KR102111669B1 - 프로바이오틱스 복합균의 대량생산을 하기 위한 특수배지 및 이를 이용한 프로바이오틱스 복합균 대량생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 프로바이오틱스 복합균의 대량생산을 하기 위한 특수배지 및 이를 이용한 프로바이오틱스 복합균 대량생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 복수의 기능성 미생물 각각이 모두 공존할 수 있는 특수배지를 제공하고, 장내 전달이 용이한 프로바이오틱스 복합균을 배양하여 질병유래균의 생육을 억제할 수 있는, 프로바이오틱스 복합균의 대량생산을 하기 위한 특수배지 및 이를 이용한 프로바이오틱스 복합균 대량생산방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 프로바이오틱스 복합균의 대량생산을 하기 위한 특수배지 및 이를 이용한 프로바이오틱스 복합균 대량생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 복수의 기능성 미생물 각각이 모두 공존할 수 있는 특수배지를 제공하고, 장내 전달이 용이한 프로바이오틱스 복합균을 배양하여 질병유래균의 생육을 억제할 수 있는, 프로바이오틱스 복합균의 대량생산을 하기 위한 특수배지 및 이를 이용한 프로바이오틱스 복합균 대량생산방법에 관한 것이다.
프로바이오틱스 복합균을 이루는 미생물종인 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens), 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 및 클로스트리듐 브티리컴(Clostridium butyricum)은 효과기작이 서로 다르고, 각각의 배양 환경 또한 다르다.
상기와 같은 9종의 미생물은 표준 배양법에 의해 각각 배양될 수 있다. 다만, 상기 9종의 미생물은 각각 표준배지성분, 배양온도, pH, 및 급기 방법이 상이하기 때문에, 상기 9종의 미생물을 한 번에 고르게 배양시키기 위한 기술 등이 적용되지는 않고 있는 실정이다.
또한, 표준 배양법은 고가의 성분으로 구성된 영양배지를 사용하고 있기 때문에 프로바이오틱스 복합균을 이루는 상기와 같은 9종의 미생물을 대량으로 생산하기에는 적합하지 않은 문제점이 있다.
특허문헌 1(한국등록특허 제1980098호, 2019.5.20 공고)는 양어용 사료, 어분 또는 어분 부산물, 효소 및 물을 포함하는 프로바이오틱스 배양용 배지 조성물, 및 상기 배지 조성물에 프로바이오틱스를 배양한 프로바이오틱스 배양액을 양어용 사료에 흡착 또는 배합하여 수득한 양어용 사료를 어패류에 섭이시킴으로써, 각종 병원성 미생물이 양식 어패류에 감염되는 것을 저감할 수 있는 어패류의 양식방법을 개시하고 있다. 그러나, 이는 배양액 배지의 원가가 상승하고, 상기와 같은 9종의 미생물을 동시에 고르게 배양시키지 못한다는 문제점이 있다.
특허문헌 1(한국등록특허 제1980098호, 2019.5.20 공고)는 양어용 사료, 어분 또는 어분 부산물, 효소 및 물을 포함하는 프로바이오틱스 배양용 배지 조성물, 및 상기 배지 조성물에 프로바이오틱스를 배양한 프로바이오틱스 배양액을 양어용 사료에 흡착 또는 배합하여 수득한 양어용 사료를 어패류에 섭이시킴으로써, 각종 병원성 미생물이 양식 어패류에 감염되는 것을 저감할 수 있는 어패류의 양식방법을 개시하고 있다. 그러나, 이는 배양액 배지의 원가가 상승하고, 상기와 같은 9종의 미생물을 동시에 고르게 배양시키지 못한다는 문제점이 있다.
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본 발명은 복수의 기능성 미생물 각각이 모두 공존할 수 있는 특수배지를 제공하고, 장내 전달이 용이한 프로바이오틱스 복합균을 배양하여 질병유래균의 생육을 억제할 수 있는, 프로바이오틱스 복합균의 대량생산을 하기 위한 특수배지 및 이를 이용한 프로바이오틱스 복합균 대량생산방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 일 실시예에서는, 프로바이오틱스 복합균의 대량생산방법으로서, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens), 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 및 클로스트리듐 브티리컴(Clostridium butyricum) 각각의 초기배양액을 포함하는 제1배양액을 준비하는 초기배양액준비단계; 및 상기 제1배양액을 단일의 특수배지에서 배양하는 배양단계;를 포함하고, 상기 특수배지는 중량%로, 단백질(Protein) 6.3 ~ 9.3%, 탄수화물(Carbohydrate) 1.8 ~ 4.2%, 및 미네랄(Mineral) 0.061 ~ 0.121%를 함유하고, 상기 배양단계에서는 섭씨 32도 ~ 섭씨 34도의 배양온도에서 상기 제1배양액이 상기 특수배지에서 배양되는, 프로바이오틱스 복합균의 대량생산방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 배양단계에서는 4% ~ 6%의 이산화탄소(CO2)가 급기되는 환경에서 상기 제1배양액이 상기 특수배지에서 배양되는, 프로바이오틱스 복합균의 대량생산방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 단백질은(Protein) 섭씨 115도 ~ 섭씨 125도에서 가압열탕하여 화기건조한 돼지부산물의 미분말을 포함하고, 상기 탄수화물(Carbohydrate)은 섭씨 115도 ~ 섭씨 125도에서 가압열탕하여 화기건조한 쌀겨의 미분말 및 밀겨의 미분말을 포함하는, 프로바이오틱스 복합균의 대량생산방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 미네랄(Mineral)은 이온화미네랄수용액 및 천일염을 포함하고, 상기 이온화미네랄수용액은, 맥반석, 규석, 및 장석 중 1 이상을 포함하는 비금속성광물로부터 미네랄 성분을 획득하고 모려로부터 탄산칼슘 성분을 획득하여, 상기 미네랄 성분 및 상기 탄산칼슘 성분을 포함하는 기능성성분을 가진 미네랄복합체의 결정을 저분자화, 저밀도화, 및 이온화 처리한 저분자 저밀도 이온화 미네랄 복합체를 수용화하여 포함하는, 프로바이오틱스 복합균의 대량생산방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 특수배지는 중량%로, 미세조류미분말 0.1 ~ 2%를 더 함유할 수 있고, 상기 미세조류미분말은 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma), 두나리엘라 샐리나(Dunaliella salina), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 및 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis)를 원재료로 포함하는, 프로바이오틱스 복합균의 대량생산방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 미세조류미분말은, 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma), 두나리엘라 샐리나(Dunaliella salina), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 및 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis)의 네 미세조류 균주를 배지에서 대량으로 배양하는 미세조류배양단계; 배양된 미세조류를 배지로부터 분리하여 포집하는 미세조류포집단계; 미세조류를 압착하여 오일 성분을 추출하는 오일추출단계; 오일추출 후의 미세조류를 분쇄하는 분말가공단계; 및 상기 분말가공단계를 거친 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma), 두나리엘라 샐리나(Dunaliella salina), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 및 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis)의 네 미세조류 분말을 혼합하는 분말혼합단계;를 통해 제조되고, 상기 미세조류배양단계, 상기 미세조류포집단계, 상기 오일추출단계 및 상기 분말가공단계는 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma), 두나리엘라 샐리나(Dunaliella salina), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 및 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis)의 네 미세조류에 대해 각각 수행되는, 프로바이오틱스 복합균의 대량생산방법을 제공한다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 일 실시예에서는, 프로바이오틱스 복합균의 대량생산을 하기 위한 특수배지로서, 상기 특수배지는 중량%로, 단백질(Protein) 6.3 ~ 9.3%, 탄수화물(Carbohydrate) 1.8 ~ 4.2%, 및 미네랄(Mineral) 0.061 ~ 0.121%를 함유하고, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens), 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 및 클로스트리듐 브티리컴(Clostridium butyricum) 각각의 초기배양액을 포함하는 제1배양액이 단일의 상기 특수배지에서 배양될 수 있는, 프로바이오틱스 복합균의 대량생산을 하기 위한 특수배지를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 단백질은(Protein) 섭씨 115도 ~ 섭씨 125도에서 가압열탕하여 화기건조한 돼지부산물의 미분말을 포함하고, 상기 탄수화물(Carbohydrate)은 섭씨 115도 ~ 섭씨 125도에서 가압열탕하여 화기건조한 쌀겨의 미분말 및 밀겨의 미분말을 포함하는, 프로바이오틱스 복합균의 대량생산을 하기 위한 특수배지를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 미네랄(Mineral)은 이온화미네랄수용액 및 천일염을 포함하고, 상기 이온화미네랄수용액은, 맥반석, 규석, 및 장석 중 1 이상을 포함하는 비금속성광물로부터 미네랄 성분을 획득하고 모려로부터 탄산칼슘 성분을 획득하여, 상기 미네랄 성분 및 상기 탄산칼슘 성분을 포함하는 기능성성분을 가진 미네랄복합체의 결정을 저분자화, 저밀도화, 및 이온화 처리한 저분자 저밀도 이온화 미네랄 복합체를 수용화하여 포함하는, 프로바이오틱스 복합균의 대량생산을 하기 위한 특수배지를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 특수배지는 중량%로, 미세조류미분말 0.1 ~ 2%를 더 함유할 수 있고, 상기 미세조류미분말은 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma), 두나리엘라 샐리나(Dunaliella salina), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 및 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis)를 원재료로 포함하는, 프로바이오틱스 복합균의 대량생산을 하기 위한 특수배지를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 미생물 각각에 대한 배양법을 토대로, 배양온도, 배지pH, 급기환경, 및 배지조성의 적정치를 산출함으로써, 초기배양액을 포함하는 제1배양액을 고르게 배양하는 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 동일한 배양환경에서 프로바이오틱스 복합균을 배양함으로써, 프로바이오틱스 복합균의 제조 공정이 비교적 단순해지는 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 고가의 표준 배양배지 성분을 대체재로 변경한 특수배지를 제공함으로써, 프로바이오틱스 복합균의 생산 원가를 낮출 수 있고, 프로바이오틱스 복합균을 대량으로 생산할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 프로바이오틱스 복합균을 닭의 사료에 첨가함으로써, 프로바이오틱스 복합균의 효용을 나타낼 수 있는 양계산물로써 닭을 사양관리할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 프로바이오틱스 복합균을 산란계의 사료에 첨가함으로써, 프로바이오틱스 복합균의 효용을 나타낼 수 있는 SPF계란으로써 산란계의 계란을 사양관리할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 프로바이오틱스 복합균을 미니돼지의 사료에 첨가함으로써, 프로바이오틱스 복합균의 효용을 나타낼 수 있는 SPF실험동물로써 미니돼지를 사양관리할 수 있고, 미니돼지의 심장, 허파, 간, 및 신장을 포함하는 주요 장기를 인간이 섭취할 수 있는 기능성 식품으로써 수득할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균의 제조방법을 개략적으로 도시한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 공통배지의 배양온도 실험을 개략적으로 도시한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 공통배지의 배양온도 실험 결과를 개략적으로 도시하는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 배양단계의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 이온화미네랄수용액준비단계의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 비금속성암반준비단계의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 비 금속성 암반을 예시적으로 도시한다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 암반소성단계를 실시하는 모습을 개략적으로 도시한다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 모려준비단계의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 결정저밀도화단계의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 결정저밀도화단계 및 급랭단계를 실시하는 모습을 개략적으로 도시한다.
도 12는 일반 미네랄 입자 및 본 발명의 일 실시예에 따른 결정저밀도화단계에 따라 조성된 미네랄 입자를 현미경으로 관찰한 모습을 개략적으로 도시한다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노파우더수득단계의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 전기폭발단계를 수행하기 위한 제조장치의 모식도를 개략적으로 도시한다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 수용성화단계의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세조류미분말준비단계의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 파피아 로도지마가 미세조류배양단계에서 배양되는 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 파피아 로도지마의 돌연변이주 선별 과정을 개략적으로 도시한다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 두나리엘라 샐리나가 미세조류배양단계에서 배양되는 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 두나리엘라 샐리나의 돌연변이주 선별 과정을 개략적으로 도시한다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 파피아 로도지마의 배양률을 개략적으로 도시하는 그래프이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 두나리엘라 샐리나의 배양률을 개략적으로 도시하는 그래프이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 클로렐라 불가리스의 배양률을 개략적으로 도시하는 그래프이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 스피루리나 플라텐시스의 배양률을 개략적으로 도시하는 그래프이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세조류포집단계의 수행 과정을 개략적으로 도시한다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에 따른 오일추출단계 및 분말가공단계를 수행한 모습을 개략적으로 도시한다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에 따른 특수배지의 조성 최적화 실험을 개략적으로 도시한다.
도 28은 본 발명의 일 실시예에 따른 특수배지의 조성 최적화 실험 결과를 개략적으로 도시하는 그래프이다.
도 29는 본 발명의 일 실시예에 따른 제2실험군에서 대량으로 배양된 결과를 개략적으로 도시한다.
도 30은 본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균의 효용을 확인하기 위한 육계 생산관리 실험 과정을 개략적으로 도시한다.
도 31은 본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균의 효용을 확인하기 위한 산란계 생산관리 실험 과정을 개략적으로 도시한다.
도 32는 본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균의 효용을 확인하기 위한 돼지 생산관리의 대상종을 개략적으로 도시한다.
도 33은 본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균의 효용을 확인하기 위한 돼지장기 생산관리 실험 과정을 개략적으로 도시한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 공통배지의 배양온도 실험을 개략적으로 도시한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 공통배지의 배양온도 실험 결과를 개략적으로 도시하는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 배양단계의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 이온화미네랄수용액준비단계의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 비금속성암반준비단계의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 비 금속성 암반을 예시적으로 도시한다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 암반소성단계를 실시하는 모습을 개략적으로 도시한다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 모려준비단계의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 결정저밀도화단계의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 결정저밀도화단계 및 급랭단계를 실시하는 모습을 개략적으로 도시한다.
도 12는 일반 미네랄 입자 및 본 발명의 일 실시예에 따른 결정저밀도화단계에 따라 조성된 미네랄 입자를 현미경으로 관찰한 모습을 개략적으로 도시한다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노파우더수득단계의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 전기폭발단계를 수행하기 위한 제조장치의 모식도를 개략적으로 도시한다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 수용성화단계의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세조류미분말준비단계의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 파피아 로도지마가 미세조류배양단계에서 배양되는 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 파피아 로도지마의 돌연변이주 선별 과정을 개략적으로 도시한다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 두나리엘라 샐리나가 미세조류배양단계에서 배양되는 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 두나리엘라 샐리나의 돌연변이주 선별 과정을 개략적으로 도시한다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 파피아 로도지마의 배양률을 개략적으로 도시하는 그래프이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 두나리엘라 샐리나의 배양률을 개략적으로 도시하는 그래프이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 클로렐라 불가리스의 배양률을 개략적으로 도시하는 그래프이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 스피루리나 플라텐시스의 배양률을 개략적으로 도시하는 그래프이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세조류포집단계의 수행 과정을 개략적으로 도시한다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에 따른 오일추출단계 및 분말가공단계를 수행한 모습을 개략적으로 도시한다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에 따른 특수배지의 조성 최적화 실험을 개략적으로 도시한다.
도 28은 본 발명의 일 실시예에 따른 특수배지의 조성 최적화 실험 결과를 개략적으로 도시하는 그래프이다.
도 29는 본 발명의 일 실시예에 따른 제2실험군에서 대량으로 배양된 결과를 개략적으로 도시한다.
도 30은 본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균의 효용을 확인하기 위한 육계 생산관리 실험 과정을 개략적으로 도시한다.
도 31은 본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균의 효용을 확인하기 위한 산란계 생산관리 실험 과정을 개략적으로 도시한다.
도 32는 본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균의 효용을 확인하기 위한 돼지 생산관리의 대상종을 개략적으로 도시한다.
도 33은 본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균의 효용을 확인하기 위한 돼지장기 생산관리 실험 과정을 개략적으로 도시한다.
이하에서는, 다양한 실시예들 및/또는 양상들이 이제 도면들을 참조하여 개시된다. 하기 설명에서는 설명을 목적으로, 하나이상의 양상들의 전반적 이해를 돕기 위해 다수의 구체적인 세부사항들이 개시된다. 그러나, 이러한 양상(들)은 이러한 구체적인 세부사항들 없이도 실행될 수 있다는 점 또한 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 인식될 수 있을 것이다. 이후의 기재 및 첨부된 도면들은 하나 이상의 양상들의 특정한 예시적인 양상들을 상세하게 기술한다. 하지만, 이러한 양상들은 예시적인 것이고 다양한 양상들의 원리들에서의 다양한 방법들 중 일부가 이용될 수 있으며, 기술되는 설명들은 그러한 양상들 및 그들의 균등물들을 모두 포함하고자 하는 의도이다.
더불어, 용어 "또는"은 배타적 "또는"이 아니라 내포적 "또는"을 의미하는 것으로 의도된다. 즉, 달리 특정되지 않거나 문맥상 명확하지 않은 경우에, "X는 A 또는 B를 이용한다"는 자연적인 내포적 치환 중 하나를 의미하는 것으로 의도된다. 즉, X가 A를 이용하거나; X가 B를 이용하거나; 또는 X가 A 및 B 모두를 이용하는 경우, "X는 A 또는 B를 이용한다"가 이들 경우들 어느 것으로도 적용될 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용된 "및/또는"이라는 용어는 열거된 관련 아이템들 중 하나 이상의 아이템의 가능한 모든 조합을 지칭하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
또한, "포함한다" 및/또는 "포함하는"이라는 용어는, 해당 특징 및/또는 구성요소가 존재함을 의미하지만, 하나이상의 다른 특징, 구성요소 및/또는 이들의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 본 명세서에서 명백하게 다른 내용을 지시하지 않는 “한”과, “상기”와 같은 단수 표현들은 복수 표현들을 포함한다는 것이 이해될 수 있을 것이다.
또한, 제1, 제2 등과 같이 서수를 포함하는 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되지는 않는다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 및/또는 이라는 용어는 복수의 관련된 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 관련된 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다.
또한, 본 발명의 실시예들에서, 별도로 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명의 실시예에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 명세서에서, “미네랄”은 광물, 광석, 무기질을 주성분으로 무기염류를 지칭하고, Ca, Mn, Fe, Cu, P, Zn, K, Na, Cl, Ma, Mo, Ge 등 및 이들을 주원소로 하여 다른 원소와 반응한 화합물을 지칭하여 해석되어야 할 것이다.
본 명세서에서, “프로바이오틱스”는 건강한 사람의 장에 살고 있는 균으로, 적절한 양을 섭취하였을 때 체내에서 건강에 좋은 효과를 주는 균으로 해석되어야 할 것이다.
저분자 저밀도 이온화 미네랄 복합체의 경우 수용화하여 이온화 미네랄 동·식물 및 인체의 면역력 강화, 항산화 등에 활용될 수 있고, 또한 함량비에 따라서는 세포의 성장촉진 등에 활용될 수 있다. 또한, 특정 동·식물성 미생물이 필요로 하는 환경의 수질조건을 해당 미네랄을 활용하여 특정 함량을 갖게 되면 종래에 비해 비약적으로 배양을 촉진시킬 수 있다는 장점이 있다.
프로바이오틱스 복합균의 제조
이하에서는, 상기 프로바이오틱스 복합균을 제조하는 방법에 대해서 상세하게 서술하기로 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균의 제조방법을 개략적으로 도시한다.
본 발명의 일 실시예에 따른, 프로바이오틱스 복합균의 대량생산방법은, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens), 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 및 클로스트리듐 브티리컴(Clostridium butyricum) 각각의 초기배양액을 포함하는 제1배양액을 준비하는 초기배양액준비단계(S1000); 및 상기 제1배양액을 단일의 특수배지에서 배양하는 배양단계(S2000);를 포함하고, 상기 특수배지는 중량%로, 단백질(Protein) 6.3 ~ 9.3%, 탄수화물(Carbohydrate) 1.8 ~ 4.2%, 및 미네랄(Mineral) 0.061 ~ 0.121%를 함유하고, 상기 배양단계(S2000)에서는 섭씨 32도 ~ 섭씨 34도의 배양온도에서 상기 제1배양액이 상기 특수배지에서 배양될 수 있다.
이하에서는, 상기 아스퍼질러스 오리재, 상기 아스퍼질러스 니거, 상기 바실러스 서브틸리스, 상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스, 상기 락토바실러스 플랜타럼, 상기 락토바실러스 카세이, 상기 비피도박테리움 롱검, 상기 비피도박테리움 비피덤, 및 상기 클로스트리듐 브티리컴을 “9종의 미생물”이라 부를 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른, 상기 배양단계(S2000)에서는 4% ~ 6%의 이산화탄소(CO2)가 급기되는 환경에서 상기 제1배양액이 상기 특수배지에서 배양될 수 있다.
도 1에 도시된 바와 같이, 상기 프로바이오틱스 복합균의 대량생산방법은 상기 초기배양준비단계(S1000); 및 상기 배양단계(S2000);를 포함할 수 있다.
상기 초기배양준비단계(S1000)에서는, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 아스퍼질러스 오리재, 상기 아스퍼질러스 니거, 상기 바실러스 서브틸리스, 상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스, 상기 락토바실러스 플랜타럼, 상기 락토바실러스 카세이, 상기 비피도박테리움 롱검, 상기 비피도박테리움 비피덤, 및 상기 클로스트리듐 브티리컴을 개별적으로 배양하여 상기 초기배양액을 수득하고, 상기 초기배양액을 기설정된 양만큼 추출하여 상기 제1배양액을 준비할 수 있다. 상기 초기배양액은 후술하는 표 1의 배지조성 및 배양조건에서 10일 간 배양된 결과물일 수 있다. 바람직하게는, 상기 초기배양액은 상기 아스퍼질러스 오리재, 상기 아스퍼질러스 니거, 상기 바실러스 서브틸리스, 상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스, 상기 락토바실러스 플랜타럼, 상기 락토바실러스 카세이, 상기 비피도박테리움 롱검, 상기 비피도박테리움 비피덤, 및 상기 클로스트리듐 브티리컴을 후술하는 표 1의 배지조성 및 배양조건에서 개별적으로 10일 간 배양한 결과물일 수 있고, 상기 제1배양액은 1 내지 100 밀리리터씩 추출된 상기 초기배양액을 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 제1배양액은 1 내지 30 밀리리터씩 추출된 상기 초기배양액을 포함할 수 있다.
한편, 상기 배양단계(S2000)에서는, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 제1배양액을 단일의 배지에서 배양하여 상기 프로바이오틱스 복합균을 제조할 수 있다. 상기 단일의 배지는, 상기 아스퍼질러스 오리재, 상기 아스퍼질러스 니거, 상기 바실러스 서브틸리스, 상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스, 상기 락토바실러스 플랜타럼, 상기 락토바실러스 카세이, 상기 비피도박테리움 롱검, 상기 비피도박테리움 비피덤, 및 상기 클로스트리듐 브티리컴 모두를 고르게 배양할 수 있는 배양환경을 제공할 수 있고, 상기 배양환경은 섭씨 25도 ~ 섭씨 38도의 배양온도와 3% ~ 7%의 이산화탄소(CO2)를 급기하는 급기환경을 포함할 수 있다. 또한, 상기 단일의 배지는, 구성하는 배지의 재료에 따라 공통배지와 특수배지로 구분될 수 있다. 상기 공통배지에 접종하여 배양하는 환경은 도 2 및 도 3에서 자세히 후술하기로 하고, 상기 특수배지에 접종하여 배양하는 환경은 도 27 및 도 28에서 자세히 후술하기로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 배양단계(S2000)는, 상기 제1배양액을 단일의 특수배지에서 배양하기 위해, 상기 특수배지를 제조하기 위한, 단백질성분준비단계(S2100), 탄수화물성분준비단계(S2200), 이온화미네랄수용액준비단계(S2300), 미세조류미분말준비단계(S2400), 특수배지제조단계(S2500), 및 제1배양액접종단계(S2600)를 포함할 수 있다. 이와 같은 상기 배양단계(S2000)의 세부단계는 도 4 내지 도 26에서 자세히 후술하기로 한다.
이하에서는 본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균을 이루는 상기 9종의 미생물에 대해 설명하도록 한다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 9종의 미생물은 상기 초기배양준비단계(S1000)에서 각각 배양될 수 있고, 각각의 초기배양액을 기설정된 양만큼 추출하여 상기 제1배양액을 구성할 수 있다.
상기 아스퍼질러스 오리재, 상기 아스퍼질러스 니거 및 상기 바실러스 서브틸리스는 미생물로써, 단백질 및 탄수화물 분해효소인 아밀라아제, 프로타아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 만난아제, 리파아제를 장내에서 동시에 분비시킬 수 있고, 복합 소화 효소 생산능 및 난소화성 탄수화물 분해능이 뛰어난 특징을 갖고 있다. 상기 아밀라아제는 녹말을 포도당으로 분해하는 효소이고, 녹말은 포도당의 중합체로서 아밀로오스와 아밀로펙틴으로 구성되어 있다. 상기 프로타아제는 단백질과 펩티드결합을 가수분해하는 효소이고, 단백질의 아미노산 배열 결정에 중요한 역할을 한다. 상기 셀룰라아제는 섬유소 분해효소이고, 한 류의 생물로부터 여러 형태로 생산될 수 있다. 대부분의 사상균이나 세균 등은 균체 밖으로 상기 셀룰라아제를 분비하여 균체 밖의 셀룰로오스를 분해할 수 있다. 상기 자일라나아제는 자일란 가수분해효소이고, 밀짚, 밀기울, 사탕수수, 옥수수, 볏짚 등의 세포벽을 구성하는 비전분성 다당류를 분해할 수 있고, 사료의 흡수율을 향상시킴으로써 가축의 건강한 발육을 촉진시킬 수 있다. 상기 만난아제는 글루코즈를 포도당 형태로 흡수시켜 에너지원으로써 활용되게 할 수 있고, 사료 원료의 세포벽 성분 중 하나인 만난을 분해하여 장관 내 면역 자극에 효과가 있는 MOS를 생성함으로써 가축의 건강한 발육을 촉진시킬 수 있다. 상기 리파아제는 동물의 췌장에서 나오는 췌액에 많이 분포되어 있고, 중성지방을 지방산과 글리세린으로 효과적으로 분해할 수 있다.
상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스는 미생물로써, 열과 산에 강하며, 항균활성 및 바이오제닉 아민의 생성을 저해하는 특징을 갖고 있다. 상기 바이오제닉 아민은 단백질을 발효하는 과정에서 발생할 수 있고, 설사와 복통을 유발하는 히스타민, 고혈압을 유발하는 티라민 등을 포함할 수 있다. 상기 히스타민과 상기 티라민은 80도 이상에서 1시간 이상 가열하거나 위장 내 다른 물질과 결합해 발암물질이 될 수 있기 때문에 주의가 필요하다.
상기 락토바실러스 플랜타럼, 및 상기 락토바실러스 카세이는 미생물로써, 부패를 방지하기 위해 부패균에 대한 항균물질을 생산하는 균주이고, 세포에 붙어있거나 외부로 방출될 수 있고, 성장사이클 전 후로 생성될 수 있고, 프로테아제 등의 효소에 저항력을 가지고, 안정적인 pH 및 온도 특성을 갖는 특징을 갖고 있다. 상기 락토바실러스 플랜타럼은 여러가지 방법으로 유해균을 억제한다. 뮤신이라는 점액의 분비를 자극하여 장벽을 보호하고 유해균의 성장을 방해한다. 또한 장 점막에 점착하여 유해박테리아 및 유해물질이 장 안쪽으로 침투하지 못하도록 막고, 장의 염증을 줄이며 면역력을 향상시킨다. 이러한 효과는 결론적으로 염증성 장 질환을 예방하는데 도움을 준다. 상기 락토바실러스 플랜타럼은 인간 및/또는 동물의 간 및 장을 통해 콜레스테롤 수치를 조절할 수 있는 담즙산 가수분해효소를 생성할 수 있고, 항진균성 물질을 생산함으로써 곡류, 커피 생두, 포도주 등을 오염시킬 수 있는 곰팡이 독소의 한 종류인 오크라톡신A의 양을 감소시킬 수 있다. 상기 락토바실러스 카제이는 운동성이 없고 산 및 열에 강하여 소화액으로 사멸되지 않고 소장내 균총을 정상화할 수 있고, 유당불내증을 줄여주어 정장 작용 및 소화작용을 증진시킬 수 있고, 아밀라아제를 생산할 수 있다. 이 때, 상기 유당불내증이란, 소장에서의 유당분해효소 결핍으로 인해 유당의 분해와 흡수가 충분히 이루어지지 않아 생기는 증상으로, 설사, 및 가스로 인한 장 팽만, 및 복통 등의 증상을 일으킬 수 있다.
상기 비피도박테리움 롱검, 및 상기 비피도박테리움 비피덤은 미생물로써, 모유아의 장내에서 우점종으로 증식함으로써 모유를 섭취하는 유아의 설사 등 질병이환율을 낮게 유지시킬 수 있고, 항돌연변이 효과, 면역기능 증강효과, 항암효과, 및 혈중 콜레스테롤 감소효과를 갖는 특징을 갖고 있다. 상기 비피도박테리움 롱검, 및 상기 비피도박테리움 비피덤은 담즙산 농도에 관한 높은 내성이 있어 장내 생존이 용이하고 선천적인 면역력을 형성하는 데에 중요한 역할을 할 수 있다. 또한, 장의 염증을 악화시킬 수 있는 호중구 엘라스타제, 및 장독성 원소인 대장균 수용체의 결합과 이동을 억제할 수 있다. 또한, 식이단백질에 대한 면역 글로불린의 분비 반응을 향상시켜 세균성 패혈증을 예방할 수 있다.
상기 클로스트리듐 브티리컴은 미생물로써, 바실러스 세레우스, 살모넬라 콜레라수이스, 살모넬라 엔테리카, 살모넬라 티피뮤리움, 및 스트렙토코쿠스 아갈락티에 등의 병원성 미생물에 대한 억제능을 갖는 특징을 갖는다. 상기 클로스트리듐 브티리컴은 항부패성 낙산균 또는 혐기성의 아포 형성균으로써, 장내에서 병원성균을 억제할 수 있고 유익균과의 공생작용으로 장내균총의 정상화를 촉진할 수 있다. 또한, 열 및 위산의 영향을 받지 않고 정착성 및 증식성이 뛰어나, 각종 병원성 세균의 증식을 억제하고 장내 유익균의 증식을 촉진하여 장내 유기산과 비타민 B군 및 소화효소를 생성할 수 있다.
이하에서는, 상기 제1배양액을 단일의 상기 공통배지에 접종하여 배양하는 환경에 대하여 상세하게 서술하기로 한다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 배양단계(S2000)에서는, 상기 제1배양액을 상기 단일의 배지에서 배양하여 상기 프로바이오틱스 복합균을 제조할 수 있고, 상기 단일의 배지는, 상기 아스퍼질러스 오리재, 상기 아스퍼질러스 니거, 상기 바실러스 서브틸리스, 상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스, 상기 락토바실러스 플랜타럼, 상기 락토바실러스 카세이, 상기 비피도박테리움 롱검, 상기 비피도박테리움 비피덤, 및 상기 클로스트리듐 브티리컴 모두를 고르게 배양할 수 있는 배양환경을 제공할 수 있다. 상기 배양환경은, 배지조성, 배양온도, 배지pH, 및 급기환경 등을 포함할 수 있다.
상기 배양환경에 있어서, 상기 9종의 미생물 각각은 배양에 최적화된 배양환경을 필요로 할 수 있고, 상기 9종의 미생물 각각을 하기 표 1의 배지조성 및 배양조건을 포함하는 배양환경에서 10일 간 배양하여 상기 9종의 미생물 각각의 상기 초기배양액을 수득할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 9종의 미생물 각각의 상기 초기배양액을 수득할 수 있는 상기 배양환경은 하기 표 1과 같다.
| [A-O] | 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) |
| 배지조성 | 맥아추출물 20.0 g, 글루코오스 20.0 g, 한천 20.0 g, 펩톤 1.0 g을 증류수(Deionized water) 1000 ml에 용해 후, 섭씨 121도 오토클레이브에서 가압 열탕하여 액상배지를 조성 |
| 배양조건 | 섭씨 26도 |
| [A-N] | 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) |
| 배지조성 | 맥아추출물 20.0 g, 글루코오스 20.0 g, 한천 20.0 g, 펩톤 1.0 g을 증류수(Deionized water) 1000 ml에 용해 후, 섭씨 121도 오토클레이브에서 가압 열탕하여 액상배지를 조성 |
| 배양조건 | 섭씨 24도, 전형적인 호기성(Typical aerobic) 폭기 |
| [B-S] | 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) |
| 배지조성 | 비프추출물 3.0 g, 펩톤 5.0 g, 한천 15.0 g을 혼합 후, 섭씨 121도 오토클레이브에서 가압 열탕. 최종 pH는 6.6 내지 7.0. 액상배지로 조성하려면 한천을 제거. |
| 배양조건 | 섭씨 30도, 호기성(Aerobic) 폭기 |
| [B-A] | 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) |
| 배지조성 | 껍질을 벗긴 감자 200g을 1 리터의 수돗물에 30 분 동안 끓인 후, 면으로 여과하여 5 mg 황산망간을 첨가. 최종 pH는 6.8. 수돗물로 1 리터의 부피가 되도록 증액 조성한 후, 한천 15g을 혼합 후, 섭씨 121도 오토클레이브에서 가압 열탕. |
| 배양조건 | 섭씨 37도, 호기성(Aerobic) 폭기 |
| [L-P-C] | 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) |
| 배지조성 | 프로테오스 펩톤 10.0 g, 비프추출물 10.0 g, 효모추출물 5.0 g, 덱스트로오스 20.0 g, 소르비탄 모노올레이트 1.0 g, 시트르산 암모늄 2.0 g, 초산 나트륨 5.0 g, 황산망간 x H2O 0.05 g, 디소듐포스페이트 2.0 g를 증류수(Deionized water) 1000 ml에 혼합 후, 섭씨 121도 오토클레이브에서 가압 열탕. 최종 pH 6.3 내지 6.7. |
| 배양조건 | 섭씨 37도, 5%CO2 급기 |
| [B-L-B] | 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) |
| 배지조성 | 트립토제 10.0 g, 비프추출물 10.0 g, 효모추출물 3.0 g, 덱스트로오스 5.0 g, NaCl 5.0 g, 가용성 녹말 1.0 g, L-시스테인 염산 HCl 0.5 g, 초산 나트륨 3.0 g, 레자주린 (0.025%) 4 ml를 증류수(Deionized water) 1000 ml에 혼합 후, 섭씨 121도 오토클레이브에서 가압 열탕. 최종 pH 6.8. |
| 배양조건 | 섭씨 37도, 5%CO2 급기 |
| [C-B] | 클로스트리듐 브티리컴(Clostridium butyricum) |
| 배지조성 | 트립토제 10.0 g, 비프추출물 10.0 g, 효모추출물 3.0 g, 덱스트로오스 5.0 g, NaCl 5.0 g, 가용성 녹말 1.0 g, L-시스테인 염산 HCl 0.5 g, 초산 나트륨 3.0 g, 레자주린 (0.025%) 4 ml를 증류수(Deionized water) 1000 ml에 혼합 후, 섭씨 121도 오토클레이브에서 가압 열탕. 최종 pH 6.8. |
| 배양조건 | 섭씨 37도, 5%CO2 급기 |
상기 표 1에 기재된 바와 같이, 상기 9종의 미생물 각각의 상기 초기배양액을 수득할 수 있는 최적화된 배양환경은 대부분 상이하다. 다만, 자연계 또는 장내에는 단일의 미생물종이 아닌 복수 종의 미생물종이 공생하는 것이 대부분이고, 복수의 미생물을 대량으로 배양해야 하는 경우 상기 표 1에 기재된 상기 배양환경을 복수의 미생물에게 제공하는 것이 매우 복잡하고 번거로울 수 있다.
이에 따라, 본 발명에서는, 복수의 미생물을 모두 고르게 배양할 수 있는 배양환경을 제공하고자 하였다. 바람직하게는, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 제1배양액을 상기 단일의 배지에서 배양하여 상기 프로바이오틱스 복합균을 제조하는 경우, 상기 프로바이오틱스 복합균을 구성하는 상기 아스퍼질러스 오리재, 상기 아스퍼질러스 니거, 상기 바실러스 서브틸리스, 상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스, 상기 락토바실러스 플랜타럼, 상기 락토바실러스 카세이, 상기 비피도박테리움 롱검, 상기 비피도박테리움 비피덤, 및 상기 클로스트리듐 브티리컴 모두를 고르게 배양할 수 있는 배지조성, 배양온도, 배지pH, 및 급기환경을 포함하는 상기 배양환경을 제공함으로써, 상기 프로바이오틱스 복합균의 제조 공정을 단순화할 수 있도록 하는 상기 공통배지를 도출하고자 하는 것이 그 목적이다. 즉, 상기 프로바이오틱스 복합균을 보다 단순하게 제조하기 위해, 상기 제1배양액을 상기 공통배지에 접종하여 동일한 상기 배양환경에서 배양하는 것이 그 목적이다.
동일한 배양환경을 제공하는 것에 있어서, 상기 9종의 미생물 각각을 배양하기 위한 최적의 조건의 배지조성, 배양온도, 배지pH, 및 급기환경이 상이하기 때문에 상기 9종의 미생물의 일부의 생육을 저해하거나 억제할 수 있다. 이에 따라, 상기 조건을 최적화하여 상기 9종의 미생물의 균체수가 고르게 배양될 수 있는 배양환경을 도출하기 위한 실험을 진행할 필요가 있다고 판단하였다.
상기 배지조성에 있어서, 상기 프로바이오틱스 복합균을 이루는 일종인 유산균은, 상기 유산균의 영양조건에 있어서, 특정 미생물종에게 필요한 영양성분 이외의 다른 영양성분이 과도하게 함유되었다 하더라도 상기 특정 미생물종의 생육에 문제가 되지 않을 수 있다. 즉, 상기 9종의 미생물의 상기 배양환경에 있어서, 상기 배지조성은 미생물의 배양에 필요한 영양성분 이외의 다른 영양성분이 포함되어 있더라도 그 생육에 영향을 주지 않을 수 있다. 이에 따라, 상기 배양환경에 있어서, 상기 배지조성의 설정은 간단할 수 있다.
또한, 상기 배지pH에 있어서, 상기 9종의 미생물은 대부분 약산성을 띄는 배양배지에서 배양될 수 있기 때문에, 상기 배지pH는 약산성 환경으로 설정할 수 있다.
또한, 상기 급기환경에 있어서, 상기 프로바이오틱스 복합균을 이루는 대부분의 균은 통성혐기성균이기 때문에, 5%의 이산화탄소를 함유한 트로피컬 에어폭기 환경으로 설정할 수 있다.
다만, 상기 배양온도에 있어서, 상기 표 1에 개시된 바와 같이 섭씨 26도 내지 섭씨 37도 범위에 속할 수 있다. 이에 따라, 상기 배양온도의 적정범위를 보다 축소하기 위하여 이를 중점으로 실험군을 설정하여, 상기 프로바이오틱스 복합균을 배양할 수 있는 동일한 배양환경을 도출하고자 하였다.
1. 공통조건
본 발명의 일 실시예에서, 상기 동일한 배양환경을 도출하기 위한 실험에 있어서, 표 1에 기재된 배양방법으로 상기 9종의 미생물 각각을 10일 간 액상배양하여 상기 초기배양액을 수득한 후, 상기 초기배양액 각각을 기설정된 양만큼 추출하여 하기 표 2의 조건으로 제조된 단일의 배지에 접종하였다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 기설정된 양은 1 내지 30 밀리리터일 수 있고, 더욱 바람직하게는, 상기 기설정된 양은 10 밀리리터일 수 있다.
| 분류 | 배지 (중량%) | pH | 기체의 폭기 | ||
| 단백질 | 탄수화물 | 미네랄 | |||
| 공통조건 | 8.3 | 3.2 | 0.091 | 6.7 | 5 % CO2 + 호기성 |
본 발명의 일 실시예에서, 상기 표 2의 조성과 배양환경을 갖는 상기 단일의 배지를 본 실험에서 사용하였으며, 이하에서는, 상기 단일의 배지를 “공통배지”라 한다. 즉, 상기 공통배지의 배지조성, 배지pH, 및 폭기환경은 표 2와 같으며, 상기 공통배지에서 배양하는 경우 상기 표 2의 배양환경에서 배양되는 것으로 판단하는 것이 바람직하다.
상기 표 2에 있어서, 상기 공통배지의 재료인 상기 단백질은, 본 발명의 일 실시예에서, 펩톤, 비프추출물, 및 효모추출물을 첨가제로써 포함할 수 있다. 상기 펩톤은 유도단백질로서, 수용성 단백질이고, 펩티다아제에 의해 분해되어 아미노산이 되어 미생물 배양기의 질소원으로써 사용될 수 있다. 또한, 크기가 다른 양성 펩티드의 혼합물로, 기존에는 단백질의 펩신에 의한 분해산물을 지칭하기도 했다. 상기 비프추출물은 세균배양용의 단백질 배지성분으로서, 소 또는 말고기의 삼출액 또는 농축액의 형태일 수 있고, 아미노산, 펩티드, 유기산류, 인산, 및 비타민류 등 풍부한 영양원이 함유되어 있다. 상기 효모추출물은 지방 및 단백질원으로서 사료에 사용될 수 있고, 비타민 B군 및 비타민 D를 함유한다.
한편, 상기 표 2에 있어서, 상기 공통배지의 재료인 상기 탄수화물은, 본 발명의 일 실시예에서, 맥아추출물, 글루코오스, 한천, 덱스트로오스, 및 소르비탄 모노올레이트를 첨가제로써 포함할 수 있다. 상기 맥아추출물은 탄수화물원으로서, 맥아를 맥주양조작업 중 사입작업의 방식으로 당화시킨 용액을 여과, 건조, 및 분말화하여 만든 물질이다. 홉을 포함하지 않고, 효모, 및 곰팡이 등의 배지조정용으로 사용될 수 있다. 상기 글루코오스는 탄수화물원으로서, 세포벽의 구성성분으로 자연계에 널리 존재하고, 천연으로 존재하는 D형인 D-글루코스를 포도당이라 한다. 상기 한천은 탄수화물원으로서, 액상배지를 고체화하기 위한 점성제로 사용될 수 있다. 상기 덱스트로오스는 탄수화물원으로서, 전분의 가수분해로 제조될 수 있다. 상기 소르비탄 모노올레이트는 지용성 계면활성제로 사용될 수 있고, 구성하는 성분들의 계면에 흡착하여 표면 장력을 감소시킬 수 있고, 비혼화성 성분들의 분산과 유화에 도움을 줄 수 있으며, 화장품의 다양한 성분들의 결합에 도움을 줄 수 있다.
한편, 상기 표 2에 있어서, 상기 공통배지의 재료인 상기 미네랄은, 본 발명의 일 실시예에서, 초산 나트륨, 황산 망간, 및 인산염을 첨가제로써 포함할 수 있다. 상기 초산 나트륨은 미네랄 성분으로서, 약한 산성의 아세트산과 강한 염기성의 나트륨으로 구성되어 약한 알칼리성을 띄며 pH 조절용으로 사용될 수 있다. 상기 황산 망간은 미네랄 성분으로서, 조건에 따라 다양한 수화염이 될 수 있어 배지의 pH 조절용으로 사용될 수 있다. 또한, 엷은 홍색의 과립 또는 분말로 냄새가 없는 강화제이다. 상기 인산염은 미네랄 성분으로서, pH 조절용으로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 배지에 있어서, 미네랄 재료로써 사용되는 초산 나트륨, 황산 망간, 및 인산염은 상기 배지의 최종 pH를 맞추거나 염도를 설정하기 위해 사용될 수 있다.
한편, 상기 표 2에 있어서, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 단백질, 상기 탄수화물, 및 상기 미네랄을 제외하는 상기 공통배지를 이루는 나머지 중량부는 물일 수 있고, 바람직하게는 Deionized water일 수 있다.
2. 실험조건
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 공통배지의 배양온도 실험을 개략적으로 도시한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 공통배지의 적정 배양온도를 도출하기 위한 실험에 있어서, 본 실험의 실험군은 상기 표 2의 조건을 갖는 상기 공통배지의 배양온도를 하기 표 3과 같이 설정하였다.
| 배양온도 (섭씨) | |||
| (가) | (나) | (다) | (라) |
| 26 | 29.5 | 33 | 37 |
본 발명의 일 실시예에 따른 본 실험에서는, 상기 9종의 미생물 각각의 상기 초기배양액을 포함하는 상기 제1배양액을 상기 공통배지에 접종하고, 상기 표 3과 같이 배양온도를 4가지로 설정하여 각각 15일 간 배양하여 그 결과를 분석하였다. 도 2(A)는 배양온도 (가)의 온도로 배양된 공통배지를 개략적으로 도시하고, 도 2(B)는 배양온도 (나)의 온도로 배양된 공통배지를 개략적으로 도시하고, 도 2(C)는 배양온도 (다)의 온도로 배양된 공통배지를 개략적으로 도시하고, 도 2(D)는 배양온도 (라)의 온도로 배양된 공통배지를 개략적을 도시한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 공통배지의 배양온도 실험 결과를 개략적으로 도시하는 그래프이다.
도 3(A)는 상기 제1배양액을 (가)의 온도에서 배양한 후, 검출된 균체수를 나타낸 그래프를 개략적으로 도시한다. 본 발명의 일 실시예에서, 표 2에 개시된 공통배지조성에서 상기 9종의 미생물을 (가)의 온도에서 배양한 결과, 전체 균체수는 3.83 x 104 CFU이고, 아스퍼질러스 오리재, 아스퍼질러스 니거, 및 바실러스 서브틸리스가 검출되었다. 즉, (가)의 온도에서는 상기 9종의 미생물 중 3종만을 검출할 수 있다.
한편, 도 3(B)는 상기 제1배양액을 (나)의 온도에서 배양한 후, 검출된 균체수를 나타낸 그래프를 개략적으로 도시한다. 본 발명의 일 실시예에서 표 2에 개시된 공통배지조성에서 상기 9종의 미생물을 (나)의 온도에서 배양한 결과, 전체 균체수는 3.99 x 103 CFU이고, 아스퍼질러스 오리재, 아스퍼질러스 니거, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 아밀로리퀴페시언스, 및 클로스트리듐 브티리컴이 검출되었다. 즉, (나)의 온도범위에서는 상기 9종의 미생물 중 5종만을 검출할 수 있다.
한편, 도 3(C)는 상기 제1배양액을 (다)의 온도에서 배양한 후, 검출된 균체수를 나타낸 그래프를 개략적으로 도시한다. 본 발명의 일 실시예에서 표 2에 개시된 공통배지조성에서 상기 9종의 미생물을 (다)의 온도에서 배양한 결과, 전체 균체수는 1.25 x 104 CFU이고, 아스퍼질러스 오리재, 아스퍼질러스 니거, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 아밀로리퀴페시언스, 락토바실러스 플랜타럼, 락토바실러스 카세이, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 비피덤, 및 클로스트리듐 브티리컴이 검출되었다. 즉, (다)의 온도에서는 상기 9종의 미생물 중 9종 모두를 검출할 수 있다.
한편, 도 3(D)는 상기 제1배양액을 (라)의 온도에서 배양한 후, 검출된 균체수를 나타낸 그래프를 개략적으로 도시한다. 본 발명의 일 실시예에서 표 2에 개시된 공통배지조성에서 상기 9종의 미생물을 (라)의 온도에서 배양한 결과, 전체 균체수는 4.29 x 104 CFU이고, 락토바실러스 플랜타럼, 락토바실러스 카세이, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 비피덤, 및 클로스트리듐 브리티컴이 검출되었다. 즉, (라)의 온도에서는 상기 9종의 미생물 중 6종만을 검출할 수 있다.
상기와 같은 실험 결과에 있어서, 동일한 배지에서 다양한 온도로 상기 9종의 미생물을 배양하는 경우, (라), (가), (다), 및 (나)의 순서로 많은 균체수를 기록한 것을 알 수 있다.
다만, 본 발명의 일 실시예에 따른 본 실험의 목적을 고려할 때, (다)의 배양온도에서 배양된 상기 공통배지가 상기 9종의 미생물 모두를 골고루 배양할 수 있었기 때문에, 상기 (다)의 배양온도가 가장 적절한 배양환경을 조성했다고 판단할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프로바이오틱스 복합균을 이루는 상기 9종의 미생물은 섭씨 33도의 배양온도에서 상기 표 2의 배양환경에서 모두 고르게 배양할 수 있다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프로바이오틱스 복합균을 배양하기 위한 최적의 배양환경은 상기 표 2의 배지조성, 배지pH, 및 급기환경을 포함하고, 섭씨 33도의 배양온도를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 프로바이오틱스 복합균을 이루는 상기 9종의 미생물을 모두 고르게 배양시킬 수 있는 단일의 배지는, 본 발명의 일 실시예에서, 중량%로 단백질 8.3%, 탄수화물 3.2%, 및 미네랄 0.091%을 포함할 수 있고, pH 6.7의 약산성 환경을 포함할 수 있고, 5%의 이산화탄소의 호기성 급기환경을 포함할 수 있고, 섭씨 33도의 배양온도를 포함할 수 있다.
이와 같이, 상기 9종의 미생물 각각에 대한 배양법을 토대로, 상기 배양온도, 상기 배지pH, 상기 급기환경, 및 상기 배지조성의 적정치를 산출함으로써, 상기 초기배양액을 포함하는 상기 제1배양액을 고르게 배양하는 효과를 발휘할 수 있다. 또한, 동일한 배양환경에서 상기 프로바이오틱스 복합균을 배양함으로써, 상기 프로바이오틱스 복합균의 제조 공정이 비교적 단순해지는 효과를 발휘할 수 있다.
이하에서는, 상기 배양단계(S2000)의 세부단계에 대하여 상세하게 서술하기로 한다.
상기 세부단계는, 상기 제1배양액을 배양하기 위하여 상기 특수배지를 제조하는 단계일 수 있다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 배양단계(S2000)의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른, 프로바이오틱스 복합균의 대량생산방법은, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens), 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 및 클로스트리듐 브티리컴(Clostridium butyricum) 각각의 초기배양액을 포함하는 제1배양액을 준비하는 초기배양액준비단계(S1000); 및 상기 제1배양액을 단일의 특수배지에서 배양하는 배양단계(S2000);를 포함하고, 상기 특수배지는 중량%로, 단백질(Protein) 6.3 ~ 9.3%, 탄수화물(Carbohydrate) 1.8 ~ 4.2%, 및 미네랄(Mineral) 0.061 ~ 0.121%를 함유하고, 상기 배양단계(S2000)에서는 섭씨 32도 ~ 섭씨 34도의 배양온도에서 상기 제1배양액이 상기 특수배지에서 배양될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균의 대량생산방법에 있어서, 상기 단백질은(Protein) 섭씨 115도 ~ 섭씨 125도에서 가압열탕하여 화기건조한 돼지부산물의 미분말을 포함하고, 상기 탄수화물(Carbohydrate)은 섭씨 115도 ~ 섭씨 125도에서 가압열탕하여 화기건조한 쌀겨의 미분말 및 밀겨의 미분말을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균의 대량생산방법에 있어서, 상기 미네랄(Mineral)은 이온화미네랄수용액 및 천일염을 포함하고, 상기 이온화미네랄수용액은, 맥반석, 규석, 및 장석 중 1 이상을 포함하는 비금속성광물로부터 미네랄 성분을 획득하고 모려로부터 탄산칼슘 성분을 획득하여, 상기 미네랄 성분 및 상기 탄산칼슘 성분을 포함하는 기능성성분을 가진 미네랄복합체의 결정을 저분자화, 저밀도화, 및 이온화 처리한 저분자 저밀도 이온화 미네랄 복합체를 수용화하여 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균의 대량생산방법에 있어서, 상기 특수배지는 중량%로, 미세조류미분말 0.1 ~ 2%를 더 함유할 수 있고, 상기 미세조류미분말은 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma), 두나리엘라 샐리나(Dunaliella salina), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 및 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis)를 원재료로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균의 대량생산을 하기 위한 특수배지로서, 상기 미네랄(Mineral)은 이온화미네랄수용액 및 천일염을 포함하고, 상기 이온화미네랄수용액은, 맥반석, 규석, 및 장석 중 1 이상을 포함하는 비금속성광물로부터 미네랄 성분을 획득하고 모려로부터 탄산칼슘 성분을 획득하여, 상기 미네랄 성분 및 상기 탄산칼슘 성분을 포함하는 기능성성분을 가진 미네랄복합체의 결정을 저분자화, 저밀도화, 및 이온화 처리한 저분자 저밀도 이온화 미네랄 복합체를 수용화하여 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균의 대량생산을 하기 위한 특수배지로서, 상기 특수배지는 중량%로, 미세조류미분말 0.1 ~ 2%를 더 함유할 수 있고, 상기 미세조류미분말은 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma), 두나리엘라 샐리나(Dunaliella salina), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 및 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis)를 원재료로 포함할 수 있다.
도 4에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 배양단계(S2000)는, 돼지부산물을 가압열탕하고 화기건조하여 미분말 형태의 단백질성분을 준비하는 단백질성분준비단계(S2100); 쌀겨 및 밀겨를 가압열탕하고 화기건조하여 미분말 형태의 탄수화물성분을 준비하는 탄수화물성분준비단계(S2200); 맥반석, 규석, 및 장석 중 1 이상을 포함하는 비금속성광물로부터 미네랄 성분을 획득하고 모려로부터 탄산칼슘 성분을 획득하여, 상기 미네랄 성분 및 상기 탄산칼슘 성분을 포함하는 기능성성분을 가진 미네랄복합체의 결정을 저분자화, 저밀도화, 및 이온화 처리한 저분자 저밀도 이온화 미네랄 복합체를 수용화하는 이온화미네랄수용액준비단계(S2300); 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma), 두나리엘라 샐리나(Dunaliella salina), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 및 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis)의 네 미세조류 균주를 배지에서 대량으로 배양하고 가공하여 미세조류미분말을 준비하는 미세조류미분말준비단계(S2400); 상기 단백질성분, 상기 탄수화물성분, 상기 이온화미네랄수용액 및 상기 천일염을 포함하는 상기 미네랄, 및 상기 미세조류미분말을 혼합하여 상기 특수배지를 제조하는 특수배지제조단계(S2500); 및 상기 특수배지에 상기 제1배양액을 접종하여 배양하는 제1배양액접종단계(S2600);를 포함할 수 있다.
전술한 상기 공통배지에 있어서, 그 재료로써 포함되는 펩톤, 비프추출물, 및 효모추출물을 포함하는 상기 단백질, 및 맥아추출물, 글루코오스, 한천, 덱스트로오스, 및 소르비탄 모노올레이트를 포함하는 상기 탄수화물은 고가의 재료이기 때문에, 상기 공통배지를 통해 상기 프로바이오틱스 복합균을 대량으로 배양하기에 적합하지 않은 문제점이 있다.
이에 따라, 본 발명에서는, 비교적 저가의 재료로 해당 성분을 대체하여 복수의 미생물을 모두 고르게 배양할 수 있는 상기 특수배지를 도출하고자 하였다. 바람직하게는, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 프로바이오틱스 복합균을 이루는 상기 9종의 미생물을 상기 특수배지에서 배양함으로써, 상기 프로바이오틱스 복합균을 대량으로 생산하는 것이 그 목적이다.
상기 단백질성분준비단계(S2100)에서는, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 돼지부산물을 가압열탕하고 화기건조하여 미분말 형태의 상기 단백질성분을 준비할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 돼지부산물은, 저렴함에도 불구하고 비타민 B₁, B₂, 철분 등의 기능성 성분을 다량으로 함유하고 있어 훌륭한 단백질원으로써 사용될 수 있으며, 돼지의 잡뼈, 간, 신장, 심장, 위, 소장, 대장, 머리고기, 족발, 사골, 막창, 자궁, 허파 등을 포함할 수 있다. 하기 표 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 돼지부산물 중 상기 간의 성분을 분석한 결과를 도시한다.
| 니아신 | 나트륨 | 단백질 | 당질 | 레티놀 | 베타카로틴 |
| 11.80mg | 75.00mg | 18.70g | 2.60g | 10,119.00㎍ | 0.00㎍ |
| 비타민 A | 비타민 B1 | 비타민 B2 | 비타민 B6 | 비타민 C | 비타민 E |
| 10,119.00㎍RE | 0.25mg | 2.59mg | 0.62mg | 13.00mg | 0.40mg |
| 식이섬유 | 아연 | 엽산 | 인 | 지질 | 철분 |
| 0.00g | 6.90mg | 259.00㎍ | 327.00mg | 3.90g | 18.20mg |
| 칼륨 | 칼슘 | 콜레스테롤 | 회분 | ||
| 299.00mg | 16.00mg | 304.00mg | 1.40g |
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 돼지부산물은 고온으로 열탕 소독하고, 이를 화기건조 후 가공하여 미분말의 형태로 준비될 수 있다. 바람직하게는, 상기 돼지부산물 내의 세균을 제거하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에서 섭씨 120도로 가압열탕 후 화기건조하여 미분말의 형태로 상기 특수배지에 첨가되기 위한 상기 단백질성분을 준비할 수 있다.
한편, 상기 탄수화물성분준비단계(S2200)는, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 쌀겨 및 상기 밀겨를 가압열탕하고 화기건조하여 미분말 형태의 탄수화물성분을 준비할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 쌀겨는, 단백질, 지방, 비타민 B군, 무기질, 및 비타민 E, 오리자놀, 사이토스테롤, 및 식이섬유 등을 함유하고 있어 훌륭한 탄수화물원으로 사용될 수 있으며, 현미를 도정해 정백미를 만들 때 생기는 과피, 종피, 및 호분층 등을 포함할 수 있다. 하기 표 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 쌀겨의 성분을 분석한 결과를 도시한다.
| 니아신 | 나트륨 | 단백질 | 당질 | 레티놀 | 베타카로틴 |
| 6.00mg | 11.60mg | 20.01g | 38.10g | 0.00㎍ | 0.00㎍ |
| 비타민 A | 비타민 B1 | 비타민 B2 | 비타민 B6 | 비타민 C | 비타민 E |
| 0.00㎍RE | 1.51mg | 0.88mg | 0.28mg | 0.00mg | 2.30mg |
| 식이섬유 | 아연 | 엽산 | 인 | 지질 | 철분 |
| 15.60g | 2.70mg | 30.23㎍ | 816.00mg | 3.84g | 4.80mg |
| 칼륨 | 칼슘 | 콜레스테롤 | 회분 | ||
| 900.00mg | 72.35mg | 0.00mg | 3.60g |
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 밀겨는, 밀기울로 불리기도 하고, 섬유질, 단백질, 지방, 무기질 등을 함유하고 있어 훌륭한 탄수화물원으로 사용될 수 있으며, 밀에서 가루를 빼고 남은 찌꺼기, 제분밀로부터 밀가루와 배아를 분리한 나머지의 것, 종자의 피 등을 포함할 수 있다. 하기 표 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 밀겨의 성분을 분석한 결과를 도시한다.
| 니아신 | 나트륨 | 단백질 | 당질 | 레티놀 | 베타카로틴 |
| 7.00mg | 12.00mg | 27.90g | 47.00g | 0.00㎍ | 0.00㎍ |
| 비타민 A | 비타민 B1 | 비타민 B2 | 비타민 B6 | 비타민 C | 비타민 E |
| 0.00㎍RE | 2.10mg | 0.60mg | 0.40mg | 0.00mg | 1.40mg |
| 식이섬유 | 아연 | 엽산 | 인 | 지질 | 철분 |
| 14.30g | 2.93mg | 49.00㎍ | 1,200.00mg | 9.70g | 6.60mg |
| 칼륨 | 칼슘 | 콜레스테롤 | 회분 | ||
| 1,100.00mg | 65.00mg | 0.00mg | 4.10g |
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 쌀겨 및 상기 밀겨는 고온으로 열탕 소독하고, 이를 화기건조 후 가공하여 미분말의 형태로 준비될 수 있다. 바람직하게는, 상기 쌀겨 및 상기 밀겨는, 본 발명의 일 실시예에서, 섭씨 120도로 가압열탕 후 화기건조하여 미분말의 형태로 상기 특수배지에 첨가되기 위한 상기 탄수화물성분을 준비할 수 있다.이와 같이, 상기 공통배지를 구성하는 고가의 상기 단백질 및 상기 탄수화물을 상기 돼지부산물, 상기 쌀겨, 및 상기 밀겨로 대체함에 따라, 상기 돼지부산물, 상기 쌀겨, 및 상기 밀겨를 첨가한 상기 특수배지로 상기 프로바이오틱스 복합균을 생산하는 경우의 원가를 낮출 수 있다. 바람직하게는, 고가의 표준 배양배지 성분을 대체재로 변경한 상기 특수배지를 제공함으로써, 상기 프로바이오틱스 복합균의 생산 원가를 낮출 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 이온화미네랄수용액준비단계(S2300)의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
상기 이온화미네랄수용액준비단계(S2300)는, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 비금속성광물로부터 상기 미네랄 성분을 획득하고 상기 모려로부터 상기 탄산칼슘 성분을 획득하여, 상기 미네랄 성분 및 상기 탄산칼슘 성분을 포함하는 기능성성분을 가진 상기 미네랄복합체의 상기 결정을 저분자화, 저밀도화, 및 이온화 처리한 상기 저분자 저밀도 이온화 미네랄 복합체를 수용화하여 상기 이온화미네랄수용액을 준비할 수 있다. 상기 이온화미네랄수용액은 본 발명자의 특허인 제10-2036125호의 특허기술을 통하여 수득한 저분자 저밀도 이온화 미네랄 복합체를 포함할 수 있고, 그 성분은 발명의 일 실시예에서 표 7과 같다.
| 시험항목 | 단위 | 결과 |
| 칼슘 | mg/L | 42.60 |
| 칼륨 | mg/L | 3.00 |
| 마그네슘 | mg/L | 15.05 |
| 나트륨 | mg/L | 9.03 |
| 규소 | mg/L | 75.01 |
| 이산화규소 | mg/L | 0.33 |
| 철 | mg/L | 0.05 |
| 게르마늄 | mg/L | 10 |
| 아연 | mg/L | 0.03 |
| 인 | mg/L | 0.31 |
| 바나듐 | mg/L | 불검출 |
| 게르마늄 | mg/L | 15.8 |
| 유황 | mg/L | 불검출 |
본 발명의 일 실시예에 따라 사용되는 상기 비금속성광물인 상기 맥반석, 상기 규석, 및 상기 장석에는, 칼슘, 칼륨, 마그네슘, 규소, 규산, 셀레늄, 아연이 함유되어 있다. 다만 100% 해당 성분으로만 이루어지지 않았을 수 있다.
즉, 도 5에 도시된 바와 같이, 상기 이온화미네랄수용액준비단계(S2300)는 상기 맥반석, 상기 규석, 및 상기 장석 중 1 이상을 포함하는 상기 비금속성광물로부터 미네랄 결정을 수득하는 비금속성암반준비단계(S2310); 상기 모려로부터 탄산칼슘 결정을 수득하는 모려준비단계(S2320); 상기 미네랄 결정 및 상기 탄산칼슘 결정을 저밀도화 하는 결정저밀도화단계(S2330); 상기 결정저밀도화단계(S2330)를 통해 수득된 결정의 나노파우더를 생성하는 나노파우더수득단계(S2340); 수득된 상기 나노파우더를 증류수에 용해시키는 수용성화단계(S2350); 및 상기 수용성화단계(S2350) 중 침전된 침전물을 회수하고, 회수된 상기 침전물을 상기 나노파우더수득단계(S2340) 수행 시 첨가하여 활용하는 재가공단계(S2360);를 포함할 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 비금속성암반준비단계(S2310)의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 6을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 비금속성암반준비단계(S2310)는, 맥반석, 규석, 및 장석 중 1 이상을 포함하는 비금속성광물을 기설정된 크기로 파쇄하는 암반파쇄단계(S2311); 고압 분사기를 통해 파쇄된 상기 비금속성광물의 불순물을 제거하는 암반세척단계(S2312); 세척된 상기 비금속성광물을 건조하는 암반건조단계(S2313); 및 건조된 상기 비금속성광물을 용융하는 암반소성단계(S2314); 를 포함할 수 있다. 상기 비금속성암반준비단계(S2310)는 비금속성광물로부터 미네랄 결정을 수득한다. 이 때 상기 비금속성광물은 맥반석, 규석, 장석 중 1 이상을 포함할 수 있다. 이 때, 본 발명의 일 실시예에서 상기 비금속성광물은 맥반석 35∼45%, 규석 30∼40%, 장석 20∼30%의 함량비를 가질 수 있다. 바람직하게는 맥반석 39∼41%, 규석 34∼36%, 장석 24∼26%의 함량비를 가질 수 있다.
상기 암반파쇄단계(S2311)에서는 상기 비금속성광물을 직경 10 내지 20mm의 크기로 파쇄할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 비금속성광물을 파쇄한 후 육안으로 드러나는 상태이상 광물을 제거할 수 있다.
한편, 상기 암반세척단계(S2312)에서는 1000bar 이상의 초고압 분사기를 활용하여 물로 불순물을 제거할 수 있다.
한편, 상기 암반건조단계(S2313)에서는 수분이 모두 마르도록 건조할 수 있다.
한편, 상기 암반소성단계(S2314)에서는 세척 후 건조된 상기 비금속성광물을 로에서 섭씨 1100도 내지 1300도 온도에서 3시간 이상 용융하여 소성할 수 있다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 비 금속성 암반을 예시적으로 도시한다.
도 7(A)는 맥반석을 예시적으로 도시하고, 도 7(B)는 규석을 예시적으로 도시하고, 도 7(C)는 장석을 예시적으로 도시한다.
본 발명의 일 실시예에 따라 사용되는 비금속성광물인 상기 맥반석, 상기 규석, 및 상기 장석에는, 칼슘, 칼륨, 마그네슘, 규소, 규산, 셀레늄, 아연이 함유되어 있다. 다만 100% 해당 성분으로만 이루어지지 않았을 수 있으며, 소성단계에서의 온도조절 및 클링커 추출을 통한 정제와 나노파우더 제조 후, 비철금속선별단계(S2342) 및 EMF탈철단계(S2343)를 통해 금속성 광물분말을 모두 제거하는 공정이 필요할 수 있다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 암반소성단계(S2314)를 실시하는 모습을 개략적으로 도시한다.
상기 암반소성단계(S2314)에서 상기 비금속성광물을 용융할 때, 전기로 또는 가스화로에서 용융하는 것이 바람직하다. 구형 용광로를 사용하여 용융하는 경우, 용융 과정에서 녹지 않는 철 성분 및 본 발명에 필요하지 않은 기타 금속류를 걸러내기 위해 도구를 사용하는 데에 어려움이 있을 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 도 8(A)에 도시된 것과 같이 상기 암반소성단계(S2314)에서 도구를 사용하여 용융물 내부의 녹지 않은 덩어리를 제거할 수 있다. 도 8(B)에는 이와 같은 과정을 통해 제거된 금속광물이 도시되어 있다. 이 때, 차가운 도구를 사용하는 경우 용융물의 온도가 내려가는 문제가 있으므로, 도구를 사전에 가열하여 용융물에 삽입하여 녹지 않은 덩어리를 제거할 수 있다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 모려준비단계(S2320)의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 9를 참조하면 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 모려준비단계(S2320)는, 모려를 선별하여 고압 분사기를 통해 세척하는 모려세척단계(S2321); 세척된 상기 모려의 잔여 불순물을 제거하는 불순물제거단계(S2322); 세척된 상기 모려를 건조하는 모려건조단계(S2323); 건조된 상기 모려를 소성하는 모려소성단계(S2324); 및 소성된 상기 모려를 기설정된 크기로 파쇄하는 모려파쇄단계(S2325); 를 포함할 수 있다.
상기 모려세척단계(S2321)에서는 1000bar 이상의 초고압 분사기를 활용하여 물로 불순물을 제거할 수 있다.
한편, 상기 불순물제거단계(S2322)에서는 상기 모려세척단계(S2321)에서 떨어지지 않은 잔여 불순물이 붙어 있을 시 이를 제거할 수 있다. 이 때 핸드그라인더 등의 도구를 사용하여 잔여 불순물을 제거할 수 있다.
한편, 상기 모려건조단계(S2323)에서는 세척된 모려의 수분이 모두 마르도록 건조한다.
한편, 상기 모려소성단계(S2324)에서는 건조된 모려를 전기로에서 섭씨 900도 이상의 온도를 가하여 소성한다.
한편, 상기 모려파쇄단계(S2325)에서는 소성되어 흰색의 클링커가 된 모려를 직경 10 내지 20mm의 크기로 파쇄할 수 있다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 결정저밀도화단계(S2330)의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 10을 참조하면 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 결정저밀도화단계(S2330)는, 상기 비금속성암반준비단계(S2310) 및 상기 모려준비단계(S2320)를 통해 준비된 상기 비금속성광물 및 상기 모려를 소성하는 재소성단계(S2331); 및 소성된 상기 비금속성광물 및 상기 모려를 급랭시켜 입자를 팽창시키는 급랭단계(S2332); 를 포함할 수 있다.
상기 재소성단계(S2331)는, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 비금속성광물 45∼55% 및 상기 모려 45∼55%의 함량비를 갖도록 상기 비금속성광물 및 상기 모려를 소성할 수 있다. 바람직하게는 상기 비금속성광물 49∼51% 및 상기 모려 49∼51%의 함량비를 가질 수 있다. 또한, 상기 재소성단계(S2331)에서는 섭씨 1500도 이상의 온도를 가하여 용융시킬 수 있다.
한편, 상기 급랭단계(S2332)에서는 용융된 수득물을 급랭시킨다. 이와 같은 급랭 과정을 통해 미네랄의 입자를 팽창시켜 밀도를 낮게 하여 저밀도 미네랄을 수득할 수 있다. 이와 같이 생성된 저밀도 미네랄은 서냉 되어 제조되는 종래의 미네랄에 비해 흡수가 용이한 특성을 갖게 된다. 본 발명의 일 실시예에서는 얼음을 이용하여 수냉 함으로써 용융된 수득물을 급랭시킬 수 있다. 도 11는 본 발명의 일 실시예에 따른 결정저밀도화단계(S2330) 및 급랭단계(S2332)를 실시하는 모습을 개략적으로 도시한다. 도 11(A)는 이와 같이 얼음을 이용한 수냉방법으로 급랭시키기 위해 용융된 수득물을 세라믹 모루에 펼치는 모습을 개략적으로 도시하고, 도 11(B)는 얼음을 이용하여 급랭시키는 모습을 개략적으로 도시한다.
도 12는 일반 미네랄 입자 및 본 발명의 일 실시예에 따른 결정저밀도화단계(S2330)에 따라 조성된 미네랄 입자를 현미경으로 관찰한 모습을 개략적으로 도시한다.
상기와 같은 급랭단계(S2332)를 통해 용융된 수득물을 급랭시키게 되면 소성된 미네랄이 빠르게 냉각되면서 입자의 밀도가 낮아지게 되는데, 이와 같은 입자의 변화는, 나노분말이 되어서도 특성의 차이를 보이게 된다. 도 12를 참조하면 이처럼 냉각된 입자의 변화를 확인할 수 있다. 도 12(A)는 일반적인 미네랄 입자의 현미경 사진이 도시하고, 도 12(B)는 본 발명의 일 실시예에 따라 생성된 저밀도 미네랄 입자의 현미경 사진을 도시한다. 두 현미경 사진을 비교하면 본 발명의 일 실시예에 따라 생성된 저밀도 미네랄 입자의 크기가 더 큰 것을 확인할 수 있다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노파우더수득단계(S2340)의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 13를 참조하면 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 나노파우더수득단계(S2340)는, 상기 결정저밀도화단계(S2330)를 통해 수득된 결정을 전기폭발법에 의해 나노파우더로 변환하는 전기폭발단계(S2341); 와전류선별기를 통해 나노파우더의 비철금속 불순물을 선별하는 비철금속선별단계(S2342); EMF탈철기를 통해 나노파우더의 철금속 이물을 제거하는 EMF탈철단계(S2343); 및 정전기 발생유도 건식 교반을 통해 상기 나노파우더에 정전기를 발생시키는 이온화교반단계(S2344); 를 포함할 수 있다.
상기 전기폭발단계(S2341)에서는 수득된 결정을 전기폭발법에 의해 나노파우더로 변환한다. 전기폭발법은, 약 10cm 길이의 가는 금속선에 매우 높은 전류(107 A/cm2)를 흘려 금속선을 급속 저항 가열시켜 폭발적으로 금속을 증기화 하여 나노분말을 합성하는 방법이다. 표준 규격화된 장비를 활용하여 균일한 나노분말을 제조한다. 더욱 상세하게는, Purse power를 이용하여 캐패시터에 충전된 고밀도 전류가 Metal wire를 통과할 때 Metal wire의 저항에 의하여 열이 발생되고, 이를 견디지 못한 Wire가 폭발하는 것이다. 인가된 고밀도 전류에 의하여 10-6 sec의 짧은 시간에 순간적으로 높은 온도(섭씨 104도 내지 106도)에 도달하게 되며 Wire 전체가 동시에 기화되기 때문에 최초 물질의 조성을 갖는 분말의 합성이 가능하다. 이때 미세입자나 금속증기가 발생하고 응축, 증발을 통하여 나노분말을 합성하게 된다. 전기폭발법의 장점은 wire에 인가되는 에너지를 제어함으로 분말의 크기를 조절할 수 있으며, 반응기 내부의 분위기를 조절하여 산화물, 질화물, 탄화물 등의 다양한 합금을 제조할 수 있다. 이와 같은 전기폭발법을 수행할 수 있는 제조장치가 도 14에 도시되어 있다. 도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 전기폭발단계(S2341)를 수행하기 위한 제조장치의 모식도를 개략적으로 도시한다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 전기폭발단계(S2341)를 통해 생성되는 상기 나노파우더는 100nm 이하의 크기의 분말일 수 있다.
한편, 상기 비철금속선별단계(S2342)에서는 와전류선별기를 활용하여 비철금속을 선별하여 불순물을 제거할 수 있다. 상기 와전류선별기는 강력한 영구자석이 설치된 마그네틱 로터를 고속으로 회전시켜 생성된 와전류(Eddy current)를 이용하여 탈철 및 알루미늄, 동, 구리 등의 비철금속 불순물을 선별하는 기계이다. 유리, 플라스틱 리사이클링, E-scrap 리사이클링 등 물질 속에서 유가자원의 회수 등에 쓰인다. 초 강력 영구자석을 이용하여 비철금속과 같은 일반 자력으로 선별하기 힘든 상자성체 금속 등을 선별해준다.
한편, 상기 EMF탈철단계(S2343)에서는 EMF탈철기 통해 나노파우더의 철금속 이물을 제거한다. 상기 EMF탈철기는 자성물질을 분류할 수 있는 장치로, 극소량의 철 금속 이물을 ppb 및/또는 ppm 단위까지 제거할 수 있어 철분관리가 용이하다.
한편, 상기 이온화교반단계(S2344)에서는 정전기 발생유도 건식 교반을 통해 상기 나노파우더에 정전기를 발생시킨다. 상기 정전기 발생유도 건식 교반을 통하여 물질이 이온성질을 가지게 하고 물에 녹는 성질을 가지게 할 수 있다. 건식 교반을 통한 정전기 발생 단계는, HOMOGENIZING DISPER 기기를 활용하여, 융합조성물을 1시간 동안 2,200rpm으로 건식 교반 함으로써 강제적인 정전기를 발생시켜 이온반응단계를 위한 미네랄 분말을 제조하게 된다. 많은 양을 건식교반 하는 데에는 큰 기기와 많은 비용이 소요된다. 하지만 이온분말은 적은 양을 수중에 용해시켜 많은 양의 미네랄 이온수를 얻어낼 수 있으므로, 소량을 건식 교반 할 수 있는 기기를 선정하여 사용하는 것이 바람직하다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 수용성화단계(S2350)의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 15를 참조하면 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 수용성화단계(S2350)는, 상기 나노파우더가 들어있는 용기에 포화증기를 공급하여 정전기를 발생시키는 정전기발생단계(S2351); 상기 용기의 압력을 유지하면서 용기 내부를 교반하여 이온반응을 유도하는 수용화습식교반단계(S2352); 및 상기 용기 내부의 포화증기를 감압탱크를 통해 감압하여 미네랄 이온수를 수득하는 미네랄이온수수득단계(S2353); 를 포함할 수 있다.
상기 정전기발생단계(S2351)에서는 용기에 상기 나노파우더를 충진하고, 상기 용기에 섭씨 300도 이하의 온도 및 1.4 내지 5MPa의 압력을 갖는 포화증기를 공급한다. 이 때 상기 포화증기에 의해 생성되는 물방울에 의해 정전기가 발생하게 된다.
한편, 상기 수용화습식교반단계(S2352)에서는 상기 용기 내부의 압력을 일정하게 유지하면서 용기 내부를 교반하여 이온반응을 유도한다.
한편, 상기 미네랄이온수수득단계(S2353)에서는 상기 용기 내부의 포화증기를 감압탱크에서 미네랄 이온수를 수득할 수 있다. 이때 상기 포화증기는 제1감압탱크 및 제2감압탱크를 통해 감압될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 수용성화단계(S2350)에서 사용되는 물과 상기 나노파우더의 중량 비는 물 50중량부에 대해 나노파우더 0.2 내지 0.4중량부의 비율로 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 미네랄이온수수득단계(S2353)를 통해 수득된 미네랄 이온수는 증류수에 희석될 수 있다. 바람직하게는 수득된 상기 미네랄이온수 1중량부에 대해 증류수 950 내지 1050중량부를 희석하여 사용할 수 있다. 상기 수용성화단계(S2350)를 통해 획득한 수용화 조성물의 경우 일부 구성 성분이 물에 포화되어 침전물이 발생할 수 있다.
상기 재가공단계(S2360)에서는, 이에 따라, 상기 수용성화단계(S2350) 중 침전된 침전물을 회수하고, 회수된 상기 침전물을 상기 나노파우더수득단계(S2340) 수행 시 첨가하여 활용할 수 있다. 구체적으로 침전물의 발현 시점은 고온 고압의 증기가 식어 실온인 20∼30℃가 되었을 때이므로, 섭씨 20 도 내지 30도의 온도에서 침전물을 제거한다. 침전물의 제거는 사이펀(또는 스포이트)을 여러 차례 활용하거나, 아래 침전물이 부유되지 않도록 조심하면서 맑은 윗물을 여러 차례 떠내는 방법이 적절하다.
상기와 같은 단계를 통해 제조된 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 이온화미네랄수용액은 저분자 저밀도 이온화 미네랄 복합체는 비금속성광물로부터 수득한 미네랄 결정; 및 모려로부터 수득한 탄산칼슘 결정;을 저밀도화 처리한 나노파우더를 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 나노파우더에 포화증기를 공급하면서 교반하여 이온반응을 유도하여 획득한 수용화 조성물을 포함할 수 있다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 미세조류미분말준비단계(S2400)의 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균의 대량생산방법에 있어서, 상기 특수배지는 중량%로, 미세조류미분말 0.1 ~ 2%를 더 함유할 수 있고, 상기 미세조류미분말은 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma), 두나리엘라 샐리나(Dunaliella salina), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 및 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis)를 원재료로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 미세조류미분말은, 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma), 두나리엘라 샐리나(Dunaliella salina), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 및 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis)의 네 미세조류 균주를 배지에서 대량으로 배양하는 미세조류배양단계(S2410); 배양된 미세조류를 배지로부터 분리하여 포집하는 미세조류포집단계(S2420); 미세조류를 압착하여 오일 성분을 추출하는 오일추출단계(S2430); 오일추출 후의 미세조류를 분쇄하는 분말가공단계(S2440); 및 상기 분말가공단계(S2440)를 거친 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma), 두나리엘라 샐리나(Dunaliella salina), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 및 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis)의 네 미세조류 분말을 혼합하는 분말혼합단계(S2450);를 통해 제조되고, 상기 미세조류배양단계(S2410), 상기 미세조류포집단계(S2420), 상기 오일추출단계(S2430) 및 상기 분말가공단계(S2440)는 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma), 두나리엘라 샐리나(Dunaliella salina), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 및 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis)의 네 미세조류에 대해 각각 수행될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균의 대량생산을 하기 위한 특수배지에 있어서, 상기 특수배지는 중량%로, 미세조류미분말 0.1 ~ 2%를 더 함유할 수 있고, 상기 미세조류미분말은 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma), 두나리엘라 샐리나(Dunaliella salina), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 및 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis)를 원재료로 포함할 수 있다.
상기 미세조류미분말준비단계(S2400)는, 본 발명의 일 실시예에서, 파피아 로도지마, 두나리엘라 샐리나, 클로렐라 불가리스, 및 스피루리나 플라텐시스의 네 미세조류 균주를 배지에서 대량으로 배양하고 가공하여 상기 미세조류미분말을 준비할 수 있다.
한편, 상기 미세조류미분말은, 도 16에 도시된 바와 같이, 상기 미세조류배양단계(S2410), 상기 미세조류포집단계(S2420), 상기 오일추출단계(S2430), 상기 분말가공단계(S2440), 및 상기 분말혼합단계(S2450)를 통해 준비될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 미세조류배양단계(S2410), 상기 미세조류포집단계(S2420), 상기 오일추출단계(S2430), 및 상기 분말가공단계(S2440)는, 파피아 로도지마, 두나리엘라 샐리나, 클로렐라 불가리스 및 스피루리나 플라텐시스의 네 미세조류에 대해 각각 수행할 수 있다. 즉, 상기 파피아 로도지마, 상기 두나리엘라 샐리나, 상기 클로렐라 불가리스 및 상기 스피루리나 플라텐시스 각각의 미세조류는 상기 미세조류배양단계(S2410), 상기 미세조류포집단계(S2420), 상기 오일추출단계(S2430) 및 상기 분말가공단계(S2440)를 각각 수행하고, 상기 분말가공단계(S2440)를 통해 생성된 미세조류 분말을 상기 분말혼합단계(S2450)를 통해 혼합하게 된다. 이 때, 본 발명의 일 실시예에서 상기 분말혼합단계(S2450)는, 파피아 로도지마, 두나리엘라 샐리나, 클로렐라 불가리스 및 스피루리나 플라텐시스 각각의 분말을 모두 동일한 비율로 혼합할 수 있다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 파피아 로도지마가 상기 미세조류배양단계(S2410)에서 배양되는 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 17에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 파피아 로도지마에 대한 미세조류배양단계(S2410.1)는, 상기 파피아 로도지마의 균체에 스트레스를 가하여 변이를 유발하는 뮤테이션촉진단계(S2410.11); 변이가 일어난 파피아 로도지마 균체에서 아스타잔틴 고 함유 균주를 선별하여 분리하는 돌연변이주선별단계(S2410.12); 파피아 로도지마의 배양을 위한 액체배지를 조성하는 배지조성단계(S2410.13); 및 선별된 파피아 로도지마 균주를 상기 액체배지에서 배양하는 대량배양단계(S2410.14);를 포함할 수 있다. 이와 같은 상기 미세조류배양단계(S2410.1)의 세부 단계들은 상기 파피아 로도지마가 생성하는 아스타잔틴의 함량을 높여 대량 생산하기 위한 과정이다. 본 발명에서는 상기 아스타잔틴을 대량 생산하기 위하여 상기 파피아 로도지마의 돌연변이를 유발하고, 상기 아스타잔틴을 대량으로 생산하는 균주를 선별하여 배양하게 된다.
상기 뮤테이션촉진단계(S2410.11)는, 본 발명의 일 실시예에서, 파피아 로도지마의 균체에 스트레스를 일으켜서 변이를 일으킨다. 이와 같은 스트레스에서 살아남는 우수 개체를 상기 돌연변이주선별단계(S2410.12)를 통해 선별함으로써 파피아 로도지마로부터 대량의 상기 아스타잔틴을 생산할 수 있게 된다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 뮤테이션촉진단계(S2410.11)는, 파피아로도지마 균체에 Methylnitronitrosoguanidine(MNNG)를 가하여 변이를 유발할 수 있다. MNNG 혹은 NTG라고도 하는 Methylnitronitrosoguanidine은 파피아 로도지마의 변이를 유발하게 된다. 액체배지에 MNNG를 혼합하기 위하여 아세톤에 MNNG를 용해시켜 혼합할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 MNNG를 용해시킨 아세톤과 증류수를 1:8 내지 1:10의 중량비로 희석하여 액체배지에 첨가할 용액을 생성할 수 있다. MNNG의 농도, 처리온도 및 처리시간에 따라 미세조류의 사멸률이 달라질 수 있으며, 사멸률에 따라 변이주를 얻는 확률이 달라지므로 이들 조건들을 적절히 조절하는데, 바람직하게는 사멸률이 95% 내지 98%가 되도록 조절한다. 본 발명의 일 실시예에서는 MNNG 용액을 0.1 mg/ml의 농도로 첨가하여 20분간 현탁배양 후, 멸균수 및 인산 완충 용액(ph7.0)으로 각각 1회 세척한 후 YM배지에 현탁하여 20℃에서 12 내지 16시간 배양한 뒤, 멸균수로 희석하여 도말한다.
한편, 본 발명의 다른 실시예에서 상기 뮤테이션촉진단계(S2410.11)는, 18,000 lx 내지 21,000 lx의 조도의 광 조건 하에서 배양하여 변이를 유발할 수 있다. 이와 같은 광 스트레스를 받은 파피아 로도지마는 변이가 일어날 수 있다. 더욱 바람직하게는 19,000 lx 내지 20,000 lx의 조도의 광 조건 하에서 배양하여 변이를 유발할 수 있다.
한편, 상기 돌연변이주선별단계(S2410.12)는, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 뮤테이션촉진단계(S2410.11)에서 변이가 유발된 파피아 로도지마를 배양 후 아스타잔틴 고 함유 균주를 선별한다. 아스타잔틴은 붉은 색을 띄는 색소이므로 본 발명의 일 실시예에서는 모균주보다 더 붉은 색을 띠는 균주를 선별함으로써 아스타잔틴의 함량이 높은, 즉 아스타잔틴의 생성이 원활한 파피아 로도지마를 선별할 수 있다.
한편, 상기 배지조성단계(S2410.13)에서는, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 파피아 로도지마를 배양하기 위한 액체배지를 조성한다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 액체배지는 L당 포도당 10g, 씨에스엘(CSL) 9.6g, 효모추출물 3g, 펩톤 5g, 인산제1칼륨 0.6g, 황산 마그네슘 0.5g, 황산구리 0.25g, 염화칼슘 0.15g, 황산아연0.03g, 티아민 0.02g, 바이오틴 0.0001g을 오차범위 10% 이내에서 포함할 수 있다. 한편, 본 발명의 일 실시예에서 상기 액체배지는 전술한 액체배지에 이온화칼슘 및 규산 중 1 이상을 더 포함할 수 있다. 이와 같이 이온화칼슘 및 규산을 더 포함하는 액체배지에서 파피아 로도지마가 더 높은 배양률을 나타내게 된다.
한편, 상기 대량배양단계(S2410.14)에서는, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 돌연변이주선별단계(S2410.12)에서 선별된 돌연변이주를 상기 배지조성단계(S2410.13)에서 조성된 액체배지에서 배양한다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 대량배양단계(S2410.14)에서는 교반속도 250 내지 350 rpm, 배양온도 섭씨 18도 내지 22도, pH 4.8 내지 5.2를 유지하는 조건에서 배양한다. 또한, 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 파피아 로도지마가 배양되는 발효조 내에 공기와 산소를 9:1 내지 11:1로 혼합한 기체를 4 내지 6 vvm의 속도로 공급할 수 있다. 한편, 본 발명의 일 실시예에서는 4,000 내지 8,000 lx, 더욱 바람직하게는 5,500 내지 6,500 lx의 광 조건하에서 배양한다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 파피아 로도지마의 돌연변이주 선별 과정을 개략적으로 도시한다.
도 18의 (A)는 상기 뮤테이션촉진단계(S2410.11)를 통해 스트레스에서 살아남은 변이체를 도시하고 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 돌연변이주선별단계(S2410.12)를 통해 변이가 유발된 파피아 로도지마 중 붉은 색을 띠는 균주를 선별하여 배양하게 된다.
한편, 도 18의 (B)는 상기 돌연변이주선별단계(S2410.12)를 통해 선별된 돌연변이주를 상기 대량배양단계(S2410.14)를 통해 대량 배양한 모습을 도시하고 있다. 붉은 색을 띠는 균주가 다량으로 배양되어 아스타잔틴이 대량으로 생성되었음을 확인할 수 있다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 두나리엘라 샐리나가 상기 미세조류배양단계(S2410)에서 배양되는 세부 단계들을 개략적으로 도시한다.
도 19를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른, 상기 두나리엘라 샐리나에 대한 미세조류배양단계(S2410.2)는, 두나리엘라 샐리나 균체에 스트레스를 가하여 변이를 유발하는 뮤테이션촉진단계(S2410.21); 변이가 일어난 두나리엘라 샐리나의 균체에서 베타카로틴 고 함유 균주를 선별하여 분리하는 돌연변이주선별단계(S2410.22); 두나리엘라 샐리나의 배양을 위한 액체배지를 조성하는 배지조성단계(S2410.23); 및 선별된 두나리엘라 샐리나 균주를 상기 액체배지에서 배양하는 대량배양단계(S2410.24);를 포함할 수 있다. 이와 같은 미세조류배양단계(S2410.2)의 세부 단계들은 상기 두나리엘라 샐리나가 생성하는 베타카로틴의 함량을 높여 대량 생산하기 위한 과정이다. 본 발명에서는 베타카로틴을 대량 생산하기 위하여 상기 두나리엘라 샐리나의 돌연변이를 유발하고, 베타카로틴을 대량으로 생산하는 균주를 선별하여 배양하게 된다.
상기 뮤테이션촉진단계(S2410.21)는, 본 발명의 일 실시예에서, 파피아 로도지마의 균체에 스트레스를 일으켜서 변이를 일으킨다. 이와 같은 스트레스에서 살아남는 우수 개체를 상기 돌연변이주선별단계(S2410.22)를 통해 선별함으로써 두나리엘라 샐리나로부터 대량의 베타카로틴을 생산할 수 있게 된다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 뮤테이션촉진단계(S2410.21)는, 18,000lx 내지 21,000 lx의 조도의 광 조건 하에서 배양하여 변이를 유발할 수 있다. 이와 같은 광 스트레스를 받은 두나리엘라 샐리나는 변이가 일어날 수 있다. 더욱 바람직하게는 19,000 lx 내지 20,000 lx의 조도의 광 조건 하에서 배양하여 변이를 유발할 수 있다.
한편, 상기 돌연변이주선별단계(S2410.22)는, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 뮤테이션촉진단계(S2410.21)에서 변이가 유발된 두나리엘라 샐리나를 배양 후 베타카로틴 고 함유 균주를 선별한다. 본 발명의 일 실시예에서 광 스트레스를 가하여 변이를 유발하는 경우, 광 스트레스에서 생존한 상기 두나리엘라 샐리나는 높은 베타카로틴 생산성을 나타낸다.
한편, 상기 배지조성단계(S2410.23)에서는, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 두나리엘라 샐리나를 배양하기 위한 액체배지를 조성한다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 액체배지는 1M 염화나트륨, 5mM 황산마그네슘, 0.3mM 염화칼슘, 5mM 질산칼륨, 0.2mM 인산제1칼륨, 50mM 탄산수소나트륨), 1.5μM 염화제1철, 6 μM EDTA 및 4.5 μM 염화코발트를 오차범위 10 % 이내에서 포함할 수 있다. 한편, 본 발명의 일 실시예에서 상기 액체배지는 전술한 액체배지에 이온화칼슘 및 규산 중 1 이상을 더 포함할 수 있다. 이와 같이 이온화칼슘 및 규산을 더 포함하는 액체배지에서 두날리엘라 샐리나가 더 높은 배양률을 나타내게 된다.
한편, 상기 대량배양단계(S2410.24)에서는, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 돌연변이주선별단계(S2410.22)에서 선별된 돌연변이주를 상기 배지조성단계(S2410.23)에서 조성된 액체배지에서 배양한다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 대량배양단계(S2410.24)에서는 교반속도 250 내지 350 rpm, 배양온도 섭씨 23도 내지 27도, pH 6.8 내지 7.2를 유지하는 조건에서 배양한다. 또한, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 파피아 로도지마가 배양되는 발효조 내에 공기와 산소를 9:1 내지 11:1로 혼합한 기체를 4 내지 6 vvm의 속도로 공급할 수 있다. 한편, 본 발명의 일 실시예에서는 4,000 내지 8,000 lx, 더욱 바람직하게는 5,500 내지 6,500 lx의 광 조건하에서 배양한다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 두나리엘라 샐리나의 돌연변이주 선별 과정을 개략적으로 도시한다.
도 20의 (A)는 상기 뮤테이션촉진단계(S2410.21)를 수행하기 전의 상기 두날리엘라 샐리나 균주의 모습을 도시하고 있고, 도 20의 (B)는 상기 뮤테이션촉진단계(S2410.21)를 통해 광 스트레스를 가한 후의 상기 두날리엘라 샐리나 균주의 모습을 도시하고 있다. 이와 같이 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뮤테이션촉진단계(S2410.21)를 통해 변이된 상기 두날리엘라 샐리나는 세포 내에 베타카로틴을 다량 축적하여 색이 변화되는 것을 확인할 수 있다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 파피아 로도지마의 배양률을 개략적으로 도시하는 그래프이고, 도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 두나리엘라 샐리나의 배양률을 개략적으로 도시하는 그래프이고, 도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 클로렐라 불가리스의 배양률을 개략적으로 도시하는 그래프이고, 도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 스피루리나 플라텐시스의 배양률을 개략적으로 도시하는 그래프이다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 미세조류배양단계(S2410)는, 이온화칼슘 및 규산 중 1 이상을 포함하는 배지에서 미세조류를 대량배양 할 수 있다. 도 17 및 도 19에서 전술한 바와 같이, 상기 파피아 로도지마, 상기 두날리엘라 샐리나, 상기 클로렐라 불가리스, 및 상기 스피루리나 플라텐시스를 배양하기 위한 배지에 이온화칼슘 및 규산 중 1 이상을 포함시킴으로써 더 높은 배양률을 나타내어 배양 효율을 높일 수 있다.
도 21 내지 도 24는 각각 상기 파피아 로도지마, 상기 두날리엘라 샐리나, 상기 클로렐라 불가리스, 및 상기 스피루리나 플라텐시스를 이온화칼슘 및 규산이 포함되지 않은 배지에서 배양한 대조군과 이온화칼슘 및 규산을 첨가한 배지에서 배양한 실험군의 시간에 따른 배양 밀도를 도시한다. 배양 밀도는 색상을 기준으로 도출하였고, 배양 밀도를 통해 배양률을 평가할 수 있다.
도 21 내지 도 24를 참조하면 모두 대조군에 비해 실험군에서 미세조류의 밀도가 빠르게 증가하는 것을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명의 일 실시예에 따라 이온화칼슘 및 규산 중 1 이상을 포함하는 배지에서 미세조류를 배양하는 경우 배양 효율을 높일 수 있는 효과를 나타낼 수 있다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 미세조류포집단계(S2420)의 수행 과정을 개략적으로 도시한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 미세조류포집단계(S2420)는, 미세조류가 배양되어 있는 배양수에 칼슘함량이 70 mg/L 이상의 이온화 칼슘 수용액을 투여하고 수면으로 부상하는 미세조류를 포집할 수 있다. 액체배지에서 미세조류를 포집 하기 위해서는 다양한 방법이 사용될 수 있다. 원심분리, 여과, 및 응집 기술 등이 액체배지에서 미세조류를 분리하여 물이 최대한 적게 함유된 고농도의 미세조류를 정제하기 위하여 사용된다. 다만, 상기 원심분리 기술은 미생물 수확기술로 많이 활용되고 있으나 대용량을 처리하기에는 시간이 많이 소요되며 에너지 비용이 높고, 기기가 비싼 단점이 있고, 여과기술의 경우 크기가 마이크로미터 단위로 매우 작은 미생물에 의해 쉽게 막혀 연속적인 운전이 매우 어려우며 대용량에 적용하기가 쉽지 않다. 본 발명에서는 미세조류가 배양되어 있는 배양수에, 이온화 칼슘을 단시간에 고농도로 용해시켜 물의 미네랄 비중을 높임으로써, 높아진 물의 비중에 의하여 수면으로 부상하게 되는 미세조류를 건져내는 방법으로 미세조류를 포집하게 된다. 이와 같은 미세조류 포집 방법은 미세조류 포집에의 효용이 높을 뿐만 아니라, 상대적으로 원심분리에 소요되는 비용과 시간을 절감하고, 미세조류를 건져내고 난 후, 칼슘의 함량이 높아진 칼슘이온수를 재 활용하는데 큰 비용이 소요되지 않는 장점을 갖는다.
도 25의 (A), (B), (C) 및 (D)는 각각 파피아 로도지마, 두날리엘라 샐리나, 클로렐라 불가리스, 및 스피루리나 플라텐시스가 액체배지에서 배양된 모습을 도시한다. 도시된 바와 같이 액체배지에서 네 종류의 미세조류는 균일하게 퍼져있게 된다. 도 25의 (E), (F), (G) 및 (H)는 각각 상기 파피아 로도지마, 상기 두날리엘라 샐리나, 상기 클로렐라 불가리스 및 상기 스피루리나 플라텐시스의 액체배지에 본 발명의 일 실시예에 따라 이온화 칼슘을 용해시켜 미세조류를 수면으로 부상시킨 모습을 도시한다. 도 25의 실시예에서는 1L 당 100 ml의 고농도(80 mg/L) 이온화 칼슘 수용액을 투여하여 미세조류를 부상시켰다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 오일추출단계(S2430) 및 상기 분말가공단계(S2440)를 수행한 모습을 개략적으로 도시한다.
상기 오일추출단계(S2430)는, 본 발명의 일 실시예에서, 물리적 압착에 의해 미세조류로부터 오일을 추출할 수 있다. 미세조류로부터 오일을 추출하기 위한 방법으로는 압착법, 효소처리법, 용매추출법, 마이크로파 이용법, 열수추출법 등이 사용될 수 있다. 이 중 압착법은 화학적인 물질이 포함되지 않는 물리적인 방법이므로 가장 순수한 오일을 수득할 수 있는 장점이 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 수평 볼 밀 시스템을 통해 압착이 수행되어 미세조류의 세포벽을 파괴하여 오일을 추출할 수 있다. 이와 같이 추출된 오일이 도 26의 (A) 및 (B)에 도시되어 있다.
한편, 상기 분말가공단계(S2440)는, 본 발명의 일 실시예에서, 오일을 추출하고 남은 미세조류를 분말로 가공하게 된다. 이 때 미세조류의 세포는 5 내지 15 마이크로미터 정도의 크기를 가지게 된다. 본 발명의 일 실시예에서는 미세조류 세포를 3 마이크로미터 이하의 나노분말로 가공하여, 식이 하는 경우 인체나 동물의 신체에 기능 성분의 침투이행이 용이하도록 할 수 있다.
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 분말혼합단계(S2450)에서는, 상기 분말가공단계(S2440)를 통해 생성된 미세조류 분말을 혼합하게 된다. 이 때, 본 발명의 일 실시예에서 상기 분말혼합단계(S2450)는, 파피아 로도지마, 두나리엘라 샐리나, 클로렐라 불가리스 및 스피루리나 플라텐시스 각각의 분말을 모두 동일한 비율로 혼합할 수 있다.
한편, 상기 특수배지제조단계(S2500)는, 상기 제1배양액을 단일의 배지에서 배양할 수 있도록 특수배지를 제조할 수 있다. 상기 프로바이오틱스 복합균을 대량으로 배양하기 위한 상기 특수배지를 제조하기 위해, 본 발명에서는 관련 실험을 진행하였으며, 상기 실험은 도 27에서 자세하게 후술하기로 한다.
한편, 상기 제1배양액접종단계(S2600)는, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 특수배지에 상기 제1배양액을 접종할 수 있다. 바람직하게는, 상기 배양단계(S2000)의 상기 제1배양액접종단계(S2600)에 있어서, 상기 특수배지제조단계(S2500)를 통해 제조된 상기 특수배지에 상기 초기배양준비단계(S1000)를 통해 수득한 상기 제1배양액을 접종한 후 배양함으로써, 상기 프로바이오틱스 복합균을 대량으로 생산할 수 있다.
이하에서는, 상기 제1배양액을 단일의 배지에 접종하여 대량으로 배양할 수 있는 상기 특수배지에 대하여 상세하게 서술하기로 한다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에 따른 특수배지의 조성 최적화 실험을 개략적으로 도시한다.
상기 특수배지는, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 배양단계(S2000)의 상기 단백질성분준비단계(S2100), 상기 탄수화물성분준비단계(S2200), 이온화미네랄수용액준비단계(S2300), 상기 미세조류미분말준비단계(S2400), 및 상기 특수배지제조단계(S2500)를 통해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 상기 특수배지제조단계(S2500)에서, 상기 단백질성분, 상기 탄수화물성분, 상기 이온화미네랄수용액 및 상기 천일염을 포함하는 미네랄성분, 및 상기 미세조류미분말을 혼합하여 상기 특수배지를 제조할 수 있고, 이에 따라 상기 특수배지는 저가의 재료로 제조될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에서는, 복수의 미생물을 모두 고르게 배양할 수 있는 배양환경을 제공하고, 배양배지 내의 고가 재료를 저가의 재료로 대체함으로써 상기 프로바이오틱스 복합균을 대량으로 생산할 수 있는 특수배지를 도출하는 것을 그 목적으로 한다. 이에 따라, 상기 배양배지 내 고가의 재료가 저가의 재료로 대체된 상기 특수배지에 대한 조성 실험을 도 27에 도시된 바와 같이 진행하였다. 본 발명의 일 실시예에 따른 본 실험의 실험군 배지는 상기 특수배지로써, 상기 배양단계(S2000)를 통해 제조될 수 있다.
도 27(A)는 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 공통배지에서 상기 프로바이오틱스 복합균을 배양하는 대조군을 개략적으로 도시한다. 상기 대조군은 전술한 도 3(C)의 결과를 얻었던 상기 공통배지의 배양환경 조건과 동일하며, 바람직하게는, 상기 공통배지는, 본 발명의 일 실시예에서, 중량%로 단백질 8.3%, 탄수화물 3.2%, 미네랄 0.091%, 및 물 88.409%를 포함하고, pH 6.7의 약산성 환경, 5%의 이산화탄소가 폭기된 호기성 급기환경, 및 섭씨 33도의 배양온도를 유지하여 상기 프로바이오틱스 복합균을 배양하였다. 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 단백질의 재료는 펩톤, 비프추출물, 및 효모추출물을 포함하고, 상기 탄수화물의 재료는 맥아추출물, 글루코오스, 한천, 덱스트로오스, 및 소르비탄 모노올레이트를 포함하고, 상기 미네랄의 재료는 초산 나트륨, 황산 망간, 및 인산염을 포함하고, 상기 물은 Deionized water일 수 있다.
한편, 도 27(B)는 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 프로바이오틱스 복합균을 배양하는 제1실험군을 개략적으로 도시한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 제1실험군은, 상기 단백질성분준비단계(S2100), 상기 탄수화물성분준비단계(S2200), 상기 이온화미네랄수용액준비단계(S2300), 및 미세조류미분말준비단계(S2400)를 통해 각각 준비된 상기 단백질성분, 상기 탄수화물성분, 상기 미네랄, 상기 미세조류미분말을 물에 혼합하여 액상배지의 형태로 제조할 수 있고, pH 6.7의 약산성 환경, 5%의 이산화탄소가 폭기된 호기성 급기환경, 및 섭씨 33도의 배양온도를 유지하여 상기 프로바이오틱스 복합균을 배양하였다. 바람직하게는, 상기 단백질성분의 재료는 상기 단백질성분준비단계(S2100)를 통해 준비된 가압열탕 후 화기건조한 돼지부산물을 포함하고, 상기 탄수화물성분의 재료는 상기 탄수화물성분준비단계(S2200)를 통해 준비된 가압열탕 후 화기건조한 쌀겨 및 밀겨를 포함하고, 상기 미네랄의 재료는 상기 이온화미네랄수용액준비단계(S2300)를 통해 준비된 상기 이온화미네랄수용액, 및 상기 천일염을 포함하고, 상기 미세조류미분말의 재료는 상기 미세조류미분말준비단계(S2400)를 통해 준비된 미세조류미분말을 포함하고, 상기 물은 Deionized water일 수 있다. 표 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 제1실험군의 성분을 분석한 결과이다.
| 시험항목 | 단위 | 결과 | 시험항목 | 단위 | 결과 |
| 칼슘 | mg/L | 22.31 | 이산화규소 | mg/L | 3.80 |
| 칼륨 | mg/L | 30.22 | 철 | mg/L | 0.02 |
| 마그네슘 | mg/L | 5.22 | 게르마늄 | mg/L | 0.33 |
| 나트륨 | mg/L | 3.15 | 아연 | mg/L | 0.61 |
| 규소 | mg/L | 11.05 | 인 | mg/L | 0.17 |
| 단백질 | g/L | 79.21 | 유황 | mg/L | - |
| 지방산 | mg/L | 18.35 | 탄수화물 | g/L | 25.00 |
상기 표 8은, 상기 제1실험군을 구성하는 재료의 기능성 성분이 반영된 분석 결과일 수 있다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따라 사용되는 상기 비금속성광물인 상기 맥반석, 상기 규석, 및 상기 장석에는, 칼슘, 칼륨, 마그네슘, 규소, 규산, 셀레늄, 아연이 함유되어 있고, 100% 해당 성분으로만 이루어지지 않았을 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따라 사용되는 상기 미세조류미분말인 상기 파피아 로도지마, 두나리엘라 샐리나, 클로렐라 불가리스, 및 스피루리나 플라텐시스에는, DHA, 및 EPA를 포함하는 지방산을 기능성 성분으로써 포함하고, 100% 해당 성분으로만 이루어지지 않았을 수 있다.한편, 도 27(C)는 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 프로바이오틱스 복합균을 배양하는 제2실험군을 개략적으로 도시한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 제2실험군은, 상기 단백질성분준비단계(S2100), 상기 탄수화물성분준비단계(S2200), 상기 이온화미네랄수용액준비단계(S2300), 및 미세조류미분말준비단계(S2400)를 통해 각각 준비된 상기 단백질성분, 상기 탄수화물성분, 상기 미네랄, 상기 미세조류미분말을 물에 혼합하여 액상배지의 형태로 제조할 수 있고, 이 때, 상기 미네랄은 상기 제1실험군 대비 1.5배 많이 함유될 수 있고, pH 6.7의 약산성 환경, 5%의 이산화탄소가 폭기된 호기성 급기환경, 및 섭씨 33도의 배양온도를 유지하여 상기 프로바이오틱스 복합균을 배양하였다. 바람직하게는, 상기 단백질성분의 재료는 상기 단백질성분준비단계(S2100)를 통해 준비된 가압열탕 후 화기건조한 돼지부산물을 포함하고, 상기 탄수화물성분의 재료는 상기 탄수화물성분준비단계(S2200)를 통해 준비된 가압열탕 후 화기건조한 쌀겨 및 밀겨를 포함하고, 상기 미네랄의 재료는 상기 이온화미네랄수용액준비단계(S2300)를 통해 준비된 상기 이온화미네랄수용액, 및 상기 천일염을 포함하고, 상기 미세조류미분말의 재료는 상기 미세조류미분말준비단계(S2400)를 통해 준비된 미세조류미분말을 포함하고, 상기 물은 Deionized water일 수 있다. 표 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 제2실험군의 성분을 분석한 결과이다.
| 시험항목 | 단위 | 결과 | 시험항목 | 단위 | 결과 |
| 칼슘 | mg/L | 33.46 | 이산화규소 | mg/L | 5.7 |
| 칼륨 | mg/L | 45.33 | 철 | mg/L | 0.03 |
| 마그네슘 | mg/L | 7.83 | 게르마늄 | mg/L | 0.49 |
| 나트륨 | mg/L | 4.72 | 아연 | mg/L | 0.91 |
| 규소 | mg/L | 16.57 | 인 | mg/L | 0.25 |
| 단백질 | g/L | 79.21 | 유황 | mg/L | - |
| 지방산 | mg/L | 18.35 | 탄수화물 | g/L | 25.00 |
상기 표 9는, 상기 제2실험군을 구성하는 재료의 기능성 성분이 반영된 분석 결과일 수 있다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따라 사용되는 상기 비금속성광물인 상기 맥반석, 상기 규석, 및 상기 장석에는, 칼슘, 칼륨, 마그네슘, 규소, 규산, 셀레늄, 아연이 함유되어 있고, 100% 해당 성분으로만 이루어지지 않았을 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따라 사용되는 상기 미세조류미분말인 상기 파피아 로도지마, 두나리엘라 샐리나, 클로렐라 불가리스, 및 스피루리나 플라텐시스에는, DHA, 및 EPA를 포함하는 지방산을 기능성 성분으로써 포함하고, 100% 해당 성분으로만 이루어지지 않았을 수 있다.
즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 제1실험군 및 상기 제2실험군은, 상기 공통배지에 있어서 배지를 이루는 구성성분이 상이하며, 바람직하게는, 상기 단백질성분, 상기 탄수화물성분, 및 상기 미네랄의 재료가 상이하고 상기 미세조류미분말이 추가되었다.
본 발명의 일 실시예에 따른 본 실험에서, 상기와 같이 배지의 조성을 3가지로 설정하고 배양하여 그 결과를 분석하였다.
도 28은 본 발명의 일 실시예에 따른 특수배지의 조성 최적화 실험 결과를 개략적으로 도시하는 그래프이다.
도 28(A)는 상기 프로바이오틱스 복합균을 상기 공통배지에서 배양한 후, 검출된 균체수를 나타낸 그래프를 개략적으로 도시한다. 이는 도 3(C)에 도시된 그래프 결과와 동일하며, 전체 균체수는 1.25 x 104 CFU이고, 아스퍼질러스 오리재, 아스퍼질러스 니거, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 아밀로리퀴페시언스, 락토바실러스 플랜타럼, 락토바실러스 카세이, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 비피덤, 및 클로스트리듐 브티리컴을 포함하는 상기 9종의 미생물 모두를 검출하였다.
도 28(B)는 상기 프로바이오틱스 복합균을 상기 제1실험군에서 배양한 후, 검출된 균체수를 나타낸 그래프를 개략적으로 도시한다. 그 결과, 전체 균체수는 4.84 x 104 CFU이고, 아스퍼질러스 오리재, 아스퍼질러스 니거, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 아밀로리퀴페시언스, 락토바실러스 플랜타럼, 락토바실러스 카세이, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 비피덤, 및 클로스트리듐 브티리컴을 포함하는 상기 9종의 미생물 모두를 검출하였다.
도 28(C)는 상기 프로바이오틱스 복합균을 상기 제2실험군에서 배양한 후, 검출된 균체수를 나타낸 그래프를 개략적으로 도시한다. 그 결과, 전체 균체수는 8.57 x 104 CFU이고, 아스퍼질러스 오리재, 아스퍼질러스 니거, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 아밀로리퀴페시언스, 락토바실러스 플랜타럼, 락토바실러스 카세이, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 비피덤, 및 클로스트리듐 브티리컴을 포함하는 상기 9종의 미생물 모두를 검출하였다.
상기와 같은 본 발명의 일 실시예에 따른 실험 결과에 있어서, 상기 대조군의 배지보다 저렴한 배지재료를 채택하여 배양하였음에도 불구하고 상기 제1실험군 및 상기 제2실험군 모두에서 더 많은 균체수를 기록하였다. 특히, 상기 제2실험군의 경우, 상기 공통배지 대비 2배에 가까운 균체수를 기록하였다. 즉, 배양온도, 배지pH, 및 급기환경 등을 포함하는 동일한 배양환경에서 다양한 배지조성으로 상기 프로바이오틱스 복합균을 배양하는 경우, (다), (나), 및 (가)의 순서로 많은 균체수를 기록한 것을 알 수 있다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 프로바이오틱스 복합균은, 상기 제2실험군으로 구성된 특수배지에서 대량으로 배양될 수 있다. 이하에서는, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 제2실험군을 특수배지로써 설정하였다.
도 29은 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 제2실험군에서 대량으로 배양된 결과를 개략적으로 도시한다. 이와 같이, 고가의 표준 배양배지 성분을 대체재로 변경한 상기 특수배지를 제공함으로써, 상기 프로바이오틱스 복합균의 생산 원가를 낮출 수 있고, 프로바이오틱스 복합균을 대량으로 생산할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.
즉, 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 프로바이오틱스 복합균은, 상기 초기배양준비단계(S1000), 및 상기 배양단계(S2000)를 통해 대량으로 생산될 수 있다.
바람직하게는, 상기 초기배양준비단계(S1000)에서 상기 아스퍼질러스 오리재, 상기 아스퍼질러스 니거, 상기 바실러스 서브틸리스, 상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스, 상기 락토바실러스 플랜타럼, 상기 락토바실러스 카세이, 상기 비피도박테리움 롱검, 상기 비피도박테리움 비피덤, 및 상기 클로스트리듐 브티리컴 각각을 배양한 상기 초기배양액을 1 내지 100 밀리리터씩 추출하여 포함하는 상기 제1배양액을 준비하고, 상기 배양단계(S2000)에서 상기 제1배양액을 단일의 상기 특수배지에 접종하여 섭씨 33도의 배양온도와 5%의 이산화탄소가 폭기된 호기성 환경을 포함하는 배양환경에서 배양함으로써, 상기 프로바이오틱스 복합균을 대량으로 생산할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 상기 프로바이오틱스 복합균의 상기와 같은 기능성 성분의 효과를 입증하기 위하여, 하기와 같은 복수의 실험을 실시하였다. 후술하는 본 실험은, 상기 제2실험군의 특수배지에 상기 제1배양액을 접종하여, 본 발명의 일 실시예에서, 섭씨 33도의 배양온도와 5%의 이산화탄소가 폭기된 호기성 환경을 포함하는 배양환경에서 60일 간 대량으로 배양한 결과물을 이용하였다. 즉, 이하에서는 “특수배지에서 60일 간 대량으로 배양된 상기 프로바이오틱스 복합균”은 상기 제2실험군의 결과물이라 판단하는 것이 바람직하다.
본 발명의 실험
본 실험은 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 프로바이오틱스 복합균을 활용하여 생산한 SPF동물에게서 나타나는 카로티노이드계 색소(베타-카로틴, 및 아스타잔틴), 지방산(오메가-3, DHA, 및 EPA), 지용성 비타민, 수용성 비타민, 및 무기영양성분의 성분량을 검사하고, 건강한 성장에 미치는 영향을 평가함을 주된 목적으로 한다. 바람직하게는, 본 발명의 일 실시예에 따라 상기 프로바이오틱스 복합균을 60일 간 대량으로 배양하고, 이를 배지와 함께 동결건조 및 분말화하여 사료첨가제로 상기 SPF동물에게 급이하였고, 상기 SPF동물에게서 나타나는 상기 성분량 등을 분석하여 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 프로바이오틱스 복합균의 효용을 확인하고자 한다.
상기 SPF동물은 Specific Pathogen Free 즉, 특정한 병원성 미생물에 감염되지 않은 것이 확인된 실험동물을 의미한다. 흔히 '무균, 무병동물'이라는 단어로 사용되기도 하나 모든 미생물이 없는 동물은 아니므로 '특정병원체 부재동물'이라는 단어가 정식 표현이다. 동물실험을 할 때 실험동물이 특정한 병원체에 불현성으로 감염되면 외견상 특별한 병적 증세나 소견을 보이지는 않으나, 일정한 실험적 자극을 가했을 경우에 정상적인 동물에서 보이는 반응과 다른 비정상적인 반응을 보여 실험성적에 중요한 영향을 미칠 수 있다. 따라서 상기 SPF동물을 이용한 실험이 중요하다.
한편, 상기 사료첨가제는 생균제의 형태로 첨가될 수 있다. 축사 환경이 불량하거나 스트레스를 많이 받는 가축의 경우 장내 미생물의 균형이 깨지면서 설사 등의 이상 징후가 발생되고, 결국 성장률이 낮아지거나 심할 경우 폐사에 이를 수 있다. 이를 예방하기 위한 방법으로 상기 사료첨가제를 생균제의 형태로 첨가할 수 있다. 사료첨가용 생균제는 가축의 장내 미생물의 균형이 조절되고 가축의 체내에서 유기산 등의 항생물질을 분비하여 가축을 건강하게 하는 효과를 발휘할 수 있다. 또한, 상기 사료첨가용 생균제는 가축의 건강 및 복지에 도움을 주는 미생물 제재이며, 그의 세포 성분을 활용하여 장내 미생물 균형에 도움을 주어 장내 유해 미생물의 억제를 통한 질병 억제, 소화효소 분비에 의한 소화율 향상, 유기물의 분해로 인한 악취감소, 사료 효율 증가(FCR 개선), 및 체중 증가의 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명의 실험 결과(닭(육계) 생산관리 실험)
본 실험은, 본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균을 활용하여 생산한 육계에게서 나타나는 항산화 및 면역력을 척도하기 위한 오메가-3, EPA, 및 DHA의 성분량을 검사하고, 또한 건강한 성장에 미치는 영향을 평가함을 주된 목적으로 한다. 또한, 동물실험 시에 사용될 수 있는 식용 동물로써의 유효성을 평가하기 위해 Specific pathogen 미생물의 모니터링을 실시함으로써, 상기 프로바이오틱스 복합균을 활용하여 사양관리된 상기 양계산물인 것을 증명하는 것을 부가적인 목적으로 한다. 이 때, 상기 프로바이오틱스 복합균은, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 특수배지에서 60일 간 대량으로 배양된 상기 프로바이오틱스 복합균을 배지와 함께 동결건조 및 분말화하여 상기 프로바이오틱스 복합균의 동결건조분말을 상기 육계의 실험군의 사료첨가제로 급이하였다.
1. 공통실험조건
본 발명의 일 실시예에서, 본 실험의 공통실험조건은 하기와 같다.
대상종 및 사육기간: 동일한 부화시설에서 부화하여 입추하였고, 31일 간 사육 후 평가하였다. 대상종은 대한민국에서 기르는 일반적인 육계 종을 사용하였다.
사육밀도: 실험군과 대조군 모두 25평의 동일한 계사에 육계 1,000수씩 입추하였다.
시설: 일정 온도로 가온 하여 육추하며, 자동 급이기, 및 자동급수기 등을 갖춘 현대적 사양관리시설에서 수행되었다.
사료: 일반육계사료제품을 선정하여 급이하였다.
입추 시의 사료 급이: 충분한 수수가 2 ~ 3시간동안 물을 섭취하게 한 이후에 사료를 급여하였다. 사료 급여 4 ~ 5시간 후 불특정 선정하여 모이 주머니를 만져보아 사료를 먹었는지 확인하고, 또한 소화가 되었는지 확인하면서 사료를 급여하였다. 입추 2 ~ 3일 간은, 물로 사료를 버무려서 손으로 쥐었다가 놓으면 다시 풀어질 정도로 하여 1 ∼ 2시간 불린 사료를 바닥의 종이 위에 뿌려 주거나, 보조 급이기를 이용하여 하루에 6 ~7회 급여하였다. 표 10은 육계의 체중에 따른 사료섭취량의 누계 및 사료요구율을 개시한다.
| 체중(g) | 사료섭취량누계(g) | 사료요구율(FCR) |
| 137 | 135 | 0.99 |
| 34 | 435 | 1.26 |
| 687 | 1,005 | 1.46 |
| 1,114 | 1,767 | 1.59 |
| 1,585 | 2,694 | 1.70 |
온습도 관리: 온습도는 상기 사료요구율에 가장 크게 영향을 미치는 요인이며, 바람직하게는 온도가 낮을 경우 체열의 손실을 보충하기 위해 사료의 섭취가 증가하여 상기 사료섭취량이 증가하고, 온도가 필요 이상으로 높을 경우 사육장 내의 열원인 삿갓의 연료비가 증가하고 암모니아 가스 발생이 증가할 수 있다. 이에 따라 표 11과 같이, 연령별로 적절한 온습도 관리를 시행하였다.
| 구분 | 입추 | 1주 | 2주 | 3주 | 4주 | 5주 | |
| 온도(°C) | 삿갓내 | 35 | 32 | 29 | 26 | 23 | 23 |
| 실내 | 28 | 26 | 24 | 22 | 10 | 10 | |
| 습도(%) | 75 | 70 | 65 | 65 | 63 | 60 | |
기타관리: 본 실험에 있어서 사료통과 물통을 깨끗하게 유지하는 것이 바람직하다. 상기 물통은 매일 물로 세척하고 정기적으로 음수 겸용 소독제로 소독하였다. 급이관리의 요령은 병아리 시기에 충분한 급이 공간을 확보하는데 있다. 보조급이기는 5 ~ 7일령부터 제거하기 시작하여, 10일령에 완전히 제거하였다. 급이기의 높이가 높을 경우 균일도와 상기 사료요구율이 불량해질 수 있기 때문에, 상기 급이기 주위의 깔 짚을 관찰한 후 상기 급이기의 높이를 닭의 등 높이와 같도록 수시로 조절하였다. 또한, 상기 급이기 내의 사료량을 1/3 이하로 유지하여 사료의 허실을 적게 하였다. 상기 급이기는 자주 작동하여 사료 섭취를 자극하였다.음용수: 대조군 및 실험군의 음용수는 충청북도 보은군의 지하수를 사용하였으며, 상기 지하수의 성분은 표 12와 같다.
| 시험항목 | 단위 | 결과 |
| 칼슘 | mg/L | 5.33 |
| 칼륨 | mg/L | 1.04 |
| 마그네슘 | mg/L | 3.75 |
| 나트륨 | mg/L | 8.82 |
| 규소 | mg/L | 9.36 |
| 이산화규소 | mg/L | 0.25 |
| 철 | mg/L | 0.10 |
| 게르마늄 | mg/L | 불검출 |
| 아연 | mg/L | 불검출 |
| 인 | mg/L | 0.12 |
| 바나듐 | mg/L | 불검출 |
| 게르마늄 | mg/L | 불검출 |
| 유황 | mg/L | 불검출 |
2. 대조군 실험조건
본 발명의 일 실시예에 따른, 본 실험의 대조군의 사료에 있어서, 일반육계사료제품을 선정하여 급이하였다. 상기 사료의 급이량에 있어서, 대조군과 실험군의 성장속도가 달라 각각의 소화속도가 상이하였기 때문에, 상기 급이량의 차이가 발생하였다.
3. 실험군 실험조건
본 발명의 일 실시예에 따른, 본 실험의 실험군의 사료에 있어서, 대조군과 동일하게 일반육계사료제품을 선정하여 급이하였으며, 상기 특수배지에서 60일 간 대량으로 배양된 상기 프로바이오틱스 복합균을 배지와 함께 동결건조 및 분말화하고, 그 분말을 사료첨가제로 첨가하여 급이하였다.
상기 사료첨가제의 사용량은, 배합사료 톤 당 상기 프로바이오틱스 복합균의 상기 동결건조분말 10 kg를 혼합하여 사용하였다.
상기 공통실험조건에서 상기 대조군 실험조건 및 상기 실험군 실험조건을 적용하여 육계의 사양관리를 실시하고, 대조군과 실험군을 하기와 같이 평가하였다.
도 30은 본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균의 효용을 확인하기 위한 육계 생산관리 실험 과정을 개략적으로 도시한다.
도 30(A)는 1주령 대조군의 병아리의 모습을 도시하고, 도 30(B)는 1주령 실험군의 병아리의 모습을 도시한다. 입추 후 1주령의 실험군과 대조군의 병아리를 평가한 결과, 육안으로 보기에는 발달상태에 큰 차이를 보이진 않았으나, 실험군 병아리의 사료소모량이 7 % 가량 많아 실제 크기에 있어서 차이가 발생하였다. 또한, 입추 후 7일 차에 평가한 평균체중에 있어서, 대조군은 약 140 g, 실험군은 약 160 g으로 20 g 가량의 큰 차이가 발생하였다. 즉, 7 %의 사료소모량 차이로 인해 20 g의 평균체중 차이가 발생한 것을 통해, 실험군 병아리의 영양 흡수율이 보다 증가하였음을 알 수 있다. 무리에서 상대적으로 크기가 작은 병아리인 약추나 기형추 발생률에 있어서, 대조군 및 실험군 모두 0.5% ~ 1%로 비슷하였다.
한편, 도 30의 (C)에는 31일령 대조군의 병아리의 모습을 도시하고, 도 30의 (D)에는 31일령 실험군의 병아리의 모습을 도시한다. 입추 후 31일령의 실험군과 대조군의 닭을 평가한 결과, 육안으로 보기에도 크기의 차이가 관찰되었으며, 닭의 활동성 면에서도 차이가 발생하여 상기 사료급이기의 작동 소리에 대한 반응이 크게 차이가 있었다. 대조군에서 발생했던 약추나 기형추 11마리는 전량 폐사하여 처분하였고, 실험군에서 발생된 쪼리 13마리는 전량 살아남았으나 그 성장률이 저조하였다. 대조군과 실험군의 가장 큰 차이는 털빠짐의 차이였다. 대조군의 닭은 크기도 작고 털이 군데군데 빠진 모습인 반면, 실험군의 닭은 털이 고르게 자라 건강함을 느낄 수 있다. 하기 표 13은 대조군과 실험군의 주령별 성장률을 비교하였다.
| 구분 | 1주령 | 2주령 | 3주령 | 4주령 | 31일령 |
| 대조군(kg) | 137 | 339 | 775 | 1,340 | 1,510 |
| 실험군(kg) | 162 | 384 | 891 | 1,537 | 1,734 |
상기 표 13과 같이, 실험군의 성장률이 대조군의 성장률에 비해 높은 것을 확인할 수 있다.또한, 사양실험을 통해 성장한 닭의 체성분을 하기 표 14 및 표 15와 같이 분석하였다. 표 14는 대조군의 체성분 분석 결과를 개시하고, 표 15는 실험군의 체성분 분석 결과를 개시한다. 각각의 영양성분은 100 g당 함량을 표시되어 있다.
| niacin | Natrium | protein | Carbohydrate | Retinol |
| 12.60mg | 64.094mg | 15.30g | 0.00g | 0.00㎍ |
| Beta-carotene | Vitamin A | Vitamin B1 | Vitamin B2 | Vitamin B6 |
| 0.00㎍ | 4.80㎍RE | 0.08mg | 0.07mg | 0.47mg |
| Vitamin C | Vitamin E | Dietary Fiber | Zinc | Folic acid |
| 0.90mg | 0.35mg | 0.00g | 0.76mg | 3.44㎍ |
| Phosphorus | Lipid | Iron | Potassium | Calcium |
| 187.00mg | 1.64g | 0.66mg | 249.00mg | 12.10mg |
| 지방산 분석 Fatty acids analysis | ||||
| Omega-3 Fatty Acids: 0.31% min Omega-6 Fatty Acids: 2.65% min |
||||
| 콜레스테롤 함유량 분석 Cholesterol content analysis | ||||
| 76.10mg | ||||
| niacin | Natrium | protein | Carbohydrate | Retinol | Vitamin E |
| 8.17mg | 58.47mg | 18.24g | 0.45g | 2.85㎍ | 0.42mg |
| Vitamin A | Vitamin B1 | Vitamin B2 | Vitamin B6 | Vitamin C | Iron |
| 25.50㎍RE | 9.41㎍RE | 0.23mg | 0.32mg | 0.48mg | 0.78mg |
| Dietary Fiber | Zinc | Folic acid | Phosphorus | Lipid | Ge |
| 0.00g | 0.72mg | 4.50㎍ | 200.00mg | 2.63g | 0.04mg |
| Potassium | Calcium | Cholesterol | Ash | ||
| 282.50mg | 30.05mg | 5.25mg | 3.14g | ||
| 지방산 분석 Fatty acids analysis | |||||
| Omega-3 Fatty Acids: 3.4% min Omega-6 Fatty Acids: 0.6% min |
|||||
| 기능성 영양성분 분석 [EPA, DHA]: Nuritional analysis | |||||
| DHA | EPA | ||||
| 0.63 mg | 0.21 mg | ||||
| 콜레스테롤 함유량 분석 Cholesterol content analysis | |||||
| 29.58mg | |||||
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 본 실험을 통해 수득한 실험군의 병아리에 대하여 산물로써의 유효성에 대한 모니터링을 실시하였다. 하기 표 16은 상기 실험군의 병아리에 대한 모니터링 시험법을 개시한다.
| 구분 | 원인체 | 검사방법 (시험법) |
| Virus | Avian adenovirus, group 1 | ELISA 시험법 (ELISA kit) ELISA serum antibody monitoring 실험군 중, 5개 개체를 무작위로 선정하여 모니터링을 시행하였음. |
| Avian encephalomyelitis virus | ||
| Infectious bursal disease virus | ||
| Avian infectious bronchitis virus | ||
| Influenza A Virus | ||
| Avian infectious laryngotracheitis virus | ||
| Marek‘s disease virus | ||
| Newcastle disease virus | ||
| Avian nephritis virus | ||
| Chicken anaemia virus | ||
| Bacteria | Mycoplasma gallisepticum | PCR 시험법 |
| Mycoplasma synoviae | PCR 시험법 | |
| Salmonella pullorum | PCR 시험법 |
하기 표 17은 상기 실험군의 병아리를 모니터링 한 결과를 개시한다.
| ELISA serum antibody monitoring | |
| Avian adenovirus, group 1 |
① 검사방법 - Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=5(M001, M002, M003, M004, M005) - 전체 negative |
| Avian encephalomyelitis virus |
① 검사방법 - Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=5(M001, M002, M003, M004, M005) - 전체 negative |
| Infectious bursal disease virus |
① 검사방법 - Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=5(M001, M002, M003, M004, M005) - 전체 negative |
| Avian infectious bronchitis virus | ① 검사방법 - Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=5(M001, M002, M003, M004, M005) - 전체 negative |
| Influenza A Virus | ① 검사방법- Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=5(M001, M002, M003, M004, M005) - 전체 negative |
| Avian infectious laryngotracheitis virus |
① 검사방법 - Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=5(M001, M002, M003, M004, M005) - 전체 negative |
| Marek‘s disease virus | ① 검사방법 - Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=5(M001, M002, M003, M004, M005) - 전체 negative |
| Newcastle disease virus | ① 검사방법- Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=5(M001, M002, M003, M004, M005) - 전체 negative |
| Avian nephritis virus | ① 검사방법- Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=5(M001, M002, M003, M004, M005) - 전체 negative |
| Chicken anaemia virus | ① 검사방법- Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=5(M001, M002, M003, M004, M005) - 전체 negative |
| PCR based test | |
| Mycoplasma gallisepticum |
① 검사방법 - PCR조건 - condition 94℃ 2min 94℃ 30sec, 53℃ 30sec, 68℃ 40sec (32cycle) 4℃ ∞ - sample: nasal swab ② 검사 결과 - 샘플 수: n=5(M001, M002, M003, M004, M005) - 검사결과 모든 검체에서 Mycoplasma gallisepticum 이 검출되지 않음 |
| Mycoplasma synoviae |
① 검사방법 - PCR 조건 - condition 94℃ 2min 94℃ 30sec, 56℃ 30sec, 68℃ 40sec(32cycle) 4℃ ∞ - sample: nasal swab ② 검사 결과 -샘플 수: n=5(M001, M002, M003, M004, M005) -검사결과 모든 검체에서 Mycoplasma synoviae 가 검출되지 않음 |
| Salmonella pullorum | ① 검사방법 - PCR조건 - condition 94℃ 2min 94℃ 30sec, 55℃ 30sec, 68℃ 40sec(32cycle) 4℃ ∞ - sample: nasal swab ② 검사 결과 - 샘플 수: nn=5(M001, M002, M003, M004, M005) - 검사결과 모든 검체에서 Salmonella pullorum 이 검출되지 않음 |
상기와 같이 실험군의 병아리에 대해 다양한 바이러스 및 박테리아 모니터링 시험을 수행한 결과 모든 모니터링 결과에서 이상이 나타나지 않았다.
이와 같이, 상기 프로바이오틱스 복합균을 활용하여 생산한 육계는, 항산화 및 면역력이 우수하여 상기 육계의 건강한 성장에 좋은 영향을 끼칠 수 있다. 또한, 본 실험에서의 실험군의 병아리는, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 프로바이오틱스 복합균을 활용하여 사양관리된 양계산물임을 증명할 수 있다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 프로바이오틱스 복합균을 상기 육계인 닭의 사료에 첨가함으로써, 상기 프로바이오틱스 복합균의 효용을 나타낼 수 있는 상기 양계산물로써 상기 닭을 사양관리할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명의 실험 결과(SPF 계란(산란계) 생산관리 실험)
다음으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균을 활용하여 생산한 산란계가 낳은 계란에게서 나타나는 항산화 및 면역력을 척도하기 위한 오메가-3, EPA, 및 DHA의 성분량을 검사하고, 또한 건강한 성장에 미치는 영향을 평가함을 주된 목적으로 한다. 또한, 동물실험 시에 사용될 수 있는 SPF동물로써의 유효성을 평가하기 위해 Specific pathogen 미생물의 모니터링을 실시함으로써, 상기 프로바이오틱스 복합균을 활용하여 사양관리된 상기 SPF계란인 것을 증명하는 것을 부가적인 목적으로 한다.
이 때, 상기 프로바이오틱스 복합균은, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 특수배지에서 60일 간 대량으로 배양된 상기 프로바이오틱스 복합균을 상기 특수배지와 함께 동결건조 및 분말화하여 상기 프로바이오틱스 복합균의 동결건조분말을 상기 산란계의 실험군의 사료첨가제로 급이하였다.
1. 공통실험조건
본 발명의 일 실시예에서, 본 실험의 공통실험조건은 하기와 같다.
대상종 및 사육기간: 동일한 부화시설에서 부화하여 입추하였고, 32주 간 사육 후 평가하였다. 대상종은 대한민국에서 기르는 일반적인 화이트레그혼 종을 사용하였다.
사육밀도: 실험군과 대조군 모두 25평의 동일한 계사에 화이트레그혼 300수씩 입추하였다.
시설: 일정 온도로 가온 하여 육추하며, 자동 급이기, 및 자동급수기 등을 갖춘 현대적 사양관리시설에서 수행되었다.
사료: 일반산란계사료제품을 선정하여 급이하였다.
입추~ 6주령까지의 사양 관리: 6주 간은 폐, 호흡기관, 소화기관, 심장, 간, 신장 등의 주요 장기, 면역기관, 및 골격의 발달에 중요한 중요한 기간이며, 육계 전기사료의 급여를 수행하였다. 6주령의 체중 성장은 산란기간의 대사기능과 난각질에 영향을 줄 수 있기 때문에 신중한 사양관리가 중요하며, 입추로부터 3일간 섭씨 35도 이상의 온도를 유지하였다.
온습도 관리: 온습도는 사료요구율에 가장 크게 영향을 미치는 요인이며, 바람직하게는 온도가 낮을 경우 체열의 손실을 보충하기 위해 사료의 섭취가 증가하여 상기 사료섭취량이 증가하고, 온도가 필요 이상으로 높을 경우 사육장 내의 열원인 삿갓의 연료비가 증가하고 암모니아 가스 발생이 증가할 수 있다. 이에 따라 하기 표 18과 같이, 연령별로 적절한 온습도 관리를 시행하였다.
| 구분 | 입추 | 1주 | 2주 | 3주 | 4주 | 5주 | 6주~ | |
| 온도(°C) | 삿갓내 | 35 | 32 | 29 | 26 | 23 | 23 | 유지 |
| 실내 | 28 | 26 | 24 | 22 | 10 | 10 | 유지 | |
| 습도(%) | 75 | 70 | 65 | 65 | 63 | 60 | 유지 | |
6 ~ 8주령까지의 사양관리: 골격의 85 % 발달하는 시기이며, 충분한 생활면적을 유지해 주는 등 육계의 사양관리와 동일하게 수행하였다.8 ~ 9주령까지의 사양관리: 난소 발육이 시작되는 시기이며, 성성숙 억제 관리를 시작하였으며, 암실에서 일정점등 하였다. 육성기간 점등시간은 난소발육억제와 관련된다. 8주령부터 10시간의 점등시간을 공급하고 광도는 10~15 룩스로 하였다.
9 ~ 15주령까지의 사양관리: 골격의 95 %가 발달되는 시기이며, 점등시간유지를 통한 성성숙 억제관리를 수행하였다.
15 ~ 17주령까지의 사양관리: 빠른 난소 발육과 성호르몬 분비가 증가되고 골격의 칼슘침착이 시작되는 시기이며, 점등시간유지를 통한 성성숙 억제관리를 수행하였다.
17 ~ 27주령까지의 사양관리: 120 ~ 126일령이 되는 시기이며, 체중이 1.4~1.48kg에 도달하는 시기에 점등자극을 통하여 성성숙 억제를 해제하였다. 이에 산란 기관이 빠르게 발육되고 체중증가가 시작되어 시산이 시작되는 산란1기이다. 이 시기에는 산란초기 사료로 변경하여 사료를 충분히 급여토록 하였고, 점등자극을 위하여 점증점등 1일 16시간까지 증가하였다. 심야점등 및 심야급이를 통해 사료섭취량을 늘리고, 적어도 27주령까지 위 사항을 실시한다. 한편, 이 시기에는 닭의 면역력이 최하위로 내려가 질병이 잘 발생되는 기간이다.
27 ~ 30주령까지의 사양관리: 산란 중기로써 체성숙이 완료되는 시기이며, 산란율은 서서히 감소하지만 난중은 계속 증가하므로 1일 1수 당 산란량은 거의 변화가 없는 시기이다. 사료 내 칼슘함량을 증가하기 위해 산란중기 사료로 변경하여 급이하였다.
산란 기간 내 계란의 수득: 실험군 및 대조군의 동일한 산물 품질 평가를 위하여서 23주령이 되는 기간에 수득된 계란을 채취하여 평가하였다.
음용수: 대조군 및 실험군의 음용수는 충청북도 보은군의 지하수를 사용하였으며, 상기 지하수의 성분은 표 19와 같다.
| 시험항목 | 단위 | 결과 |
| 칼슘 | mg/L | 5.33 |
| 칼륨 | mg/L | 1.04 |
| 마그네슘 | mg/L | 3.75 |
| 나트륨 | mg/L | 8.82 |
| 규소 | mg/L | 9.36 |
| 이산화규소 | mg/L | 0.25 |
| 철 | mg/L | 0.10 |
| 게르마늄 | mg/L | 불검출 |
| 아연 | mg/L | 불검출 |
| 인 | mg/L | 0.12 |
| 바나듐 | mg/L | 불검출 |
| 게르마늄 | mg/L | 불검출 |
| 유황 | mg/L | 불검출 |
2. 대조군 실험조건
본 발명의 일 실시예에 따른, 본 실험의 대조군의 사료에 있어서, 일반육계사료제품을 선정하여 급이하였으며, 상기 사료의 급이량에 있어서, 대조군과 실험군의 성장속도가 달라 각각의 소화속도가 상이하였기 때문에, 상기 급이량의 차이가 발생하였다.
3. 실험군 실험조건
본 발명의 일 실시예에 따른, 본 실험의 실험군의 사료에 있어서, 대조군과 동일하게 일반육계사료제품을 선정하여 급이하였으며, 상기 특수배지에서 60일 간 대량으로 배양된 상기 프로바이오틱스 복합균을 배지와 함께 동결건조 및 분말화하고, 그 분말을 사료첨가제로 첨가하여 급이하였다.
상기 사료첨가제의 사용량은, 배합사료 톤 당 상기 프로바이오틱스 복합균의 상기 동결건조분말 10 kg를 혼합하여 사용하였다.
도 31는 본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균의 효용을 확인하기 위한 산란계 생산관리 실험 과정을 개략적으로 도시한다.
도 31(A)는 대조군의 23주령 산란계에서 수득한 계란의 모습을 도시하고, 도 31(B)는 실험군의 23주령 산란계에서 수득한 계란의 모습을 도시한다. 이와 같은 사양실험을 통해 수득한 계란에 함유된 기능성분을 하기 표 20 및 표 21과 같이 분석하였다. 표 20은 대조군의 산란계에서 수득한 계란에 함유된 기능성분의 분석 결과를 개시하고, 표 21은 실험군의 산란계에서 수득한 계란에 함유된 기능성분의 분석 결과를 개시한다. 각각의 영양성분은 100 g당 함량을 표시되어 있다.
| niacin | Natrium | protein | Carbohydrate | Retinol |
| 0.45mg | 147.00mg | 12.50g | 4.55g | 69.20㎍ |
| Beta-carotene | Vitamin A | Vitamin B1 | Vitamin B2 | Vitamin B6 |
| 0.00㎍ | 89.00㎍RE | 0.32mg | 0.72mg | 0.00mg |
| Vitamin C | Vitamin E | Dietary Fiber | Zinc | Folic acid |
| 0.00mg | 0.00mg | 1.91g | 1.42mg | 0.00㎍ |
| Phosphorus | Lipid | Iron | Potassium | Calcium |
| 183.00mg | 9.20g | 1.85mg | 150.00mg | 53.00mg |
| 지방산 분석 Fatty acids analysis | ||||
| Omega-3 Fatty Acids: 0.14% min Omega-6 Fatty Acids: 2.07% min |
||||
| 콜레스테롤 함유량 분석 Cholesterol content analysis | ||||
| 468.16mg | ||||
| Niacin | Natrium | protein | Carbohydrate | Retinol | Beta-carotene |
| 1.50mg | 201.00mg | 20.00g | 2.40g | 106.05㎍ | 624.10㎍ |
| Vitamin A | Vitamin B1 | Vitamin B2 | Vitamin B6 | Vitamin C | Vitamin E |
| 124.80㎍RE | 2.62㎍RE | 1.30mg | 0.28mg | 0.46mg | 0.26mg |
| Dietary Fiber | Zinc | Folic acid | Phosphorus | Lipid | Iron |
| 3.30g | 3.05mg | 0.00㎍ | 205.52mg | 10.08g | 2.12mg |
| Potassium | Calcium | Cholesterol | Ash | Ge | |
| 300.00mg | 76.00mg | 421.37mg | 0.94g | 0.26mg | |
| 지방산 분석 Fatty acids analysis | |||||
| Omega-3 Fatty Acids: 2.90% min Omega-6 Fatty Acids: 0.32% min |
|||||
| 기능성 영양성분 분석 [EPA, DHA]: Nuritional analysis | |||||
| DHA | EPA | ||||
| 0.84 mg | 0.350 mg | ||||
| 기능성 영양성분 분석 [Astaxanthin] : Nuritional analysis | |||||
| 0.07 mg | |||||
| [Lutein] : Nuritional analysis | [Zeaxanthin] : Nuritional analysis | ||||
| 0.05mg | 0.08mg | ||||
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 본 실험을 통해 수득한 실험군의 계란에 대하여 SPF산물로써의 유효성에 대한 모니터링을 실시하였다. 하기 표 22는 상기 실험군의 계란에 대한 SPF 모니터링 시험법을 개시한다.
| 구분 | 원인체 | 검사방법 (시험법) |
| Virus | Avian adenovirus, group 1 | ELISA 시험법 (ELISA kit) ELISA serum antibody monitoring 실험군 중, 5개 개체를 무작위로 선정하여 모니터링을 시행하였음. |
| Avian encephalomyelitis virus | ||
| Infectious bursal disease virus | ||
| Avian infectious bronchitis virus | ||
| Influenza A Virus | ||
| Avian infectious laryngotracheitis virus | ||
| Marek‘s disease virus | ||
| Newcastle disease virus | ||
| Avian nephritis virus | ||
| Chicken anaemia virus | ||
| Bacteria | Mycoplasma gallisepticum | PCR 시험법 |
| Mycoplasma synoviae | PCR 시험법 | |
| Salmonella pullorum | PCR 시험법 |
하기 표 23은 상기 실험군의 계란을 SPF 모니터링 한 결과를 개시한다.
| ELISA serum antibody monitoring | |
| Avian adenovirus, group 1 |
① 검사방법 - Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=10(M001, M002, M003, M004, M005, M006, M007, M008, M009, M010) - 전체 negative |
| Avian encephalomyelitis Virus |
① 검사방법 - Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=10(M001, M002, M003, M004, M005, M006, M007, M008, M009, M010) - 전체 negative |
| Infectious bursal disease virus | ① 검사방법 - Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=10(M001, M002, M003, M004, M005, M006, M007, M008, M009, M010) - 전체 negative |
| Avian infectious bronchitis virus |
① 검사방법 - Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=10(M001, M002, M003, M004, M005, M006, M007, M008, M009, M010) - 전체 negative |
| Influenza A Virus | ① 검사방법 - Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=10(M001, M002, M003, M004, M005, M006, M007, M008, M009, M010) - 전체 negative |
| Avian infectious laryngotracheitis virus | ① 검사방법 - Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=10(M001, M002, M003, M004, M005, M006, M007, M008, M009, M010) - 전체 negative |
| Marek‘s disease virus | ① 검사방법- Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=10(M001, M002, M003, M004, M005, M006, M007, M008, M009, M010) - 전체 negative |
| Newcastle disease virus | ① 검사방법- Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=10(M001, M002, M003, M004, M005, M006, M007, M008, M009, M010) - 전체 negative |
| Avian nephritis virus | ① 검사방법 - Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=10(M001, M002, M003, M004, M005, M006, M007, M008, M009, M010) - 전체 negative |
| Chicken anaemia virus | ① 검사방법 - Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=10(M001, M002, M003, M004, M005, M006, M007, M008, M009, M010) - 전체 negative |
| PCR based test | |
| Mycoplasma gallisepticum |
① 검사방법 - PCR조건 - condition 94℃ 2min 94℃ 30sec, 53℃ 30sec, 68℃ 40sec (32cycle) 4℃ ∞ - sample: nasal swab ② 검사 결과 - 샘플 수: n=10(M001, M002, M003, M004, M005, M006, M007, M008, M009, M010) - 검사결과 모든 검체에서 Mycoplasma gallisepticum 이 검출되지 않음 |
| Mycoplasma synoviae | ① 검사방법 - PCR 조건 - condition 94℃ 2min 94℃ 30sec, 56℃ 30sec, 68℃ 40sec(32cycle) 4℃ ∞ - sample: nasal swab ② 검사 결과 -샘플 수: n=10(M001, M002, M003, M004, M005, M006, M007, M008, M009, M010) -검사결과 모든 검체에서 Mycoplasma synoviae 가 검출되지 않음 |
| Salmonella pullorum | ① 검사방법 - PCR조건- condition 94℃ 2min 94℃ 30sec, 55℃ 30sec, 68℃ 40sec(32cycle) 4℃ ∞ - sample: nasal swab ② 검사 결과 - 샘플 수: n=10(M001, M002, M003, M004, M005, M006, M007, M008, M009, M010) - 검사결과 모든 검체에서 Salmonella pullorum 이 검출되지 않음 |
상기와 같이 실험군의 계란에 대해 다양한 바이러스 및 박테리아 모니터링 시험을 수행한 결과 모든 모니터링 결과에서 이상이 나타나지 않았다.
이와 같이, 상기 프로바이오틱스 복합균을 활용하여 생산한 산란계가 낳은 달걀은, 항산화 및 면역력이 우수하여 상기 육계의 건강한 성장에 좋은 영향을 끼칠 수 있다. 또한, 본 실험에서의 실험군의 산란계가 낳은 달걀은, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 프로바이오틱스 복합균을 활용하여 사양관리된 SPF계란임을 증명할 수 있다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 프로바이오틱스 복합균을 산란계의 사료에 첨가함으로써, 상기 프로바이오틱스 복합균의 효용을 나타낼 수 있는 상기 SPF계란으로써 상기 산란계의 계란을 사양관리할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명의 실험 결과(SPF 미니돼지 생산관리 실험)
다음으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균을 활용하여 생산한 미니돼지에게서 나타나는 항산화 및 면역력을 척도하기 위한 오메가-3, EPA, 및 DHA의 성분량을 검사하고, 또한 건강한 성장에 미치는 영향을 평가함을 주된 목적으로 한다. 또한, 동물실험 시에 사용될 수 있는 SPF동물로써의 유효성을 평가하기 위해 Specific pathogen 미생물의 모니터링을 실시함으로써, 상기 프로바이오틱스 복합균을 활용하여 사양관리된 상기 SPF실험동물인 것을 증명하는 것을 부가적인 목적으로 한다.
이 때, 상기 프로바이오틱스 복합균은, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 특수배지에서 60일 간 대량으로 배양된 상기 프로바이오틱스 복합균을 상기 특수배지와 함께 동결건조 및 분말화하여 상기 프로바이오틱스 복합균의 동결건조분말을 상기 미니돼지의 실험군의 사료첨가제로 급이하였다.
본 실험의 개체인 돼지는 생리해부학적 소견이 사람과 유사하여 연구 분야에 넓게 이용되어 실험동물로서 크게 주목받고 있다. 특히 순환기계의 연구, 장기이식의 기초연구, 및 피부자극 시험 등에 넓게 이용되고 있으며, 동맥경화증, 위궤양 등의 질환 모델 동물로서의 이용도 많다. 이에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 프로바이오틱스 복합균의 상기 동결건조분말을 활용하여, 인공장기의 생산용으로써 유전자가 변이된 종을 사육하였을 경우 무균관리 및 면역력 측면에서 더욱 유리한 사양관리가 가능할 수 있다.
1. 공통실험조건
본 발명의 일 실시예에서, 본 실험의 공통실험조건은 하기와 같다.
도 32는 본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균의 효용을 확인하기 위한 돼지 생산관리의 대상종을 개략적으로 도시한다.
대상종 및 사육기간: 동일한 부화시설에서 부화한 종 중 15일 간 무균관리된 이유자돈 4마리를 선별하였고, 200일령까지 사육 후 평가하였다. 대상종은 괴팅겐계 미니어처피그를 사용하였다.
개체 선발: 하기 표 24와 같은 개체 선발을 통하여, 최대한 동일한 개체 4마리를 선별하여 실험하였다.
| 구분 | 검사항목 | 개체 선정 세부기준 |
| Vital sign | 체온 | 직장체온이 37 ~ 39˚C 로 표준인 개체를 선정하였음. |
| 심박수 | 심박수 청진시 70 ~ 160 회로 표준인 개체를 선정하였음. | |
| 호흡수 | 호흡음의 청진시 10 ~ 30 회로 표준인 개체를 선정하였음. | |
| 체중 | 1.5kg 내외의 표준개체를 선정하였음. | |
| 식욕 | 음식에 관심을 기울이는 개체를 선정하였음. | |
| 배뇨 | 배뇨 상태와 횟수가 날마다 일정한 개체를 선정하였음. | |
| 배분 | 배변 상태와 횟수가 날마다 일정한 개체를 선정하였음. | |
| 자세 | 자세 | 머리가 한쪽으로 기울어져 있지 않은 개체를 선정하였음. 스스로 자세를 잡을 수 있고 휘청거리지 않는 개체를 선정하였음. 앉거나 일어나는 동작을 할 때 편안해 보이는 개체를 선정하였음. |
| 의식상태 | 의식상태 | 주위 자극에 반응하는 개체를 선정하였음.다른 동물이나 사람에게 공격적이지 않은 개체를 선정하였음. 우둔해 보이지 않는 개체를 선정하였음. 발작이 없는 개체를 선정하였음. |
| 머리와 목 | 구조의 완전성과 대칭성 | 입술은 대칭인 개체를 선정하였음. 코가 한쪽으로 일그러져 있지 않은 개체를 선정하였음. 부은 곳이 없는 개체를 선정하였음. |
| 입의 움직임 | 저작 운동이 정상인 개체를 선정하였음. | |
| 눈 | 안구 | 1. 크기와 위치가 정상인 개체를 선정하였음. 2. 색깔과 상태가 정상인 개체를 선정하였음. 3. 안구가 이상 운동을 보이지 않는 개체를 선정하였음. 4. 동공 반사가 정상인 개체를 선정하였음. |
| 안검 | 1. 모양이 대칭인 개체를 선정하였음. 2. 변색, 홍조, 종괴가 없는 개체를 선정하였음. 3. 경련이 없는 개체를 선정하였음. 4. 제3 안검은 정상인 개체를 선정하였음. |
|
| 결막 | 충혈이나 염증이 없는 개체를 선정하였음. | |
| 유루 | 평상시 눈물을 흘리지 않는 개체를 선정하였음. | |
| 코 | 비루 | 비루가 존재하지 않는 개체를 선정하였음. |
| 귀 | 귓바퀴 | 1. 평상시 귀를 자꾸 긁지 않는 개체를 선정하였음. 2. 혈색 정상개체 (창백 = 말초순환장애 / 노란색 = 황달) |
| 이도 | 1. 외이도가 충혈되거나 궤양이 없는 개체를 선정하였음. 2. 이도내 삼출물이 존재하지 않는 개체를 선정하였음. |
사료 및 급이: J사의 미니돼지용 고형사료 중 비타민 A, D, 철분이 함유된 사료를 채택하여 급이하였음. 괴팅겐계의 미니돼지는 30일령에 일일 200 g씩 급이하였고, 이후 10개월령 까지는 각월 100 g단위로 증가시켜 급이하였고, 1 kg을 최대 급이량으로 한다. 사료는 성숙하기 전의 동물이 정상으로 발육하고 또는 성숙한 동물이 정상체중을 유지할 수 있도록 충분한 영양소를 포함해야 하며, 청결하고 오염물질을 포함하지 않아야 한다.사육용 케이지: 사육케이지는 체중이 20 ~ 25 kg정도까지의 돼지를 한 마리씩 사육하는 데에 충분한 크기를 선택하는 것이 바람직하다. 사육실은 거주부, 침상부, 및 배분부로 구분하였고, 상기 거주부와 상기 침상부는 동일 구획 내에 배치되고 상기 침상구의 바닥이 습윤해지는 것을 막기 위해 목재와 톱밥을 쌓은 침상을 준비하였다. 상기 배분부는 별도의 구획 내에 배치되어 그 일부를 개폐식으로 하여 돼지의 이동통로로써 배치함으로써 일상 관리에 편리하도록 구성하였다. 돼지는 머리로 미는 힘이 세기 때문에 케이지의 칸막이를 철근 각제를 사용하였다.
사육 환경조건: 돼지를 사육하기에 적절한 환경조건에 있어서, 온도와 통기성이 중요할 수 있다. 돼지는 저온에 강하고 고온에 약하지만, 본 실험의 개체인 자돈의 경우 피하지방이 얇고 체온조절기능이 발달하지 않았기 때문에 저온조건은 피하는 것이 바람직하다. 포유중의 자돈은 섭씨 25도 내지 34도를 유지하는 것이 바람직하고, 이유 후에는 섭씨 24도를 유지하는 것이 바람직하고, 3개월령 이상에는 섭씨 15도를 유지하는 것이 바람직하다. 온도 유지를 위한 보온은 적외선 램프, 및 전기 매트를 사용하였다. 습도는 50 ~ 65 %의 범위를 유지하였으며, 통기성 확보를 위해 환기를 충분히 해 주었다.
기타관리: 본 실험에 있어서 사료통과 물통을 깨끗하게 유지하는 것이 바람직하다. 상기 물통은 매일 물로 세척하고 정기적으로 음수 겸용 소독제로 소독하였다. 급이관리의 요령은 자돈 시기에 충분한 급이 공간을 확보하는데 있다. 상기 급이기 내의 사료량을 1/3이하로 유지하여 사료의 허실을 적게 하였다. 상기 급이기는 자주 작동하여 사료 섭취를 자극하였다.
음용수: 대조군 및 실험군의 음용수는 충청북도 보은군의 지하수를 사용하였으며, 상기 지하수의 성분은 하기 표 25와 같다.
| 시험항목 | 단위 | 결과 |
| 칼슘 | mg/L | 5.33 |
| 칼륨 | mg/L | 1.04 |
| 마그네슘 | mg/L | 3.75 |
| 나트륨 | mg/L | 8.82 |
| 규소 | mg/L | 9.36 |
| 이산화규소 | mg/L | 0.25 |
| 철 | mg/L | 0.10 |
| 게르마늄 | mg/L | 불검출 |
| 아연 | mg/L | 불검출 |
| 인 | mg/L | 0.12 |
| 바나듐 | mg/L | 불검출 |
| 게르마늄 | mg/L | 불검출 |
| 유황 | mg/L | 불검출 |
2. 대조군 실험조건
본 발명의 일 실시예에 따른, 본 실험의 대조군의 사료에 있어서, 미니돼지용 고형사료를 선정하여 급이하였다. 상기 사료의 급이량에 있어서, 대조군과 실험군의 성장속도가 달라 각각의 소화속도가 상이하였기 때문에, 상기 급이량의 차이가 발생하였다.
3. 실험군 실험조건
본 발명의 일 실시예에 따른, 본 실험의 실험군의 사료에 있어서, 대조군과 동일하게 미니돼지용 고형사료를 선정하여 급이하였으며, 상기 특수배지에서 60일 간 대량으로 배양된 상기 프로바이오틱스 복합균을 배지와 함께 동결건조 및 분말화하고, 그 분말을 사료첨가제로 첨가하여 급이하였다.
상기 사료첨가제의 사용량은, 배합사료 10 kg 당 상기 프로바이오틱스 복합균의 상기 동결건조분말 100 g를 혼합하여 사용하였다.
상기의 조건을 적용하여 185일 간 사육한 200일령의 대조군 및 200일령의 실험군의 평가를 수행하였다. 하기 표 26은 대조군 및 실험군의 진단평가표를 개시한다.
| 구분 | 검사항목 | 검사 세부기준 | 대조군 | 실험군 |
| 입 | 입술 | 1. 변색, 홍조, 종괴 여부 | 정상 | 정상 |
| 2. 경련이 여부 | 정상 | 정상 | ||
| 3. 입을 벌리는 과정의 정상여부 | 정상 | 정상 | ||
| 침흘림 | 4. 침흘림 여부 | 정상 | 정상 | |
| 구강내부 | 1. 잇몸의 변색, 홍조, 종괴여부 | 정상 | 정상 | |
| 2. 혀의 정상여부 | 정상 | 정상 | ||
| 3. 편도선의 정상여부 | 정상 | 정상 | ||
| 흉부 (호흡기, 순환기) |
호흡 | 1. 호흡수의 정상여부 | 가끔 가쁜숨 | 정상 |
| 2. 입을 벌리고 숨을 쉬는지 여부 | 항상 입벌림 | 정상 | ||
| 3. 기침이나 재채기 여부 | 가끔 | 없음 | ||
| 4. 호흡음에서 잡음여부 | 정상 | 정상 | ||
| 전신순환 | 1. 구강 점막 색조 정상여부 | 정상 | 정상 | |
| 2. 모세혈관 재충진 시간 | 정상 | 정상 | ||
| 3. 운동량의 정상여부 | 비활동적 | 활동적 | ||
| 4. 맥박의 정상성 | 정상 | 정상 | ||
| 구조의 완전 성과 대칭성 | 1. 흉곽의 대칭성 | 정상 | 정상 | |
| 2. 종괴나 부종여부 | 정상 | 정상 | ||
| 복부 (소화기) |
구조의 완전 성과 대칭성 | 1. 복부 팽창 여부 | 정상 | 정상 |
| 2. 탈장 여부 | 정상 | 정상 | ||
| 복통 | 1. 허리를 구부림 여부 | 정상 | 정상 | |
| 2. 촉진시 통증 호소 여부 | 정상 | 정상 | ||
| 소화기능 | 1. 배변 상태 정상 여부 | 정상, 냄새 | 정상 | |
| 회음부 (비뇨생식기) |
항문 | 1. 청결 여부 | 변 묻음, 냄새 | 정상 |
| 2. 항문을 끌고 다님현상 | 자주 | 정상 | ||
| 배뇨기능 | 1. 배뇨 상태는 정상 여부 | 냄새 | 정상 | |
| 외부생식기 | 1. 정상 구조 여부 | 정상 | 정상 | |
| 2. 분비물 여부 | 정상 | 정상 | ||
| 근골격계 (신경계 포함) |
구조의 완전성과 대칭성 | 1. 사지의 정상 여부 | 정상 | 정상 |
| 2. 발가락 움직임 여부 | 정상 | 정상 | ||
| 3. 사지를 사용 여부 | 정상 | 정상 | ||
| 4. 다리를 끌음 여부 | 가끔 끌음 | 정상 | ||
| 5. 근력 정상 여부 | 다소 약함 | 강함 | ||
| 6. 사지 통증호소 여부 | 정상 | 정상 | ||
| 피부 | 피부의 변화 | 1. 탈모 여부 | 목주변 | 정상 |
| 2. 변색, 홍조, 종괴 여부 | 목 주변 홍조 | 정상 | ||
| 4. 털이 뭉친 곳 여부 | 배 주위 | 정상 | ||
| 5. 자주 털빠짐 여부 | 목주변 | 정상 | ||
| 6. 가려움 현상 여부 | 목주변 | 정상 |
상기와 같은 진단평가 결과, 실험군의 돼지는 모든 검사항목에 있어서 정상인 반면, 대조군의 돼지는 대부분 정상이나 호흡, 운동량, 근골격계, 및 피부 등에 있어서 다소 문제가 발생된 것으로 판단된다.또한, 본 사양실험을 통해 수득한 미니돼지에 함유된 체성분을 하기 표 27 및 표 28과 같이 분석하였다. 표 27은 대조군의 미니돼지에 함유된 체성분의 분석 결과를 개시하고, 표 28은 실험군의 미니돼지에 함유된 체성분의 분석 결과를 개시한다. 각각의 영양성분은 100 g당 함량을 표시되어 있다.
| Niacin | Natrium | protein | Carbohydrate | Retinol |
| 4.90mg | 57.50mg | 20.56g | 0.36g | 4.80㎍ |
| Beta-carotene | Vitamin A | Vitamin B1 | Vitamin B2 | Vitamin B6 |
| 0.00㎍ | 6.32㎍RE | 0.56mg | 0.22mg | 0.68mg |
| Vitamin C | Vitamin E | Dietary Fiber | Zinc | Folic acid |
| 2.00mg | 0.34mg | 0.00g | 1.75mg | 5.48㎍ |
| Phosphorus | Lipid | Iron | Potassium | Calcium |
| 180.00mg | 14.85g | 1.82mg | 300.52mg | 6.54mg |
| 지방산 분석 Fatty acids analysis | ||||
| Omega-3 Fatty Acids: 0.09% min Omega-6 Fatty Acids: 2.87% min |
||||
| 콜레스테롤 함유량 분석 Cholesterol content analysis | ||||
| 49.30mg | ||||
| niacin | Natrium | protein | Carbohydrate | Retinol | Vitamin E |
| 9.42mg | 60.00mg | 27.04g | 0.20g | 7.05㎍ | 3.00mg |
| Vitamin A | Vitamin B1 | Vitamin B2 | Vitamin B6 | Vitamin C | Iron |
| 17.06㎍RE | 4.82㎍RE | 0.80mg | 1.42mg | 5.08mg | 2.60mg |
| Dietary Fiber | Zinc | Folic acid | Phosphorus | Lipid | Ge |
| 0.00g | 2.40mg | 7.84㎍ | 210.14mg | 22.07g | 0.30mg |
| Potassium | Calcium | Cholesterol | Ash | ||
| 410.20mg | 36.00mg | 14.00mg | 1.60g | ||
| 지방산 분석 Fatty acids analysis | |||||
| Omega-3 Fatty Acids: 5.4% min Omega-6 Fatty Acids: 0.5% min |
|||||
| 기능성 영양성분 분석 [EPA, DHA]: Nuritional analysis | |||||
| DHA | EPA | ||||
| 0.48 mg | 0.84 mg | ||||
| 콜레스테롤 함유량 분석 Cholesterol content analysis | |||||
| 15.60mg | |||||
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 본 실험을 통해 수득한 실험군의 미니돼지에 대하여 SPF산물로써의 유효성에 대한 모니터링을 실시하였다. 하기 표 29는 상기 실험군의 미니돼지에 대한 SPF 모니터링 시험법을 개시한다.
| 구분 | 원인체 | 검사방법 (시험법) |
| Virus | Hog cholera | ELISA 시험법 |
| Aujeszky (pseudorabies) | ELISA 시험법 | |
| (PRRS) Porcine reproductive and respiratory sydrome virus |
ELISA, RT-PCR 시험법 | |
| Porcine circovirus type2 | ELISA 시험법 | |
| Swine influenza (H1N1) | ELISA 시험법 | |
| Bacteria | Salmonella spp. | Bacterial Culture |
| Erysipelothrix rhusiopathiae | PCR 시험법 | |
| Bordetella spp. | PCR 시험법 | |
| Actinobacillus spp. | PCR 시험법 | |
| Mycoplasma hyopneumoniae | PCR 시험법 |
하기 표 30은 상기 실험군의 미니돼지를 SPF 모니터링 한 결과를 개시한다.
| ELISA serum antibody monitoring | |
| Hog cholera | ① 검사방법 - Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=2(M001, M003) - 전체 negative |
| Aujesky(Pseudorabies) | ① 검사방법- Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=2( M001, M003) - 전체 negative |
| (PRRS)Porcine reproductive and respiratory sydrome virus |
① 검사방법 - Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=2(M001, M003) - 전체 negative |
| Porcine circovirus type 2 | ① 검사방법 - Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=2(M001, M003) - 전체 negative |
| Swine influenza H1N1 | ① 검사방법 - Serum antibody ELISA 검사 - ELISA kit - 제작사 Protocol ② 검사 결과 - 샘플 수: n=2(M001, M003) - 전체 negative |
| PCR based test | |
| (PRRS) Porcine reproductive and respiratory sydrome virus |
① 검사방법 - PCR 조건 - primer(first round): sense: 5'-ATGGCCAGCCAGTCAATCA-3' anti-sense: 5-TCGCCCTAATTGAATAGGTGA-3' - primer(second round): sense: 5'-CCAGTCAATCAGCTGTGCCA-3' anti-sense: 5-CGGATCAGGCGCACAGTATG-3' - product size: First PCR 433bp, second PCR 296bp - condition 94℃ 2min 94℃ 30sec, 54℃ 30sec, 68℃ 40sec (32cycle) 4℃ ∞ - sample: whole blood ② 검사 결과 - 샘플 수: n=2(M001, M003) - 검사결과 모든 검체에서 PRRS virus가 검출되지 않음 |
| Erysipelothrix Rhusiopathia |
① 검사방법 - PCR 조건 - primer: sense: 5'-CGATTATATTCTTAGCACGCAACG-3' anti-sense: 5-TGCTTGTGTTGTGATTTCTTGACG-3' - PCR product size: 937bp - condition 94℃ 2min 94℃ 30sec, 55℃ 30sec, 68℃ 40sec(32cycle) 4℃ ∞ - sample: skin swab ② 검사 결과 - 샘플 수: n=2(M001, M003) - 검사결과 모든 검체에서 Erysipelothrix rhusiopathiae가 검출되지 않음 |
| Bordetella bronchiseptica |
① 검사방법 - PCR조건 - primer: sense: 5'-TGCCGCCTGCCCTATC3' anti-sense: 5-AGGCYCCCAAGAGAGAAAGGCTT-3' - product size: 237bp - condition 94℃ 2min 94℃ 30sec, 53℃ 30sec, 68℃ 40sec (32cycle) 4℃ ∞ - sample: nasal swab ② 검사 결과 - 샘플 수: n=2(M001, M003) - 검사결과 모든 검체에서 Bordetella spp가 검출되지 않음 |
| Actinobacillus spp. | ① 검사방법 - PCR 조건 - primer: sense: 5'-GGGCCGATGAAACCTATTAAAATAGCT-3' anti-sense: 5-AGGCYCCCAAGAGAGAAAGGCTT-3' - product size: 422bp - condition 94℃ 2min 94℃ 30sec, 56℃ 30sec, 68℃ 40sec(32cycle) 4℃ ∞ - sample: nasal swab ② 검사 결과 -샘플 수: n=2(M001, M003) -검사결과 모든 검체에서 Actinobacillus spp.가 검출되지 않음 |
| MycoplasmaHyopneumonia | ① 검사방법 - PCR조건 - primer: sense: 5'-TGGCACTGACGGTGATGA-3' anti-sense: 5-GGGGACCGACTCAACCAT-3' - product size: 948bp - condition 94℃ 2min 94℃ 30sec, 55℃ 30sec, 68℃ 40sec(32cycle) 4℃ ∞ - sample: nasal swab ② 검사 결과 - 샘플 수: n=2(M001, M003) - 검사결과 모든 검체에서 Mycoplasma hyopneumoniae가 검출되지 않음 |
| Bacterial culture | |
| Salmonella spp. | ① 검사방법 - RV selective broth enrichment에서 증균한 다음 XLD agar 배지 ② 검사 결과 - 샘플 수: n=2(M001, M003) - 모든 검체에 salmonella로 추정되는 colony는 확인되지 않음 |
상기와 같이 실험군의 미니돼지에 대해 다양한 바이러스 및 박테리아 모니터링 시험을 수행한 결과 모든 모니터링 결과에서 이상이 나타나지 않았다.
이와 같이, 상기 프로바이오틱스 복합균을 활용하여 생산한 미니돼지는, 항산화 및 면역력이 우수하여 건강하게 성장할 수 있다. 또한, 본 실험에서의 실험군의 미니돼지는, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 프로바이오틱스 복합균을 활용하여 사양관리된 SPF실험동물임을 증명할 수 있다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 프로바이오틱스 복합균을 미니돼지의 사료에 첨가함으로써, 상기 상기 프로바이오틱스 복합균의 효용을 나타낼 수 있는 SPF실험동물로써 미니돼지를 사양관리할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명의 실험 결과(SPF 돼지장기 생산관리 실험)
다음으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균을 활용하여 생산한 실험의 실험군 수득물 2 개체의 심장, 허파, 간, 및 신장을 포함하는 주요 장기에서 나타나는 체성분을 검사하여 실험용 SPF돼지장기로써의 가치를 증명함을 목적으로 한다. 이 때, 상기 프로바이오틱스 복합균은, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 특수배지에서 60일 간 대량으로 배양된 상기 프로바이오틱스 복합균을 배지와 함께 동결건조 및 분말화하고, 그 분말을 실험군의 사료첨가제로 첨가하여 급이하였다.
이에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 프로바이오틱스 복합균의 상기 동결건조분말을 활용하여, 인공장기의 생산용으로써 유전자가 변이된 종을 사육하였을 경우 무균관리 및 면역력 측면에서 더욱 유리한 사양관리가 가능할 수 있다. 또한, 인간이 섭취하였을 경우 건강에 유효할 수 있는 기능성 식품으로써의 가치를 증명함을 부가적인 목적으로 한다.
도 33은 본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 복합균의 효용을 확인하기 위한 돼지장기 생산관리 실험 과정을 개략적으로 도시한다. 도 33(A)는 SPF미니돼지 생산실험의 실험군의 심장을 도시하고, 도 33(B)는 SPF미니돼지 생산실험의 실험군의 허파를 도시하고, 도 33(C)는 SPF미니돼지 생산실험의 실험군의 간을 도시하고, 도 33(D)는 SPF미니돼지 생산실험의 실험군의 콩팥을 도시한다.
전술한 SPF미니돼지 생산실험의 실험군 수득물 2 개체의 상기 주요 장기에 함유된 성분을 표 31, 표 32, 표 33, 및 표 34와 같이 분석하였다. 표 31은 실험군의 미니돼지의 장기 중 심장의 성분분석 결과를 개시하고, 표 32는 실험군의 미니돼지의 장기 중 허파의 성분분석 결과를 개시하고, 표 33은 실험군의 미니돼지의 장기 중 간의 성분분석 결과를 개시하고, 표 34는 실험군의 미니돼지의 장기 중 콩팥의 성분분석 결과를 개시한다. 각각의 영양성분은 100 g당 함량을 표시되어 있다.
| niacin | Natrium | protein | Carbohydrate | Retinol | Vitamin E |
| 66.75mg | 114.20mg | 21.07g | 0.08g | 0.15㎍ | 0.37mg |
| Vitamin A | Vitamin B1 | Vitamin B2 | Vitamin B6 | Vitamin C | Iron |
| 0.22㎍RE | 0.50㎍RE | 2.51mg | 0.63mg | 0.13mg | 5.92mg |
| Dietary Fiber | Zinc | Folic acid | Phosphorus | Lipid | Ge |
| 0.00g | 3.20mg | 25.41㎍ | 320.00mg | 4.00g | 0.12mg |
| Potassium | Calcium | Cholesterol | Ash | ||
| 250.22mg | 90.55mg | 175.00mg | 1.20g | ||
| 지방산 분석 Fatty acids analysis | |||||
| Omega-3 Fatty Acids: 3.8% min Omega-6 Fatty Acids: 0.7% min |
|||||
| 기능성 영양성분 분석 [EPA, DHA]: Nuritional analysis | |||||
| DHA | EPA | ||||
| 0.32 mg | 0.28 mg | ||||
| 콜레스테롤 함유량 분석 Cholesterol content analysis | |||||
| 175.00mg | |||||
| niacin | Natrium | protein | Carbohydrate | Retinol | Vitamin E |
| 4.32mg | 154.12mg | 17.80g | 0.05g | 0.12㎍ | 0.27mg |
| Vitamin A | Vitamin B1 | Vitamin B2 | Vitamin B6 | Vitamin C | Iron |
| 0.12㎍RE | 0.25mg | 0.60mg | 0.12mg | 15.40mg | 23.00mg |
| Dietary Fiber | Zinc | Folic acid | Phosphorus | Lipid | Ge |
| 0.00g | 2.58mg | 3.74㎍ | 255.00mg | 3.47g | 0.11mg |
| Potassium | Calcium | Cholesterol | Ash | ||
| 369.10mg | 11.00mg | 227.10mg | 0.80g | ||
| 지방산 분석 Fatty acids analysis | |||||
| Omega-3 Fatty Acids: 2.7% min Omega-6 Fatty Acids: 0.5% min |
|||||
| 기능성 영양성분 분석 [EPA, DHA]: Nuritional analysis | |||||
| DHA | EPA | ||||
| 0.40 mg | 0.17 mg | ||||
| 콜레스테롤 함유량 분석 Cholesterol content analysis | |||||
| 227.10mg | |||||
| niacin | Natrium | protein | Carbohydrate | Retinol | Vitamin E |
| 16.90mg | 76.10mg | 30.14g | 4.11g | 16,814.3㎍ | 0.53mg |
| Vitamin A | Vitamin B1 | Vitamin B2 | Vitamin B6 | Vitamin C | Iron |
| 14,675.4㎍RE | 0.42mg | 3.93mg | 0.95mg | 18.00mg | 26.00mg |
| Dietary Fiber | Zinc | Folic acid | Phosphorus | Lipid | Ge |
| 0.00g | 10.30mg | 341.00㎍ | 480.30mg | 5.20g | 0.10mg |
| Potassium | Calcium | Cholesterol | Ash | ||
| 428.00mg | 28.20mg | 253.30mg | 2.21g | ||
| 지방산 분석 Fatty acids analysis | |||||
| Omega-3 Fatty Acids: 3.2% min Omega-6 Fatty Acids: 1.0% min |
|||||
| 기능성 영양성분 분석 [EPA, DHA]: Nuritional analysis | |||||
| DHA | EPA | ||||
| 0.48 mg | 0.21 mg | ||||
| 콜레스테롤 함유량 분석 Cholesterol content analysis | |||||
| 253.30mg | |||||
| niacin | Natrium | protein | Carbohydrate | Retinol | Vitamin E |
| 76.30mg | 115.20mg | 30.15g | 2.14g | 0.23㎍ | 0.45mg |
| Vitamin A | Vitamin B1 | Vitamin B2 | Vitamin B6 | Vitamin C | Iron |
| 0.00㎍RE | 0.62mg | 2.90mg | 0.70mg | 0.13mg | 6.82mg |
| Dietary Fiber | Zinc | Folic acid | Phosphorus | Lipid | Ge |
| 0.00g | 3.20mg | 29.30㎍ | 370.44mg | 5.00g | 0.06mg |
| Potassium | Calcium | Cholesterol | Ash | ||
| 285.40mg | 121.05mg | 178.80mg | 1.70g | ||
| 지방산 분석 Fatty acids analysis | |||||
| Omega-3 Fatty Acids: 3.6% min Omega-6 Fatty Acids: 0.8% min |
|||||
| 기능성 영양성분 분석 [EPA, DHA]: Nuritional analysis | |||||
| DHA | EPA | ||||
| 0.47 mg | 0.17 mg | ||||
| 콜레스테롤 함유량 분석 Cholesterol content analysis | |||||
| 178.80mg | |||||
이와 같이, 상기 프로바이오틱스 복합균을 활용하여 생산한 미니돼지의 주요 장기는, 실험용 SPF돼지장기임을 증명할 수 있다. 또한, 상기 프로바이오틱스 복합균을 활용하여 생산한 미니돼지의 주요 장기는 항산화 및 면역력이 우수하여 인간이 섭취하였을 경우 건강에 유효할 수 있어 기능성 식품으로써 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 프로바이오틱스 복합균을 상기 미니돼지의 사료에 첨가함으로써, 상기 미니돼지의 심장, 허파, 간, 및 신장을 포함하는 주요 장기를 인간이 섭취할 수 있는 기능성 식품으로써 수득할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 미생물 각각에 대한 배양법을 토대로, 배양온도, 배지pH, 급기환경, 및 배지조성의 적정치를 산출함으로써, 초기배양액을 포함하는 제1배양액을 고르게 배양하는 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 동일한 배양환경에서 프로바이오틱스 복합균을 배양함으로써, 프로바이오틱스 복합균의 제조 공정이 비교적 단순해지는 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 고가의 표준 배양배지 성분을 대체재로 변경한 특수배지를 제공함으로써, 프로바이오틱스 복합균의 생산 원가를 낮출 수 있고, 프로바이오틱스 복합균을 대량으로 생산할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 프로바이오틱스 복합균을 닭의 사료에 첨가함으로써, 프로바이오틱스 복합균의 효용을 나타낼 수 있는 SPF양계산물로써 닭을 사양관리할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 프로바이오틱스 복합균을 산란계의 사료에 첨가함으로써, 프로바이오틱스 복합균의 효용을 나타낼 수 있는 SPF계란으로써 산란계의 계란을 사양관리할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 프로바이오틱스 복합균을 미니돼지의 사료에 첨가함으로써, 프로바이오틱스 복합균의 효용을 나타낼 수 있는 SPF실험동물로써 미니돼지를 사양관리할 수 있고, 미니돼지의 심장, 허파, 간, 및 신장을 포함하는 주요 장기를 인간이 섭취할 수 있는 기능성 식품으로써 수득할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.
이상과 같이 실시 예들이 비록 한정된 실시 예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등 물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다. 그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.
S1000: 초기배양준비단계
S2000: 배양단계
S2100: 단백질성분준비단계
S2200: 탄수화물성분준비단계
S2300: 이온화미네랄수용액준비단계
S2310: 비금속성암반준비단계
S2311: 암반파쇄단계 S2312: 암반세척단계
S2313: 암반건조단계 S2314: 암반소성단계
S2320: 모려준비단계
S2321: 모려세척단계 S2322: 불순물제거단계
S2323: 모려건조단계 S2324: 모려소성단계
S2325: 모려파쇄단계
S2330: 결정저밀도화단계
S2331: 재소성단계 S2332: 급랭단계
S2340: 나노파우더수득단계
S2341: 전기폭발단계 S2342: 비철금속선별단계
S2343: EMF탈철단계 S2344: 이온화교반단계
S2350: 수용성화단계
S2351: 정전기발생단계 S2352: 수용화습식교반단계
S2353: 미네랄이온수수득단계
S2360: 재가공단계
S2400: 미세조류미분말준비단계
S2410: 미세조류배양단계
S2410.1: 파피아 로도지마에 대한 미세조류배양단계
S2410.11: 뮤테이션촉진단계 S2410.12: 돌연변이주선별단계
S2410.13: 배지조성단계 S2410.14: 대량배양단계
S2410.2: 두나리엘라 샐리나에 대한 미세조류배양단계
S2410.21: 뮤테이션촉진단계 S2410.22: 돌연변이주선별단계
S2410.23: 배지조성단계 S2410.24: 대량배양단계
S2420: 미세조류포집단계 S2430: 오일추출단계
S2440: 분말가공단계 S2450: 분말혼합단계
S2500: 특수배지제조단계
S2600: 제1배양액접종단계
S2000: 배양단계
S2100: 단백질성분준비단계
S2200: 탄수화물성분준비단계
S2300: 이온화미네랄수용액준비단계
S2310: 비금속성암반준비단계
S2311: 암반파쇄단계 S2312: 암반세척단계
S2313: 암반건조단계 S2314: 암반소성단계
S2320: 모려준비단계
S2321: 모려세척단계 S2322: 불순물제거단계
S2323: 모려건조단계 S2324: 모려소성단계
S2325: 모려파쇄단계
S2330: 결정저밀도화단계
S2331: 재소성단계 S2332: 급랭단계
S2340: 나노파우더수득단계
S2341: 전기폭발단계 S2342: 비철금속선별단계
S2343: EMF탈철단계 S2344: 이온화교반단계
S2350: 수용성화단계
S2351: 정전기발생단계 S2352: 수용화습식교반단계
S2353: 미네랄이온수수득단계
S2360: 재가공단계
S2400: 미세조류미분말준비단계
S2410: 미세조류배양단계
S2410.1: 파피아 로도지마에 대한 미세조류배양단계
S2410.11: 뮤테이션촉진단계 S2410.12: 돌연변이주선별단계
S2410.13: 배지조성단계 S2410.14: 대량배양단계
S2410.2: 두나리엘라 샐리나에 대한 미세조류배양단계
S2410.21: 뮤테이션촉진단계 S2410.22: 돌연변이주선별단계
S2410.23: 배지조성단계 S2410.24: 대량배양단계
S2420: 미세조류포집단계 S2430: 오일추출단계
S2440: 분말가공단계 S2450: 분말혼합단계
S2500: 특수배지제조단계
S2600: 제1배양액접종단계
Claims (10)
- 프로바이오틱스 복합균의 대량생산방법으로서,
아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens), 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 및 클로스트리듐 브티리컴(Clostridium butyricum) 각각의 초기배양액을 포함하는 제1배양액을 준비하는 초기배양액준비단계; 및
상기 제1배양액을 단일의 특수배지에서 배양하는 배양단계;를 포함하고,
상기 특수배지는 가압열탕하여 화기건조한 돼지부산물의 미분말; 가압열탕하여 화기건조한 쌀겨의 미분말 및 밀겨의 미분말; 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma), 두나리엘라 샐리나(Dunaliella salina), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 및 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis)를 원재료로 하는 미세조류미분말; 이온화미네랄수용액 및 천일염; 및 물;을 혼합하여 제조되고,
상기 이온화미네랄수용액은 맥반석, 규석, 및 장석 중 1 이상을 포함하는 비금속성광물로부터 미네랄 성분을 획득하고 모려로부터 탄산칼슘 성분을 획득하여, 상기 미네랄 성분 및 상기 탄산칼슘 성분을 포함하는 미네랄복합체의 결정을 1500도씨 이상의 온도에서 소성하고 급랭시켜 결정을 저밀도화한 후, 전기폭발법에 의해 나노파우더로 변환하고, 상기 나노파우더로부터 불순물을 제거한 후에, 이를 수용화하여 제조되고,
상기 특수배지는 1L 당,
30.1 내지 36.8mg의 칼슘, 40.8 내지 49.9mg의 칼륨, 7.0 내지 8.6mg의 마그네슘, 4.2 내지 5.1mg의 나트륨, 15.0 내지 18.2mg의 규소, 71.3g 내지 87.1g의 단백질, 16.5 내지 20.2mg의 지방산, 5.1 내지 6.3mg의 이산화규소, 0.027 내지 0.033mg의 철, 0.441 내지 0.539mg의 게르마늄, 0.82 내지 1.00mg의 아연, 0.23 내지 0.28mg의 인, 22.5g 내지 27.5g의 탄수화물을 포함하고,
상기 배양단계에서는 섭씨 32도 ~ 섭씨 34도의 배양온도에서 상기 제1배양액이 상기 특수배지에서 배양되는, 프로바이오틱스 복합균의 대량생산방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 배양단계에서는 4% ~ 6%의 이산화탄소(CO2)가 급기되는 환경에서 상기 제1배양액이 상기 특수배지에서 배양되는, 프로바이오틱스 복합균의 대량생산방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 청구항 1에 있어서,
상기 미세조류미분말은,
파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma), 두나리엘라 샐리나(Dunaliella salina), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 및 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis)의 네 미세조류 균주를 배지에서 대량으로 배양하는 미세조류배양단계;
배양된 미세조류를 배지로부터 분리하여 포집하는 미세조류포집단계;
미세조류를 압착하여 오일 성분을 추출하는 오일추출단계;
오일추출 후의 미세조류를 분쇄하는 분말가공단계; 및
상기 분말가공단계를 거친 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma), 두나리엘라 샐리나(Dunaliella salina), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 및 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis)의 네 미세조류 분말을 혼합하는 분말혼합단계;를 통해 제조되고,
상기 미세조류배양단계, 상기 미세조류포집단계, 상기 오일추출단계 및 상기 분말가공단계는 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma), 두나리엘라 샐리나(Dunaliella salina), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 및 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis)의 네 미세조류에 대해 각각 수행되는, 프로바이오틱스 복합균의 대량생산방법.
- 프로바이오틱스 복합균의 대량생산을 하기 위한 특수배지로서,
상기 특수배지는 가압열탕하여 화기건조한 돼지부산물의 미분말; 가압열탕하여 화기건조한 쌀겨의 미분말 및 밀겨의 미분말; 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma), 두나리엘라 샐리나(Dunaliella salina), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 및 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis)를 원재료로 하는 미세조류미분말; 이온화미네랄수용액 및 천일염; 및 물;을 혼합하여 제조되고,
상기 이온화미네랄수용액은 맥반석, 규석, 및 장석 중 1 이상을 포함하는 비금속성광물로부터 미네랄 성분을 획득하고 모려로부터 탄산칼슘 성분을 획득하여, 상기 미네랄 성분 및 상기 탄산칼슘 성분을 포함하는 미네랄복합체의 결정을 1500도씨 이상의 온도에서 소성하고 급랭시켜 결정을 저밀도화한 후, 전기폭발법에 의해 나노파우더로 변환하고, 상기 나노파우더로부터 불순물을 제거한 후에, 이를 수용화하여 제조되고,
상기 특수배지는 1L 당,
30.1 내지 36.8mg의 칼슘, 40.8 내지 49.9mg의 칼륨, 7.0 내지 8.6mg의 마그네슘, 4.2 내지 5.1mg의 나트륨, 15.0 내지 18.2mg의 규소, 71.3g 내지 87.1g의 단백질, 16.5 내지 20.2mg의 지방산, 5.1 내지 6.3mg의 이산화규소, 0.027 내지 0.033mg의 철, 0.441 내지 0.539mg의 게르마늄, 0.82 내지 1.00mg의 아연, 0.23 내지 0.28mg의 인, 22.5g 내지 27.5g의 탄수화물을 포함하고,
아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens), 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 및 클로스트리듐 브티리컴(Clostridium butyricum) 각각의 초기배양액을 포함하는 제1배양액이 단일의 상기 특수배지에서 배양될 수 있는, 프로바이오틱스 복합균의 대량생산을 하기 위한 특수배지. - 삭제
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200026278A KR102111669B1 (ko) | 2020-03-03 | 2020-03-03 | 프로바이오틱스 복합균의 대량생산을 하기 위한 특수배지 및 이를 이용한 프로바이오틱스 복합균 대량생산방법 |
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| KR1020200026278A KR102111669B1 (ko) | 2020-03-03 | 2020-03-03 | 프로바이오틱스 복합균의 대량생산을 하기 위한 특수배지 및 이를 이용한 프로바이오틱스 복합균 대량생산방법 |
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|---|---|
| KR102111669B1 true KR102111669B1 (ko) | 2020-05-15 |
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|---|---|
| KR (1) | KR102111669B1 (ko) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110591941A (zh) * | 2019-08-29 | 2019-12-20 | 甘肃省科学院生物研究所 | 对有机磷具有高效降解作用的枯草芽孢杆菌及其制备方法 |
| CN114431476A (zh) * | 2022-02-28 | 2022-05-06 | 山东拜因诺生物科技有限公司 | 一种女士专用益生菌 |
| CN116616367A (zh) * | 2023-02-17 | 2023-08-22 | 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) | 干酪乳杆菌在制备增强鱼抗寒能力的制剂中的应用 |
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| KR101604633B1 (ko) * | 2015-08-28 | 2016-03-18 | 주식회사 락토메이슨 | 유산균 배지 조성물 및 이를 이용한 유산균 분말의 제조 방법 |
| KR101608735B1 (ko) * | 2014-09-01 | 2016-04-04 | 최일현 | 유용 및 기능성미생물을 이용한 미생물균질추출물 및 그 제조방법 |
-
2020
- 2020-03-03 KR KR1020200026278A patent/KR102111669B1/ko active IP Right Grant
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| CN116616367B (zh) * | 2023-02-17 | 2024-05-17 | 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) | 干酪乳杆菌在制备增强鱼抗寒能力的制剂中的应用 |
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