KR102155730B1 - 포스파티딘산을 유효성분으로 포함하는 노화 억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포스파티딘산의 노화 억제 용도에 관한 것으로, 구체적으로 포스파티딘산을 유효성분으로 포함하는, 노화 억제용 화장료 조성물; 노화 억제용 건강기능식품 조성물; 노인성 질환 치료용 약학 조성물; 및 노인성 질환 치료 보조용 의약외품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 포스파티딘산을 유효성분으로 포함하여, 세포 생존능을 증가시켜 세포 수명 연장의 효과를 가지므로, 피부 노화 억제 또는 주름 개선; 및 세포의 노화와 관련된 노인성 질환의 예방 또는 치료 효과를 가질 수 있다. 특히, 포스파티딘산은 지질 성분으로 체내 흡수가 용이하므로 건강기능식품 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

포스파티딘산을 유효성분으로 포함하는 노화 억제용 조성물{A composition for anti-aging comprising phosphatidic acid as an active ingredient}

본 발명은 포스파티딘산의 노화 억제 용도에 관한 것으로, 구체적으로 포스파티딘산을 유효성분으로 포함하는, 노화 억제용 화장료 조성물; 노화 억제용 건강기능식품 조성물; 노인성 질환 치료용 약학 조성물; 및 노인성 질환 치료 보조용 의약외품 조성물에 관한 것이다.

노화란 질병이나 사고에 의한 것이 아니라 시간의 흐름에 따라 생체 구조와 기능이 쇠퇴하는 현상을 말하며, 개체에 따라 수많은 요인에 의해 노화의 촉진 또는 억제가 일어날 수 있다. 노화는 크게 내인성 노화와 외인성 노화로 나누어진다. 내인성 노화는 텔로미어의 마모와 같은 유전적 요인과 큰 연관이 있으며, 일반적으로 나이를 먹어감에 따라 자연스럽게 늙어가는 과정이 여기에 속한다. 반면에 외인성 노화는 UV, 흡연, 외부적 스트레스 등과 같은 환경적인 요인에 의해 발생하는 노화를 말한다. 특히 피부에서 외인성 노화가 진행되면, 색소 침착이 발생하거나 새포 재생이 느려지고, 피부 탄력이 감소하여 콜라겐, 엘라스틴과 같은 세포외 기질의 붕괴 등이 일어나게 된다.

피부 노화에 있어서는 UV가 외인성 노화의 가장 일반적이며 크게 작용하는 요인이며, ROS를 생성하고 DNA에도 피해를 입히게 된다. UV에 의해 생성되는 ROS는 mitogen-activated protein kinase(MAPK) 경로를 촉진시키는데, 이때 가장 먼저 AP-1과 NF-κB가 활성화된다. AP-1과 NF-κB가 활성화되면, ECM remodeling에 중요한 역할을 하는 matrix metalloproteinases(MMPs)가 발현된다. MMP는 피부에서 주름을 형성하는 큰 요인인데, 인간의 피부에서 MMP-1, MMP-3, MMP-9의 발현이 주름을 형성한다고 알려져 있다. UV에 의한 DNA 손상은 p53 및 p21의 발현을 증가시키므로, p53 및 p21 단백질은 노화를 측정하는 지표로 사용된다. 또한, 세포의 노화는 다양한 분자적인 형태 및 표현형으로 특징지을 수 있는데, 세포 모양이 납작해지거나 senescence associated-β-galactosidase(SA-β-gal_) 활성이 증가하는 등이 이에 포함된다.

이러한 노화와 관련하여, 내인성 노화를 근본적으로 차단할 수 있는 방법에 대해서는 크게 밝혀진 바가 없으나, 다양한 외부적 요인을 차단하거나, 외부적 요인에 의해 손상된 신체를 회복과 관련한 많은 연구가 진행되어 왔다.

더욱이 현대 의학의 발전에 따라 인간 수명이 증가하여, 단순한 수명 연장이 아닌, 신체적인 건강 및 노화가 나타나는 외적인 부분의 관리에 많은 관심이 쏠리고 있는 실정이다. 그러나 항노화와 관련된 화장품, 건강기능 식품 등의 산업에서는 몇몇의 화학 물질 또는 천연 물질이 외부적 요인을 단편적으로 차단하거나, 자외선 차단제나 주름 개선 화장품과 같은 피부의 재생 용도에 치중되어 왔다.

한편, 포스파티딘산(phosphatidic acid)과 관련하여, 포스파티딘산을 유효성분으로 포함하는 약제 조성물로서, 금단 증후군 또는 폐경기 여성의 발열 발생 치료에서의 용도가 알려져 있으나(국내등록특허 1004046930000), 상기 문헌을 포함한 공지된 다른 문헌에도 포스파티딘산의 노화 억제 효과에 대해서는 전혀 알려진 것이 없다.

이러한 배경하에서, 상기와 같은 한계점을 극복하기 위해 본 발명자는 외인성 요인을 1차적으로 차단하는 것이 아닌, 외인성 요인에 의해 발생하는 물질과 그에 따른 체내 신호전달 경로 자체를 억제함으로써 근본적으로 노화를 억제할 수 있는 조성물을 개발하고자 하였다. 따라서, 노화가 이미 진행되었거나 이후에 진행될 노화를 더디게 하는 방법에 초점을 맞춘 것이다. 이에, 본 발명과 관련한 연구에서는 포스파티딘산의 처리가 노화 관련된 바이오마커의 발현, 노화에 따른 운동성 감소 및 수명 연장 효과에 미치는 영향에 관한 실험을 진행하였다. 또한, 다른 파장대의 UV를 조사한 경우보다 중파장인 UVB를 조사하였을 때 주름이 더 심각하게 형성되었다는 이전 문헌[Takama, Y., Imokawa, G. (1998) The effects of UVA and UVB irradiation on the viscoelastic properties of hairless mouse skin in vivo. Dermatology. 196(4) : 397-400.]의 내용을 참고하여, 세포에 외인성 노화를 유도하기 위해 UVB를 세포에 조사해주는 방법을 사용하였고, MMP를 생산하는 것으로 알려진 섬유아세포를 사용하여 포스파티딘산의 피부 노화에 미치는 영향에 관한 실험을 진행하였다.

본 발명의 하나의 목적은 포스파티딘산을 유효성분으로 포함하는 노화 억제용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 포스파티딘산을 유효성분으로 포함하는 노화 억제용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 포스파티딘산을 유효성분으로 포함하는 노인성 질환 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 포스파티딘산을 유효성분으로 포함하는 노인성 질환 치료 보조용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한, 본 발명의 하나의 양태는 포스파티딘산을 유효성분으로 포함하는 노화 억제용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서의 용어, "포스파티딘산(Phosphatidic acid)"은 일반적으로 carbon-1에 결합한 포화 지방산, carbon-2에 결합한 불포화 지방산 및 carbon-3에 결합한 인산기와 함께 글리세롤 백본으로 구성된다. 포스파티딘산은 크게 세가지 방법에 의해 형성될 수 있다. 첫째로, 포스포리파아제 D(PLD)에 의한 포스파티딜콜린의 P-O 결합의 가수분해를 통해 포스파티딘산과 콜린이 형성된다. 두번째로, DAG 키나아제에 의한 디아실글리세롤(DAG)의 인산화에 의해 포스파티딘산이 형성된다. 세번째로, lysoPA-아실트렌스퍼라제(LPAAT)에 의한 리소포스파티딘산의 아실화에 의해 포스파티딘산이 형성되며, 이는 포스파티딘산 형성의 가장 흔한 방법이다. 포스파티딘산은 가장 간단한 인지질이며, 세포의 기능에서 중요한 역할을 한다. 구체적으로, 포스파티딘산은 Raf-1이 세포막으로 이동하도록 촉진시키고, MAP 키나아제(MAPK) 경로의 활성을 유도한다. 또한, 포스파티딘산은 세포 내에서 중요한 lipid messenger의 역할로서 세포의 성장 및 증식, 분화, 세포 사멸, 소낭 수송, 세포 골격의 재구성, 물질 분비, 등과 같은 다양한 생리적 조절자의 역할을 한다.

본 발명에서의 용어, "노화 억제"는 당업계에 알려진 노화 과정을 늦추거나 막거나 또는 예방할 수 있는 효과를 말하는 것으로, 구체적으로 세포의 수명 연장, 세포의 노화에 따른 운동성 감소의 완화, 환경적 스트레스에 대한 내성 증가 등을 통한 노화 억제를 의미하고, 더 나아가 노화 방지를 의미할 수 있다.

본 발명에서의 용어, "주름"은 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미하는데, 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재하는 콜라겐과 엘라스틴의 감소, 외부환경 등에 의해 유발될 수 있다. 또한, 본 발명에서의 용어, "주름 개선"은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것을 말한다.

상기 노화 억제는 항산화 활성에 의해 달성되는 것일 수 있으며, 본 발명에서의 용어, "항산화 활성"이란 생체 내 활성산소의 생성을 방지하고, 세포에 회복 불가능한 손상을 야기하는 산화 현상을 방비하는 활성을 의미한다. 인체는 산화촉진물질(peroxidant)과 산화억제물질(antioxidant)이 균형을 이루고 있으나, 여러가지 요인들에 의하여 상기와 같은 균형 상태가 불균형을 이루게 되고, 산화촉진으로 균형이 기울게 되면, 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유발되어 잠재적인 세포손상 및 병리적 질환을 일으키게 된다. 이러한 산화적 스트레스의 직접적인 원인이 되는 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)은 불안정하고 반응성이 높아 여러 생체물질과 쉽게 반응하고, 체내 고분자들을 공격하여 세포와 조직에 비가역적인 손상을 일으키거나, 돌연변이, 세포독성 및 발암 등을 초래하게 된다. 이에, 본 발명의 노화 억제용 화장료 조성물은 상기와 같은 항산화 활성에 의해 노화 억제 또는 주름 개선 효과를 달성할 수 있다.

본 발명의 노화 억제용 화장료 조성물은 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선을 위한 화장료 조성물일 수 있으며, 구체적으로는 상기 피부 노화 또는 피부 주름은 자외선에 의해 유발된 것일 수 있다.

본 발명에서의 용어, "피부 노화"는 피부 조직의 탄력성이 저하되면서 피부가 주름지거나, 피부의 색소 침착, 피부의 탄력 감소 등 일반적으로 당업계에 알려져 있는 피부 노화 상태를 모두 포함하는 개념이다. 좀 더 구체적으로, 피부 노화는 나이가 들어감에 따라 자연히 발생하는 자연노화(intrinsic aging, 내인성 노화)와 주위 환경 특히 자외선에 의한 광노화(photoaging)로 나눌 수 있다. 광노화(photoaging)는 오랫동안 햇빛에 노출된 얼굴, 손등, 목뒤 등의 피부에서 관찰되는 노화현상을 말하는 것으로 자연노화 현상과 자외선에 의한 영향이 합쳐진 결과로 발생한다. 자연노화와 광노화 사이에는 주름이 생성되는 기전이 세부적으로 차이가 있지만, 피부 세포의 증식이나 신진대사가 저하되며, 표피-진피 사이의 결합이 약해 조그만 자극에도 손상을 입기 쉽고, 콜라겐의 합성량이 감소하며, 콜라겐 분해효소인 MMP(Matrix metalloproteinase)의 과다한 발현 증가 등의 생리적 변화들이 나타나 피부가 건조해지며, 표피, 진피 층의 구조적인 차이로 인해 탄력성을 잃어버리고, 점차적으로 주름이 깊어지는 것을 의미할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 메이컵 베이스, 파운데이션, 염모제, 샴푸, 린스 또는 바디 세정제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장품에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 포스파티딘산을 유효성분으로 포함하는, 노화 억제용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

이때, 상기 용어 "포스파티딘산", "노화 억제"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명에서의 용어, "건강기능식품 조성물(functional food)"은 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기에서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 제품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물에서 포함할 수 있는 필수 성분으로 포스파티딘산 외에는 다른 성분에는 특별히 제한이 없으며 통상의 식품과 같이 여러가지 생약추출물, 식품 보조 첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 또한, 상기 식품 보조 첨가제는 당업계에 통상적인 식품 보조 첨가제, 예를 들어, 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함한다.

상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외에 향미제로서 천연 향미제(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 식품조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 팩트산 및 이의 염, 알긴산 및 이의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 포스파티딘산 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물에 의한 노화 억제 효과는, 전술한 바와 같은 "항산화 활성"에 의해 달성되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 포스파티딘산을 유효성분으로 포함하는 노인성 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.

이때, 상기 용어 "포스파티딘산"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명에서의 용어, "노인성 질환"은 고령화가 진행됨에 따라 발생하는 세포의 노화가 원인이 되어 발병하는 질환을 의미한다. 구체적으로, 상기 노인성 질환에는 생체 내 세포의 노화가 원인이 되는 알츠하이머병, 혈관성 치매, 파킨슨병, 뇌경색증, 뇌졸중, 뇌혈관 질환, 중풍을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 노인성 질환이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 "약학 조성물"은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있고, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 "약학적으로 허용가능한"은 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.

구체적으로, 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 노인성 질환 치료용 약학 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 노인성 질환 치료용 약학 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 포스파티딘산을 유효성분으로 포함하는 노인성 질환 치료 보조용 의약외품 조성물을 제공한다.

이때, 상기 용어 "포스파티딘산", "노인성 질환", "치료"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명에서의 용어, "의약외품 조성물"은 질병을 치료하거나 예방하기 위해 쓰는 의약품보다는 인체에 대한 작용이 경미한 물품에 대해 보건복지부가 따로 정한 분류 기준에 의한 약품 조성물을 의미하고, 약사법에 따르면 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유 또는 고무제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것을 포함한다. 본 발명의 의약외품 조성물의 예시로서 샴푸, 비누, 치약, 손 소독제, 보건용 마스크, 소독 청결제, 연고액, 물티슈 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 의약외품 조성물은 포스파티딘산 외에, 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는 한 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 포스파티딘산을 유효성분으로 포함하여, 세포 생존능을 증가시켜 세포 수명 연장의 효과를 가지므로, 피부 노화 억제 또는 주름 개선; 및 세포의 노화와 관련된 노인성 질환의 예방 또는 치료 효과를 가질 수 있다. 특히, 포스파티딘산은 지질 성분으로 체내 흡수가 용이하므로 건강기능식품 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 선충에 포스파티딘산을 처리하였을때, 노화에 의한 수명 단축 완화 및 수명 연장 효과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 선충에 포스파티딘산을 처리하였을때, 노화와 관련된 바이오마커인 지방갈색소 축적의 감소 효과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 선충에 포스파티딘산을 처리하였을때, 노화와 관련된 바이오마커로서, 열 및 산화 스트레스에 대한 내성의 증가 효과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 선충에 포스파티딘산을 처리하였을때, 노화와 관련된 바이오마커로서, 이동 속도의 증가 효과를 보여주는 그래프이다.
도 5은 SA-β-gal 염색 결과를 나타내며, 인간 피부 섬유아세포에서 포스파티딘산이 UVB에 의해 유도된 노화를 완화하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 6는 p53 and p21^{Cip1 / WAF1} 웨스턴 블로팅 결과를 나타내며, 인간 피부 섬유아세포에서 포스파티딘산이 UVB에 의해 유도된 노화를 완화하는 것을 보여준다.
도 7은 ROS 염색 결과를 나타내며, 피부 섬유아세포에서 포스파티딘산이 UVB에 의해 유도된 ROS 생성을 완화하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 8는 자이모그래피(Zymography) 결과를 나타내며, 피부 섬유아세포에서 포스파티딘산이 UVB에 의해 유도된 MMP 활성화를 완화하는 것을 보여주는 그래프이다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것을 해석되지는 않는다.

실시예 1: 선충 수명 및 노화에 대한 포스파티딘산의 효능 확인.

포스파티딘산의 노화 관련 효능을 확인하기 위하여, 선충을 실험대상으로 하여, 수명 연장 효과를 확인하고, 노화와 관련된 바이오마커를 분석하고자 하였다. 이때, 포스파티딘산의 대사경로와 연관된 pld-1 억제에 의한 노화의 유도를 함께 확인하였으며, 노화 유도 이후의 포스파티딘산의 노화 억제 효과뿐만 아니라, 노화 유도와 무관한 포스파티딘산의 노화 억제 효과도 함께 확인하고자 하였다.

실시예 1-1: 선충의 배양 및 재료 준비

꼬마 선충(C.elegans)은 나이에 관한 연구를 위한 동물 모델로서 널리 사용되고 있는바, 본 발명의 노화에 대한 포스파티딘산의 역할을 확인하기 위해, 대표적으로 선충을 이용하여 실험하였다. 선충 N2(야생형) 균주, 돌연변이 대립 유전자를 보유한 균주 daf -16( mu86 ), age-1( hx546 ), 및 akt -1( mg144 ), 리포터 균주 sod-3::gfp, dod-11:: gfp, dod-8:: gfp, 및 mtl -1:: gfp는 Caenorhabditis Genetics Center로부터 구입하였다. 선충을 21℃에서 선충 생장 배지(NGM) 한천 평판 상에서 식량 공급원으로서 Escherichia coli 균주 OP50와 함께 생장시켰다.

아울러, 포스파티딘산의 대사 경로와 관련된 pld-1 유전자의 녹다운(knock-down)을 통해 노화가 유도되고, 노화 유도된 후의 PA, 양성대조군인 NAC 및 SPM 처리에 의한 노화 억제 효과를 확인하기 위해, 꼬마 선충 ORFeome RNAi 라이브러리로부터 얻어진, 이중-가닥의 pld-1 유전자(pld-1 RNAi)를 발현하는 E. coli HT115 세포가 시딩된 NGM 플레이트에 선충의 알을 두어, 부화시켰다. 이때, 선충의 성장 단계에서 pld-1 억제에 의한 효과를 배제하기 위해, 알로부터 부화된 선충을 L4 유충 단계까지만 HT115-시딩된 NGM 플레이트에 성장시켰다.

또한, 수명 단축과 연관된 활성산소(ROS)를 제거하는 N-아세틸-L-시스테인(NAC) 또는 노화 억제를 하는 것으로 알려진 CK2 활성을 자극하는 폴리아민류의 스페르미딘(SPM)을 처리한 군을 양성 대조군으로 하여, 포스파디딘산(PA)의 노화 억제 효과와 비교하였다.

실시예 1-2: 수명 분석 ( Lifespan assay)

포스파티딘산의 처리에 따른 수명 연장 효과를 확인하기 위하여, 이전 문헌[Lee SJ, Hwang AB, Kenyon C. Inhibition of respiration extends C. elegans life span via reactive oxygen species that increase HIF-1 activity. Curr Biol 2010; 20: 2131-2136]에 기재된 바와 같이, 선충의 수명 분석(lifespan assay)을 수행하였다. 구체적으로는, 동기화된(Synchronized) L4 유충을 FUdR을 함유하는 HT115-시딩된 NGM 플레이트 상에 두고, 생존한 초파리의 수를 매일 세었고, 새로운 HT115-시딩된 NGM 플레이트로 이동시켰다. 사멸은 얇은 백금 와이어를 사용하여 약간의 접촉에도 반응하지 않는 것으로 측정하였다.

이후 pld-1 억제하지 않은 야생형 선충(control RNAi) 및 pld-1 억제된 선충(pld-1 RNAi)을 대상으로 하여, 각각의 선충에 NAC, SPM 및 PA를 처리한 후, 선충의 생존율을 계산한 결과를 도 1에 나타내었다.

그 결과, 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, pld-1 억제된 선충(pld-1 RNAi)의 경우, pld-1 억제되지 않은 야생형 선충에 비하여 수명이 짧아져, 노화가 유도됨을 확인할 수 있었고, 노화가 유도된 선충에 NAC, SPM 및 PA를 처리하는 경우, 수명이 연장되는 효능을 확인할 수 있었다. 특히, 양성대조군인 NAC 및 SPM을 처리한 군에 비하여, PA를 처리한 군에서 가장 현저한 수명 연장 효능을 가짐을 확인할 수 있었다.

한편, 노화가 유도되지 않은 야생형 선충(control RNAi)의 경우에도 마찬가지로 PA가 처리된 군의 수명이 현저히 연장됨을 확인할 수 있었다. 구체적으로는, PA(30 μM)의 처리 후, 야생형 선충의 최대 수명(maximum lifespan)은 26일에서 35일로 연장되었고, 중간 수명(median lifespan)은 20일에서 28일로 연장되었음을 확인할 수 있었다. 이는 pld-1 억제에 의한 노화 유도 여부와 무관하게, 포스파티딘산 자체적으로 수명 연장 효능을 가짐을 보여주는 결과이다.

실시예 1-3: 지방갈색소 분석 ( Lipofuscin assay)

지방갈색소(lipofuscin)는 나이가 들어감에 따라 세포 내에 축적되는 노화색소로서, 지방갈색소의 축적는 노화의 특징을 나타내는 것이다. 이에 따라, 포스파티딘산의 노화 억제 효과를 확인하기 위해, 포스파티딘산의 처리에 따른 지방갈색소의 농도를 측정하였다. 구체적으로는, 이전 문헌[Gerstbrein B, Stamatas G, Kollias N, Driscoll M. In vivo spectrofluorimetry reveals endogenous biomarkers that report healthspan and dietary restriction in Caenorhabditis elegans . Aging Cell 2005; 4: 127-137.]에 기재된 바와 같이, 자발형광에 의해 동기화된(성체의 1 및 8일) 선충의 장에서 생성되는 지방갈색소의 축적을 확인하였다. 지방갈색소의 자발형광을 여기(excitation) 및 방사(emission) 파장을 각각 350 nm 및 470 nm로 하는 형광 현미경(ZEISS AxioCam MRc, Germany)을 사용하여 측정하였다. 지방갈색소의 농도를 측정하기 위한 상대적인 형광 강도는 ImageJ software(National Institutes of Health, MD)를 사용하여 정량화하였다.

이후 pld-1 억제하지 않은 야생형 선충 및 pld-1 억제된 선충을 대상으로 하여, 각각의 선충에 NAC, SPM 및 PA를 처리한 후, 지방갈색소의 상대적 농도를 백분율로 나타낸 결과를 도 2에 나타내었다.

그 결과, 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, pld-1 억제된 선충의 경우, pld-1 억제되지 않은 야생형 선충에 비하여, 약 100%에서 약 140%로 지방갈색소의 축적이 증가되어, 이를 통해 노화가 유도되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 노화가 유도된 선충에 양성대조군인 NAC 및 SPM를 처리한 경우뿐만 아니라, PA를 처리하는 경우에도 약 140%에서 약 120%로, 지방갈색소의 축적이 감소되어, 이를 통해 포스파티딘산의 노화 억제 효과를 확인할 수 있었다.

한편, 노화가 유도되지 않은 야생형 선충의 경우에도 마찬가지로 PA가 처리된 군의 경우, 약 100%에서 약 70%로 지방갈색소의 축적이 현저히 감소되어, 이를 통해 pld-1 억제에 의한 노화 유도 여부와 무관하게, 포스파티딘산 자체적으로 노화 억제 효능을 가짐을 확인할 수 있었다.

실시예 1-4: 산화 및 열 스트레스에 대한 내성 분석 (Assay for oxidative and heat stress resistance)

많은 연구에서 세포 내 산화 스트레스의 증가는 노화 발생에 있어 중요한 메커니즘임을 증명하였으며, 산화 및 열 스트레스에 대한 내성의 감소는 노화를 나타낼 수 있는 주요한 특징이다. 이에 따라, 포스파티딘산의 노화 억제 효과를 확인하기 위해, 포스파티딘산의 처리에 따른 선충의 열 및 산화 스트레스에 대한 내성를 측정하였다. 구체적으로는, 산화 스트레스 내성 분석을 위해, 동기화된(성체의 8일) 선충을 5 mM의 H₂O₂를 함유하는 HT115-시딩된 NGM 플레이트로 이동시켰다. 5시간의 배양 후, 생존된 선충의 수를 매 4시간 마다 접촉-유발성 움직임(touch-provoked movement)을 이용하여 측정하였다. 또한, 열 스트레스 내성 분석을 위해, 동기화된(성체의 1 및 8일) 선충이 있는 HT115-시딩된 NGM 플레이트를 21°C에서 35°C로 이동시켰다. 온도 변화 후, 생존된 선충의 수를 매 2시간 마다 접촉-유발성 움직임을 이용하여 측정하였다. 각 실험 그룹에서는 50마리의 선충이 사용되었다.

이후 pld-1 억제하지 않은 야생형 선충 및 pld-1 억제된 선충을 대상으로 하여, 각각의 선충에 NAC, SPM 및 PA를 처리한 후, 산화 및 열 스트레스를 가한 후에 선충의 생존율을 나타낸 결과를 도 3에 나타내었다.

그 결과, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, pld-1 억제된 선충(pld-1 RNAi)의 경우, pld-1 억제되지 않은 야생형 선충(control RNAi)에 비하여 산화 및 열 스트레스에 의한 생존율이 감소되어, 노화가 유도됨을 확인할 수 있었다. 또한, 노화가 유도된 선충에 양성대조군인 NAC 및 SPM를 처리한 경우뿐만 아니라, PA를 처리하는 경우에도 산화 및 열 스트레스에 의한 생존율이 증가되어, 이를 통해 포스파티딘산의 노화 억제 효과를 확인할 수 있었다.

한편, 노화가 유도되지 않은 야생형 선충(control RNAi)의 경우에도 마찬가지로 PA가 처리된 군의 산화 및 열 스트레스에 의한 생존율이 현저히 증가됨을 확인할 수 있었다. 이는 pld-1 억제에 의한 노화 유도 여부와 무관하게, 포스파티딘산 자체적으로 노화 억제 효능을 가짐을 보여주는 결과이다.

실시예 1-5: 이동 속도 분석 (Locomotion velocity assay)

선충은 노화가 진행됨에 따라, 자극에 의한 이동 속도가 감소되므로, 이동 속도 측정을 통해 선충의 노화 정도를 확인할 수 있다. 이에 따라, 포스파티딘산의 노화 억제 효과를 확인하기 위해, 포스파티딘산 처리에 의해 선충의 이동 속도가 회복되는 정도를 측정하였다. 구체적으로는, 문헌[Hahm JH, Kim S, DiLoreto R, Shi C, Lee SJ, Murphy CT et al. C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation. Nat Commun 2015; 6: 8919.]에 기재된 바와 같이, 선충의 평균 속도 및 최대 속도를 측정하였다. 동기화된(성체의 1 및 8일) 선충을 박테리아 콜로니(bacterial lawn)가 없는 NGM 플레이트로 이동시켰고, 이들의 움직임을 바로 기록하였다. 기록 시스템은 실체현미경(stereomicroscope, Nikon SMZ 745T), 전하 결합 소자 사진기(charge-coupled device camera; TUCSEN TCH-5.0) 및 이미지화 소프트웨어(imaging software, TUCSEN ISCapture)를 포함한다. 기록 기간은 초당 30 프레임 속도로 30초였다. 이동 속도는 초당 mm로 표현하였다(초당 표시된 중심 간의 거리(mm)). 기록된 이미지를 ImageJ 및 wrMTrck(plugin for ImageJ: www.phage.dk/plugins)에 의해 평가하였다. 이동 속도 데이터는 엑셀 워크시트로 읽어들였다. 30초 동안 가장 높게 측정된 이동 속도를 최대 속도로 나타내었다.

이후 NAC, SPM 및 PA를 처리한 후에 선충의 이동 속도를 나타낸 결과를 도 4에 나타내었다. 그 결과, 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, pld-1 억제된 선충(pld-1 RNAi)의 경우, pld-1 억제되지 않은 야생형 선충에 비하여 이동 속도가 현저히 감소되어, 노화가 유도됨을 확인할 수 있었다. 또한, 노화가 유도된 선충에 양성대조군인 NAC 및 SPM를 처리한 경우뿐만 아니라, PA를 처리하는 경우에도 노화가 유도되지 않은 야생형 선충과 동일한 정도로 이동 속도가 회복됨을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 포스파티딘산은 노화에 의한 운동성 감소를 완화함으로써, 노화 억제 효과를 확인할 수 있었다.

이상의 결과를 종합하면, 선충의 수명 연장 분석 및 노화와 관련된 바이오마커를 분석하는 실험을 통해, 본 발명의 포스파티딘산이 수명을 연장시키고, 노화를 억제하는 효능을 가짐을 확인할 수 있고, 이는 기존에 항산화제로 알려진 NAC 및 SPM 보다도 우수한 효능을 나타내며, pld-1 억제에 의한 노화 유도와는 무관하게, 포스파티딘산이 독립적으로 작용하여 나타내는 효능임을 확인할 수 있다.

실시예 2: 광노화에 대한 포스파티딘산의 효능 확인

포스파티딘산의 광노화 억제 효능을 확인하기 위하여, 동물세포에 UV를 조사하여 광노화를 유도한 후, 포스파티딘산을 처리하여 광노화 억제 효과를 확인하였다.

실시예 2-1: 동물세포 배양 및 UV 조사

인간 피부 섬유아세포 HS 68 세포주를 American Type CultureCollection(ATCC, Manassas, USA)에서 구매하였다. 배양 배지로는 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM, Gibco, Carlsbad, USA)를 사용하였으며, 10 % 소태아혈청(FBS, Gibco, Carlsbad, USA)과 최종 농도 100 U/㎖의 페니실린/스트렙토마이신(Gibco, Carlsbad, USA)를 첨가하여 37 ℃, 5 % CO₂ 조건에서 배양하였다. 계대 배양 시에는 트립신-EDTA(Gibco, Carlsbad, USA)를 이용하여 탈착 후 100 mm 디쉬에 5×10⁵ 세포/웰 농도로 접종하였다. 실험을 위해서, passage 15^th~20^th까지 사용하였다.

UVB 광선을 세포에 처리하기 위해서 UVB 램프(312 nm, Spectronics Corporation, westbury, USA)를 사용하였고, UVB 광선의 강도를 측정하기 위해서 UVX 라디오미터(UVX-31, Upland, USA)를 사용하였다. UVB 광선을 처리하기 위해서 HS 68 세포주를 100 mm 디쉬에 4×10⁵ 세포 수로 접종하여 48시간 배양한 후 배지를 제거하고 인산 완충 생리식염수(PBS, Gibco, Carlsbad, USA) 5 ㎖를 사용하여 총 3회 세척하였다. UVB 광선은 이전의 연구를 참고하여 세포사멸을 일으키지 않되 노화를 충분히 일으키는 적정 강도인 10-20 mJ/cm²로 처리해 주었다. UVB 광선을 방해 없이 처리하기 위하여 PBS를 얇게 도포한 후 처리해 주었으며, 이때 도포한 PBS는 처리가 끝난 후 제거하였다. 이후에 HS 68 세포주에 50-100 μM의 포스파티딘산(PA, Sigma, St. Louis, USA)을 혈청 없는 배지에 희석하여 처리하거나, pcDNA3.1-벡터 또는 pcDNA-PLD2 전장 3 ㎍을 각 세포에 Polyfect(Qiagen, Valensis, USA)를 이용해 형질주입(transfection) 시켰고, 20시간 이후 PBS로 2회 세척 후 혈청 없는 배지로 교체하여 28시간 배양하였다.

실시예 2-2: 포스파티딘산의 광노화에 의한 세포 변형 및 SA-β-gal 활성 억제 효능 확인

UV에 의해 광노화가 진행되면 DNA 손상으로 인해, 세포의 모양이 납작해지거나, 세포의 SA-β-gal 활성이 증가하게 된다. 이에 따라, 포스파티딘산의 광노화 억제 효능을 확인하기 위해, 광노화가 유도된 세포에 포스파티딘산을 처리한 후, 광학 현미경으로 세포 모양을 관찰하고, SA-β-gal 활성을 측정하였다.

구체적으로는, 배양이 완료된 세포를 PBS로 세척한 다음 3 % 포름알데하이드로 PBS에 희석해 상온에서 10분간 고정을 진행한다. 고정된 세포를 PBS로 2회 세척한 다음, 염색 용액(N,N-디메틸포름아미드(DMF))에 1㎎/㎖으로 희석한 X-Gal(5-bromo-4chloro-indolyl-β-D-galactose), 40 mM 시트르산-인산나트륨, pH 6.0, 5 mM 페리시안화칼륨, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl₂을 처리하고, 37 ℃에서 15시간 배양하였다.

이후, UV 조사 및 포스파티딘산의 처리에 따라, 광학현미경으로 촬영한 결과 및 SA-β-gal 활성을 측정한 결과를 도 5에 나타내었다. 그 결과, 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, UV 처리에 의해 세포 모양이 변형되고, UV 조사된 세포에 포스파티딘산을 처리할 경우, 변형된 세포의 수가 감소됨을 확인할 수 있었다. 또한, UV가 조사되어 광노화가 유도된 세포에서 SA-β-gal 염색 활성이 약 29%로 증가하는 반면에, 포스파티딘산을 각각 50, 100 μM 처리해 준 세포에서는 그 활성이 각각 14%, 5%로 감소하고, 특히 100 μM을 처리한 세포에서는 아무것도 처리하지 않은 대조군과 거의 흡사한 정도로 감소됨을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 포스파티딘은 광노화에 의한 세포 모양의 변형 및 SA-β-gal 활성을 현저하게 억제함으로써, 광노화를 억제하는 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 2-3: 포스파티딘산의 광노화에 의한 P53/P21 경로 억제 효능 확인

UV에 의해 DNA 손상이 일어나면, p53 및 p21의 발현이 증가되므로, p53 및 p21 단백질은 노화를 측정하는 지표로서 사용된다. 이에, 포스파티딘산의 광노화 억제 효과를 확인하기 위해, UVB 조사하여 광노화를 유도된 세포에 포스파티딘산을 처리한 후, p53 및 p21 단백질에 대한 웨스턴 블로팅을 수행하였다.

구체적으로는, 각각의 단백질 시료를 정량하여 30 ㎍ 씩 SDS 샘플 로딩 완충액(60 mM 트리스(Tris) pH 6.8, 25 % 글리세롤, 2 % SDS, 14.4 mM β-메르캅토에탄올, 0.1 % 브로모페놀 블루)과 같이 3분간 끓인 후, 8-12 % SDS-폴리아크릴아미드 겔에 전기영동 하였다. 이를 니트로셀룰로오스 막에 이동시켜 Ponceau S로 염색하여 확인한 다음, 막을 TBSt(20 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05 % Tween 20)에 5 % 알부민, Bovine(BSA, Amresco, Ohio, USA)을 첨가한 완충액으로 2시간 이상 블로킹한 후 항체에 반응시켰다. 항-PLD 항체의 경우 1:2000으로 희석하여 4 ℃에서 15시간 동안 반응시킨 후 TBSt 완충액으로 10분씩 3회 세척한 다음 1:2000으로 희석된 항-Rabbit IgG 항체로 상온에서 1시간 반응시킨 후 다시 TBSt 완충액으로 10분씩 3회 세척하였다. 항-PPARγ 항체의 경우 1:500으로 희석하여 4 ℃에서 15시간 동안 반응시킨 후 TBSt 완충액으로 10분씩 3회 세척한 다음 1:500으로 희석된 항-Mouse IgG 항체로 상온에서 1시간 반응시킨 후 다시 TBSt 완충액으로 10분씩 3회 세척하였다. 항-α-tubulin 항체의 경우 1:500으로 희석하여 4 ℃에서 15시간 동안 반응시킨 후 TBSt 완충액으로 10분씩 3회 세척한 다음 1:500으로 희석된 항-Mouse IgG 항체로 상온에서 1시간 반응시킨 후 다시 TBSt 완충액으로 10분씩 3회 세척하였다. 항-p53 항체의 경우 1:500으로 희석하여 4 ℃에서 15시간 동안 반응시킨 후 TBSt 완충액으로 10분씩 3회 세척한 다음 1:500으로 희석된 항-Mouse IgG 항체로 상온에서 1시간 반응시킨 후 다시 TBSt 완충액으로 10분씩 3회 세척하였다. 항-c-Jun 항체의 경우 1:500으로 희석하여 4 ℃에서 15시간 동안 반응시킨 후 TBSt 완충액으로 10분씩 3회 세척한 다음 1:2000으로 희석된 항-Rabbit IgG 항체로 상온에서 1시간 반응시킨 후 다시 TBSt 완충액으로 10분씩 3회 세척하였다. 항-phospho-c-Jun 항체의 경우 1:500으로 희석하여 4 ℃ 에서 15시간 동안 반응시킨 후 TBSt 완충액으로 10분씩 3회 세척한 다음 1:500으로 희석된 항-Mouse IgG 항체로 상온에서 1시간 반응시킨 후 다시 TBSt 완충액으로 10분씩 3회 세척하였다. 항-p21 항체의 경우 1:500으로 희석하여 4 ℃ 에서 15시간 동안 반응시킨 후 TBSt 완충액으로 10분씩 3회 세척한 다음 1:2000으로 희석된 항-Rabbit IgG 항체로 상온에서 1시간 반응시킨 후 다시 TBSt 완충액으로 10분씩 3회 세척하였다. 항체반응 후에는 ECL을 처리하여 1시간 감광 후 현상하였다.

이후, UV 조사 및 포스파티딘산의 처리에 따라, p53 및 p21 단백질의 발현 정도를 보여주는 웨스턴 블로팅 결과 및 대조군 α-튜불린에 대한 상대적인 p53 및 p21 생산율을 도 6에 나타내었다. 그 결과, 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, UV를 조사한 세포에서 p53 및 p21 단백질 발현이 현저히 증가하는 반면, 포스파티딘산 50 μM 및 100 μM을 처리한 세포에서는 p53 및 p21 단백질의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 그 중에서도 100 μM을 처리한 세포에서는 더욱 현저하게 p53 및 p21 단백질의 양이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 포스파티딘산은 광노화에 의한 DNA 손상, 즉 p53 및 p21 단백질의 발현을 효과적으로 억제함으로써, 광노화 억제 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 2-4: 포스파티딘산의 광노화에 의한 활성산소 생성 억제 효능 확인

UV 조사에 의해 광노화가 유도되는 경우, 활성산소(ROS) 생성되어 DNA에 손상을 입히게 된다. 이에, 포스파티딘산의 광노화 억제 효과를 확인하기 위해, UV 조사하여 광노화를 유도된 세포에 포스파티딘산을 처리한 후, 세포 내 ROS 양을 측정하였다.

구체적으로는, 세포 내 ROS 양을 측정하기 위해, 20 mM로 희석한 CM-H₂DCFDA(Invitrogen, Waltham, USA)와 10 mM로 희석한 디하이드로에티튬(DHE, Life technologies, Carlsbad, USA)을 배지에 각각 40 μM, 10 μM로 희석해 1시간 동안 세포 염색을 진행하였다. 이후 PBS로 2회 세척 후 세포 위치를 확인하기 위한 대비염색으로 Hoechst 33342(Thermo Fisher, Waltham, USA)로 30초 동안 염색을 진행하였다. 이후 PBS로 2회 세척 후 PBS를 얇게 도포 한 다음 형광 현미경으로 촬영하였다.

이후, UV 조사 및 포스파티딘산의 처리에 따라, ROS 생성 정도를 보여주는 형광 형미경 촬영 결과를 도 7에 나타내었다. 그 결과, 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, UV를 조사하여 광노화가 유도된 세포에서 ROS 양이 현저히 증가하는 반면에, 포스파티딘산 50 μM 및 100 μM을 처리한 세포에서 ROS 양이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 그 중에서도 100 μM을 처리한 세포에서 아무것도 처리하지 않은 대조군과 다를 바 없을 만큼 ROS가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 포스파티딘산은 광노화에 의한 ROS의 축적을 효과적으로 억제함으로써, 광노화 억제 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 2-5: 포스파티딘산의 광노화에 의한 MMP 활성 감소 효능 확인

UV 조사에 의해 광노화가 유도되는 경우, 활성산소(ROS) 생성되고, 이는 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 경로를 촉진시키고, 이때 AP-1 및 NF-κB가 활성화된다. 또한, 이들의 활성화에 의해 MMP(matrix metalloproteinase)가 발현되게 되는데, MMP는 피부에서 주름을 형성하는 큰 요인으로 알려져 있으며, 구체적으로는 MMP-1 및 MMP-3의 발현이 인간의 피부에서 주름을 형성한다고 알려져 있다. 이에, 포스파티딘산의 광노화 억제 효과를 확인하기 위해, MMP를 생산할 수 있는 섬유아세포(HS 68 세포주)에 UV 조사하여 광노화를 유도하고, 포스파티딘산을 처리한 후, 세포 내 MMP-1 및 MMP-3의 활성 및 생산량을 자이모그래피 및 웨스턴 블로팅을 이용하여 측정하였다

구체적으로, MMP-1, MMP-3의 효소활성을 알아보기 위하여 세포 배양 배지를 이용한 콜라겐 자이모그래피를 진행하였다. UVB 처리 후 48시간 배양한 배지를 전부 E-튜브로 옮긴 다음 speed vacuum 농축기(Heto Holten, Allerod, Denmark)로 배지를 농축하였다. Bradford(Biorad, Hercules, USA)로 단백질 정량하여 0.8 ㎍/㎖의 단백질을 샘플 완충액(5 mM 트리스-HCl, pH 6.8, 4 % SDS, 25 % 글리세롤, 0.01 % BPB)과 섞고, 래트 꼬리의 0.02% 콜라겐(C7661, Sigma, USA)과 섞어, 10 % SDS-폴리아크릴아미드 겔에 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 겔은 세척 완충액(2.5 % 트리톤 X-100, 50 mM 트리스-HCl, pH 7.5)으로 15분씩 총 3회 세척하였고, 반응 완충액(50 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 5 mM CaCl₂, 0.15 M NaCl)으로 15분간 세척한 뒤 반응 완충액에 담구어 37 ℃ 에서 48시간 동안 배양하였다. 그 다음 0.1 % Coomassie brilliant blur R-250(Biorad, Hercules, USA)로 3시간 이상 염색한 후 탈색 완충액(50 % 메탄올, 10 % 아세트산)으로 30분 이상 탈색하였다.

이후, UV 조사 및 포스파티딘산의 처리에 따라, MMP-1 및 MMP-3의 활성 및 생산량을 보여주는 자이모그래피 및 웨스턴 블로팅 결과를 도 8에 나타내었다. 그 결과, 도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, UV를 조사하여 광노화가 유도된 세포에서 MMP-1 및 MMP-3의 활성이 현저히 증가하는 반면에, 포스파티딘산을 처리하면 활성이 현저히 감소하는 것도 확인할 수 있었다. 또한, UV를 조사한 세포에서 증가하였던 MMP-1 및 MMP-3 단백질의 양이, 이후 포스파티딘산을 처리한 경우에는 급격히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 포스파티딘산은 광노화에 의한 MMP 활성 및 단백질 발현 증가를 포스파티딘산 현저하게 억제시킴으로써, 광노화 억제 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다.

이상의 결과를 종합하면, UV 조사에 의해 광노화가 유도된 세포에 포스파티딘산을 처리한 실험을 통해, 본 발명의 포스파티딘산은 광노화에 의해 유도된 ROS 축적을 억제하고, DNA 손상에 의한 세포 변형 억제하고, 주름을 형성하는 MMP 단백질의 활성 및 발현을 감소시킴으로써, 광노화를 효과적으로 억제함을 확인할 수 있고, 더 나아가, 포스파티딘산은 피부 노화 방지 및 주름 개선에 탁월한 효능가 있음을 확인할 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

1. 포스파티딘산 및 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 유효성분으로 포함하는, 항산화 활성에 의한 피부노화 억제용 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제 및 향료로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 화장료 조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 포스파티딘산을 유효성분으로 포함하는, 항산화 활성에 의한 피부노화 억제용 건강기능식품 조성물.
   
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제

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