KR101089712B1

KR101089712B1 - 디하이드로피라노쿠마린-ｄ２를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물

Info

Publication number: KR101089712B1
Application number: KR1020090050318A
Authority: KR
Inventors: 유익동; 류인자; 추수진; 김영희; 이지현; 송규용
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-06-08
Filing date: 2009-06-08
Publication date: 2011-12-07
Also published as: KR20100131624A

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 디하이드로피라노쿠마린-D2를유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 디하이드로피라노쿠마린-D2는 세포에 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라 멜라닌 합성을 효과적으로 저해함으로써 우수한 미백효과를 나타내므로 피부 미백용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

[화학식 1]

디하이드로피라노쿠마린-D2, 멜라닌 합성 저해, 미백

Description

디하이드로피라노쿠마린-Ｄ２를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물{Skin-whitening composition containing dihydropyranocoumarin-D2 thereof as an active ingredien}

본 발명은 디하이드로피라노쿠마린-D2를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부색은 크게 멜라닌, 헤모글로빈, 카로틴 등에 의해 결정되는데 이 중에서 가장 중요한 인자는 멜라닌이다. 멜라닌은 사람의 피부색을 결정할 뿐만 아니라 자외선에 대한 피부 보호 및 자유 라디칼 소거제(free radical scavenger)로서의 역할도 수행한다.

그러나 자외선에의 과다 노출 또는 대기 오염, 스트레스 등 외부의 환경 변화에 의해 멜라닌이 과다하게 생성된다. 멜라닌의 과잉생산은 인체에 기미, 주근깨 등을 형성하고 피부 노화를 촉진하거나 피부암의 유발에 관여하는 것으로 보고되었 다. 또한 오존층의 파괴로 자외선에 노출이 심해져 생기는 과잉의 멜라닌 합성은 인체의 피부 노화에 치명적인 해를 가져오고 있다.

멜라닌의 생합성 대사는 피부암과 관련하여 최근 집중적으로 연구되고 있고 이로부터 다양한 멜라닌 생성 저해제 등이 개발되어 의약품 산업에서 피부 질환 치료제, 화장품 산업에서 기미, 주근깨 등을 예방 및 치료하는 피부 미백제 또는 식품산업에서 갈변 방지제 등으로 적용되고 있다. 또한 최근에는 환경문제와 관련하여 그 수요가 급격히 증가되고 있다.

멜라닌의 합성 과정을 살펴 보면, 먼저 세포 내의 티로신을 기질로 하여 티로시나아제라는 효소가 도파(DOPA)를 거쳐 도파퀴논(DOPAquinone)을 생성시키고, 도파퀴논으로부터 자동 산화 반응과 효소 반응으로 도파크롬(DOPAchrome)을 거쳐 공중합체인 멜라닌이 생성된다. 이렇게 생성된 멜라닌은 멜라노좀이라는 소포체를 통해 케라티노사이트로 옮겨진 후 각화 과정을 거치면서 피부 표면으로 나와 각질과 함께 소실된다. 그러나 이 과정에서 멜라닌 생성을 촉진하는 요인에 의해 멜라닌이 과량 생성되고 각화에 의해 멜라닌이 완전히 없어지지 않으면 색소 침착 현상이 일어나게 된다. 따라서 이러한 색소 침착 현상을 방지하기 위해서는 멜라닌 생성 과정에서의 일부분을 조절하여 멜라닌의 생성을 감소시켜야 한다.

멜라닌의 합성을 저해하는 기작은 여러 가지가 있다. 먼저 대표적인 방법은 멜라닌 합성의 중요한 효소인 티로시나아제의 활성을 저해하는 것으로서, 가장 많이 알려진 것으로는 효소 활성을 위해 필요한 구리 이온을 킬레이트화하여 티로시나아제의 활성을 억제하는 코직산과 같은 킬레이터가 있다. 또한, 티로시나아제 활성을 저해하는 식물 추출물로는 상백피 추출물, 감초 추출물 등이 알려져 있다. 한편, 티로시나아제의 기질인 티로신의 경쟁적 저해제인 기질 유사 물질을 사용하여 멜라닌 합성을 감소시키는 방법이 있는데, 이러한 기질 유사 물질로는 알부틴, 감마-피론, 히노키톨 등이 알려져 있다.

그러나, 이런 미백 원료들은 안정성이 낮아 효과가 오래 지속되지 못하며 피부에 대한 자극성이 높기 때문에 그 사용이 제한되고 있으며, 식물 추출물의 경우는 고농도에서만 비교적 높은 효과를 나타내는 단점을 가지고 있어 제품의 적용 범위가 매우 제한된다.

참당귀(Angelica gigas)는 미나리과(umbelliferae)의 식물로서 중국산을 중국당귀(Angelica sinesis), 일본산을 왜당귀(Angelica acutilobae), 한국산을 참당귀(Angelica gigas)라고 한다. 예로부터 당귀는 어린순을 나물로 식용하고 뿌리를 진통효과, 신장독성 경감효과, 당뇨성 고혈압 치료 등 여러 가지 질환에 대한 약제로 사용하고 있다(Chi, H. J and Kim H. S. : Studies on the components of Umbelliferae Plants in Korea). 이러한 여러 가지 활성을 나타내는 주요한 성분은 dihydropyranocoumarin 계열의 물질인 (+)-데커신(decursin), (+)-데커시놀 안젤레 이트(decursinol angelate)와 같이 (+)-데커시놀(decursinol)[7-hydroxy-8,8-dimethyl-7,8-dihydro-6H-pyrano (3,2-g)chromen-2-one]의 secondary alcohol 기가 에스터화된 물질들이다(Bae, E. A. et al., Anti-Helicobacter pylori activity of herbal medicines. Biol Pharm Bull. 21, pp.990, 1998).

데커신(decursin)은 1996년 일본에서 최초로 바디나물(Angelica decursiva Fr. et Sav.)로부터 처음 분리된 천연물질이며, 데커신이 한국산 참당귀(Angelica gigas Nakai)에 다량 함유되어 있다는 것은 1967년과 1969년(J., Pharm. Soc. Korea, 11, pp.22-26, 1967; 13, pp.47-50, 1969)에 밝혀졌으며, 그 밖의 식물로는 기름나물(Peucedanum terevinthaceum Fisher et Turcz.)의 과실에서도 분리된 바 있다(한국약학회지, 30(2), pp.73-78, 1986). 데커신의 생리활성에 대해서는 항암효과(Cancer Res. 2005 & Mol. Pharmacol. 2007), 항염효과(Mol. Pharmacol. 2006) 및 신경세포독성에 대한 보호효과(J. Pharm. Pharmacol. 2007) 등이 보고되어 있다.

디하이드로피라노쿠마린-D2 합성의 전구체가 되는 데커시놀을 제조하기 위해서는 합성에 의하거나 참당귀를 용매 추출한 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 얻어진 분획물을 가수분해, 산추출한 후 다시 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 반복 실시하는 복잡한 과정을 거쳐야 하기 때문에 대량 제조의 문제, 복잡한 공정 및 원료의 비용 등 비효율성이 문제시되고 있다. 이에 본 발명자들은 대한 민국등록특허 제0715206호에서 참당귀로부터 데커시놀을 효율적으로 제조한 바 있다. 또한 대한민국 등록특허 제0812093호에서 데커시놀을 기본골격으로 하여 다양한 구조의 유도체를 합성한 바 있다.

한편, 데커신이 멜라닌 합성에 중요한 역할을 담당하는 효소인 티로시나아제의 활성을 억제하여 세포내 멜라닌의 합성을 저해하는 활성을 나타낸다는 보고가 있다(대한민국등록특허 제0379131호). 또한 데커시놀이 인체섬유아세포에서 세포의 증식을 촉진하며 주름개선 효능을 나타낸다는 보고가 있다 (대한민국공개특허 제10-2008-0040094).

그러나, 종래 디하이드로피라노쿠마린-D2 및 데커시놀 안젤레이트 화합물의 세포내 멜라닌의 합성을 저해하는 활성에 대해서는 전혀 알려진 바 없다. 이에 본 발명자들은 참당귀에서 분리된 (+)-데커시놀을 전구물질로 하여 다양한 구조의 화합물을 합성하던 중 디하이드로피라노쿠마린-D2가 세포에 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라 멜라닌 합성을 효과적으로 저해하여 우수한 미백효과를 나타내는 것을 확인함으로써 피부 미백용 조성물로 사용될 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 디하이드로피라노쿠마린-D2를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 디하이드로피라노쿠마린-D2를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에 따른 화학식 1의 디하이드로피라노쿠마린-D2는 세포에 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라, 멜라닌 합성을 효과적으로 저해함으로써 우수한 미백효과를 나타내므로 피부 미백용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 디하이드로피라노쿠마린-D2(3-페닐-아 크릴산-2,2-디메틸-8-옥소-3,4-디하이드로-2H,8H-피라노[3,2-g]크로멘-3-일-에스터터)를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 디하이드로피라노쿠마린-D2은 화장품 총중량을 기준으로 0.0001 내지 90 중량% 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 디하이드로피라노쿠마린-D2는 대한민국등록특허 제0812093호에 기재되어 있는 제조방법을 이용하여 합성될 수 있다. 상기 디하이드로피라노쿠마린-D2에 대한 구체적인 제조방법은 하기 제조예에서 설명한다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 디하이드로피라노쿠마린-D2는 B16 멜라노마 세포를 이용한 멜라닌 합성 저해 효과 측정 실험에서 농도의 증가에 따라 멜라닌의 합성양이 감소함으로써, 농도의존적으로 멜라닌의 합성을 저해하는 것을 알 수 있다(실시예 1, 표 1, 도 1 및 도 2 참조).

또한, 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 디하이드로피라노쿠마린-D2는 멜라노마 세포주인 B16을 이용한 세포독성 측정 실험에서 고농도에서도 높은 세포생존율 을 나타냄으로써 세포 독성을 나타내지 않아 매우 안전한 화합물임을 알 수 있다(실시예 2, 표 2 및 도 3 참조).

따라서, 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 디하이드로피라노쿠마린-D2는 세포에 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라, 멜라닌 합성을 효과적으로 저해함으로써 우수한 미백효과를 나타내므로 피부 미백용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 디하이드로피라노쿠마린-D2를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물은 피부 미백 및 개선 효과를 위한 화장품에 사용될 수 있다.

상기 화장품은 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤, 립스틱, 파운데이션, 아이쉐도우, 팻취, 마스크시트, 마사지 크림 등의 제형으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 화학식 1의 디하이드로피라노쿠마린-D2를 함유하는 화장품 이외에도 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

적합한 화장품의 제형으로는 예를 들면, 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스 킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱(conceal stick)의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 미백용 조성물은 화학식 1의 디하이드로피라노쿠마린-D2에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다,

단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 제조예 1> 디하이드로피라노쿠마린 - D2 의 제조

디하이드로피라노쿠마린-D2(3-페닐-아크릴산-2,2-디메틸-8-옥소-3,4-디하이드로-2H,8H-피라노[3,2-g]크로멘-3-일-에스터)는 2가지 다른 방법으로 합성하였다.

첫 번째 방법은 라운드 플라스크에 1.5 당량의 3-페닐-아크릴산을 넣고 이를 30-40 당량의 무수 벤젠으로 용해하였다. 여기에 2 방울의 N,N-디메틸포름아마이드와 7.5 당량의 티오닐클로라이드를 넣고 70-80 ℃에서 5시간 동안 환류시켜 시나모일 클로라이드를 제조하고, 실온으로 냉각하여 감압농축하였다. 1구 라운드 플라스크에 1 당량의 (+)-데커시놀과 3 당량의 피리딘을 넣고 50배(부피비)의 무수 디클로로메탄으로 용해하였다. 여기에 1.5 당량의 시나모일 클로라이드를 무수 디클로로메탄으로 용해하여 넣고, 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. 이를 감압농축한 뒤 농축액은 이동상(n-헥산 : 에틸아세테이트 = 10 : 1 - 1 : 1)을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피법으로 분리하여 디하이드피라노쿠마린-D2(3-페닐-아크릴산 2,2-디메틸-8-옥소-3,4-디하이드로-2H,8H-피라노[3,2-g]크로멘-3-일-에스터)를 수득하였다.

두 번째 방법은 라운드 플라스크에 1.5 당량의 3-페닐-아크릴산, 1.5-2.0 당량의 1,3-디사이클로헥실카보디이미드(DCC) 및 0.4 당량의 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)을 넣고 무수 디클로로메탄으로 용해하였다. 반응혼액에 1 당량의 (+)-데커시놀을 넣고 실온에서 24시간 동안 교반시켰다. 반응혼액은 디클로로메탄으로 세척하며 여과한 후, 여액을 감압농축하였다. 농축액은 이동상(n-헥산 : 에틸아세테이트 = 10 : 1 - 1 : 1)을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피법으로 분리하여 디하이드로피라노쿠마린-D2(3-페닐-아크릴산 2,2-디메틸-8-옥소-3,4-디하이드로-2H,8H-피라노[3,2-g]크로멘-3-일-에스터)를 수득하였다.

수율 : 49.3%;

성상 : 고체상;

m.p : 136-137 ℃;

분자량 : 376.40;

R_f = 0.40(n-헥산 : 에틸아세테이트 = 1 : 1);

¹H NMR(acetone-d₆, 400MHz): δ ppm 7.882(d, J=9.6Hz, 1H), 7.707(m, 3H), 7.433(m, 4H), 6.754(s, 1H), 6.568(d, J=16.0Hz, 1H), 6.212(d, J=9.2Hz, 1H), 5.240(t, J=4.6Hz, 1H), 3.344(dd, J=4.6, 17.6Hz, 1H), 2.991(dd, J=4.4, 17.6Hz, 1H), 1.436(s, 3H), 1.424(s, 3H);

MS(m/z) 377 (M+H)⁺

< 실시예 1> 디하이드로피라노쿠마린 - D2 의 멜라닌 합성 저해 효과

본 발명에 따른 디하이드로피라노쿠마린-D2 화합물의 멜라닌 합성 저해 효과를 알아보기 위하여 멜라노마 세포주인 B16을 대상으로 하기의 실험을 수행하였다.

10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 100 U/㎖ 페니실린이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에 멜라노마 세포주인 B16를 혼합하여 24 웰 플레이트에 1×10⁵ 세포/웰의 밀도로 접종하고 하루 동안 5% CO₂ 및 37 ℃의 조건에서 배양하였다. 그 후, 본 발명의 디하이드로피라노쿠마린-D2 화합물(제조예 1), 하기 화학식 2-4로 표시되는 비교예 1-3의 화합물 및 일반적으로 미백원료로 알려진 알부틴(비교예 4) 화합물을 3, 10, 30 및 100 μM 농도로 첨가한 후 30분 후 100 nM의 α-MSH(멜라닌세포 자극호르몬)를 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 음성 대조군에는 제조예 1의 화합물과 α-MSH를 모두 처리하지 않았고, 양성 대조군에는 제조예 1의 화합물만 처리하였다. 48시간 후, 405 ㎚에서 흡광도를 측정함으로써 배지에 존재하는 멜라닌의 양을 측정하였고, 화합물의 농도별 멜라닌 저해활성을 측정하여 IC₅₀ 값을 계산하였다. 그 결과를 하기 표 1, 도 1 및 도 2에 나타내었다.

<비교예 1> 데커신

[화학식 2]

3,3-디메틸아크릴산(4.065 g, 1 eq), 1,3-디사이클로헥실카보디이미드(16.8 g, 2 eq) 및 4-디메틸아미노피리딘(1.98 g, 0.4 eq)을 무수 디클로로메탄 350 ㎖에 용해시킨 용액에 데커시놀(10 g, 40.6 mmol, 1 eq)을 가한 후 실온에서 하루 동안 반응시켰다. 반응용액을 여과한 후 여액을 감압농축한 뒤 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 데커신을 수득하였다.

수율 : 64.0%(8.53 g);

R_f = 0.35(n-헥산 : 에틸아세테이트 = 2 : 1);

¹H NMR(CDCl₃, 400MHz) δ 7.589(d, J=9.6Hz, 1H), 7.160(s, 1H), 6.788(s, 1H), 6.222(d, J=9.6Hz, 1H), 5.663(s, 1H), 5.086(t, J=4.8Hz, 1H), 3.197(dd, J=4.8, 17.2Hz, 1H), 2.867(dd, J=4.8, 17.2Hz, 1H), 2.146(d, J=1.0Hz, 3H), 1.880(d, J=1.0Hz, 3H), 1.384(s, 3H), 1.365(s, 3H)

<비교예 2> 데커시놀 안젤레이트

[화학식 3]

안겔린산(4.065 g, 1 eq) 및 4-디메틸아미노피리딘(1.98 g, 0.4 eq)을 무수 디클로로메탄 350 ㎖에 용해시킨 용액에 데커시놀(10 g, 40.6 mmol, 1 eq)을 가한 후 실온에서 하루 동안 반응시켰다. 반응용액을 여과한 후 여액을 감압농축한 뒤 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 데커시놀 안젤레이트를 수득하였다.

수율 : 56.3%(7.5 g);

R^f = 0.35(n-헥산 : 에틸아세테이트 = 2 : 1);

¹H NMR(CDCl₃, 400MHz) δ 7.595(d, J=9.2Hz, 1H), 7.167(s, 1H), 6.819(qd, J=6.8, 1.2Hz, 1H), 6.790(s, H), 6.223(d, J=9.2Hz, 1H), 5.092(t, J=5.4Hz, 1H), 3.214(dd, J=4.8, 17.2Hz, 1H), 2.888(dd, J=5.4, 17.2Hz, 1H), 1.803(d, J=1.2Hz, 3H), 1.767(d, J=6.8Hz, 3H), 1.398(s, 3H), 1.378(s, 3H)

< 비교예 3> 데커시놀

[화학식 4]

대한민국 등록특허 제10-0715206호에 기재된 방법에 따라 데커시놀을 제조하였다. 참당귀 뿌리 1 kg을 에탄올로 80 ℃에서 9시간 동안 가열 환류추출한 후 감압농축하여 343 g의 조추출물을 얻은 후 에테르로 재추출하여 에테르 층을 얻었다. 에테르층을 감압농축한 후 25 g의 알칼리(NaOH)를 넣어 상온에서 24시간 동안 교반한 후 35% 염산수용액을 가하여 산성(pH 2)이 되게 하고 에틸아세테이트로 추출하여 감압농축하였다. 감압농축하여 얻은 갈색 잔사를 메탄올 또는 에틸아세테이트로 녹인 후 활성탄으로 처리하고 재결정하며, 실리카겔(75-250 mesh) 분리를 통해 데컬시놀 백색결정을 수득하였다.

	시료		멜라닌 합성(%)	IC₅₀(μM)
대조군	음성 대조군		26.37 ± 0.85	-
대조군	양성 대조군		100.00 ± 2.13	-
실험군	제조예 1	30(μM)	101.60 ± 0.80	17.1
		10(μM)	88.43 ± 1.79
		30(μM)	35.32 ± 0.39
		100(μM)	27.90 ± 0.12
	비교예 1	30(μM)	98.82 ± 1.43	45.4
		10(μM)	97.90 ± 9.53
		30(μM)	52.26 ± 8.74
		100(μM)	39.01 ± 12.10
	비교예 2	30(μM)	101.32 ± 0.36	89.1
		10(μM)	99.12 ± 3.32
		30(μM)	98.45 ± 6.65
		100(μM)	29.30 ± 7.12
	비교예 3	30(μM)	101.12 ± 0.78	활성 없음
		10(μM)	100.98 ± 6.32
		30(μM)	98.69 ± 3.32
		100(μM)	98.78 ± 9.12
	비교예 4	500(μM)	41.01 ± 4.02	1003.9

도 1 및 상기 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 제조예 1의 디하이드로피라노쿠마린-D2 화합물은 농도의존적으로 멜라닌의 합성양을 감소시키는 것을 알 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 제조예 1의 디하이드로피라노쿠마린-D2 화합물의 IC50 값은 17.1 μM로서, 비교예 1의 화합물의 IC50 값인 45.4 μM보다 2.7배, 비교예 2의 화합물의 IC50 값인 89.1 μM보다 5.2배, 비교예 4의 화합물의 IC50 값인 1003.9 μM보다 58.7배 우수한 멜라닌 저해활성을 나타내었다. 또한, 본 발명에 따른 제조예 1의 화합물은 비교예 2의 화합물과 비교하여 100 μM 농도에서 멜라닌 합성을 감소시키는 정도는 비슷하나, 제조예 1의 화합물은 IC50 값이 17.1 μM이고 비교예 2의 화합물의 IC50 값이 89.1 μM이므로, 본 발명에 따른 제조예 1의 디하이드로피라노쿠마린-D2 화합물이 비교예 2의 화합물보다 더 우수한 멜라닌 합성 저해활성을 갖는 것을 알 수 있다.

이로부터 본 발명에 따른 디하이드로피라노쿠마린-D2 화합물은 우수한 멜라닌 합성 저해활성을 갖는 것을 알 수 있다.

< 실시예 2> 디하이드로피라노쿠마린 - D2 화합물의 세포독성 실험

본 발명에 따른 디하이드로피라노쿠마린-D2 화합물의 세포독성을 측정하기 위하여 멜라노마 세포주인 B16을 대상으로 하기의 실험을 수행하였다.

10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 100 U/㎖ 페니실린이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에 멜라노마 세포주인 B16를 혼합하여 24 웰 플레이트에 1×10⁵ 세포/웰의 밀도로 접종하고 하루 동안 5% CO₂ 및 37 ℃ 의 조건에서 배양하였다. 새 배지로 교환한 후, 본 발명의 디하이드로피라노쿠마린-D2 화합물(제조예 1) 및 상기 화학식 2-4로 표시되는 비교예 1-3의 화합물을 1, 3, 10, 30 및 100 μM 농도로 첨가하고 24시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 제조예 화합물을 처리하지 않은 군을 사용하였다. 24시간 후, 5 ㎎/㎖의 MTT (3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드) 시약을 10 ㎕씩 처리하여 37 ℃에서 4시간 동안 추가배양하였다. 그 후, 배지 및 MTT 시약을 제거한 후, 1 ㎖의 디메틸설폭사이드(DMSO)를 첨가하여 발색정도를 575 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이를 3회 반복한 후, 통계처리하여 평균값을 구하였고, 그 결과를 하기 표 2 및 도 3에 나타내었다.

시료	농도(μM)	세포 생존율(%)
대조군	0	100
제조예 1	1	96.98 ± 1.87
	3	103.24 ± 3.99
	10	104.14 ± 2.64
	30	108.88 ± 0.01
	100	108.17 ± 0.14
비교예 1	1	99.5 ± 2.63
	3	92.8 ± 4.37
	10	92.0 ± 3.36
	30	85.9 ± 1.02
	100	55.4 ± 1.12
비교예 2	1	102.5 ± 5.32
	3	100.1 ± 3.65
	10	104.0 ± 2.46
	30	96.4 ± 1.39
	100	50.3 ± 4.21
비교예 3	1	107.0 ± 3.10
	3	109.7 ± 0.87
	10	110.3 ± 3.33
	30	109.3 ± 0.49
	100	100.5 ± 1.35

도 2 및 상기 표2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 제조예 1의 디하이드로피라노쿠마린-D2 화합물은 고농도에서도 세포에 독성을 나타내지 않음을 알 수 있다. 반면 비교예 1-2의 화합물은 100 μM의 농도에서 각각 55.4% 및 50.3%의 세포 생존율을 나타내며 세포에 독성을 일으키는 것을 알 수 있다. 또한, 비교예 2의 화합물은 100 μM의 농도에서 멜라닌 합성을 감소시키는 정도가 제조예 1의 화합물과 비슷하나, 세포 생존율이 50.3%로 제조예 1의 화합물의 세포 생존율인 108.17%보다 약 2배 정도 낮으므로, 세포에 독성을 유발하는 것을 알 수 있다.

이로부터 본 발명에 따른 디하이드로피라노쿠마린-D2 화합물은 세포에 독성을 유발하지 않아 인체에 안전하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.

그러므로 본 발명에 따른 디하이드로피라노쿠마린-D2는 세포에 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라 멜라닌 합성을 효과적으로 저해함으로써 우수한 미백효과를 나타내므로 피부 미백용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 디하이드로피라노쿠마린-D2는 목적에 따라 여러 형태로 제형화가 가능하다. 하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

< 제제예 1> 유연 화장수의 제조

정제수에 부틸렌 글리콜, 글리세린, 폴리옥시에틸렌(60) 경화피마자유, 베타인, 구연산, 구연산나트륨 및 방부제를 첨가하여 교반한 후 용해시킨 다음, 에탄올에 향료를 넣어 용해시킨 혼합물을 첨가하였다. 여기에 본 발명에 따른 디하이드로피라노쿠마린-D2를 가하여 충분히 교반한 후, 숙성시켜 실리마린 함유 유연 화장수를 제조하였다. 하기 표 3에 각 성분의 함량을 나타내었다.

원료	함량(w/w%)
본 발명에 따른 디하이드로피라노쿠마린-D2	50.0
부틸렌 글리콜	7.0
글리세린	5.0
폴리옥시에틸렌(60) 경화 피마자유	0.2
에탄올	5.0
베타인	2.0
구연산	0.02
구연산 나트륨	0.06
방부제	미량
향료	미량
정제수	미량

<제제예 2> 영양 화장수의 제조

본 발명에 따른 디하이드로피라노쿠마린-D2, 부틸렌 글리콜, 글리세린, 카르복시비닐폴리머, 아르기닌, 방부제 및 정제수를 70 내지 75 ℃에서 교반하면서 가열하였다. 여기에 75 내지 80 ℃에서 교반하여 가열시킨 스쿠알란, 부틸렌글리콜 디카프릴레이트/디카프레이트, 소르비탄스테아레이트, 포리소르베이트 60, 글리세릴스테아레이트 및 스테아릴글리세레티네이트 혼합물을 가하여 유화시킨 후, 교반하면서 45 ℃정도로 냉각하면서 향료를 첨가하여 교반한 다음, 30 ℃까지 냉각한 후 숙성시켜 디하이드로피라노쿠마린-D2 함유 영양화장수를 제조하였다. 하기 표 4에 각 성분의 함량을 나타내었다.

원료	함량(w/w%)
본 발명에 따른 디하이드로피라노쿠마린-D2	40.0
부틸렌 글리콜	8.0
글리세린	5.0
스쿠알란	10.0
부틸렌글리콜 디카프릴레이트/디카프레이트	5.0
소르비탄스테아레이트	1.5
폴리소르베이트 60	1.0
글리세릴스테아레이트	0.5
스테아릴글리시레티네이트	0.2
카르복시비닐폴리머	0.1
아르기닌	0.1
방부제	미량
향료	미량
정제수	미량

<제제예 3> 에센스의 제조

시토 시테롤, 폴리글리세릴 2-올레이트, 세라마이드, 세테아레스-4 및 콜레스테롤을 교반하여 혼합한 다음, 시토 시테롤, 폴리글리세릴 2-올레이트, 세라마이드, 세테아레스-4 및 콜레스테롤을 교반하여 혼합한 다음, 본 발명에 따른 실리마린, 디세틸포스페이트, 농글리세린 및 정제수 혼합 용액을 첨가하여 유화시킨 후, 교반하면서 45 ℃로 냉각되면 향료를 첨가하여 교반하고 30 ℃까지 냉각시켜 숙성시켰다. 여기에 카르복시비닐폴리머, 산탄검 및 방부제를 첨가하여 안정화시킨 후 숙성시켜 디하이드로피라노쿠마린-D2 함유 에센스를 제조하였다. 하기 표 5에 각 성분의 함량을 나타내었다.

원료	함량(w/w%)
본 발명에 따른 디하이드로피라노쿠마린-D2	10.0
시토 스테로	1.7
폴리글리세릴 2-올레이트	1.5
세라마이드	0.7
세테아레스-4	1.2
콜레스테롤	1.5
디세틸포스페이트	0.4
농글리세린	0.5
카르복시비닐폴리머	0.2
산탄검	0.2
방부제	미량
향료	미량
정제수	미량

도 1은 본 발명에 따른 제조예 1의 디하이드로피라노쿠마린-D2 화합물의 멜라닌 합성 저해 효과를 나타낸 그래프이고;

도 2는 본 발명에 따른 제조예 1의 디하이드로피라노쿠마린-D2 화합물의 멜라닌 합성 저해에 대한 반수저해농도(IC₅₀(μM))를 나타낸 그래프이고;

도 3은 본 발명에 따른 제조예 1의 디하이드로피라노쿠마린-D2 화합물의 세포독성 실험에 따른 세포생존율을 나타낸 그래프이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 디하이드로피라노쿠마린-D2를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장품 조성물.

[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 디하이드로피라노쿠마린-D2는 화장품 총중량을 기준으로 0.0001 내지 90 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 디하이드로피라노쿠마린-D2는 멜라닌 합성을 저해하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 디하이드로피라노쿠마린-D2는 세포에 독성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장품 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 화장품은 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤, 립스틱, 파운데이션, 아이쉐도우, 팻취, 마스크시트 및 마사지 크림으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장품 조성물.