KR102169710B1

KR102169710B1 - 커큐민 나노스피어, 그 제조방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102169710B1
Application number: KR1020200002346A
Authority: KR
Inventors: 민태선; 이세중
Original assignee: 제주대학교 산학협력단; 대구한의대학교산학협력단
Priority date: 2020-01-08
Filing date: 2020-01-08
Publication date: 2020-10-26
Also published as: KR20210089571A

Abstract

본 발명의 의한 커큐민 나노스피어의 제조방법은 커큐민 또는 커큐민 유도체를 비극성 용매에 혼합하여 커큐민 나노입자를 제조하는 단계; 그리고 상기 커큐민 나노입자와 인지질을 혼합하여 커큐민 나노스피어를 제조하는 단계를 포함한다. 본 발명의 생체 이용률이 향상된 커큐민 나노스피어의 제조방법을 이용하면, 커큐민의 흡수율을 높임으로써, 세포 내 환경 독성 물질의 작용을 억제하는 효과가 있다. 또한, 동물의 장기 및 혈액에 독성 효과를 가지지 않으면서, 동물 사료 효율 및 악취를 저감하는 효과가 있다.

Description

커큐민 나노스피어, 그 제조방법 및 이의 용도{Curcumin nanospheres, preparation method thereof and use thereof}

본 발명은 커큐민 나노스피어, 그 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

동물의 성장과 발달은 사료가 소화기관을 통과하는 동안 영양소가 소화효소에 의해서 가수분해되어 체내로 흡수됨으로써 이루어진다. 체내에 흡수되지 않는 영양소와 내생 물질은 분뇨를 통해 배설되는데, 배설물들이 축사 또는 사육장 바닥에 쌓여 혐기성 미생물에 의해 발효되면 Hydrogen sulfide(H₂S), Ammonia(NH₃), 및 Methanethiol(CH₄S) 등의 악취물질들이 생성된다. 이러한 악취물질들은 동물의 건강과 생산성에 영향을 미칠 뿐만 아니라 환경오염문제를 야기할 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 동물의 생산성을 높이기 위해 생체에 부작용이 없고, 환경 독성으로부터 세포보호효과를 가지면서 동시에 악취제거 효과를 가진 물질들을 천연물로부터 찾으려는 연구가 다각도로 진행되고 있다.

한편, Curcumin은 생강과에 속하는 Curcuma longa(L.)의 뿌리에서 추출되는 노란색의 천연 폴리페놀 화합물로서, 인체에 다양한 약리학적 효과를 가지고 있으며, 특히 소취 능력을 가지고 있는 천연물로 알려져 있다. 그러나, 이러한 생리학적 효과가 있음에도 불구하고, 소화기관에서의 낮은 흡수율로 인해 생체 이용률이 매우 낮다고 보고되었다.

최근에 Curcumin의 흡수율을 높이기 위한 새로운 약물전달체계를 개발하려는 많은 노력들이 이루어져왔으며, 특히 Curcumin의 나노화에 대한 다양한 연구와 더불어, 나노화한 Curcumin의 또 다른 형태인 Curcumin nano-emulsions의 경우, 마우스 염증반응을 85% 이상 억제할 뿐만 아니라, Curcumin을 투여한 마우스 보다 그 생체 이용률이 3배 이상 증가하는 것으로 보고 되었다(Liu and Chang, 2011).

이와 같은 결과는 Curcumin의 흡수율을 높이기 위한 새로운 약물전달체계를 개발함에 있어서, 나노화 방법을 통한 입자의 크기 조절의 필요성뿐만 아니라, 혈액에서의 순환, 결합 친화력, 표적화 등에 영향을 미치는 입자의 형태 또한 Curcumin 생체 이용률을 높여주는 필수요소임을 시사한다.

이에 본 발명자들은 생체 이용률을 증대시키기 위한 Curcumin을 연구개발을 하던 중 세포막과 동일한 구조이며, 인지질 이중층을 포함하여 생체 이용률이 증대된 Curcumin nanospheres(나노화된 구형의 Curcumin, CN)의 제조방법을 개발하였다.

1. Ravindranath and Chandrasekhara, 1980; Sharma et al., 2001

본 발명의 목적은 생체 이용률을 향상시키기 위해 세포막과 동일한 구조인 인지질 이중층을 갖는 커큐민 나노스피어의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명자들은 Curcumin의 생체 이용률을 증대시키기 위해 세포막과 동일한 구조인 인지질 이중층을 갖는 Curcumin Nanospheres(나노화된 구형의 Curcumin, CN)의 제조방법을 개발하였고, 이에 따른 Curcumin Nanospheres를 개발하여 상기 종래의 Curcumin과 비교하여 CN의 환경 독성 물질 제어효과를 조사하고, 마우스를 이용하여 CN의 악취저감 및 사료 효율에 미치는 영향을 조사함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다. 또한, 본 발명의 Curcumin Nanospheres는 기능성 식품, 약학 조성물, 그리고 화장료 조성물에 적용할 수 있다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위한, 하나의 양태로 본 발명은 커큐민 또는 커큐민 유도체를 비극성 용매에 혼합하여 커큐민 나노입자를 제조하는 단계; 그리고 상기 커큐민 나노입자와 인지질을 혼합하여 커큐민 나노스피어를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 커큐민 나노스피어의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 “커큐민”은 항종양, 항산화, 항아밀로이드와 항염증작용을 가지고 있다. 상기 항염증작용은 이코사노이드(Eicosanoid) 생합성의 억제에 의해서 기능을 수행한다. 또한, 커큐민은 산화에 의한 DNA 손상과 지질과산화를 억제하고, 항산화 작용과 자유래디컬 제거하는 역할을 한다. Cytochrome P450의 잠재적인 억제와 글루타티온-S-전이효소(glutathione S-transferase)을 유도하는 것에 의해 역할을 수행한다. 상기 커큐민은 Azoxymethane 유발 동물 대장암의 초기 발암과정을 차단하며, 벤조피렌(benzopyrene)에 의한 DNA adduct의 형성을 억제하여 항발암작용 및 항돌연변이 작용을 가진다. 커큐민은 쥐실험에서 벤조피렌, 7,12-dimethylbenz anthracen, phorbol ester로 유발시킨 피부암, 위암, 구강암의 형성 및 촉진을 억제시키고, N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidin으로 유발시킨 위암형성을 억제하는 기능을 수행할 수 있다.

상기 커큐민은 하기의 화학식 1로 표시될 수 있다.

[화학식 1]

본 발명에서, 용어 “유도체”란 본 발명의 어떤 화합물의 일부를 화학적으로 변화시켜 얻어지는 유사화합물로서, 본 발명의 커큐민 화합물이 화학적으로 변화된 유사화합물을 의미한다.

본 발명에서 커큐민 나노입자를 제조하는 제조하는 단계는 커큐민 또는 유도체를 비극성 용매에 1:3~5 중량비로 혼합하여 혼합액을 제조하는 과정과, 상기 제조된 혼합액 1ml를 50ml의 끊는 물에 적가하며 40 내지 60 ㎑로 초음파 처리하는 과정과, 상기 초음파 처리된 용액을 교반기에서 700 ~ 900 rpm으로 15 ~ 25분 동안 교반한 후 감압농축시키는 과정과, 상기 감압농축된 용액을 동결건조하여 커큐민 나노입자를 수득하는 과정을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 “비극성 용매”란 용매분자가 영구쌍극자를 갖지 않아 그 결과 극성의 화학종에 분자간 회합을 일으킬 힘이 없는 용매를 의미한다.

상기 비극성 용매는, 톨루엔, 벤젠, 헥산, 디메틸에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 디클로로메탄로 이루어진 그룹 중 선택되는 1종일 수 있으며, 구체적으로 톨루엔일 수 있다.

본 발명에서 상기 커큐민 나노입자와 인지질을 혼합하여 커큐민 나노스피어를 제조하는 단계는, 디클로로 메탄(Dichloromethane)과 인지질 분말을 혼합하여 제1 혼합물을 제조하는 과정과, 상기 커큐민 나노입자와 상기 제1 혼합물을 1:0.5~2 (중량/부피)비로 혼합하여 제2 혼합물을 제조하는 과정과, 상기 제2 혼합물을 1~2 시간 동안 40 내지 60 ㎑로 초음파 처리하여 커큐민 나노스피어를 수득하는 과정을 포함한다.

상기 인지질은 상기 인지질은, 포스파티딜콜린(Phosphatidylcholine, PC), 포스파티드산(Phosphatidic acid, PA), 포스파티딜에탄올아민(Phosphatidylethanolamine, PE), 포스파티딜세린(Phosphatidylserine, PS), 포스파티딜이노시톨(Phosphatidylinositol, PI), 포스파티딜이노시톨 포스페이트(Phosphatidylinositol phosphate, PIP), 포스파티딜이노시톨 바이포스페이트(Phosphatidylinositol biphosphate, PIP2) 및 포스파티딜이노시톨 트라이포스페이트(Phosphatidylinositol triphosphate PIP3)로 이루어진 그룹 중 선택되는 1종일 수 있으며, 구체적으로는 포스타파딜콜린일 수 있다.

본 발명에서 상기 “포스파티딜콜린”은 “레시틴”을 의미한다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위한, 하나의 양태로 상기한 제조방법에 따라 제조되는 커큐민 나노스피어를 제공한다.

상기 커큐민 나노스피어는 구성이고, 지름이 30 ~ 200nm일 수 있으며, 구체적으로 40 ~ 150nm일 수 있으며, 더욱 구체적으로 60 ~ 100nm일 수 있다.

상기 커큐민 나노스피어는 커큐민의 생체 흡수 효율을 향상시키는 것이다.

본 발명의 일실시예로 상기 커큐민 나노스피어를 포함하는 사료용 조성물을 제공한다.

상기 커큐민 나노스피어를 포함하는 사료용 조성물은, 분변 내의 악취를 억제하는 용도인 것이며, 상기 악취 억제는 분변 내의 악취 물질인 H₂S 또는 NH₃의 함량을 억제한다.

또한, 상기 커큐민 나노스피어를 포함하는 사료용 조성물은 환경독성 물질의 독성을 감소시킨다.

본 발명에서 상기 커큐민 나노스피어를 포함하는 사료용 조성물은 동물사료, 동물간식 등의 제품에 첨가하기 용이하게 하기 위하여 분말 또는 액상의 형태일 수 있다.

본 발명의 일실시예의 동물용 제품은 상기 커큐민 나노스피어를 포함하는 사료용 조성물과 함께 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이, 효소, 살아있는 미생물 제제 등과 같은 각종 보조제; 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀과 같은 곡물; 평지, 콩 및 해바라기 같은 식물성 단백질; 혈분, 육분, 골분 및 생선분 같은 동물성 단백질; 각종 분유 및 유장 분말과 같은 당분 및 유제품을 포함할 수 있다.

상기 동물용 제품은 상기 커큐민 나노스피어를 포함하는 사료용 조성물을 제품 총 중량 대비 바람직하게는 0.1 ~ 50중량% 더욱 바람직하게는 0.2~10중량% 포함할 수 있으나, 배합량이 상기의 범위에 한정되는 것은 아니다. 상기 동물용 제품이 사료용 조성물을 상기 함량으로 포함할 경우 동물의 분변 내의 악취물질인 H₂S 또는 NH₃의 감소시켜 분변의 악취를 억제하는 효과가 있다.

본 발명의 일실시예로 상기 커큐민 나노스피어를 포함하는 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 '건강 기능성 식품 조성물'에서, 기능성 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 커큐민 나노스피어를 첨가할 수있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미의 건강기능식품 또는 건강보조식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강 기능성 식품 조성물에서 상기 커큐민 나노스피어를 포함하는 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 본 발명의 건강 기능성 식품 조성물에서 커큐민 나노스피어를 포함하는 조성물의 첨가량은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 본 발명의 건강 기능성 식품 조성물 총 중량에 대하여 상기 커큐민 나노스피어를 포함하는 조성물을 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예로 상기 커큐민 나노스피어를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물이 약학 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약학 조성물은 약학으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약학으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이 에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구, 비경구 투여 또는 피부패치로 사용할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 점막 투여 및 점안 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.0001-100 ㎎/kg(체중)이다.

본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로

제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위한, 하나의 양태로 상기 커큐민 나노스피어를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 커큐민 나노스피어를 포함하는 화장료 조성물은 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(Foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다.

또한, 상기 커큐민 나노스피어를 포함하는 화장료 조성물은, 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없다. 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 메이컵 베이스, 파운데이션, 염모제, 샴푸, 린스, 바디 세정제, 연고, 패치 또는 분무제 등의 화장료 조성물로 제형화될 수 있다. 이들 각 제형은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있다.

본 발명의 생체 이용률이 향상된 커큐민 나노스피어의 제조방법을 이용하면, 커큐민의 흡수율을 높임으로써, 세포 내 환경 독성 물질의 작용을 억제하는 효과가 있다. 또한, 동물의 장기 및 혈액에 독성 효과를 가지지 않으면서, 동물 사료 효율 및 악취를 저감하는 효과가 있다.

도 1은 커큐민 나노스피어의 제조방법을 도식화한 것이다.
도 2는 커큐민 나노스피어의 합성 메커니즘을 나타낸 것이다.
도 3는 커큐민 나노스피어 입자의 UV-가시광선 흡광도를 나타낸 것이다.
도 4는 커큐민 나노스피어 입자의 FE-SEM(스케일바=100nm) 이미지를 나타낸 것이다.
도 5는 커큐민 나노스피어 입자의 FE-SEM(스케일바=100nm) 이미지를 나타낸 것이다.
도 6은 커큐민 나노스피어 입자의 FE-SEM(스케일바=100μm) 이미지를 나타낸 것이다.
도 7은 커큐민 나노스피어 입자의 FT-IR 분석결과를 나타낸 것이다.
도 8A는 1Nm의 톨루엔으로 처리된 HCT116 세포에서 LDH의 세포독성 시간을 나타낸 것이고, 도 8B는 HCT116 세포를 톨루엔 존재하에 커큐민과 커큐민 나노스피어 입자를 처리한 후 LDH의 세포독성 시간을 나타낸 것이며, 도 8C는 HCT116세포에 톨루엔 및 커큐민 나노스피어 입자를 24시간 동안 처리한 후 MTT 분석으로 세포 생존율을 측정한 것이다.
도 9는 마우스에 커큐민 나노스피어를 14일 동안 처리한 후 H₂O(A)와 NH₃(B)의 농도를 분석한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예1> 커큐민 나노스피어의 준비

커큐민 나노입자(Curnumin nanoparticle)를 제조하는 단계, 그리고 나노구체(Nanosphere) 형성(formulation)하는 단계를 거쳐 커큐민 나노스피어는 제조하였다.

실시예1.1. 커큐민 나노입자의 제조

커큐민(1,7-bis (4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione, curcumin) 분말을 톨루엔(toluene) 20㎖에 5㎎/㎖의 농도로 용해시키고, 커큐민 스톡용액을 제조하였다. 상기 커큐민 스톡 1㎖을 끊는 물 50㎖에 적가하고 50㎑로 초음파를 처리하였다. 그 후 800rpm에서 20분간 교반하고 회전식감압농축기를 사용하여 40℃에서 감압하에 농축시키고, 이를 동결건조하여 커큐민 나노입자 분말을 제조하였다.

실시예1.2. 나노스피어의 형성

디클로로메탄(Dichloromethane) 40㎕에 레시틴(Phosphatidylcholine) 분말 0.2㎎을 첨가하고 레시틴 혼합물을 제조하였다. 상기 레시틴 혼합물과 상기 커큐민 나노입자 분말을 1: 1의 (중량/부피) 비율로 혼합한 후, 20 내지 30㎑에서 2시간 동안 초음파 처리하여 투명한 오렌지색의 커큐민 나노스피어(Curcumin nanosphere, CN)를 제조하였다.

<실시예2> 커큐민 나노스피어의 특성 분석

실시예1에서 제조된 커큐민 나노스피어의 특성을 확인하기 위해, UV- 가시광선 분광광도계(UV-visible spectrophotometer), 전계 방출 주사 전자 현미경(Field-emission scanning electron microscopy, FE-SEM), 푸리에 변환 적외선 분광기(Fourier　Transform Infrared Spectroscopy, FTIR)를 이용하여 분석하였다.

<실시예3> 세포배양 및 LDH 측정

장 상피 세포(HCT116 cells)는 한국 세포주 은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 구입하였으며, McCoy's medium에 10% FBS와 100 U/ml Penicillin 및 100 mg/ml Streptomycin을 혼합한 후, 37℃의 5% CO₂ Incubator에서 배양하였다. 장 상피 세포에서 CN의 환경 독성 물질 억제 효과는 젖산 기질법을 이용해 측색법으로 세포독성을 정량화하는 lactate dehydrogenase(LDH) kit(Thermo Scientific, Hudson, NH, USA)를 사용하여 Microplate reader(SPARK, Seestrasse, Mδnnedorf, Switzerland)로 490nm와 680nm 파장에서 흡광도를 측정하였으며, LDH cytotoxicity 값은 [(Maximum LDH activity spontaneous LDH activity) /(Compound-treated LDH activity spontaneous LDH activity)×100]과 같은 공식을 활용해 표시하였다.

<실시예4> MTT 분석

장 상피 세포에 CN과 톨루엔을 처리한 후, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT)를 처리하고 2시간 동안 CO² 세포배양 기에서 배양하였다. 배양 후 형성된 자색의 Formazen 결정을 육안 및 현미경을 이용해 관찰하고 세포를 PBS를 이용하여 2번 세척하였다. 500 ㎕의 Dimethyl sulfoxide (DMSO)를 처리하고 Formazen을 완전히 용해시킨 후, 200 ㎕씩 96-Well flat bottom plates에 분주하여 570 nm에서 그 흡광도를 측정하였다.

<실시예5> 사료 효율 및 장기 독성 측정

실험동물은 6주령의 ICR계 수컷 마우스(n=9)를 사용하였으며, CN을 10 μg/kg의 농도로 경구 투여하였고, 대조군의 경우, PBS를 투여하였다. 14일간 격일에 한번씩 Animal feeding needle을 이용하여 경구 투여하였으며, 마우스의 체중 및 식이섭취량은 식이개시일부터 14일간 측정하여 사료 효율 계산에 이용하였다.

사료 효율(%)은 [(증체량/사료섭취량)×100]으로 계산하였다. 15일째에 마우스를 Ether로 마취한 후 안와정맥총 채혈법에 의 해 혈액을 채취하고 4 에서 10,000×g로 2분 동안 원심 분리한 후 혈청을 취하여 실험에 사용하였다. CN의 마우스 내 독성효과를 알아보기 위해 마우스를 개복하여 장기(간, 심장, 콩팥 및 비장)를 적출하였다. 장기는 생리식 염수를 이용하여 혈액을 제거한 후 거름종이에서 수분을 제거하고 각각의 무게를 측정하였다. 2.6. GOT, GPT 및 LDH 측정 마우스 혈액의 Glutamate Oxaloacetate Transaminase (GOT), Glutamate Pyruvate Transaminase (GPT)는 Reitman Frankel 법에 의해 조제된 아산제약의 Kit (Asanpharm, Dajeon, Korea)로 측정하였으며, LDH는 LDH kit(Thermo Scientific, Hudson, NH, USA)를 이용하여 측정하였다. GOT, GPT의 측정을 위해 각각 1 ㎖의 기질액을 취해37℃ 에서 5분간 가온한 후, 0.2 ㎖의 혈청을 첨가하여 더 반응시켰다. 여기에 1 ㎖의 정색 시액을 첨가해 실온에 20분간 반응시켰다. 10 ㎖의 Sodium hydroxide solution을 첨가한 후, Microplate reader(SPARK, Seestrasse, Mδnnedorf, Switzerland)를 이용해 505nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

<실시예7> H ₂ S 및 NH ₃ 농도 측정

식이개시일부터 14일간 총 4번에 걸쳐 하루에 배설되는 분을 수집해서 이물질을 제거하고 무게를 확인한 후 시료 내 악취물질인 Hydrogen sulfide(H₂S)와 Ammonia(NH₃)의 농도를 측정하였다. H₂S 농도의 경우, 100 ㎖의 ddH₂O에 용해시킨 시료를 Alka-Seltzer tablets와 넣고 2분간 방치한 후 H₂S kit (Model NI-SA, HACH, USA)를 사용하여 측정하였다.

NH₃ 농도의 경우, NH₃ kit (Model NI-SA, HACH, USA)를 사용하였으며, 5 ㎖의 ddH₂O에 용해시킨 시료에 Ammonia salicylate reagent powder를 첨가하여 3분간 반응시켰다. 여기에 Ammonia cyanurate reagent powder를 첨가하여 15분간 더 반응시켰고, 시약이 녹색으로 변한 후 Color comparator box에 넣어 결과값을 측정하였다.

<실시예8> 통계처리

모든 실험은 최소 3회 이상 반복하였으며, 실험결과는 Means±S.E.로 표현하였다. 유의적 차이는 Student's test 및 One-way analysis of variance (ANOVA) 이용하여 결정하였으며, p-values<0.05의 값들을 유의적인 결과로 고려하였다.

< 결과 및 고찰>

<실험예1> 나노스피어의 특성

실험예1.1. UV- 가시 광선 분광 광도 분석

커큐민 나노스피어 입자를 수용액(1㎎/㎖)을 LAMBDA25, Perkin Elmer 분광광도계를 이용하여 300 내지 700㎚ 파장 범위에서 스캐닝하여 특성 피크를 검출하였다. 분석결과, 커큐민 나노스퍼어는 430nm를 중심으로 단일 피크가 검출되어 증류수에서 가용성(Solubilization)이 있음을 확인하였다(도 3).

실험예1.2. 전계 방출 주사 현미경 분석

일반 커큐민과 커큐민 나노스피어 입자의 표면형태 및 입자 크기의 비교 분석을 위해 전계 방출 주사현미경(Field emission scanning electron microscope, JSM-6700F, JEOL Ltd.)을 이용하여 저배율 및 고배율에서 분석을 수행하였다.

커큐민 나노스피어 입자의 수성 분산액을 유리 슬라이드에 펼치고 건조시키고, 이후 샘플을 진공 조건에서 200 *?* 두께의 백금층으로 오스윰 플라즈마 스퍼터 코팅기(osmium plasma sputter coater, OPC80 T)에서 코팅하였다.

분석결과, 커큐민 나노스피어 입자가 구형이며 100㎚ 미만의 직경을 가지며, 형상이 균일함을 확인하였다(도 4). 일반 커큐민과 커큐민 나노스피어 입자의 입자 형태를 비교 분석하면, 일반 커큐민 입자는 육각형, 다각형 및 삼각형 형태로 형태가 각기 다르게 나타났다(도 5). 반면 커큐민 나노스피어 입자는 정확하게 구형의 형태를 가짐을 확인하였다(도 6).

실험예1.3. 푸리에 변환 자외선 분광법

FT-IR 분광법을 화합결합의 진동 주파수를 측정하여 작용기(functional groups)를 분석하였다. FT-IR 분석을 통해 conjugate complexes의 형성을 확인하고, 추가적으로 유기 분자의 결합, 분자환경 및 나노입자의 구조적인 특성을 분석하였다.

화합물의 진동 스펙트럼은 푸리에 변환 자외선 분광기(FTIR, Nicolet 6700)를 사용하여 분석하였으며, 스펙트럼은 diffused reflectance accessory (DRA)를 이용하여 500 내지 4000cm^-1의 파수 범위에서 분석하였고 백그라운드 스펙트럼은 브롬화 칼륨(potassium bromide, KBr)이다.

분석결과를 통해 얻은 분자 데이터는 나노입자 표면의 self-assembled 작용기의 구조 및 형태적 변화를 분석할 수 있다(도 7).

<작용기의 구조 및 형태 분석한 결과가 첨부 또는 기재부탁드립니다.>

<실험예2> 장 상피 세포(HCT116 cells)에서 Curcumin Nanospheres (CN)의 환경 독성 물질 억제 효과

Curcumin(C₂₁H₂₀O₆)은 소화기관에서의 낮은 흡수율로 인해 생체 이용률이 매우 낮아 75% 정도가 분변에서 검출된다고 알려져 있다. 따라서, 본 발명에서는 Curcumin의 흡수율 및 생체 이용률을 높이기 위해 Curcumin Nanospheres(CN)를 제조하였고, CN의 약리학적 능력을 Curcumin과 비교 분석하였다.

방향족 탄화수소인 톨루엔(Toluene)은 자일렌(Xylene)과 함께 도료, 잉크, 페인트, 고무, 접착제 및 화학공업 제품원료 등으로 널리 사용되고 있는 휘발성 유기화합물(Volatile organic compounds) 중 하나로서 대기 중에서 2차 오염물질을 생성하여 환경 독성을 유도하거나, 인체 건강에 심각한 부작용을 일으킬 수 있다.

도 8에서 보는 바와 같이, 1 mM의 톨루엔을 인간 장 상피 세포(HCT116 cells)에 처리하였을 때, 세포막 손상으로 인한 세포독성 지표인 Lactate dehydrogenase(LDH) 수준은 대조군과 비교하여 2시간째 74.6%만큼 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 흥미롭게도, 10 ng/ml의 Curcumin의 경우, 톨루엔과 함께 처리하였을 때 LDH 수준을 43% 억제한 반면, 10 ng/ml의 CN의 경우, 약 88% 억제하는 2배 이상의 세포독성 억제효과를 보여주었다 (도 81B).

톨루엔이 장 상피 세포의 생사에 미치는 효과를 알아보기 위해, 세포생존율의 생물표지자 측정방법인 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide (MTT) 실험을 수행하였다. 장 상피 세포를 톨루엔에 24시간 노출시켰을 때, 세포의 생존률은 68.7% 감소한 반면, 10 ng/ml의 CN의 처리는 98.5%로 대조군과 비슷한 수준으로 세포 생존률을 유지시키는 효과를 보여주었다(도 8C). 이와 같이 본 발명의 일 실시예에 따른 커큐민 나노스피어는 Curcumin의 흡수율이 증대되는 것을 확인할 수 있다.

<실험예3> CN의 마우스 장기 및 혈액 독성에 미치는 영향

체내에 흡수된 CN의 독성유무를 알아보기 위해, 마우스 모델을 활용해 다양한 독성검증실험을 수행하였다.

< 결과 및 고찰>

<실험예1> 나노스피어의 특성

실험예1.1. UV- 가시 광선 분광 광도 분석

실험예1.2. 전계 방출 주사 현미경 분석

커큐민 나노스피어 입자의 수성 분산액을 유리 슬라이드에 펼치고 건조시키고, 이후 샘플을 진공 조건에서 200 Å 두께의 백금층으로 오스윰 플라즈마 스퍼터 코팅기(osmium plasma sputter coater, OPC80 T)에서 코팅하였다.

실험예1.3. 푸리에 변환 자외선 분광법

<실험예3> CN의 마우스 장기 및 혈액 독성에 미치는 영향

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 10 μg/kg의 CN을 2주간 마우스에 경구 투여하였을 때, 독성으로 인한 무게의 변화가 고려되는 간, 심장, 콩팥 및 비장의 무게는 PBS만을 처리한 대조군과 비교하여 유의적인 차이를 보이지 않았다. 특히 모든 마우스를 부검하여 주요 내부 장기의 육안적 소견을 관찰한 결과, 외관상 어떠한 이상 병변도 발견되지 않았다. 이러한 결과는 CN의 경구투여는 마우스에 어떠한 병적 이상이나 성장저해 현상을 나타내지 않는다는 것을 확인할 수 있다.

체내에 흡수된 CN의 혈액 독성유무를 판단하기 위해, 마우스 모델을 활용해 Glutamate Oxaloacetate Transaminase (GOT), Glutamate Pyruvate Transaminase (GPT) 및 lactate dehydrogenase(LDH)의 활성을 추가적으로 측정하였다.

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 10 μg/kg의 CN을 2주간 마우스에 경구 투여 하였을 때, 혈액 독성으로 인한 GOT, GPT 및 LDH 수준은 각각, 0.96 ± 0.04 IU/L, 0.80 ± 0.05 IU/L, 및 97.43%로 PBS만을 처리한 대조군과 비교하여 유의적 인 차이를 보이지 않았다. GOT, GPT 및 LDH의 활성은 세포손상 후 순환계로 분비되어 혈중에서의 그 활성이 증가하는 점에서 독성과 많은 관련이 있으며, 특히, GOT 및 GPT는 독성에 관여하는 주요 장기에 많이 분포되어 있어 세포나 조직에 이상이 있을 시 혈중으로 유리되어 그에 따른 농도의 증가가 나타내는 것으로 보고되었다. 따라서, CN은 동물의 장기 및 혈액에 독성 효과를 가지지 않으면서, Curcumin의 흡수율을 높여서 그 약리효과를 증대시킬 수 있는 효과적인 약물 전달체계가 될 수 있는 가능성을 확인할 수 있다.

<실험예4> CN이 마우스 사료 효율에 미치는 영향

독성효과를 보이지 않으면서, 동시에 Curcumin 보다 생체 흡수율 및 약리학적 효과가 높은 CN이 동물의 영양소 이용률에 미치는 영향을 알아보기 위해, 섭취한 사료에 대한 증체량을 의미하는 동물 사료 효율에 대해 조사해 보았다.

상기의 표 3에서 보는 바와 같이, 10 μg/kg의 CN을 2주간 마우스에 경구 투여 하였을 때 변화되는 일당 평균 증체량은 대조군과 비교했을 때 유의적 차이가 나지 않았지만, 일당 평균 사료섭취량은 유의적으로 19.07 g/day 감소하였고, 이에 따라 사료 효율이 대조군에 비해 3.58% 크게 증가함을 알 수 있었다. 이러한 결 과는 인지질 이중층의 구조를 갖춘 CN이 소장 기관 내 다양한 세포들(상피, 점막, 내분비 및 줄기 세포 등) 안으로 Curcumin의 흡수를 용이하게 할 뿐만 아니라, 섭취한 영양소 이용률 및 대사적 효율을 증대시켜 소량의 사료섭취량으로도 유의적인 증체량을 나타낸다는 것을 의미한다.

<실험예5> CN이 마우스 분내 악취저감에 미치는 효과

Curcumin의 나노화 구형인 CN의 사료 효율 촉진 효과와 더불어, 일반적으로 Curcumin은 소취효과가 있어 악취물질을 제거하는데 사용 되어왔다. 인간의 후각을 자극하여 생활과 건강에 피해를 주는 Hydrogen sulfide (H₂S)와 Ammonia(NH₃)는 악취의 주된 오염물질이다. CN의 경구 투여가 마우스의 분내 악취물질 농도에 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 식이개시일부터 14일간 총 4번에 걸쳐 하루에 배설되는 분을 수집해서 악취의 주요 원인물질로 알려진 H₂S와 NH₃의 농도를 측정하였다.

도 9A 와F 9B에서 보는 바와 같이, 10 μg/kg의 CN을 2주간 마우스에 경구 투여하였을 때, 마우스의 분내의 H₂S와 NH₃ 농도는 시간에 따라 점차 감소하였다.

특히 CN 경구투여 14일째 H₂S 및 NH₃ 농도는 대조군에 비해 각각 0.133 및 0.166ppm 만큼 유의적으로 감소되었다. 이와 같은 결과는 CN의 경우, 사료 효율과 더불어 분내 악취물질의 농도를 감소시키는 다중적인 약리학적 효과를 가지고 있 음을 확인하였다.

이와 같은 현상은 방향족 화합물인 CN이 소화기관내 세포들의 다양한 독성 물질 배설과 관련된 대사기전에 영향을 미칠 수 있음을 시사하며, 새로운 가 축분뇨 악취저감제로서의 사용할 수 있다.

종합적으로, 위와 같은 결과는 CN은 Curcumin의 흡수율을 높여서 환경 독성 물질의 세포적 작용을 억제하고, 동물의 장기 및 혈액에 독성 효과를 가지지 않으면서 사료 효율 및 악취저감을 촉진하는 Curcumin의 효과적인 약물전달체계에 적용할 수 있다.

Claims

커큐민 또는 커큐민 유도체를 비극성 용매에 혼합하여 커큐민 나노입자를 제조하는 단계; 그리고
상기 커큐민 나노입자와 인지질을 혼합하여 커큐민 나노스피어를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 커큐민 나노스피어의 제조방법으로서,
상기 커큐민 나노입자를 제조하는 단계는,
커큐민 또는 유도체를 비극성 용매에 1:3~5 중량비로 혼합하여 혼합액을 제조하는 과정과, 상기 제조된 혼합액 1ml를 50ml의 끊는 물에 적가하며 40 내지 60 ㎑로 초음파 처리하는 과정과, 상기 초음파 처리된 용액을 교반기에서 700 ~ 900 rpm으로 15 ~ 25분 동안 교반한 후 감압농축시키는 과정과, 상기 감압농축된 용액을 동결건조하여 커큐민 나노입자를 수득하는 과정을 포함하고,
상기 커큐민 나노입자와 인지질을 혼합하여 커큐민 나노스피어를 제조하는 단계는,
디클로로 메탄(Dichloromethane)과 인지질 분말을 혼합하여 제1 혼합물을 제조하는 과정과, 상기 커큐민 나노입자와 상기 제1 혼합물을 1:0.5~2 (중량/부피)비로 혼합하여 제2 혼합물을 제조하는 과정과, 상기 제2 혼합물을 1~2 시간 동안 40 내지 60 ㎑로 초음파 처리하여 커큐민 나노스피어를 수득하는 과정을 포함하고,
상기 커큐민 나노스피어는 구형이고, 지름이 30 내지 200㎚이며, 커큐민의 생체 흡수 효율을 향상시키고, 분변 내의 악취 물질인 H₂S 또는 NH₃의 함량을 억제하는 것을 특징으로 하는 커큐민 나노스피어의 제조방법.
삭제
제1항에서,
상기 비극성 용매는, 톨루엔, 벤젠, 헥산, 디메틸에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 디클로로메탄로 이루어진 그룹 중 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는, 커큐민 나노스피어의 제조방법.
삭제
제1항에서,
상기 인지질은,
포스파티딜콜린(Phosphatidylcholine), 포스파티드산(Phosphatidic acid), 포스파티딜에탄올아민(Phosphatidylethanolamine), 포스파티딜세린(Phosphatidylserine), 포스파티딜이노시톨(Phosphatidylinositol), 포스파티딜이노시톨 포스페이트(Phosphatidylinositol phosphate), 포스파티딜이노시톨 바이포스페이트(Phosphatidylinositol biphosphate) 및 포스파티딜이노시톨 트라이포스페이트(Phosphatidylinositol triphosphate)로 이루어진 그룹 중 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는, 커큐민 나노스피어의 제조방법.
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