 380 Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Leu 385 390 395 400 Val Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Lys Lys Met Thr Gly Lys Ser 405 410 415 Ile Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Arg Ile Met Leu Ser Val His Gly 420 425 430 Ser Gln His Ser Gly Met Ile Val Asn Asp Thr Gly His Glu Thr Asp 435 440 445 Glu Asn Arg Ala Lys Val Glu Ile Thr Pro Asn Ser Pro Arg Ala Glu 450 455 460 Ala Thr Leu Gly Gly Phe Gly Ser Leu Gly Leu Asp Cys Glu Pro Arg 465 470 475 480 Thr Gly Leu Asp Phe Ser Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Met Asn Asn Lys 485 490 495 His Trp Leu Val His Lys Glu Trp Phe His Asp Ile Pro Leu Pro Trp 500 505 510 His Ala Gly Ala Asp Thr Gly Thr Pro His Trp Asn Asn Lys Glu Ala 515 520 525 Leu Val Glu Phe Lys Asp Ala His Ala Lys Arg Gln Thr Val Val Val 530 535 540 Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Val His Thr Ala Leu Ala Gly Ala Leu 545 550 555 560 Glu Ala Glu Met Asp Gly Ala Lys Gly Arg Leu Ser Ser Gly His Leu 565 570 575 Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Arg Leu Lys Gly Val Ser Tyr 580 585 590 Ser Leu Cys Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu Thr 595 600 605 Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp Gly 610 615 620 Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln Met Ala Val Asp Met Gln Thr Leu Thr 625 630 635 640 Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr Glu Ser Thr 645 650 655 Glu Asn Ser Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe Gly Asp Ser 660 665 670 Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Glu Lys Lys Ile Thr His His Trp His 675 680 685 Arg Ser Gly Ser Thr Ile Gly Lys Ala Phe Glu Ala Thr Val Arg Gly 690 695 700 Ala Lys Arg Met Ala Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser 705 710 715 720 Val Gly Gly Ala Leu Asn Ser Leu Gly Lys Gly Ile His Gln Ile Phe 725 730 735 Gly Ala Ala Phe Lys Leu Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Phe Ser Gln 740 745 750 Ile Leu Ile Gly Thr Leu Leu Val Trp Leu Gly Leu Asn Thr Lys Asn 755 760 765 Gly Ser Ile Ser Leu Thr Cys Leu Ala Leu Gly Gly Val Leu Ile Phe 770 775 780 Leu Ser Thr Ala Val Ser Ala Gly Ala Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn 785 790 795 800 Phe Gly Lys Arg Glu Leu Lys Cys Gly Asp Gly Ile Phe Ile Phe Arg 805 810 815 Asp Ser Asp Asp Trp Leu Asn Lys Tyr Ser Tyr Tyr Pro Glu Asp Pro 820 825 830 Val Lys Leu Ala Ser Ile Val Lys Ala Ser Phe Glu Glu Gly Lys Cys 835 840 845 Gly Leu Asn Ser Val Asp Ser Leu Glu His Glu Met Trp Arg Ser Arg 850 855 860 Ala Asp Glu Ile Asn Ala Ile Phe Glu Glu Asn Glu Val Asp Ile Ser 865 870 875 880 Val Val Val Gln Asp Pro Lys Asn Val Tyr Gln Arg Gly Thr His Pro 885 890 895 Phe Ser Arg Ile Arg Asp Gly Leu Gln Tyr Gly Trp Lys Thr Trp Gly 900 905 910 Lys Asn Leu Val Phe Ser Pro Gly Arg Lys Asn Gly Ser Phe Ile Ile 915 920 925 Asp Gly Lys Ser Arg Lys Glu Cys Pro Phe Ser Asn Arg Val Trp Asn 930 935 940 Ser Phe Gln Ile Glu Glu Phe Gly Thr Gly Val Phe Thr Thr Arg Val 945 950 955 960 Tyr Met Asp Ala Val Phe Glu Tyr Thr Ile Asp Cys Asp Gly Ser Ile 965 970 975 Leu Gly Ala Ala Val Asn Gly Lys Lys Ser Ala His Gly Ser Pro Thr 980 985 990 Phe Trp Met Gly Ser His Glu Val Asn Gly Thr Trp Met Ile His Thr 995 1000 1005 Leu Glu Ala Leu Asp Tyr Lys Glu Cys Glu Trp Pro Leu Thr His 1010 1015 1020 Thr Ile Gly Thr Ser Val Glu Glu Ser Glu Met Phe Met Pro Arg 1025 1030 1035 Ser Ile Gly Gly Pro Val Ser Ser His Asn His Ile Pro Gly Tyr 1040 1045 1050 Lys Val Gln Thr Asn Gly Pro Trp Met Gln Val Pro Leu Glu Val 1055 1060 1065 Lys Arg Glu Ala Cys Pro Gly Thr Ser Val Ile Ile Asp Gly Asn 1070 1075 1080 Cys Asp Gly Arg Gly Lys Ser Thr Arg Ser Thr Thr Asp Ser Gly 1085 1090 1095 Lys Val Ile Pro Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Met Pro Pro 1100 1105 1110 Val Ser Phe His Gly Ser Asp Gly Cys Trp Tyr Pro Met Glu Ile 1115 1120 1125 Arg Pro Arg Lys Thr His Glu Ser His Leu Val Arg Ser Trp Val 1130 1135 1140 Thr Ala Gly Glu Ile His Ala Val Pro Phe Gly Leu Val Ser Met 1145 1150 1155 Met Ile Ala Met Glu Val Val Leu Arg Lys Arg Gln Gly Pro Lys 1160 1165 1170 Gln Met Leu Val Gly Gly Val Val Leu Leu Gly Ala Met Leu Val 1175 1180 1185 Gly Gln Val Thr Leu Leu Asp Leu Leu Lys Leu Thr Val Ala Val 1190 1195 1200 Gly Leu His Phe His Glu Met Asn Asn Gly Gly Asp Ala Met Tyr 1205 1210 1215 Met Ala Leu Ile Ala Ala Phe Ser Ile Arg Pro Gly Leu Leu Ile 1220 1225 1230 Gly Phe Gly Leu Arg Thr Leu Trp Ser Pro Arg Glu Arg Leu Val 1235 1240 1245 Leu Thr Leu Gly Ala Ala Met Val Glu Ile Ala Leu Gly Gly Val 1250 1255 1260 Met Gly Gly Leu Trp Lys Tyr Leu Asn Ala Val Ser Leu Cys Ile 1265 1270 1275 Leu Thr Ile Asn Ala Val Ala Ser Arg Lys Ala Ser Asn Thr Ile 1280 1285 1290 Leu Pro Leu Met Ala Leu Leu Thr Pro Val Thr Met Ala Glu Val 1295 1300 1305 Arg Leu Ala Ala Met Phe Phe Cys Ala Met Val Ile Ile Gly Val 1310 1315 1320 Leu His Gln Asn Phe Lys Asp Thr Ser Met Gln Lys Thr Ile Pro 1325 1330 1335 Leu Val Ala Leu Thr Leu Thr Ser Tyr Leu Gly Leu Thr Gln Pro 1340 1345 1350 Phe Leu Gly Leu Cys Ala Phe Leu Ala Thr Arg Ile Phe Gly Arg 1355 1360 1365 Arg Ser Ile Pro Val Asn Glu Ala Leu Ala Ala Ala Gly Leu Val 1370 1375 1380 Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Phe Gln Glu Met Glu Asn Phe Leu 1385 1390 1395 Gly Pro Ile Ala Val Gly Gly Leu Leu Met Met Leu Val Ser Val 1400 1405 1410 Ala Gly Arg Val Asp Gly Leu Glu Leu Lys Lys Leu Gly Glu Val 1415 1420 1425 Ser Trp Glu Glu Glu Ala Glu Ile Ser Gly Ser Ser Ala Arg Tyr 1430 1435 1440 Asp Val Ala Leu Ser Glu Gln Gly Glu Phe Lys Leu Leu Ser Glu 1445 1450 1455 Glu Lys Val Pro Trp Asp Gln Val Val Met Thr Ser Leu Ala Leu 1460 1465 1470 Val Gly Ala Ala Leu His Pro Phe Ala Leu Leu Leu Val Leu Ala 1475 1480 1485 Gly Trp Leu Phe His Val Arg Gly Ala Arg Arg Ser Gly Asp Val 1490 1495 1500 Leu Trp Asp Ile Pro Thr Pro Lys Ile Ile Glu Glu Cys Glu His 1505 1510 1515 Leu Glu Asp Gly Ile Tyr Gly Ile Phe Gln Ser Thr Phe Leu Gly 1520 1525 1530 Ala Ser Gln Arg Gly Val Gly Val Ala Gln Gly Gly Val Phe His 1535 1540 1545 Thr Met Trp His Val Thr Arg Gly Ala Phe Leu Val Arg Asn Gly 1550 1555 1560 Lys Lys Leu Ile Pro Ser Trp Ala Ser Val Lys Glu Asp Leu Val 1565 1570 1575 Ala Tyr Gly Gly Ser Trp Lys Leu Glu Gly Arg Trp Asp Gly Glu 1580 1585 1590 Glu Glu Val Gln Leu Ile Ala Ala Val Pro Gly Lys Asn Val Val 1595 1600 1605 Asn Val Gln Thr Lys Pro Ser Leu Phe Lys Val Arg Asn Gly Gly 1610 1615 1620 Glu Ile Gly Ala Val Ala Leu Asp Tyr Pro Ser Gly Thr Ser Gly 1625 1630 1635 Ser Pro Ile Val Asn Arg Asn Gly Glu Val Ile Gly Leu Tyr Gly 1640 1645 1650 Asn Gly Ile Leu Val Gly Asp Asn Ser Phe Val Ser Ala Ile Ser 1655 1660 1665 Gln Thr Glu Val Lys Glu Glu Gly Lys Glu Glu Leu Gln Glu Ile 1670 1675 1680 Pro Thr Met Leu Lys Lys Gly Met Thr Thr Val Leu Asp Phe His 1685 1690 1695 Pro Gly Ala Gly Lys Thr Arg Arg Phe Leu Pro Gln Ile Leu Ala 1700 1705 1710 Glu Cys Ala Arg Arg Arg Leu Arg Thr Leu Val Leu Ala Pro Thr 1715 1720 1725 Arg Val Val Leu Ser Glu Met Lys Glu Ala Phe His Gly Leu Asp 1730 1735 1740 Val Lys Phe His Thr Gln Ala Phe Ser Ala His Gly Ser Gly Arg 1745 1750 1755 Glu Val Ile Asp Ala Met Cys His Ala Thr Leu Thr Tyr Arg Met 1760 1765 1770 Leu Glu Pro Thr Arg Val Val Asn Trp Glu Val Ile Ile Met Asp 1775 1780 1785 Glu Ala His Phe Leu Asp Pro Ala Ser Ile Ala Ala Arg Gly Trp 1790 1795 1800 Ala Ala His Arg Ala Arg Ala Asn Glu Ser Ala Thr Ile Leu Met 1805 1810 1815 Thr Ala Thr Pro Pro Gly Thr Ser Asp Glu Phe Pro His Ser Asn 1820 1825 1830 Gly Glu Ile Glu Asp Val Gln Thr Asp Ile Pro Ser Glu Pro Trp 1835 1840 1845 Asn Thr Gly His Asp Trp Ile Leu Ala Asp Lys Arg Pro Thr Ala 1850 1855 1860 Trp Phe Leu Pro Ser Ile Arg Ala Ala Asn Val Met Ala Ala Ser 1865 1870 1875 Leu Arg Lys Ala Gly Lys Ser Val Val Val Leu Asn Arg Lys Thr 1880 1885 1890 Phe Glu Arg Glu Tyr Pro Thr Ile Lys Gln Lys Lys Pro Asp Phe 1895 1900 1905 Ile Leu Ala Thr Asp Ile Ala Glu Met Gly Ala Asn Leu Cys Val 1910 1915 1920 Glu Arg Val Leu Asp Cys Arg Thr Ala Phe Lys Pro Val Leu Val 1925 1930 1935 Asp Glu Gly Arg Lys Val Ala Ile Lys Gly Pro Leu Arg Ile Ser 1940 1945 1950 Ala Ser Ser Ala Ala Gln Arg Arg Gly Arg Ile Gly Arg Asn Pro 1955 1960 1965 Asn Arg Asp Gly Asp Ser Tyr Tyr Tyr Ser Glu Pro Thr Ser Glu 1970 1975 1980 Asn Asn Ala His His Val Cys Trp Leu Glu Ala Ser Met Leu Leu 1985 1990 1995 Asp Asn Met Glu Val Arg Gly Gly Met Val Ala Pro Leu Tyr Gly 2000 2005 2010 Val Glu Gly Thr Lys Thr Pro Val Ser Pro Gly Glu Met Arg Leu 2015 2020 2025 Arg Asp Asp Gln Arg Lys Val Phe Arg Glu Leu Val Arg Asn Cys 2030 2035 2040 Asp Leu Pro Val Trp Leu Ser Trp Gln Val Ala Lys Ala Gly Leu 2045 2050 2055 Lys Thr Asn Asp Arg Lys Trp Cys Phe Glu Gly Pro Glu Glu His 2060 2065 2070 Glu Ile Leu Asn Asp Ser Gly Glu Thr Val Lys Cys Arg Ala Pro 2075 2080 2085 Gly Gly Ala Lys Lys Pro Leu Arg Pro Arg Trp Cys Asp Glu Arg 2090 2095 2100 Val Ser Ser Asp Gln Ser Ala Leu Ser Glu Phe Ile Lys Phe Ala 2105 2110 2115 Glu Gly Arg Arg Gly Ala Ala Glu Val Leu Val Val Leu Ser Glu 2120 2125 2130 Leu Pro Asp Phe Leu Ala Lys Lys Gly Gly Glu Ala Met Asp Thr 2135 2140 2145 Ile Ser Val Phe Leu His Ser Glu Glu Gly Ser Arg Ala Tyr Arg 2150 2155 2160 Asn Ala Leu Ser Met Met Pro Glu Ala Met Thr Ile Val Met Leu 2165 2170 2175 Phe Ile Leu Ala Gly Leu Leu Thr Ser Gly Met Val Ile Phe Phe 2180 2185 2190 Met Ser Pro Lys Gly Ile Ser Arg Met Ser Met Ala Met Gly Thr 2195 2200 2205 Met Ala Gly Cys Gly Tyr Leu Met Phe Leu Gly Gly Val Lys Pro 2210 2215 2220 Thr His Ile Ser Tyr Val Met Leu Ile Phe Phe Val Leu Met Val 2225 2230 2235 Val Val Ile Pro Glu Pro Gly Gln Gln Arg Ser Ile Gln Asp Asn 2240 2245 2250 Gln Val Ala Tyr Leu Ile Ile Gly Ile Leu Thr Leu Val Ser Ala 2255 2260 2265 Val Ala Ala Asn Glu Leu Gly Met Leu Glu Lys Thr Lys Glu Asp 2270 2275 2280 Leu Phe Gly Lys Lys Asn Leu Ile Pro Ser Ser Ala Ser Pro Trp 2285 2290 2295 Ser Trp Pro Asp Leu Asp Leu Lys Pro Gly Ala Ala Trp Thr Val 2300 2305 2310 Tyr Val Gly Ile Val Thr Met Leu Ser Pro Met Leu His His Trp 2315 2320 2325 Ile Lys Val Glu Tyr Gly Asn Leu Ser Leu Ser Gly Ile Ala Gln 2330 2335 2340 Ser Ala Ser Val Leu Ser Phe Met Asp Lys Gly Ile Pro Phe Met 2345 2350 2355 Lys Met Asn Ile Ser Val Ile Met Leu Leu Val Ser Gly Trp Asn 2360 2365 2370 Ser Ile Thr Val Met Pro Leu Leu Cys Gly Ile Gly Cys Ala Met 2375 2380 2385 Leu His Trp Ser Leu Ile Leu Pro Gly Ile Lys Ala Gln Gln Ser 2390 2395 2400 Lys Leu Ala Gln Arg Arg Val Phe His Gly Val Ala Lys Asn Pro 2405 2410 2415 Val Val Asp Gly Asn Pro Thr Val Asp Ile Glu Glu Ala Pro Glu 2420 2425 2430 Met Pro Ala Leu Tyr Glu Lys Lys Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Leu 2435 2440 2445 Ala Leu Ser Leu Ala Ser Val Ala Met Cys Arg Thr Pro Phe Ser 2450 2455 2460 Leu Ala Glu Gly Ile Val Leu Ala Ser Ala Ala Leu Gly Pro Leu 2465 2470 2475 Ile Glu Gly Asn Thr Ser Leu Leu Trp Asn Gly Pro Met Ala Val 2480 2485 2490 Ser Met Thr Gly Val Met Arg Gly Asn His Tyr Ala Phe Val Gly 2495 2500 2505 Val Met Tyr Asn Leu Trp Lys Met Lys Thr Gly Arg Arg Gly Ser 2510 2515 2520 Ala Asn Gly Lys Thr Leu Gly Glu Val Trp Lys Arg Glu Leu Asn 2525 2530 2535 Leu Leu Asp Lys Arg Gln Phe Glu Leu Tyr Lys Arg Thr Asp Ile 2540 2545 2550 Val Glu Val Asp Arg Asp Thr Ala Arg Arg His Leu Ala Glu Gly 2555 2560 2565 Lys Val Asp Thr Gly Val Ala Val Ser Arg Gly Thr Ala Lys Leu 2570 2575 2580 Arg Trp Phe His Glu Arg Gly Tyr Val Lys Leu Glu Gly Arg Val 2585 2590 2595 Ile Asp Leu Gly Cys Gly Arg Gly Gly Trp Cys Tyr Tyr Ala Ala 2600 2605 2610 Ala Gln Lys Glu Val Ser Gly Val Lys Gly Phe Thr Leu Gly Arg 2615 2620 2625 Asp Gly His Glu Lys Pro Met Asn Val Gln Ser Leu Gly Trp Asn 2630 2635 2640 Ile Ile Thr Phe Lys Asp Lys Thr Asp Ile His Arg Leu Glu Pro 2645 2650 2655 Val Lys Cys Asp Thr Leu Leu Cys Asp Ile Gly Glu Ser Ser Ser 2660 2665 2670 Ser Ser Val Thr Glu Gly Glu Arg Thr Val Arg Val Leu Asp Thr 2675 2680 2685 Val Glu Lys Trp Leu Ala Cys Gly Val Asp Asn Phe Cys Val Lys 2690 2695 2700 Val Leu Ala Pro Tyr Met Pro Asp Val Leu Glu Lys Leu Glu Leu 2705 2710 2715 Leu Gln Arg Arg Phe Gly Gly Thr Val Ile Arg Asn Pro Leu Ser 2720 2725 2730 Arg Asn Ser Thr His Glu Met Tyr Tyr Val Ser Gly Ala Arg Ser 2735 2740 2745 Asn Val Thr Phe Thr Val Asn Gln Thr Ser Arg Leu Leu Met Arg 2750 2755 2760 Arg Met Arg Arg Pro Thr Gly Lys Val Thr Leu Glu Ala Asp Val 2765 2770 2775 Ile Leu Pro Ile Gly Thr Arg Ser Val Glu Thr Asp Lys Gly Pro 2780 2785 2790 Leu Asp Lys Glu Ala Ile Glu Glu Arg Val Glu Arg Ile Lys Ser 2795 2800 2805 Glu Tyr Met Thr Ser Trp Phe Tyr Asp Asn Asp Asn Pro Tyr Arg 2810 2815 2820 Thr Trp His Tyr Cys Gly Ser Tyr Val Thr Lys Thr Ser Gly Ser 2825 2830 2835 Ala Ala Ser Met Val Asn Gly Val Ile Lys Ile Leu Thr Tyr Pro 2840 2845 2850 Trp Asp Arg Ile Glu Glu Val Thr Arg Met Ala Met Thr Asp Thr 2855 2860 2865 Thr Pro Phe Gly Gln Gln Arg Val Phe Lys Glu Lys Val Asp Thr 2870 2875 2880 Arg Ala Lys Asp Pro Pro Ala Gly Thr Arg Lys Ile Met Lys Val 2885 2890 2895 Val Asn Arg Trp Leu Phe Arg His Leu Ala Arg Glu Lys Asn Pro 2900 2905 2910 Arg Leu Cys Thr Lys Glu Glu Phe Ile Ala Lys Val Arg Ser His 2915 2920 2925 Ala Ala Ile Gly Ala Tyr Leu Glu Glu Gln Glu Gln Trp Lys Thr 2930 2935 2940 Ala Asn Glu Ala Val Gln Asp Pro Lys Phe Trp Glu Leu Val Asp 2945 2950 2955 Glu Glu Arg Lys Leu His Gln Gln Gly Arg Cys Arg Thr Cys Val 2960 2965 2970 Tyr Asn Met Met Gly Lys Arg Glu Lys Lys Leu Ser Glu Phe Gly 2975 2980 2985 Lys Ala Lys Gly Ser Arg Ala Ile Trp Tyr Met Trp Leu Gly Ala 2990 2995 3000 Arg Tyr Leu Glu Phe Glu Ala Leu Gly Phe Leu Asn Glu Asp His 3005 3010 3015 Trp Ala Ser Arg Glu Asn Ser Gly Gly Gly Val Glu Gly Ile Gly 3020 3025 3030 Leu Gln Tyr Leu Gly Tyr Val Ile Arg Asp Leu Ala Ala Met Asp 3035 3040 3045 Gly Gly Gly Phe Tyr Ala Asp Asp Thr Ala Gly Trp Asp Thr Arg 3050 3055 3060 Ile Thr Glu Ala Asp Leu Asp Asp Glu Gln Glu Ile Leu Asn Tyr 3065 3070 3075 Met Ser Pro His His Lys Lys Leu Ala Gln Ala Val Met Glu Met 3080 3085 3090 Thr Tyr Lys Asn Lys Val Val Lys Val Leu Arg Pro Ala Pro Gly 3095 3100 3105 Gly Lys Ala Tyr Met Asp Val Ile Ser Arg Arg Asp Gln Arg Gly 3110 3115 3120 Ser Gly Gln Val Val Thr Tyr Ala Leu Asn Thr Ile Thr Asn Leu 3125 3130 3135 Lys Val Gln Leu Ile Arg Met Ala Glu Ala Glu Met Val Ile His 3140 3145 3150 His Gln His Val Gln Asp Cys Asp Glu Ser Val Leu Thr Arg Leu 3155 3160 3165 Glu Ala Trp Leu Thr Glu His Gly Cys Asp Arg Leu Lys Arg Met 3170 3175 3180 Ala Val Ser Gly Asp Asp Cys Val Val Arg Pro Ile Asp Asp Arg 3185 3190 3195 Phe Gly Leu Ala Leu Ser His Leu Asn Ala Met Ser Lys Val Arg 3200 3205 3210 Lys Asp Ile Ser Glu Trp Gln Pro Ser Lys Gly Trp Asn Asp Trp 3215 3220 3225 Glu Asn Val Pro Phe Cys Ser His His Phe His Glu Leu Gln Leu 3230 3235 3240 Lys Asp Gly Arg Arg Ile Val Val Pro Cys Arg Glu Gln Asp Glu 3245 3250 3255 Leu Ile Gly Arg Gly Arg Val Ser Pro Gly Asn Gly Trp Met Ile 3260 3265 3270 Lys Glu Thr Ala Cys Leu Ser Lys Ala Tyr Ala Asn Met Trp Ser 3275 3280 3285 Leu Met Tyr Phe His Lys Arg Asp Met Arg Leu Leu Ser Leu Ala 3290 3295 3300 Val Ser Ser Ala Val Pro Thr Ser Trp Val Pro Gln Gly Arg Thr 3305 3310 3315 Thr Trp Ser Ile His Gly Lys Gly Glu Trp Met Thr Thr Glu Asp 3320 3325 3330 Met Leu Glu Val Trp Asn Arg Val Trp Ile Thr Asn Asn Pro His 3335 3340 3345 Met Gln Asp Lys Thr Met Val Lys Lys Trp Arg Asp Val Pro Tyr 3350 3355 3360 Leu Thr Lys Arg Gln Asp Lys Leu Cys Gly Ser Leu Ile Gly Met 3365 3370 3375 Thr Asn Arg Ala Thr Trp Ala Ser His Ile His Leu Val Ile His 3380 3385 3390 Arg Ile Arg Thr Leu Ile Gly Gln Glu Lys Tyr Thr Asp Tyr Leu 3395 3400 3405 Thr Val Met Asp Arg Tyr Ser Val Asp Ala Asp Leu Gln Leu Gly 3410 3415 3420 Glu Leu Ile 3425 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Junction of Yellow Fever and Zika virus sequence <400> 3 Met Arg Gly Leu Ser Ser Arg Lys Arg Arg Gly Thr Asp Thr Ser Val 1 5 10 15 Gly Ile Val Gly 20 <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Zika virus signal sequence <400> 4 Gly Thr Asp Thr Ser Val Gly Ile Val Gly Leu Leu Leu Thr Thr Ala 1 5 10 15 Met Ala <210> 5 <211> 690 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Zika signal sequence and prME gene <400> 5 Gly Thr Asp Thr Ser Val Gly Ile Val Gly Leu Leu Leu Thr Thr Ala 1 5 10 15 Met Ala Val Glu Val Thr Arg Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu 20 25 30 Asp Arg Ser Asp Ala Gly Glu Ala Ile Ser Phe Pro Thr Thr Leu Gly 35 40 45 Met Asn Lys Cys Tyr Ile Gln Ile Met Asp Leu Gly His Met Cys Asp 50 55 60 Ala Thr Met Ser Tyr Glu Cys Pro Met Leu Asp Glu Gly Val Glu Pro 65 70 75 80 Asp Asp Val Asp Cys Trp Cys Asn Thr Thr Ser Thr Trp Val Val Tyr 85 90 95 Gly Thr Cys His His Lys Lys Gly Glu Ala Arg Arg Ser Arg Arg Ala 100 105 110 Val Thr Leu Pro Ser His Ser Thr Arg Lys Leu Gln Thr Arg Ser Gln 115 120 125 Thr Trp Leu Glu Ser Arg Glu Tyr Thr Lys His Leu Ile Arg Val Glu 130 135 140 Asn Trp Ile Phe Arg Asn Pro Gly Phe Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ile 145 150 155 160 Ala Trp Leu Leu Gly Ser Ser Thr Ser Gln Lys Val Ile Tyr Leu Val 165 170 175 Met Ile Leu Leu Ile Ala Pro Ala Tyr Ser Ile Arg Cys Ile Gly Val 180 185 190 Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Met Ser Gly Gly Thr Trp Val Asp 195 200 205 Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr Val Met Ala Gln Asp Lys 210 215 220 Pro Thr Val Asp Ile Glu Leu Val Thr Thr Thr Val Ser Asn Met Ala 225 230 235 240 Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu Ala Ser Ile Ser Asp Met Ala Ser 245 250 255 Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala Tyr Leu Asp Lys Gln Ser 260 265 270 Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg Thr Leu Val Asp Arg Gly Trp Gly 275 280 285 Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Leu Val Thr Cys Ala Lys 290 295 300 Phe Ala Cys Ser Lys Lys Met Thr Gly Lys Ser Ile Gln Pro Glu Asn 305 310 315 320 Leu Glu Tyr Arg Ile Met Leu Ser Val His Gly Ser Gln His Ser Gly 325 330 335 Met Ile Val Asn Asp Thr Gly His Glu Thr Asp Glu Asn Arg Ala Lys 340 345 350 Val Glu Ile Thr Pro Asn Ser Pro Arg Ala Glu Ala Thr Leu Gly Gly 355 360 365 Phe Gly Ser Leu Gly Leu Asp Cys Glu Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe 370 375 380 Ser Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Met Asn Asn Lys His Trp Leu Val His 385 390 395 400 Lys Glu Trp Phe His Asp Ile Pro Leu Pro Trp His Ala Gly Ala Asp 405 410 415 Thr Gly Thr Pro His Trp Asn Asn Lys Glu Ala Leu Val Glu Phe Lys 420 425 430 Asp Ala His Ala Lys Arg Gln Thr Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu 435 440 445 Gly Ala Val His Thr Ala Leu Ala Gly Ala Leu Glu Ala Glu Met Asp 450 455 460 Gly Ala Lys Gly Arg Leu Ser Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys 465 470 475 480 Met Asp Lys Leu Arg Leu Lys Gly Val Ser Tyr Ser Leu Cys Thr Ala 485 490 495 Ala Phe Thr Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val 500 505 510 Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro 515 520 525 Ala Gln Met Ala Val Asp Met Gln Thr Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu 530 535 540 Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr Glu Ser Thr Glu Asn Ser Lys Met 545 550 555 560 Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly 565 570 575 Val Gly Glu Lys Lys Ile Thr His His Trp His Arg Ser Gly Ser Thr 580 585 590 Ile Gly Lys Ala Phe Glu Ala Thr Val Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala 595 600 605 Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly Ala Leu 610 615 620 Asn Ser Leu Gly Lys Gly Ile His Gln Ile Phe Gly Ala Ala Phe Lys 625 630 635 640 Leu Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Phe Ser Gln Ile Leu Ile Gly Thr 645 650 655 Leu Leu Val Trp Leu Gly Leu Asn Thr Lys Asn Gly Ser Ile Ser Leu 660 665 670 Thr Cys Leu Ala Leu Gly Gly Val Leu Ile Phe Leu Ser Thr Ala Val 675 680 685 Ser Ala 690 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Zika E protein fragment <400> 6 Ile His Gln Ile Phe Gly Ala Ala Phe Lys Leu Leu Phe Gly Gly Met 1 5 10 15 Ser Trp Phe Ser Gln 20 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Zika E protein fragment <400> 7 Cys Val Thr Val Met Ala Gln Asp Lys Pro Thr Val Asp Ile Glu Leu 1 5 10 15 Val Thr Thr Thr Val 20 <210> 8 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcr primer <400> 8 gttgtggaaa atgctggacc caagacaagg cttggctgtt ctaaggaaag tcaagagagt 60 <210> 9 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcr primer <400> 9 tctaaatatg aagataccat ctccgcactt gagctctctc ttgccaaagt tgatggcgca 60 <210> 10 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YVF - ZIKA chimer <400> 10 Leu Ser Ser Arg Lys Arg Arg Ser His Asp Val Leu Thr Val Gln Phe 1 5 10 15 Leu Ile Leu Gly Met Leu Leu Met Thr Gly Gly 20 25 <210> 11 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YFV - Zika chimer <400> 11 Gly Arg Lys Gln Asn Lys Arg Gly Gly Asn Glu Gly Ser Ile Met Trp 1 5 10 15 Leu Ala Ser Leu Ala Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala 20 25 <210> 12 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YFV-Zika Chimer <400> 12 Arg Lys Glu Lys Lys Arg Arg Gly Thr Asp Thr Ser Val Gly Ile Val 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Thr Thr Ala Met Ala 20 25 <210> 13 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YFV - Zika Chimer <400> 13 Leu Ser Ser Arg Lys Arg Arg Ser His Asp Val Leu Thr Val Gln Phe 1 5 10 15 Leu Ile Leu Gly Met Leu Leu Met Thr Gly Gly 20 25 <210> 14 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YFV-Zika chimer <400> 14 Leu Ser Ser Arg Lys Arg Arg Ser His Asp Val Leu Thr Val Gln Phe 1 5 10 15 Leu Ile Leu <210> 15 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YFV - Zika chimer <400> 15 Leu Ser Ser Arg Lys Arg Arg Gly Thr Asp Thr Ser Val Gly Ile Val 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Thr Thr Ala Met Ala 20 25

Claims (35)

1. 생(live), 감염성, 약독화된(attenuated) 황열 - 지카(Zika) 키메릭(chimeric) 바이러스의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서,
   여기서, 상기 황열 바이러스의 C 단백질의 C 말단부의 신호 서열 및 prME 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 지카 바이러스의 C 단백질의 C 말단부의 신호 서열 및 prME 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 대체되어 상기 지카의 상기 신호 서열 및 prME 단백질이 발현되고, 지카 바이러스의 prME 단백질의 인코딩된 아미노산은 SEQ ID NO:2로 제시된 바와 같이 Ser742Leu 치환으로 야생형 지카 서열과는 다른 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
2. 제1항에 있어서, 지카 E 단백질의 인코딩된 아미노산 서열은 서열 IHQIFGAAFKLLFGGMSWFSQ[SEQ ID NO: 6]를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, SEQ ID NO:2로 제시된 바와 같이 Ala327Thr 치환으로 야생형 서열과 추가적으로 상이한, 폴리뉴클레오타이드.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 지카 E 단백질의 인코딩된 아미노산 서열은 서열 CVTVMAQDKPTVDIELVTTTV[SEQ ID NO: 7]를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 지카 바이러스의 인코딩된 신호 서열 및 prME 단백질은 하기의 아미노산 서열을 갖는, 폴리뉴클레오타이드:
   

   

   
   

   
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 황열 바이러스의 NS2A 단백질의 인코딩된 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2로 제시된 바와 같이 Val1318Met 치환을 갖고/갖거나,
   황열 바이러스의 NS4B 단백질의 인코딩된 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2로 제시된 바와 같이 Glu2416Lys 치환을 갖는, 폴리뉴클레오타이드.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 황열 바이러스 백본은 YFV 17D의 서열과 비교하여, SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 넘버링을 참조로 돌연변이 g4070a, t7333a, g7364a를 갖는, 폴리뉴클레오타이드.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 황열 바이러스는 YFV 17D 약독화된 바이러스인, 폴리뉴클레오타이드.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 지카 바이러스는 기탁 번호 EU545988을 갖는 Yap 균주인, 폴리뉴클레오타이드.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:1(정지코돈은 배제됨)로 나타낸 뉴클레오타이드 119 내지 10393의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:1로 나타낸 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 지카 바이러스의 신호 펩타이드의 뉴클레오타이드 서열은 아미노산 서열 GTDTSVGIVGLLLTTAMA[SEQ ID NO:4]를 인코딩하는, 폴리뉴클레오타이드.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, YF의 C 단백질 및 지카 바이러스의 신호 펩타이드의 연접부(junction)에서의 인코딩된 서열은 MRGLSSRKRR GTDTSVGIVG[SEQ ID NO:3]를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는, 폴리뉴클레오타이드.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 박테리아 염색체(Artificial Bacterial Chromosome)인, 폴리뉴클레오타이드.
15. 제14항에 있어서, 인공 박테리아 염색체는
    - 상기 인공 박테리아 염색체를 1개 박테리아 세포 당 10개 초과의 복사체(copy)까지 증폭시키기 위한 유도성 박테리아 ori 서열, 및
    - 상기 황열 지카 키메릭 바이러스의 cDNA를 포함하고, 포유류 세포에서 상기 바이러스 cDNA의 전사를 위해 그리고 감염성 RNA 바이러스 내로의 전사된 RNA의 프로세싱(processing)을 위해 cis-조절 요소를 포함하는 바이러스 발현 카세트
    를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
16. 생, 감염성, 약독화된 황열 - 지카 키메릭 바이러스로서,
    여기서, 상기 황열 바이러스의 C 단백질의 C 말단부의 신호 서열 및 prME 단백질은 지카 바이러스의 C 단백질의 C 말단부의 신호 서열 및 prME 단백질로 대체되고, 지카 바이러스의 prME 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2로 제시된 바와 같이 Ser742Leu 치환으로 야생형 지카 서열과는 다른 것을 특징으로 하는, 황열 - 지카 키메릭 바이러스.
17. 제16항에 있어서, 지카 E 단백질에 서열 IHQIFGAAFKLLFGGMSWFSQ[SEQ ID NO: 6]를 포함하는, 황열 - 지카 키메릭 바이러스.
18. 제16항 또는 제17항에 있어서, SEQ ID NO:2로 제시된 바와 같이 Ala327Thr 치환으로 야생형 서열과 추가적으로 상이한, 황열 - 지카 키메릭 바이러스.
19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 지카 E 단백질에 서열 CVTVMAQDKPTVDIELVTTTV[SEQ ID NO: 7]를 포함하는, 황열 - 지카 키메릭 바이러스.
20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 지카 바이러스의 신호 서열 및 prME 단백질은 하기 아미노산 서열을 갖는, 황열 - 지카 키메릭 바이러스:
    

    

    
    

    
21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 황열 바이러스의 NS2A 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2로 제시된 바와 같이 Val1318Met 치환을 갖고/갖거나,
    황열 바이러스의 NS4B 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2로 제시된 바와 같이 Glu2416Lys 치환을 갖는, 황열 - 지카 키메릭 바이러스
22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 황열 바이러스는 YFV 17D 약독화된 바이러스인, 황열 - 지카 키메릭 바이러스.
23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 지카 바이러스는 기탁 번호 EU545988을 갖는 Yap 균주인, 황열 - 지카 키메릭 바이러스.
24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 서열 GTDTSVGIVGLLLTTAMA[SEQ ID NO:4]를 포함하는, 황열 - 지카 키메릭 바이러스.
25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 황열 바이러스의 C 단백질 및 지카 바이러스의 신호 펩타이드의 연접부에서의 아미노산 서열은 아미노산 서열 MRGLSSRKRR GTDTSVGIVG[SEQ ID NO:3]를 갖는, 황열 - 지카 키메릭 바이러스.
26. 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 백신으로서 사용하기 위한, 황열 - 지카 키메릭 바이러스.
27. 제26항에 있어서, 지카 바이러스 감염에 대한 예방 백신으로서 사용하기 위한, 황열 - 지카 키메릭 바이러스.
28. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 백신으로서 사용하기 위한 황열 - 지카 키메릭 바이러스를 인코딩하는, 폴리뉴클레오타이드.
29. 제28항에 있어서, 지카 바이러스 감염에 대한 예방 백신으로서 사용하기 위한, 폴리뉴클레오타이드.
30. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 황열 - 지카 키메릭 바이러스를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
31. 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 황열 - 지카 키메릭 바이러스 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
32. 지카 감염에 대한 백신을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    a) 하기를 포함하는 인공 박테리아 염색체를 제공하는 단계:
    상기 인공 박테리아 염색체를 1개 박테리아 세포 당 10개 초과의 복사체까지 증폭시키기 위한 유도성 박테리아 ori 서열, 및
    제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 황열 지카 키메릭 바이러스의 cDNA를 포함하고, 포유류 세포에서 상기 바이러스 cDNA의 전사를 위해 그리고 감염성 RNA 바이러스 내로의 전사된 RNA의 프로세싱을 위해 cis-조절 요소를 포함하는 바이러스 발현 카세트
    b) 포유류 세포를 단계 a)의 인공 박테리아 염색체로 형질감염(transfect)시키고, 감염된 세포를 계대배양하는 단계
    c) 단계 b)의 형질감염된 세포에서 복제된 바이러스의 병독성(virulence) 및 지카 바이러스 감염에 대한 항체를 발생시키고 지카 바이러스 감염에 대한 보호를 유도하는 능력을 입증하는 단계
    d) 단계 c)에서 입증된 바이러스를 벡터 내로 클로닝하는 단계,
    e) 벡터를 백신 제제로 제제화하는 단계.
33. 제32항에 있어서, 벡터는 상기 인공 박테리아 염색체를 1개 박테리아 세포 당 10개 초과의 복사체까지 증폭시키기 위한 유도성 박테리아 ori 서열을 포함하는 인공 박테리아 염색체인, 방법.
34. 대상체에서 지카 바이러스에 대한 중화 항체 반응을 유도함으로써 지카 바이러스에 의한 감염을 예방하는 방법으로서,
    상기 방법은 제16항 내지 제25항 중 어느 항에 따른 황열 - 지카 키메릭 바이러스를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
35. 대상체에서 지카 바이러스에 대한 중화 항체 반응을 유도함으로써 지카 바이러스에 의한 감염을 예방하는 방법으로서,
    상기 방법은 제1항 내지 제15항 중 어느 항에 따른 제1 플라비바이러스(flavivirus) 및 제2 플라비바이러스의 키메릭 생 감염성 약독화된 플라비바이러스를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.

Images