KR102112301B1 - 노근 추출물 및 포도씨유를 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 노근 추출물 및 포도씨유를 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 노근 추출물 및 포도씨유를 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물 및 상처 재생 촉진용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 부작용이 적고, 흉터 없이 상처를 치료하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

노근 추출물 및 포도씨유를 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 조성물{Composition for treating skin wound comprising extract of Phragmitis Rhizoma and grape seed oil}

본 발명은 노근 추출물 및 포도씨유를 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 노근 추출물 및 포도씨유를 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물 및 상처 재생 촉진용 약학적 조성물에 관한 것이다.

우리 몸을 밖에서 감싸고 있는 피부는 일상생활에서 여러 가지 위험한 물리적 손상에 노출되어 있다. 피부는 절창, 자창 등의 직접적인 창상 외에도, 열에 의한 화상, 각종 물리적, 화학적 자극으로 인한 습진, 또는 부신피질호르몬의 증가로 인한 튼살 등 다양한 종류의 손상이 발생할 수 있다. 그 중에서 창상이나 화상으로 인한 손상의 경우 일반적으로 항생제를 함유하는 연고를 이용하여 상처로 인한 세균의 감염을 방지하는 치료가 일차적으로 행해지고 있다.

일반적으로 피부에 발생하는 ‘상처’는 개방형 상처 및 폐쇄형 상처로 특정화할 수 있다. 개방형 상처는 칼이나 면도칼과 같이 깔끔하고 끝이 날카로운 물질에 의한 절상, 압착력 또는 째는 힘에 의한 거칠고 불규칙적인 상처인 열상, 찰과상 또는 흔히 거친 면상에 미끄러져 생기는 피부의 최상층이 벗겨진 표면 상처 및 못이나 바늘과 같이 피부를 찌르는 물질에 의한 자상을 포함하여 여러 가지 많은 유형으로 분류할 수 있다. 또한 폐쇄형 상처는 보다 적은 수의 카테고리로 나누어지지만 개방형 상처만큼이나 위험하다. 즉, 폐쇄형 상처에는 피부 하부 조직을 손상시키는 둔기에 의한 외상으로 인한 타박상 또는 멍, 혈관을 손상시켜 혈액이 피부 밑에 체류되어 야기되는 혈종 및 장시간동안 강한 또는 엄청난 힘이 가해져 발생되는 압착 손상 등이 있다.

피부가 손상되면 부작용과 함께 2차 감염 등의 문제가 발생하므로 상처 치료가 매우 중요하다. 피부의 상처 부위가 적고 표피에만 국한되었을 경우에는 초기 염증반응 단계를 시작으로 상피세포의 증식과 이동 단계를 거쳐 정상세포 기능이 회복되는 표피층의 재건 단계로 구성된다. 또한, 피부의 바닥막까지 손상을 입었을 경우에는, 혈전 형성과 동시에 섬유소, 섬유결합소, 히아루론산과 같은 세포 외 기질의 침착이 발생하고, 상처 내의 이물질이나 괴사조직 등을 제거하여 상처를 깨끗하게 하는 염증단계, 혈관이 형성됨과 동시에 PDGF, EGF 및 FGF 등의 성장인자들이 방출되어 상처 부위가 새로운 조직으로 채워지고 새로운 상피세포로 보충되는 증식단계, 콜라겐 다발의 변형 및 재구성, 상처 수축, 장력이 증가하는 성숙단계를 거쳐 회복된다(Stadelmann, W.K. et al., Am J. Surg., 26S(176), 1998).　

상처치유는 상처 조직을 채우는 과정에서 시작하는데 이 조직들은 기질 콜라겐(matrix collagen), 피브로넥틴(fibronectin) 등으로 이루어지며, 이때 콜라겐 합성이 중요한 역할을 하게 된다. 상처치유나 피부재생 단계에서 콜라겐 합성이 중요한 역할을 담당함으로써 피부 재생을 촉진하며 흉터 생성을 억제할 수 있다 (Ueno, H. et al., Biomaterial, 1407(20), 1999; Buckley, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 7340(82), 2000; Manxi, L. et al., Cell Tissue Res., 423(297), 1999).

그동안 상처치료를 위한 다양한 물질 및 재료들이 끊임없이 개발되고 있으며 그 수요도 증가되고 있으나, 종래의 약품들은 대체로 치료 효과가 미비하고 치료가 되더라도 오랜 시간이 걸려서 장기간의 치료기간이 요구되고 이로 인하여 많은 비용이 발생한다는 문제점이 있었다.

이에 가격이 저렴하고 피부 상처에 대한 치료 효과가 우수할 뿐만 아니라 통증도 거의 없어 환자들이 사용하기 유용한 상처치료제의 개발의 필요성이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 자극 없이 효과적으로 상처 치유 효과가 있는 물질을 찾기 위해 천연물의 상처 치유 효과에 대하여 연구하던 중 노근 추출물 및 포도씨유 혼합물 피부의 콜라겐 합성, 항산화 효과, 지질 과산화 억제 효과를 나타낸다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 노근 추출물 및 포도씨유를 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 노근 추출물 및 포도씨유를 유효성분으로 포함하는 상처 재생 촉진용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 노근 추출물 및 포도씨유를 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 노근 추출물 및 포도씨유를 유효성분으로 포함하는 상처 재생 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 노근 추출물 및 포도씨유를 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 바람직하게는 노근 추출물과 포도씨유를 1:1-15 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에서는 먼저 마른 노근을 물에 넣어 고온에서 추출하였고, NaCl하에서 용출하여 추출물을 획득하였다. 그 다음 통상적인 방법을 이용하여 노근 추출물을 5 중량%가 함유되도록 하여 연고제제로 제조하였다. 또한 100% 포도씨유를 5 중량%가 함유되도록 하였고, 노근 추출물과 100% 포도씨유를 혼합하여 총량이 5 중량%가 함유되도록 하여 연고제제로 제조하였다.

본 발명에서 상기 ‘노근’은 키가 큰 갈대(Phragmitis communis Trin.)의 근경(根莖)을 말한다. 말린 노근은 납작하고 원기둥 모양으로 표면에 광택이 있고 황백색이며 마디부분은 비교적 단단하고 또렷한 황홍색이며 마디 사이에 세로주름이 있고, 늦은 봄이나 초여름 또는 가을에 채취하여 진흙과 수염뿌리를 제거하고 피막(皮膜)을 벗겨서 신선할 때 쓰거나 볕에 말려 사용한다. 성질은 차고 맛은 달며 독이 없다. 소갈과 외감열을 낫게 하고 식욕이 나게 하며 목이 메는 것, 딸꾹질하는 것을 멎게 한다. 임신부의 심열과 이질, 갈증을 낫게 한다.

본 발명에서 상기‘포도씨유(grape seed oil)’는 포도씨에서 채취한 기름을 식용에 적합하도록 정제한 것으로, 포도의 재배량이 많은 프랑스, 이탈리아, 칠레 등에서 주로 생산된다. 포도씨유는 식물성 기름의 한 종류로, 카테킨, 토코페롤, 리놀렌산, 베타씨토스테롤(β-Sitosterol) 등을 함유하고 있다. 피부 미용과 노화 방지에 효과가 있고, 동맥경화나 고혈압 등의 성인병을 예방하는 효과가 있다.

본 발명에서 상기 ‘상처(wound)’는 원인, 형상, 감염의 유무, 장기의 손상, 관절의 손상 등에 따라 나뉘어 진다. 상처에 따른 증세로는 통증, 출혈, 기능장애 등이 있다. 상처를 입는 경우, 생체는 곧 반응해서 상해를 빨리 회복하려고 한다. 바람직하게는 피부 조직이 날카로운 외부 자극에 의해 손상되어 생긴 상처인 창상을 의미한다.

상처의 치유 과정은 하기와 같이 염증기, 육아기, 상피화기, 증식기 및 성숙기의 5기로 구분할 수 있다.

염증기(inflammatory phase)는 조직 손상 후, 출혈이 일어나면 지혈을 위해 카테콜아민이 방출되어 일시적인 혈관 수축이 일어나며, 곧이어 비만세포 등에서 분비된 세로토닌, 히스타민 등으로 국소 혈관이 확장되면서 혈장 및 단백질이 누출(diapedesis)되는 과정이다.

육아기(Granulation)는 개방성 창상에서 나타나며, 콜라겐, 피브로넥틴, 히알우론산, 대식세포 및 섬유아세포 및 모세혈관 내피 세포로 구성되는 육아조직으로부터 새로운 세포외 조직이 형성되는 과정을 말한다.

상피화기(Epithelialization)에서는 상처 발생 후 수분 이내 상처 부위의 표피가 두꺼워지고, 기저세포가 커지며, 창상의 결손부위로 이동하게 되는데, 이때, 상처 부위의 가까운 곳에 있는 고정된 기저세포가 계속 분열하며 그 딸세포가 창상 기질 위로 이동하며, 결합성 당단백질인 피브리노겐, 비트로넥틴, 테나신등은 창상기질 위로 상피세포 이동을 촉진한다.

증식기(Fibroplasia)는 반흔이 형성되는 과정으로, 콜라겐이 주된 성분이 되며, 콜라겐 합성 및 분해의 균형으로 반흔의 크기와 양이 조절된다.

수축기(Contraction)는 반흔의 면적을 줄여 결손 부위를 치유하기 위한 과정으로, 근섬유아세포(myofibroblast)에 의해 이루어진다.

본 발명은 노근 추출물 및 포도씨유를 유효성분으로 포함하는 상처 재생 촉진용 약학적 조성물을 제공한다. 바람직하게는 노근 추출물과 포도씨유를 1:1-15 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 상기 약학적 조성물이 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 겔, 페이스트, 연고 프로스트, 산제, 유제 또는 에어로졸 형태의 제제로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 노근 추출물 및 포도씨유를 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.01 ㎍ 내지 10,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500 mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명의 일실시예에서는 마우스의 등 부분을 면도한 다음 지름이 0.8cm인 원형으로 상처를 두 개 만들었다. 하나는 대조군으로 증류수 및 왁스를 12일 동안 매일 발라주었고, 하나는 노근, 포도씨유, 노근+포도씨유를 12일 동안 매일 발라주었다. 상처를 낸 후 0일, 4일, 8일, 12일 째에 상처를 디지털 카메라로 촬영하였고, 투명필름으로 본 떠 상처 크기를 분석하였다. 그 결과 대조군에 비해. 노근과 포도씨유를 함께 발라준 경우에 상처 크기가 가장 빠르게 작아지는 것을 확인하였고, 상처 회복율 또한 가장 높은 것을 확인하였다.(실시예 1 및 도 1 참조).

본 발명의 또 다른 일실시예에서 마우스에 상처를 생성한 이후 4일, 8일, 12일 뒤에 상처 조직을 획득하였다. 상처 조직의 콜라겐 함량을 측정하기 위해, 키트를 이용하여 히드록시프롤린(hydroxyproline) 함량을 측정한 결과, 대조군에 비하여 노근 또는 포도씨유를 바른 경우에 상처 조직에서 히드록시프롤린의 함량이 높은 것을 확인하였으며, 포도씨유와 노근을 함께 바른 경우에 히드록시프롤린 함량이 가장 높은 것을 확인하였다(실시예 2 및 도 2 참조).

본 발명의 또 다른 일실시예에서 마우스에 상처를 생성한 이후 4일, 8일, 12일 뒤에 상처 조직을 획득하였다. 키트를 이용하여 상처 조직의 말론디알데하이드 레벨(malondialdehyde level)을 측정한 결과, 대조군에 비하여 포도씨유 또는 노근을 바른 경우에 상처 조직에서 말론디알데하이드(MDA)의 함량이 낮은 것을 확인하였고, 모든 그룹에서 노근과 포도씨유를 함께 바른 경우에 MDA의 함량이 가장 낮은 것을 확인하였다(실시예 3 및 도 3 참조).

본 발명의 또 다른 일실시예에서 마우스에 상처를 생성한 이후 4일, 8일, 12일 뒤에 상처 조직을 획득하였다. 키트를 이용하여 상처 조직의 아스코르브산(ascorbic acid, vitamin C) 레벨을 측정한 결과, 대조군에 비해 노근 또는 포도씨유를 바른 경우에 상처 조직에서 아스코르브산의 함량이 높은 것을 확인하였고, 노근과 포도씨유를 함께 바른 경우에 아스코르브산의 함량이 가장 높은 것을 확인하였다(실시예 4 및 도 4 참조).

본 발명의 또 다른 일실시예에서 마우스의 등 부분을 면도한 다음 지름이 0.8cm인 원형으로 상처를 두 개 만들었다. 하나는 대조군으로 증류수 및 왁스를 12일 동안 매일 발라주었고, 하나는 노근, 포도씨유, 노근+포도씨유를 12일 동안 매일 발라주었다. 상처를 낸 후 12일 째에 상처 조직을 획득하여 H&E 염색을 통해 조직을 관찰하였다. 그 결과, 대조군에 비해 노근 또는 포도씨유를 바른 경우에 상처가 더 많이 회복되는 것을 확인하였으며, 노근과 포도씨유를 혼합하여 바른 경우에 노근 또는 포도씨유를 바른 경우보다 상처가 거의 완벽하게 재생되는 것을 확인할 수 있었다(실시예 5 및 도 5 참조).

따라서, 본 발명은 노근 추출물 및 포도씨유를 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법은 부작용이 적고, 흉터 없이 상처를 치료하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1a는 마우스의 등에 동일한 크기의 상처를 내고 포도씨유, 노근, 포도씨유+노근을 바른 후, 0일, 4일, 8일, 12일 째의 상처 모습을 디지털 카메라로 촬영한 모습을 나타낸 것이다.
도 1b는 마우스의 등에 동일한 크기의 상처를 내고 포도씨유, 노근, 포도씨유+노근을 바른 후, 0일, 4일, 8일, 12일 째의 상처의 크기를 분석하여 회복율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 마우스의 등에 동일한 크기의 상처를 내고 포도씨유, 노근, 포도씨유+노근을 바른 후, 0일, 4일, 8일, 12일 째의 상처 조직에서 히드록시프롤린 지수(hydroxypoline index)를 이용하여 콜라겐 총 함유량을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 마우스의 등에 동일한 크기의 상처를 내고 포도씨유, 노근, 포도씨유+노근을 바른 후, 0일, 4일, 8일, 12일 째의 상처 조직에서 지질 과산화(lipid peroxidation) 정도를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 마우스의 등에 동일한 크기의 상처를 내고 포도씨유, 노근, 포도씨유+노근을 바른 후, 0일, 4일, 8일, 12일 째의 상처 조직에서 아스코르브산(ascorbic acid) 함량을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 마우스의 등에 동일한 크기의 상처를 내고 노근, 포도씨유, 노근+포도씨유를 바른 후 12일 째의 상처 조직을 수득하여, H&E 염색을 실시하여 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다(a: x50, b: x100).

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<추출물의 제조방법>

마른 노근을 아주 잘게 잘라 약 40∼50 g을 물 1 L에 넣은 후, 100℃에서 4시간 동안 추출하였고 상온에서 식혔다. 노근 추출물을 식힌 다음, 가라앉은 불순물이 섞이지 않도록 하여 상층액을 수득하였고, SephadexG-150(2.7×72cm) 칼럼(Sigma-Aldrich)을 이용하여 NaCl(0.1 mol/l)하에서 용출하여 추출물을 수득하였다. 수득한 추출물을 동결건조하여 분말을 획득하였다. 이를 65℃에서 적당량의 100% 포도씨유와 혼합하며 적량의 wax등을 섞어 주었다. 최종적으로 노근 추출물 및 포도씨유의 혼합물의 비율은 연고 100% 중량에서 포도씨유는 50 내지 70 중량%, 노근 추출물은 5 중량%로 맞추어 연고제제로 제조하였다.

또한, 포도씨유 단독제제는 포도씨유 100%를 사용하였고, 노근 단독제제는 노근 분말이 5 중량%가 되도록 하여 당업계의 통상적인 방법으로 연고제제로 제조하여 사용하였다.

<실시예 1>

마우스 절제 모델에서 노근이 상처 크기에 미치는 영향

7주령의 수컷 SD rat(180~200g) 36 마리를 구입하였고, 일주일 동안 22±2℃, 습도 55±5% 및 12 시간 주기일 표준 실험조건(conventional laboratory condition)에서 적응시켰고, 12마리씩 4일 그룹, 8일 그룹 및 12일 그룹, 3개의 그룹으로 나누어 실험을 진행하였다.

마우스 절제 모델(Excision wound model)을 이용하기 위하여, 마우스의 등 부분을 면도하여 털을 제거한 다음, 지름이 0.8cm인 원형 절제 상처(excision wound)를 두 개 만들었다. 그 중 하나의 상처는 대조군으로서 증류수 및 왁스를 12일 동안 매일 발라주었고, 다른 상처에는 노근, 포도씨유 또는 노근+포도씨유를 12일 동안 매일 발라주었다.

노근이 상처에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상처를 생성한 이후 0일, 4일, 8일, 12일 뒤에 좌우의 상처 부위를 디지털 카메라를 이용하여 촬영하였고, 투명 필름을 이용해 본 뜬 뒤, Paint NET 소프트웨어를 이용하여 상처 크기를 분석하였다. 상처 크기 분석은 하기의 식을 이용하여 분석하였다.

% Wound size = At / A₀*100

A₀ : 최초 상처 사이즈

At : 측정 당시의 상처 사이즈

그 결과 도 1에 나타난 바와 같이, 각 그룹(4일, 8일 및 12일)에서 노근, 포도씨유, 노근+포도씨유를 바른 경우에 상처의 크기가 점차 감소하는 것으로 나타났고, 노근+포도씨유를 바른 경우에 상처의 크기가 가장 빠르게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 1a). 또한 상처 크기를 분석한 결과, 각 그룹에서 대조군에 비하여 노근, 포도씨유, 노근+포도씨유를 바른 경우에 상처 회복율이 높은 것으로 나타났고, 각 그룹에서 노근+포도씨유를 바른 경우에 상처 회복율이 가장 높은 것으로 나타났다(도 1b).

<실시예 2>

마우스 절제 모델에서 노근이 조직 콜라겐에 미치는 영향

상기 실시예 1과 동일하게 마우스 절제 모델에 두 개의 상처를 만든 다음, 그 중 하나의 상처는 대조군으로서 증류수 및 왁스를 12일 동안 매일 발라주었고, 다른 상처에는 노근, 포도씨유 또는 노근+포도씨유를 12일 동안 매일 발라주었다.

노근이 상처 조직에서 콜라겐의 함량에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상처를 생성한 이후 4일, 8일, 12일 뒤에 상처 조직을 획득하였다. 그 다음 히드록시프롤린 지수(hydroxyproline index)에 따라 Hydroxyproline Colorimetric Assay Kit(Biovision, K555-100)를 이용하여 상처 조직의 콜라겐 총 함량을 측정하였다. 히드록시폴린은 콜라겐에 다량으로 함유되어 있는 아미노산이다.

5 mg 조직을 100 μl의 증류수로 균질화(homogenate)시킨다. 이렇게 만든 100 μl의 샘플에 100 μl의 HCl을 넣은 뒤, 120℃ 조건에서 3시간 동안 가수분해하였다. 이후 볼텍싱(vortexing)한 뒤 10,000 x g 조건에서 3분 동안 원심분리 하였고, 각 샘플에서 10 μl씩 취해서 96-well plate에 넣은 다음 증발시켰다. 키트 내의 히드록시프롤린 표준액(Hydroxyproline Standard)을 증류수에 희석시켜 농도 구배에 따른 표준용액을 준비하였고, 클로라민 T 용액(Chloramine T reagent) 100 μl을 각 샘플 및 표준에 넣고 상온에서 5분 동안 반응시켰다. DMAB 용액 100 μl를 각 샘플에 추가한 뒤, 60℃ 조건에서 90분 동안 반응시켰다. 그 다음 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 이용하여 560nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 노근, 포도씨유, 노근+포도씨유를 바른 경우에 상처 조직 100 mg당 히드록시프롤린의 함량이 높은 것으로 나타났으며, 노근+포도씨유를 바른 경우에 히드록시프롤린의 함량이 가장 높은 것으로 나타났다. 또한 시간에 따라 노근, 포도씨유, 노근+포도씨유를 바른 경우에 히드록시프롤린의 함량이 점차 증가하는 것으로 나타났다.

이를 통해, 대조군에 비하여 포도씨유나 노근을 바른 경우에 조직에서 콜라겐의 함량이 높으며, 노근 또는 포도씨유를 단독으로 바른 것 보다 노근과 포도씨유를 함께 바른 경우에 콜라겐 함량이 더 높은 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 3>

마우스 절제 모델에서 노근이 지질 과산화에 미치는 영향

상기 실시예 1과 동일하게 마우스 절제 모델에 두 개의 상처를 만든 다음, 그 중 하나의 상처는 대조군으로서 증류수 및 왁스를 12일 동안 매일 발라주었고, 다른 상처에는 노근, 포도씨유 또는 노근+포도씨유를 12일 동안 매일 발라주었다. 그 다음 마우스에 상처를 생성한 이후 4일, 8일, 12일 뒤에 상처 조직을 획득하였다.

노근이 상처 조직에서 지질 과산화에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 마우스 모델에서 상처 조직을 획득한 다음, 제조사의 지침에 따라 MDA Assay Kit (Biovision, K739-100)을 이용하여 말론디알데하이드 레벨(malondialdehyde level)을 측정하여, 상처 조직에서 산화적 스트레스의 정도를 평가하였다. 말론디알데하이드(malondialdehyde, MDA)는 세포막의 지질과 활성산소가 반응해 만들어지는 지질 과산화물로, 주로 세포와 조직에 염증이 일어나는 산화 스트레스를 확인하는 지표로 사용된다.

상처 조직을 10 mg으로 분리하여 MDA Lysis Buffer 300 μl와 BHT(100x) 3 μl에 넣어 균질화(homogenate) 하였고, 13,000 x g 조건에서 10분 동안 원심분리(cengrifuge) 하였다. 이후 상층액 200 μl를 분리하여 보관하였다. 제조사의 지침에 따라 키트 내의 표준액(Standard)을 200 μl씩 준비하였고, TBA reagent 600 μl를 각 샘플과 표준액에 넣고 95℃ 조건에서 60분 동안 반응시킨 다음, 10분 동안 냉각시켜서 상온으로 만들어 주었다. 이후 각각 200 μl씩 얻어 96-well plate에 넣어주었다. 그 다음 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 이용하여 532nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 노근, 포도씨유, 노근+포도씨유를 바른 경우에 상처 조직 1 mg당 말론디알데하이드(MDA)의 함량이 낮은 것으로 나타났고, 노근+포도씨유를 바른 경우에 MDA의 함량이 가장 낮은 것으로 나타났다. 이를 통해, 노근이 상처 조직의 지질 과산화를 억제하는 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 4>

마우스 절제 모델에서 노근이 항산화에 미치는 영향

상기 실시예 1과 동일하게 마우스 절제 모델에 두 개의 상처를 만든 다음, 그 중 하나의 상처는 대조군으로서 증류수 및 왁스를 12일 동안 매일 발라주었고, 다른 상처에는 노근, 포도씨유 또는 노근+포도씨유를 12일 동안 매일 발라주었다. 그 다음 마우스에 상처를 생성한 이후 4일, 8일, 12일 뒤에 상처 조직을 획득하였다.

노근이 상처 조직에서 항산화에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 마우스 모델에서 상처 조직을 획득한 다음, Ascorbic Acid Assay Kit(Biovision, K661-100)을 이용하여 아스코르브산(ascorbic acid, vitamin C) 레벨을 측정하여, 상처 조직의 항산화 정도를 평가하였다.

상기와 같이 균질화(homogenate)한 샘플을 96-well plate에 각각 넣은 뒤, 키트 내의 아스코르브산 분석 버퍼(Ascorbic Acid Assay Buffer)를 넣어서 120 μl로 만들었다. 표준액(Standard)은 키트 제조사의 지침에 따라 준비하였다. 카탈리스트(catalyst)는 100 μl를 증류수 900 μl에 넣고 볼텍싱(vortexing)하여 혼합하였고, 30 μl씩 표준(standard)과 샘플이 들어 있는 웰(well)에 넣어주었다. 그 다음 미리 만들었던 아스코르브산 반응 혼합물(Ascorbic Acid Reaction Mix) 50 μl를 각 웰에 넣고 잘 혼합하여 준 다음 5분 동안 빛이 없는 곳에 두었다. 그 다음 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 도 4에 나타난 바와 같이, 상처가 회복되는 기간 동안 아스코르브산의 함량이 증가하는 것으로 나타났다. 또한 대조군에 비해 노근, 포도씨유, 노근+포도씨유를 바른 경우에 상처 조직 100 mg당 아스코르브산의 함량이 높은 것으로 나타났고, 노근+포도씨유를 바른 경우에 아스코르브산의 함량이 가장 높은 것으로 나타났다.

이를 통해, 노근이 상처 조직의 항산화를 촉진시키는 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 5>

마우스 절제 모델에서 노근이 조직에 미치는 영향

상기 실시예 1과 동일하게 마우스 절제 모델에 두 개의 상처를 만든 다음, 그 중 하나의 상처는 대조군으로서 증류수 및 왁스를 12일 동안 매일 발라주었고, 다른 상처에는 노근, 포도씨유 또는 노근+포도씨유를 12일 동안 매일 발라주었다.

노근이 상처 조직에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 마우스에 상처를 생성한 이후 12일 뒤에 상처 조직을 획득하였고, 이 상처 조직을 이용하여 다음과 같이 조직병리학적 평가를 실시하였다

마우스 모델에서 획득한 상처 조직을 10% 포르말린(formalin)에 24 내지 48 시간 동안 고정시켰다. 그 다음 증류수로 씻은 뒤, 70% 에탄올(ethanol)로 탈수시켰다. 그 다음, 해당 부위를 자일렌(xylene)을 처리하였고, 파라핀(paraffin)을 이용하여, 파라핀 블록(paraffin block)을 만들었다. 파라핀 블록을 5 μm 단위로 잘라 섹션(section)을 만든 다음, 파라핀을 제거하고, 탈수 처리하였다. 그 다음 각 섹션은 당업계에 잘 알려진 방법에 따라, 헤마톡실린(hematoxylin)으로 염색한 뒤, 이오신(eosin)으로 대비염색(counterstain)을 실시하였다. 그 후, 현미경(Olympus BX-50,Tokyo, Japan)을 이용하여 조직을 관찰하였다.

그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 대조군인 증류수(DW)를 바른 경우에는 상처가 완전히 아물지 않았으며, 상처 부위에 염증세포들이 존재하는 것으로 나타났다. 노근을 바른 경우와 포도씨유를 바른 경우에는 상피가 복구되어 염증이 완화되는 것으로 나타났고, 섬유세포의 활성과 콜라겐이 조금 생성되는 것으로 나타났다. 노근+포도씨유를 바른 경우에는 상피가 복구되었고, 상피와 진피의 확연하게 구분되고, 섬유세포의 활성이 뚜렷하며 콜라겐의 생성이 도드라졌으며, 피부가 거의 완벽하게 재생된 것으로 나타났다.

이를 통해, 노근과 포도씨유를 함께 처리한 경우가 노근 또는 포도씨유만 처리한 경우보다 상처 치유 및 피부 재생에 더 효과적인 것을 확인할 수 있었다.

이상 살펴본 바와 같이 본 발명의 방법은 부작용이 적고, 흉터 없이 상처를 치료하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (6)

1. 노근 추출물 및 포도씨유를 1: 10-15 중량비로 혼합한 혼합물을 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물이 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 상처 치료용 약학적 조성물.
   
4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 약학적 조성물이 겔, 페이스트, 연고 프로스트, 산제, 유제 또는 에어로졸 형태의 제제인 것을 특징으로 하는 상처 치료용 약학적 조성물.
   
5. 노근 추출물 및 포도씨유를 1: 10-15 중량비로 혼합한 혼합물을 유효성분으로 포함하는 상처 재생 촉진용 약학적 조성물.
   
   
6. 삭제

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