KR102142314B1

KR102142314B1 - 백화고 유래의 에르고스테롤을 포함하는 피부 외용제 조성물

Info

Publication number: KR102142314B1
Application number: KR1020130072052A
Authority: KR
Inventors: 유세진; 박녹현; 백석윤; 신송석; 이존환
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2013-06-24
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2020-08-10
Also published as: KR20150000099A

Abstract

본 발명은 백화고 유래의 에르고스테롤을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 백화고 추출물로부터 분리 정제하여 수득한 에르고스테롤인 3β,5α,9α-트리하이드록시-(22E,24R)-에르고스타-7,22-디엔-6-온을 함유함으로써 우수한 미백 효능을 나타내는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

Description

백화고 유래의 에르고스테롤을 포함하는 피부 외용제 조성물{Skin external composition containing an ergosterol extracted from Lentinus edodes}

사람의 피부색은 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트(melanocyte)의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께, 및 카로티노이드, 빌리루빈 등 인체 내외의 색소 함유 유무와 같은 여러 요인들에 의해 결정된다. 특히 멜라노사이트에서 타이로시나제(tyrosinase) 등의 여러 효소가 작용하여 생성되는 멜라닌이라는 흑색 색소가 가장 중요한 요인이다. 멜라닌 색소의 형성에는 유전적 요인, 호르몬 분비, 스트레스 등과 관련된 생리적 요인 및 자외선 조사 등과 같은 환경적 요인이 영향을 미친다. 멜라닌은 피부에 존재하여 자외선 등으로부터 신체를 보호하는 중요한 기능을 하지만 멜라닌이 과잉생산됨으로써 색소침착 및 피부노화를 촉진하고 피부암 유발에도 주요한 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 피부색소 이상침착 증상과 자외선 노출 등에 의해 발생된 과도한 멜라닌 색소 침착을 치료 또는 경감시켜주기 위해서 이전부터 아스코르빈산(ascorbic acid), 코지산(kojic adcid), 알부틴(arbutin), 하이드로퀴논(hudroquinone), 글루타치온(glutathione) 또는 이들의 유도체, 타이로시나제 저해활성을 가진 물질들을 화장료나 의약품에 배합하여 사용해 왔는데, 이들은 불충분한 미백 효과, 피부에 대한 안전성 문제, 및 화장료에 배합시 제형 내에서의 안정성 문제 등으로 인해 그 사용이 제한되고 있다.

이에 본 발명자들은 천연물 중에서 미백 효과를 나타내는 성분을 찾고자 하였으며, 백화고에서 추출한 에르고스테롤인 3β,5α,9α-트리하이드록시-(22E,24R)-에르고스타-7,22-디엔-6-온이 우수한 미백 효과를 제공할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 백화고 유래의 성분을 함유함으로써 우수한 피부 미백 효과를 나타내는 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 3β,5α,9α-트리하이드록시-(22E,24R)-에르고스타-7,22-디엔-6-온을 유효성분으로 함유하는 미백용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 백화고로부터 분리 정제한 3β,5α,9α-트리하이드록시-(22E,24R)-에르고스타-7,22-디엔-6-온을 유효성분으로 사용함으로써 피부에 안전하면서도 높은 미백 효과를 제공할 수 있다.

도 1은 MTT 분석법을 사용하여 3β,5α,9α-트리하이드록시-(22E,24R)-에르고스타-7,22-디엔-6-온이 세포에 미치는 독성을 세포 생존율로 나타낸 것이다.
도 2는 MTT 분석법을 사용하여 백화고 추출물과 알부틴이 세포에 미치는 독성을 세포 생존율로 나타낸 것이다.
도 3 및 4는 멜란-a 세포에서 3β,5α,9α-트리하이드록시-(22E,24R)-에르고스타-7,22-디엔-6-온, 알부틴, 코지산 및 백화고 추출물이 멜라닌 생성 억제에 대하여 미치는 영향을 나타낸 것이다.

본 발명의 피부 외용제 조성물은 하기 화학식 1로 표현되는 3β,5α,9α-트리하이드록시-(22E,24R)-에르고스타-7,22-디엔-6-온(3β,5α,9α-trihydroxy-(22E,24R)-ergosta-7,22-dien-6-one)을 유효성분으로 함유한다.

본 발명에서 사용되는 3β,5α,9α-트리하이드록시-(22E,24R)-에르고스타-7,22-디엔-6-온은 백화고로부터 추출한 에르고스테롤계 화합물이다.

백화고(학명: Lentinula edodes(Berk.) Sing.)는 송이과(Tricholomataceae) 표고속(Lentinula)에 속하는 것으로서, 표고버섯 중에서도 가장 하얗게 피어난 버섯이다. 백화고는 일 년 중 기온이 낮고 습도가 낮은 봄철에만 생산되는 표고버섯으로서, 표고버섯이 생성될 때 1,000개 중 2~3개 정도만이 백화고가 되며, 맛과 향이 제일 뛰어나고, 씹히는 질감이 좋아서 표고버섯 중에서도 최고급으로 선호되는 것이다.

백화고의 알려진 효능으로는 혈액순환 촉진 작용, 항암 효과, 항산화 효과, 빈혈, 콜레스테롤, 고혈압, 골다공증 예방 등이 있으며, <본초강목>에 따르면 표고버섯은 기(氣)를 도와 주고 허기를 느끼지 않게 하며, 풍(風)을 고치는가 하면 피를 잘 통하게 한다고 기록되어 있다.

백화고의 성분으로는 비타민, 특히 비타민 D의 전구체인 에르고스테롤을 많이 함유하며, B1, B2도 상당량 함유한다. 정미성분은 구아닐산이고, 방향성분은 유황을 가진 화합물인 레티오닌이며, 그 밖에 글리호린, 코리오린, 일루신, 에리타테닌, β-글루칸 등을 함유한다.

본 발명에서 사용되는 3β,5α,9α-트리하이드록시-(22E,24R)-에르고스타-7,22-디엔-6-온은 백화고로부터 분리 정제하여 수득할 수 있으며, 간략하게는 백화고로부터 70% 에탄올을 이용하여 추출물을 얻고, 이를 건조시켜 분말화한 다음, 얻은 추출물에 에틸 아세테이트를 이용하여 분배 추출하여 단일 성분을 분리할 수 있다.

본 발명의 조성물에서 상기 유효성분은 조성물 총 중량에 대하여 10ppm~50000ppm으로 함유된다. 함량이 10ppm미만이면 미백 효능이 나타나지 않으며, 함량이 50000ppm 초과이면 피부 자극이 발생한다.

또한, 본 발명의 조성물은 미백효과를 나타내는 공지의 물질을 더 함유할 수 있다. 구체적으로는 아스코빌 글루코사이드, 감초추출물, 알부틴, 아스코빅애씨드, 코직애씨드, 나이아신아마이드, 올레아놀릭산 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 함유할 수 있으며, 이는 조성물 총 중량에 대하여 0.01~5.0중량%로 함유된다. 이는 0.01중량% 미만이면 피부에 흡수되어 효능을 나타내기 어렵고, 5.0중량% 초과이면 피부에 독성을 나타내거나 피부 끈적임이 크게 증가하여 피부 외용제로서의 가치를 나타내기 어렵기 때문이다.

본 발명의 조성물은 피부에 있는 오염물질을 정화하여 피부를 깨끗하게 해 주는 디톡스 효능을 나타내고, 칙칙한 피부를 환하게 개선시켜 미백 효과를 구현할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유하여 제형화될 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로서, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

또한 본 발명에 의한 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.

또한, 본 발명의 조성물은 피부 미백 효과를 증가시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 함유할 수 있다.

이하, 시험예 및 제형예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 시험예 및 제형예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.

[참고예 1] 3β,5α,9α-트리하이드록시-(22E,24R)-에르고스타-7,22-디엔-6-온의 분리 및 구조 동정

1. 추출

백화고(원산지: 제주) 전체 부위의 분말 4kg에 70% 에탄올 용액을 첨가하여 실온에서 24시간 동안 추출한 후, 얻어진 추출물을 여과하였다. 여과액을 모두 합치고, 40℃에서 감압 농축하여 백화고 추출물 1075g을 수득하였다.

수득한 추출물에 물(3L)와 에틸 아세테이트(3L X 6)로 분배 추출하여 에틸 아세테이트 분획(9g)과 물 분획을 얻었다.

2. 분리 및 정제

상기에서 얻은 에틸 아세테이트 분획(BHE, 9g)을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(φ 7.5cm X 15cm, n-헥산-EtOAc = 10:1 → 7:1 → 5:1 → 3:1 → CHCl₃-MeOH = 40:1 → 30:1 → 20:1 → 10:1 → 7:1)를 실시하여 36개의 분획물(BHE-1 내지 BHE-36)을 얻었다.

이 중 BHE-24[224.2mg, Ve/Vt 0.457-0.484]에 대하여 세파덱스 LH-20 칼럼 크로마토그래피(φ 1.5cm X 65cm, 80% MeOH)를 실시하여 7개의 분획(BHE-24-1 내지 BHE-24-7)을 얻었다. 이 중 2번 분획인 BHE-24-2(50mg, Ve/Vt 0.623-0.666)에서 에르고스테롤 화합물인 3β,5α,9α-트리하이드록시-(22E,24R)-에르고스타-7,22-디엔-6-온을 분리하였다(분자량: 444)

3. 에르고스테롤 화합물의 구조 동정

상기에서 분리한 에르고스테롤 화합물의 구조를 NMR을 사용하여 동정하였다. NMR은 400 MHz FT-NMR 분광기(Varian Inova AS-400, Palo Alto, CA)를 이용하였으며, 화합물은 CDCl₃, 피리딘-d ₅, 중수소화 용매(Merck, Darmstadt, Germany)에 녹였다.

무색 결정; 녹는점 181~182℃;

-115° (c=0.42, CHCl₃); IR (KBr, ν_max, cm^-1) 3400, 2871, 1720, 1663, 1461, 1377, 1053, 1024, 970, 756; EI-MS m/z 428 [M]⁺; ¹H-NMR (400 MHZ, 피리딘-d ₅) 8.51 (s, 5-OH), 6.23 (s, 9-OH), 5.93 (1H, d, J=1.2 Hz, H-7), 5.31 (1H, dd, J=15.2, 7.2 Hz, H-23), 5.24 (1H, dd, J=15.2, 8.0 Hz, H-22), 4.65 (1H, m, H-3), 3.02 (1H, t, J=9.2 Hz, H-14), 2.97 (1H, m, H-1α), 2.83 (1H, dd, J=14.0, 4.0 Hz, H-4α), 2.32 (1H, dd, J=14.0, 9.2 Hz, H-4β), 1.96 (2H, m, H-2), 2.06 (1H, m, H-20), 1.91 (1H, m, H-24), 1.16 (3H, s, H-18), 1.06 (3H, d, J=6.4 Hz, H-21), 0.97 (3H, d, J=6.8 Hz, H-28), 0.88 (3H, d, J=6.8 Hz, H-27), 0.87 (3H, d, J=6.8 Hz, H-26), 0.65 (3H, s, H-19); ¹³C-NMR (100 MHz, 피리딘-d ₅) 199.0 (C-6), 164.1 (C-8), 135.9 (C-23), 132.5 (C-22), 120.3 (C-7), 79.8 (C-5), 75.1 (C-9), 66.8 (C-3), 56.2 (C-17), 52.0 (C-14), 45.4 (C-13), 43.1 (C-24), 42.3 (C-10), 40.6 (C-20), 38.2 (C-4), 35.5 (C-12), 33.4 (C-25), 31.5 (C-2), 29.0 (C-11), 28.3 (C-16), 26.4 (C-1), 22.7 (C-15), 21.3 (C-21), 20.4 (C-18), 20.1 (C-27), 19.9 (C-26), 17.9 (C-28), 12.4 (C-19)

[참고예 2] 세포 배양(멜란-a 세포)

마우스의 멜라노사이트 세포주인 멜란-a(melan-a) 세포는 10% FBS(Fetal Bovine Serum; 소태아혈청)와 50U/ml 페니실린, 50μg/ml 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI-1640 배지(Lonza, USA)를 이용하여 37℃, 10% CO₂의 조건에서 배양하여, 하기 실험에서 사용하였다.

[시험예 1] 세포 독성 실험(MTT assay)

실험 가능한 시료의 세포 처리 농도를 판별하기 위하여, MTT 분석법을 이용하였다.

상기 참고예 2의 방법으로 배양한 멜란-a 세포를 96웰 플레이트에 웰당 세포수가 1.0 X 10⁴이 되도록 시딩한 후, 24시간 동안 배양하였다. 그 다음, 상기 참고예 1에서 분리한 3β,5α,9α-트리하이드록시-(22E,24R)-에르고스타-7,22-디엔-6-온이 다양한 농도(1, 10, 25, 50, 100μM)로 포함된 새로운 배지로 처치하고, 72시간 동안 배양하였다. 이 때, 비교를 위하여 양성대조군은 DMSO와 EtOH를 1:3의 비율로 혼합한 용액을 0.1%로 포함된 배지로 처치하고 배양하였다. 세포 배양 중인 96웰 플레이트의 각 웰마다 MTT(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide)를 포함한 배지로 교환한 후 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 96웰 플레이트에 있는 모든 배지를 제거하고, 각 웰마다 DMSO를 넣어 염색된 세포를 용해시켰다. 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 흡광도를 측정하였으며(OD 570), 대조군과 비교하여 세포 생존율을 결정하였다. 측정 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 결과를 통하여 세포 생존율이 80% 이상인 시료의 농도를 확인하였으며, 하기 실험에서는 시료를 10μM까지의 농도로 사용하였다.

[시험예 2] 알부틴 및 백화고 추출물에 대한 세포 독성 실험(MTT assay)

상기 참고예 1에서 백화고에 70% 에탄올 용액을 첨가하여 수득한 백화고 추출물 및 알부틴에 대하여 MTT 분석법을 수행하였다.

상기 시험예 1과 동일한 방법을 사용하였으며, 다만 처리한 시료로는 알부틴 50ppm, 백화고 추출물(12.5, 25, 50, 100ppm)을 이용하였다. 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 흡광도를 측정하였으며(OD 570), 대조군과 비교하여 세포 생존율을 결정하였다. 측정 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 결과를 통하여 알부틴 50ppm과 테스트한 모든 범위 농도의 백화고 추출물은 세포 성장에 영향을 주지 않음을 확인할 수 있다.

[시험예 3] 멜란-a 세포 멜라닌 분석

상기 참고예 2의 방법으로 배양한 멜란-a 세포를 48웰 플레이트에 웰당 세포수가 1.5 X 10⁴이 되도록 시딩한 후, 24시간 동안 배양하였다. 그 다음, 다양한 농도(0.1, 1, 10μM)의 상기 참고예 1에서 분리한 3β,5α,9α-트리하이드록시-(22E,24R)-에르고스타-7,22-디엔-6-온이 포함된 새로운 배지로 처치하였다. 이 때 비교를 위하여 양성 대조군으로서 알부틴 50ppm 또는 코지산 50ppm을 배지에 포함시켜 사용하였다. 배지는 6일간 처치하였으며, 3일이 경과한 다음 한 번 새로운 배지로 교환하여 주었다. 6일이 경과한 후 세포를 DPBS로 세척한 다음, 2N NaOH(10% DMSO)를 넣고 60℃에서 1시간 동안 용해시켰다. 용해된 세포 용해물을 96웰 플레이트에 옮겨 흡광도를 측정하였다(OD 475). 측정된 값은 합성 멜라닌에 대한 표준 곡선으로부터 멜라닌 함량으로 산출하였으며, 산출된 멜라닌 함량을 각 실험군의 단백질 총량으로 표준화한 다음 대조군과 비교하여 효능을 평가하였다. 측정 결과는 도 3에 나타내었다.

또한, 3β,5α,9α-트리하이드록시-(22E,24R)-에르고스타-7,22-디엔-6-온의 미백 효과를 백화고 추출물과 비교하기 위하여, 상기와 동일한 방법으로 별도의 멜란-a 세포 멜라닌 분석 실험을 실시하였다. 이 때 시료로서는 알부틴 50ppm 또는 상기 참고예 1에서 수득한 백화고 추출물 12.5, 25, 50, 100ppm을 사용하였으며, 이를 세포 배양 배지에 포함시켜 사용하였다. 측정 결과는 도 4에 나타내었다.

도 3을 보면, 본 발명에서 사용한 3β,5α,9α-트리하이드록시-(22E,24R)-에르고스타-7,22-디엔-6-온이 멜라닌 생성 억제 효능을 보이며, 이는 농도 의존적임을 확인할 수 있다.

한편, 도 4를 보면, 백화고 추출물도 멜라닌 생성 억제 효능을 보이며, 농도 의존적으로 멜라닌 생성을 억제하고, 특히 100ppm을 처리한 경우 멜라닌 생성량이 대조군과 대비하여 74.5% 정도로 감소함을 확인할 수 있다(p-값<0.5).

그러나 도 3 및 도 4를 비교하면, 3β,5α,9α-트리하이드록시-(22E,24R)-에르고스타-7,22-디엔-6-온 10μM은 4.44ppm에 해당하는데, 백화고 추출물의 경우는 25ppm 이하의 농도에서 멜라닌 생성 억제 효과가 거의 없는 반면, 3β,5α,9α-트리하이드록시-(22E,24R)-에르고스타-7,22-디엔-6-온의 경우는 단지 4.44ppm의 양으로도 현저하게 우수한 멜라닌 생성 억제 효과를 나타냄을 알 수 있다. 뿐만 아니라, 3β,5α,9α-트리하이드록시-(22E,24R)-에르고스타-7,22-디엔-6-온은 공지된 미백제인 알부틴 및 코지산보다 훨씬 적은 양의 사용으로도 알부틴 및 코지산보다 현저하게 우수한 피부 미백 효과를 제공할 수 있음을 확인할 수 있다.

Claims

백화고(Lentinula edodes(Berk.) Sing.) 유래의 3β,5α,9α-트리하이드록시-(22E,24R)-에르고스타-7,22-디엔-6-온을 유효성분으로 함유하는 미백용 피부 외용제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유효성분은 에탄올을 이용하여 백화고 추출물을 얻은 다음, 상기 추출물을 물과 에틸 아세테이트로 분배 추출하여 에틸 아세테이트 분획을 얻고, 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 상기 에틸 아세테이트 분획으로부터 분리 및 정제하여 얻은 것인, 미백용 피부 외용제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유효성분은 조성물 총 중량에 대하여 10ppm~50000ppm의 양으로 함유되는, 미백용 피부 외용제 조성물.
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