KR102095140B1 - Ctla4 결합제 - Google Patents

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브루노 돔브레히트
표른 빅토어
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Abstract

본 발명은 CTLA4 또는 인간 혈청 알부민에 결합하는 분자, 예컨대 ISVD 및 나노바디를 제공한다. 이들 분자는 이러한 분자가 투여된 대상체의 신체 내에서 선재하는 항체에 의한 결합의 발생을 저하시키도록 조작되었다. 상기 분자를 사용하여 면역 반응을 증가시키는 방법, 암을 치료하는 방법 및/또는 감염성 질환을 치료하는 방법이 제공된다.

Description

CTLA4 결합제
본 출원은 2015년 11월 18일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/257,001의 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
컴퓨터로 판독가능한 포맷의 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록은 그 전문이 참조로 포함된다. 이러한 서열 목록을 함유하는 파일은 파일명이 "24237WOPCTSEQ"인 2016년 11월 15일에 생성된 100 kb ASCII 텍스트 파일이다.
발명의 분야
본 발명은, 부분적으로, 세포독성 T-림프구-연관 단백질 4 ("CTLA4"), 예를 들어, 인간 CTLA4에 결합하는 아미노산 서열 및 폴리펩티드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 부분적으로, CTLA4에 결합하는 개선된 중쇄 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 ("ISV" 또는 "ISVD"로서 본원에 지칭되기도 함) 뿐만 아니라 이러한 ISVD를 포함하는 단백질, 폴리펩티드 및 다른 구조물, 화합물, 분자 또는 화학적 실체에 관한 것이다. 본 발명의 다른 측면, 실시양태, 특징, 용도 및 이점은 본원에서의 개시내용에 근거하여 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
면역 조절 분자, 예컨대 세포독성 T 림프구 항원 4 (CTLA-4)를 폐기하는 것은 종양 퇴행을 유도하고, 질환을 안정화시키고, 면역 체계의 조작에 의해 생존을 연장시키는 새롭고 유망한 전략을 나타낸다. 항-CTLA-4 항체인 이필리무맙은 현재 흑색종을 포함한 적응증을 위해 판매되고 있다. CTLA-4 항체를 투여받은 흑색종 환자에게서 진행 시간이 길어지는 종양 퇴행의 증거가 나타났었고, 흑색종, 난소암, 전립선암 및 신세포암 환자에게 이필리무맙을 사용한 경우에 지속적인 반응이 관찰되었다.
완전한 T-세포 활성화에는 2개의 신호가 필요하다. 첫 번째 신호는 주요 조직 적합성 복합체 I 및 II를 통해 항원 제시 세포 (APC)에 의해 제시된 종양 관련 항원에 결합하는 T-세포 수용체에 의해 개시된다. 두 번째 신호는 T 세포 상의 주요 공동-자극성 수용체인 CD28이 APC 상의 B7 리간드 하위유형 CD80 및 CD86에 결합할 때 생성된다. 이로써 생성되는 이중 신호전달은 T-세포 증식과 시토카인 방출, 면역 반응 촉발에 이어 면역 반응 증폭을 포함한 변화를 유도시킨다. T 세포 활성화에 반응하여, CTLA-4는 상향 조절되고 APC 상에서의 CD80 및 CD86 결합을 놓고 CD28과 경쟁하지만 상당히 더 높은 친화도를 가지므로 T 세포를 하향 조절하거나 또는 탈활성화시킨다 (도 1). 따라서, CTLA-4는 T 세포 반응 및 APC 기능을 하향 조절하여, 종양 관련 항원 및 면역 관용에 대한 면역 반응을 감소시킨다.
CTLA4 및 PD1이 T-세포 활성화에 대한 그의 억제 효과를 발휘하는 기전은 다각적이다. CTLA4는 주로 T-세포 활성화 및 클로날 확장을 제한하는 기능을 하는 반면, PD1은 주로 말초 조직에서 이펙터 T-세포 기능을 제한하는 기능을 한다. 그들의 뚜렷이 구별되는 분자 구조, 조절, 신호전달 경로, 리간드 분포, 및 Treg 및 다른 면역 세포에 대한 기능은 CTLA4와 PD1의 조합된 치료적 차단이 항-종양 면역을 중재하는데 상승 작용할 수 있었다는 것을 암시한다 (Intlekofer & Thompson, J. Leuko. Biol. 94(1): 25-39 (2013); Hurwitz et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10067-10071 (1998); Parry et al. Mol. Cell. Biol. 25(21): 9543-9553 (2005); Callahan et al. Front. Oncol. Vol 4, Art. 385 (2015)).
CTLA4-매개된 하향 조절을 억제하는 하나의 방법은 그것을 나노바디(Nanobody)와 결합시킴으로써 그의 리간드와의 상호 작용을 방해하는 것이다. 라마에서 유래된 나노바디는, 예를 들어, 환자의 혈청에 존재하는 선재하는 항체에 의한 나노바디의 결합에 의해 원치 않는 항-약물 면역 반응을 유발시킬 수 있는 가능성이 존재한다. 따라서, 그러한 반응을 감소시키거나 또는 제거하도록 나노바디를 인간화하는 신규 방법은 이러한 방법에 의해 창출되는 나노바디와 마찬가지로 특별한 가치가 있다.
본 발명은 하기 잔기 VRVTVL (서열식별번호(SEQ ID NO): 110의 아미노산 33 - 38), ADSQVTEVC (서열식별번호: 110의 아미노산 41-49) 및 CKVELMYPPPYYLG (서열식별번호: 110의 아미노산 93-106) 중 1개 이상, 예를 들어, 모든 3개 부위에서 인간 CTLA4와 접촉함으로써 인간 CTLA4에 결합하는 다중특이적 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD), 예컨대 나노바디를 제공한다. 예를 들어, 상기 결합제는 상기 잔기가 중수소 공급원, 예컨대 D2O의 존재 하에 수소-중수소 교환하지 못하게 한다. 본 발명의 한 실시양태에서, ISVD는 인간 CTLA4에 결합하여, 본질적으로 도 13에 제시된 바와 같은 결합 히트 맵 (예를 들어, 수소-중수소 교환 검정에서 생성된 바와 같음)을 생성시킨다.
본 발명은 또한, 아미노산 서열 FYGMG (서열식별번호: 2의 아미노산 6-10) 또는 GGTFSFYGMG (서열식별번호: 2)를 포함하는 CDR1; 아미노산 서열 DIRTSAGRTYYADSVKG (서열식별번호: 3) 또는 DIRTSAGRTY (서열식별번호: 3의 아미노산 1-10)를 포함하는 CDR2; 아미노산 서열 EXSGISGWDY (서열식별번호: 4)을 포함하는 CDR3을 포함하는, 인간 CTLA4에 결합하는 1개 이상 (예를 들어, 2개)의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD)을 포함하는 CTLA4 결합제를 제공하며; 임의적으로, 여기서 ISVD는 잔기 11 및 89에서의 돌연변이를 포함하며 (예를 들어, L11V 및/또는 V89L, 예를 들어 (E1D, L11V, A14P, Q45R, A74S, K83R, V89L, M96P, Q108L), 여기서 상기 잔기 번호는 카바트(Kabat) 잔기 번호이다.
본 발명은 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예를 들어, 나노바디)를 제공하며, 여기서 상기 CTLA4 결합제는 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열에 대하여 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 이러한 적어도 하나의 돌연변이는 11, 89, 110 및 112로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 있고, 이러한 위치는 카바트에 따라서 넘버링되며; 임의적으로, 본원 또는 다른 곳에 제시되는 임의의 수의 부가 돌연변이, 예를 들어 10개 이하 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개) 부가 돌연변이 (예를 들어, 점 돌연변이, 치환, 결실, 삽입)를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, CDR1은 아미노산 서열: FYGMG (서열식별번호: 2) 또는 GGTFSFYGMG (서열식별번호: 5)을 포함하고; CDR2는 아미노산 서열: DIRTSAGRTYYADSVKG (서열식별번호: 3) 또는 DIRTSAGRTY (서열식별번호: 6)을 포함하며; CDR3은 아미노산 서열: EMSGISGWDY (서열식별번호: 4)을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제는 서열식별번호: 1과 비교하여 돌연변이를 가지며, 여기서 위치 11에서의 아미노산 잔기는 L 또는 V로부터 선택되고/거나; 위치 89에서의 아미노산 잔기는 T, V 또는 L로부터 적합하게 선택되고/거나; 위치 110에서의 아미노산 잔기는 T, K 또는 Q로부터 적합하게 선택되고/거나; 위치 112에서의 아미노산 잔기는 S, K 또는 Q로부터 적합하게 선택되며; 예를 들어, 여기서 상기 돌연변이는 89T; 11V와 조합한 89L; 110K 또는 110Q와 조합한 89L; 112K 또는 112Q와 조합한 89L; 11V 및 110K 또는 110Q와 조합한 89L; 11V 및 112K 또는 112Q와 조합한 89L; 110K 또는 110Q와 조합한 11V; 및/또는 112K 또는 112Q와 조합한 11V이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 위치 11, 89, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 표 B에 제시된 바와 같다. 본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제는 서열식별번호: 1과 비교하여 위치 1, 14, 45, 74, 83 및/또는 108에 1개 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산의 C-말단 연장을 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 C-말단 연장은 식 -X(n)을 가지며, 여기서 X 및 n은 하기와 같다: (a) n = 1 및 X = Ala; (b) n = 2 및 각각의 X = Ala; (c) n = 3 및 각각의 X = Ala; (d) n = 2 및 적어도 1개의 X = Ala (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 자연적으로 발생하는 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨); (e) n = 3 및 적어도 1개의 X = Ala (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 자연적으로 발생하는 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨); (f) n = 3 및 적어도 2개의 X = Ala (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 자연적으로 발생하는 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨); (g) n = 1 및 X = Gly; (h) n = 2 및 각각의 X = Gly; (i) n = 3 및 각각의 X = Gly; (j) n = 2 및 적어도 1개의 X = Gly (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 자연적으로 발생하는 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨); (k) n = 3 및 적어도 1개의 X = Gly (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 자연적으로 발생하는 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨); (l) n = 3 및 적어도 2개의 X = Gly (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 자연적으로 발생하는 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨); (m) n = 2 및 각각의 X = Ala 또는 Gly; (n) n = 3 및 각각의 X = Ala 또는 Gly; (o) n = 3 및 적어도 1개의 X = Ala 또는 Gly (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 자연적으로 발생하는 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨); 또는 (p) n = 3 및 적어도 2개의 X = Ala 또는 Gly (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 자연적으로 발생하는 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨). 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, C-말단 연장은 A, AA, AAA, G, GG, GGG, AG, GA, AAG, AGG, AGA, GGA, GAA 또는 GAG이다. 본 발명은 서열식별번호: 8-43으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85% (예를 들어, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)를 포함하며, 여기서 이러한 CTLA4 결합제 또는 ISVD는 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 상기 CTLA4 결합제 또는 ISVD는 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열에 대하여 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며, 이러한 적어도 하나의 돌연변이는 11, 89, 110 및 112로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 있고, 상기 위치는 카바트에 따라서 넘버링된다. 본 발명은 또한, 서열식별번호: 9-40으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 결합제, ISVD, 나노바디 또는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한, CTLA4 결합 모이어티에 결합하는 에피토프가 아닌 에피토프 (예를 들어, PD1, CTLA4, LAG3, BTLA 및/또는 CD27)에 결합하는 하나 이상의 분자와 연결되는 CTLA4에 결합하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)를 포함하는 다중특이적 결합제를 제공한다.
본 발명은 또한, 추가 치료제와 연합되는 임의의 상기 CTLA4 결합제, 폴리펩티드, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD) 또는 다중특이적 결합제를 제공한다.
본 발명은 또한, 임의적으로 추가 치료제와 연합되는 CTLA4 결합제, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD), 나노바디, 폴리펩티드 또는 다중특이적 결합제를 포함하는 주사 장치 (예를 들어, 피하 주사 바늘 및 주사기) 또는 용기를 제공한다.
본 발명은 또한, 예를 들어, 벡터 내에 있는, CTLA4 결합제, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD), 나노바디, 폴리펩티드 또는 다중특이적 결합제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포 [예를 들어, CHO 세포 또는 피키아 (Pichia) 세포]를 제공한다.
본 발명은 또한, CTLA4 결합제, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD), 나노바디, 폴리펩티드 또는 다중특이적 결합제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포 또는 피키아 세포) 내로 도입하는 것 및 숙주 세포를 상기 폴리뉴클레오티드로부터의 상기 이뮤노글로불린의 발현에 유리한 조건 하에 배지에서 배양하는 것, 및 임의적으로, 상기 숙주 세포 및/또는 상기 배지로부터 이뮤노글로불린을 정제하는 것을 포함하는, CTLA4 결합제, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD), 나노바디, 폴리펩티드 또는 다중특이적 결합제를 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에 의해 생산된 임의의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD), 나노바디, 폴리펩티드, 다중특이적 결합제 또는 CTLA4 결합제.
본 발명은 또한, CTLA4를 임의적으로 추가 치료제와 연합된 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD), 나노바디, 폴리펩티드, 다중특이적 결합제 또는 CTLA4 결합제와 접촉시키는 것을 포함하는, T-세포 상의 CTLA4가 항원 제시 세포 상의 CD80 및/또는 CD86에 결합하는 것을 방지하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD), 나노바디, 폴리펩티드, 다중특이적 결합제 또는 CTLA4 결합제의 유효량을 임의적으로 추가 치료제와 연합하여 특정 대상체 (예를 들어, 포유류, 예컨대 인간)에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체의 신체 내에서 면역 반응을 증강시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD), 나노바디, 폴리펩티드, 다중특이적 결합제 또는 CTLA4 결합제의 유효량을 임의적으로 추가 치료제와 연합하여 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체의 신체 내에서 암 또는 감염성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 암은 전이성 암, 고형 종양, 혈액암, 백혈병, 림프종, 골육종, 횡문근육종, 신경모세포종, 신장암, 백혈병, 신장 이행 세포암, 방광암, 윌름스 암, 난소암, 췌장암, 유방암, 전립선암, 골암, 폐암, 비소세포 폐암, 위암, 결장직장암, 자궁경부암, 활막 육종, 두경부암, 편평 세포 암종, 다발성 골수종, 신세포암, 망막모세포종, 간모세포종, 간세포성 암종, 흑색종, 신장의 횡문근양 종양, 유잉 육종, 연골육종, 뇌암, 교모세포종, 수막종, 뇌하수체 선종, 전정 슈반세포종, 원시 신경외배엽 종양, 수모세포종, 성상세포종, 역형성 성상세포종, 핍지교종, 상의세포종, 맥락총 유두종, 진성 다혈구혈증, 혈소판혈증, 특발성 골수섬유증, 연부 조직 육종, 갑상선암, 자궁내막암, 카르시노이드 암 또는 간암, 유방암 또는 위암이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 감염성 질환은 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 진균 감염이다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 대상체는 추가 치료제 또는 치료 절차를 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD), 나노바디, 폴리펩티드, 다중특이적 결합제 또는 CTLA4 결합제와 연합하여 투여받는다.
본 발명은 하기 잔기: VRVTVL (서열식별번호: 110의 아미노산 33 - 38), ADSQVTEVC (서열식별번호: 110의 아미노산 41-49) 및 CKVELMYPPPYYLG (서열식별번호: 110의 아미노산 93-106) 중 하나 이상에서 인간 CTLA4를 접촉시킴으로써 인간 CTLA4에 결합하는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD)을 포함하는 CTLA4 결합제 (예를 들어, 다가 결합제)를 제공하며; 여기서 ISVD는 잔기 11 (예를 들어, L11V) 및 89 (예를 들어, V89L)에서의 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 잔기 번호는 카바트 잔기 번호이다.
본 발명은 또한, 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하지만 E1, L11, A14, Q45, A74, N73, K83, V89, M96 또는 Q108L로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함하며 (예를 들어, E1D, L11V, A14P, Q45R, A74S, N73X (여기서 X는 S, V, G, R, Q, M, H, T, D, E, W, F, K, A, Y 또는 P임), K83R, V89L, M96P, Q108L), 여기서 상기 잔기 번호는 카바트 잔기 번호인, CTLA4에 결합하는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD)을 포함하고; 임의적으로, 반감기 연장제 (예를 들어, ALB11002) 및/또는 C-말단 연장제 (예를 들어, 알라닌)를 포함하는 CTLA4 결합제 (예를 들어, 다가 결합제)를 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, ISVD는 아미노산 서열: XVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFSFYGMG
WFRQAPGKEREFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAEPSGISGWDYWGQGTLVTVSS (여기서 X는 D 또는 E임) (서열식별번호: 60)을 포함하며; 임의적으로 반감기 연장제 (예를 들어, ALB11002) 및/또는 C-말단 연장제 (예를 들어, 알라닌)를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제는 서열식별번호: 93-109로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 임의적으로 그의 아미노산 AAADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGAAHHHHHH이 결여된 ISVD를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제는 서열식별번호: 60에 제시된 아미노산 서열 (여기서 X는 D 또는 E임)을 포함하는, CTLA4에 결합하는 ISVD; 펩티드 링커 (예를 들어, GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 65)); 서열식별번호: 60에 제시된 아미노산 서열 (여기서 X는 D 또는 E임)을 포함하는, CTLA4에 결합하는 ISVD; 펩티드 링커; 반감기 연장제; 및, 임의적으로, C-말단 연장 알라닌을 포함하거나; 또는 CTLA4 결합제는 서열식별번호: 60에 제시된 아미노산 서열 (여기서 X는 D 또는 E임)을 포함하는, CTLA4에 결합하는 ISVD; 펩티드 링커; 반감기 연장제; 및, 임의적으로, C-말단 연장 알라닌을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFSFYGMG
WFRQAPGKEREFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYY
CAAEPSGISGWDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSE
VQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEREFVADIRTSAGRTYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAEPSGISGWDYWGQGTLVTVSSGG
GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGF
TFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLR
PEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA (서열식별번호: 62); 또는
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFSFYGMG
WFRQAPGKEREFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYY
CAAEPSGISGWDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSE
VQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYA
DSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA (서열식별번호: 64).
본 발명은 또한, 본원에 제시된 CTLA4 결합제가 CTLA4에 결합하는 것을 교차-차단하는 결합제 (예를 들어, 항체)를 제공한다.
본 발명은 또한, 본원에 제시된 임의의 CTLA4 결합제 (예를 들어, 서열식별번호: 62 또는 64에 제시된 아미노산 서열을 포함함)를 임의적으로 추가 치료제와 연합하여 포함하는 주사 장치 또는 용기를 제공한다.
본 발명은 또한, 본원에 제시된 임의의 CTLA4 결합제 (예를 들어, 서열식별번호: 62 또는 64에 제시된 아미노산 서열을 포함함)를 코딩하고, 예를 들어 서열식별번호: 61 또는 63의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA); 또는 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 또는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 본원에 제시된 CTLA4 결합제 (예를 들어, 서열식별번호: 62 또는 64에 제시된 아미노산 서열을 포함함)를 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포 또는 피키아 세포) 내로 도입하는 것 및 숙주 세포를 상기 폴리뉴클레오티드로부터의 상기 CTLA4 결합제의 발현에 유리한 조건 하에 배지에서 배양하는 것, 및 임의적으로, 상기 숙주 세포 및/또는 상기 배지로부터 CTLA4 결합제를 정제하는 것을 포함하는, 상기 CTLA4 결합제를 제조하는 방법 뿐만 아니라 이러한 방법에 의해 생산된 임의의 CTLA4 결합제를 제공한다.
본 발명은 또한, CTLA4를 임의적으로 추가 치료제와 연합된 CTLA4 결합제 (예를 들어, 서열식별번호: 62 또는 64에 제시된 아미노산 서열을 포함함)와 접촉시키는 것을 포함하는, CTLA4가 CD80 또는 CD86에 (예를 들어, 대상체의 신체 내에서) 결합하는 것을 방지하는 방법; 뿐만 아니라 CTLA4 결합제 (예를 들어, 서열식별번호: 62 또는 64에 제시된 아미노산 서열을 포함함)의 유효량을 추가 치료제 [예를 들어, 펨브롤리주맙]와 임의적으로 연합하여 특정 대상체 (예를 들어, 인간)에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체의 신체 내에서 면역 반응을 증강시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 CTLA4 결합제 (예를 들어, 서열식별번호: 62 또는 64에 제시된 아미노산 서열을 포함함)의 유효량을 추가 치료제 (예를 들어, 펨브롤리주맙)와 임의적으로 연합하여 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체의 신체 내에서 암 또는 감염성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 암은 전이성 암, 고형 종양, 혈액암, 백혈병, 림프종, 골육종, 횡문근육종, 신경모세포종, 신장암, 백혈병, 신장 이행 세포암, 방광암, 윌름스암, 난소암, 췌장암, 유방암, 전립선암, 골암, 폐암, 비소세포 폐암, 위암, 결장직장암, 자궁경부암, 활막 육종, 두경부암, 편평 세포 암종, 다발성 골수종, 신세포암, 망막모세포종, 간모세포종, 간세포성 암종, 흑색종, 신장의 횡문근양 종양, 유잉 육종, 연골육종, 뇌암, 교모세포종, 수막종, 뇌하수체 선종, 전정 슈반세포종, 원시 신경외배엽 종양, 수모세포종, 성상세포종, 역형성 성상세포종, 핍지교종, 상의세포종, 맥락총 유두종, 진성 다혈구혈증, 혈소판혈증, 특발성 골수섬유증, 연부 조직 육종, 갑상선암, 자궁내막암, 카르시노이드 암 또는 간암, 유방암 또는 위암이거나; 또는 감염성 질환은 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 진균 감염이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 대상체에게 추가 치료제 (예를 들어, 펨브롤리주맙) 또는 치료 절차를 상기 CTLA4 결합제와 연합하여 투여한다.
도 1. 본원에 구체적으로 지칭될 일부 아미노산 위치 및 일부 대체 넘버링 시스템 (예컨대 Aho 및 IMGT)에 따르는 그들의 넘버링을 열거한 표.
도 2. CTLA4 결합제 서열.
도 3 (a-b). 11F1 서열과 서열식별번호: 8-43의 서열의 정렬.
도 4. 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO N-연결된 글리칸) 및 조작된 효모 세포 (조작된 효모 N-연결된 글리칸)에서 생산된 모노클로날 항체에 대한 우세 N-연결된 글리칸: 사각형: N-아세틸글루코사민 (GlcNac); 원형: 만노스 (Man); 다이아몬드: 갈락토스 (Gal); 삼각형: 푸코스 (Fuc).
도 5 (a-b). hCTLA4를 발현하는 (a) Jurkat 및 (b) CHO-K1 세포에 대한 나노바디 F023700912, F023700925 또는 대조군 나노바디 (IRR00051; 항-HER2/ERBB2 (알부민 결합제와 연결된 35GS를 수반한 2가 항-HER2)) 결합의 bFACS 분석.
도 6 (a-b). CHO-K1 세포 상에서 발현된 인간 CTLA4와의 결합을 놓고 나노바디 F023700912 또는 이필리무맙과 (a) CD80 또는 (b) CD86 간의 경쟁.
도 7 (a-h). BTLA, CD8, PD1, CTLA4, LAG3, CD28 또는 대조군 세포와의 결합에 대한 나노바디 F023700912, F023700925 또는 대조군 나노바디 (IRR00051)의 특이성 평가. (a) 음성 대조군 L 세포, (b) 음성 대조군 CHO-K1 세포, (c) huCD28+ L 세포, (d) huCD8알파+ L 세포, (e) huLAG-3+ CHO-K1 세포, (f) huBTLA+ CHO-K1 세포, (g) huCTLA-4+ CHO-K1 세포, 및 (h) huPD-1+ CHO-K1 세포에 대한 상기 나노바디의 결합이 결정되었다.
도 8 (a-b). CHO-K1 세포 상에 발현된 인간 CTLA-4와의 결합을 놓고 나노바디 F023700906, F023701051, F02371054 또는 F023701061과 (a) 인간 CD80 또는 (b) 인간 CD86 간의 경쟁.
도 9 (a-j). 인간화 마우스에서 panc 08.13 종양에 대한 나노바디 효과. 이소형 대조군, 이필리무맙 (N297A), 이필리무맙, 펨브롤리주맙, 이필리무맙 + 펨브롤리주맙, 5 mpk 투여량 하의 F023700912 (CTLA4 Nab-5), 15 mpk 투여량 하의 F023700912 (CTLA4 Nab-15), 또는 펨브롤리주맙 + CTLA4 Nab-15로 처리된 마우스에서 (a) 평균 종양 용적 ± SEM 및 (b) 제37일에 개별 종양 용적; 및 (c) 이소형 대조군 항체, (d) 이필리무맙 (N297A), (e) 이필리무맙, (f) 펨브롤리주맙, (g) 이필리무맙 + 펨브롤리주맙, (h) CTLA4 Nab-5, (i) CTLA4 Nab-15 또는 (j) CTLA4 Nab-15 + 펨브롤리주맙으로 처리된 마우스에서 실험 과정 전반에 걸친 개별 마우스 내에서의 종양 용적.
도 10 (a-b). (a) 건강한 인간 대상체 혈청 및 (b) 암 환자 혈청에 의한 F023700912 및 F023700925 및 3가 대조군 나노바디 T013700112 (선재하는 항체 결합을 저하시키기 위한 돌연변이가 결여됨)에 대한 혈청 프리Ab 반응성.
도 11. CTLA4 결합제 구조물.
도 12. CTLA4 결합제 서열.
도 13. F023700912 CTLA4 결합제에 의한 인간 CTLA4 결합의 중수소 표지화 차이 히트맵.
본 발명은 ISVD 내의 네오-에피토프에 대한 선재하는 항체 (프리-항체)의 반응성을 차단하는 돌연변이를 포함하는 ISVD를 제공한다. 네오에피토프는 특정 단백질이 돌연변이되거나 (예를 들어, 말단절단되거나) 또는 그의 폴딩이 변경될 때 밝혀지는 상기 단백질 내의 에피토프이다. 선재하는 항체는 ISVD를 받기 전에 환자의 체내에 존재하는 항체이다. 본 발명의 ISVD는, 부분적으로, 그의 C-말단 불변 도메인이 제거되었으므로; 이로써 생성되는 VHH의 C-말단 내의 네오에피토프가 프리-항체 결합에 노출되는 라마 항체에 근거한다. 잔기 11의 돌연변이와 89의 돌연변이의 조합 (예를 들어, L11V와 I89L 또는 V89L)이 프리-항체 결합의 놀라운 결여를 초래하였다는 사실이 밝혀졌다. 잔기 112 내의 돌연변이가 또한, 프리-항체 결합을 현저하게 저하시킨 것으로 밝혀졌다. 부이세(Buyse) & 부통(Boutton) (WO2015/173325)은 L11V와 V89L 돌연변이의 조합이 L11V 돌연변이 단독 또는 V89L 돌연변이 단독과 비교해서 프리-항체 결합을 저하시키는데 있어서 현저한 개선을 제공하였다는 것을 보여주는 데이터를 포함하였다. 예를 들어, 97면의 부이세 & 부통의 표 H는 V89L 돌연변이 단독을 수반한 ISVD (C-말단 연장을 수반하거나 또는 수반하지 않음); 및 V89L 돌연변이를 L11V 돌연변이와 조합하여 수반한 동일한 ISVD (또한, C-말단 연장을 수반하거나 또는 수반하지 않음)에 대한 비교되는 데이터를 나타내었다. 또한, 두 가지 별도의 실험에서 생성되긴 하였지만, (동일한 ISVD에서) L11V 돌연변이 단독에 대하여 표 B에 제공된 데이터와 비교해서 L11V/V89L 조합에 대하여 표 H에 나타낸 데이터는, L11V/V89L 조합에 의해 수득되는 프리-항체 결합 저하가 L11V 돌연변이 단독에 대한 것보다 더 컸다는 것을 보여주었다. 라마 항체 스캐폴드 구조가 매우 고도로 보존되는 것으로 공지되기 때문에, 위치 11 및 89에서의 돌연변이의 효과는 어떠한 ISVD에 대해서도 존재할 가능성이 매우 높다. 실제로, 그러한 효과는 매우 낮은 수준의 프리-항체 결합을 나타내는 것으로 밝혀진 본 발명의 결합제인 F023700912 및 F023700925을 사용한 경우에 도 10에서 입증되었다.
본 출원에서, 이뮤노글로불린 중쇄 가변 도메인 내의 아미노산 잔기/위치는 카바트에 따르는 넘버링으로 표시될 것이다. 편의상, 도 1은 본원에 구체적으로 지칭될 일부 아미노산 위치 및 일부 대체 넘버링 시스템 (예컨대 Aho 및 IMGT. 주: 달리 명료하게 표시되지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위의 경우, 카바트 넘버링이 결정적이고; 다른 넘버링 시스템은 단지 참조용으로 제공됨)에 따르는 그들의 넘버링을 열거한 표를 제공한다.
관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 바와 같이, CDR과 관련해서는, VH 또는 VHH 단편의 CDR을 정의하고 설명하기 위한 여러 규칙, 예컨대 카바트 정의 (이는 서열 가변성에 근거하고 가장 흔하게 사용되고 있음) 및 코티아(Chothia) 정의 (이는 구조적 루프 영역의 위치에 근거함)가 있다. 예를 들어, 웹사이트 www.bioinf.org.uk/abs/를 참조할 수 있다. 본 명세서 및 청구범위의 목적상, 카바트에 따르는 CDR이 또한 언급될 수 있다 하더라도, CDR은 Abm 정의 [이는 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 근거한다]을 기준으로 하여 가장 바람직하게 정의되며, 이는 카바트 정의와 코티아 정의 간의 최적의 절충안인 것으로 간주되기 때문이다. 또한 웹사이트 www.bioinf.org.uk/abs/를 참조할 수 있다. 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5th ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917 or Chothia, et al., (1989) Nature 342:878-883; Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Elvin A. Kabat, Tai Te Wu, Carl Foeller, Harold M. Perry, Kay S. Gottesman (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest; Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg)]을 참조한다. 본 발명의 한 실시양태에서, CDR 결정은 카바트에 따르며, 예를 들어, 여기서 VHH의 FR1은 위치 1-30에서의 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 CDR1은 위치 31-35에서의 아미노산 잔기를 포함하며, VHH의 FR2는 위치 36-49에서의 아미노산을 포함하고, VHH의 CDR2는 위치 50-65에서의 아미노산 잔기를 포함하며, VHH의 FR3은 위치 66-94에서의 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 CDR3은 위치 95-102에서의 아미노산 잔기를 포함하며, VHH의 FR4는 위치 103-113에서의 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, CDR은 콘테르만(Kontermann) 및 두에벨(Duebel)에 따라서 결정된다 (Eds., Antibody Engineering, vol 2, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, Chapter 3, pp. 33-51, 2010).
용어 "이뮤노글로불린 단일 가변 도메인" ("ISV" 또는 "ISVD"로서 지칭되기도 함)은 일반적으로, 또 다른 가변 도메인과의 상호 작용 없이 (예를 들어, 통상적인 4-쇄 모노클로날 항체의 VH 도메인과 VL 도메인 간에 요구되는 바와 같은 VH/VL 상호 작용을 수반하지 않음) 기능적 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 이뮤노글로불린 가변 도메인 (이는 VH, VHH 또는 VL 도메인을 포함한 중쇄 또는 경쇄 도메인일 수 있음)을 지칭하기 위해 사용된다. ISVD의 예는 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 예를 들어 나노바디 (VHH, 인간화 VHH 및/또는 카멜화 VH, 예컨대 카멜화 인간 VH 포함), IgNAR 도메인, VH 도메인이거나 또는 VH 도메인으로부터 유래되는 (단일 도메인) 항체 (예컨대 dAbs™) 및 VL 도메인이거나 또는 VL 도메인으로부터 유래되는 (단일 도메인) 항체 (예컨대 dAbs™)를 포함한다. 중쇄 가변 도메인 (예컨대 VH 또는 VHH 도메인)에 근거하고/거나 이로부터 유래되는 ISVD가 일반적으로 바람직하다. 가장 바람직하게, ISVD는 나노바디일 것이다. 예를 들어, F023700906이 ISVD이다.
용어 "나노바디"는 일반적으로, WO 2008/020079 또는 WO 2009/138519에서 정의된 바와 같으므로, 구체적 측면에서 일반적으로, VHH, 인간화 VHH 또는 카멜화 VH (예컨대 카멜화 인간 VH)를 의미하거나 또는 일반적으로 서열 최적화된 VHH (예컨대 예를 들어, 화학적 안정성 및/또는 용해도, 공지된 인간 프레임워크 영역과의 최대 중복 및 최대 발현을 위해 최적화됨)를 의미한다. 나노바디 또는 나노바디스라는 용어는 아블린쓰 엔.브이.(Ablynx N.V.)의 등록 상표이고, 따라서 나노바디® 및/또는 나노바디스®를 또한 지칭할 수 있음을 주목한다.
다중특이적 결합제는 제1 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD 또는 나노바디); 및 제1 CTLA4 결합 모이어티의 에피토프 이외의 에피토프 (예를 들어, CTLA4의 상이한 에피토프, 또는 CD27, LAG3, PD1 또는 BTLA)에 결합하는 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개)의 부가 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD 또는 나노바디)를 포함하는 분자이다.
결합 모이어티 또는 결합 도메인 또는 결합 단위는 항원, 예컨대 CTLA4에 결합하는 분자, 예컨대 ISVD 또는 나노바디 (예를 들어, 서열식별번호: 8-43 또는 60 중 임의의 것)이다. 결합 모이어티 또는 결합 도메인 또는 결합 단위는 또 다른 기능적 요소, 예컨대, 예를 들어, 반감기 연장제 (HLE), 표적화 단위 및/또는 작은 분자, 예컨대 폴리에틸렌글리콜 (PEG)을 포함할 수 있는 2개 이상의 모이어티, 도메인 또는 단위를 포함하는 보다 큰 분자, 예컨대 다가 또는 다중특이적 결합제의 일부일 수 있다.
1가 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 단일 항원-결합 도메인을 포함하는 분자이다. 2가 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 2개의 항원-결합 도메인을 포함한다. 다가 CTLA4 결합제는 2개 이상의 항원-결합 도메인 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개)을 포함한다.
단일특이적 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 단일 항원 (CTLA4)에 결합하고; 이중특이적 CTLA4 결합제는 2개의 상이한 항원에 결합하며 다중특이적 CTLA4 결합제는 2개 이상의 항원에 결합한다.
이중파라토프 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 단일특이적이지만, 동일한 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 다중파라토프 CTLA4 결합제는 동일한 항원에 결합하지만, 이러한 항원 내의 2개 이상의 에피토프에 결합한다.
CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디) 또는 다른 분자와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "반감기"는 일반적으로, WO 2008/020079의 57면 상의 단락 o)에 기재된 바와 같이 정의될 수 있으며, 거기에 언급된 바와 같이 이는, 예를 들어 아미노산 서열 또는 화합물의 분해 및/또는 자연 기전에 의한 상기 서열 또는 화합물의 클리어런스 또는 격리로 인해, 생체내에서 아미노산 서열, CTLA4 결합제, 화합물 또는 폴리펩티드의 혈청 농도가 50%만큼 감소되는데 소요되는 시간을 지칭한다. 본 발명의 아미노산 서열, CTLA4 결합제, 화합물 또는 폴리펩티드의 생체내 반감기는 자체 공지된 임의의 방식, 예컨대 약동학적 분석에 의해 결정될 수 있다. 적합한 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 예를 들어 일반적으로, WO 2008/020079의 57면 상의 단락 o)에 기재된 바와 같을 수 있다. 또한 WO 2008/020079의 57면 상의 단락 o)에 언급된 바와 같이, 반감기는 파라미터, 예컨대 t1/2-알파, t1/2-베타 및 곡선 아래 면적 (AUC)을 사용하여 표현될 수 있다. 이와 관련하여, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "반감기"는 특히, t1/2-베타 또는 말단 반감기 (여기서는 t1/2-알파 및/또는 AUC 또는 둘 다가 고려되지 않을 수도 있음)를 지칭한다는 것에 주목해야 한다. 예를 들어 아래 실험 파트 뿐만 아니라 표준 핸드북, 예컨대 문헌 [Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and Peters et al., Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996)]을 참조할 수 있다. 또한 문헌 ["Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)]을 참조할 수 있다. 유사하게, 용어 "반감기 상의 증가" 또는 "증가된 반감기"는 또한, WO 2008/020079의 57면 상의 단락 o)에 정의된 바와 같고, 특히 t1/2-알파 및/또는 AUC 또는 둘 다 상의 증가를 수반하거나 또는 수반하지 않으면서 t1/2-베타 상의 증가를 지칭한다.
특정 용어가 본원에 구체적으로 정의되지 않은 경우, 이는 통상의 기술자에게 명백할, 관련 기술분야에서의 통상적인 의미를 갖는다. 예를 들어, 표준 핸드북, 예컨대 문헌 [Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd.Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al., eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985); Old et al., "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., "Immunology" (6th. Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt et al., Roitt's Essential Immunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK (2001); and Janeway et al., "Immunobiology" (6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005)] 및 이에 인용된 일반적 배경 분야를 참조할 수 있다.
하나 이상의 나노바디를 함유하는 다가 및 다중특이적 폴리펩티드 및 그의 제조의 일반적 설명에 관해서는, 문헌 [Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001; Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302]; 뿐만 아니라, 예를 들어 WO 1996/34103, WO 1999/23221, WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 또는 WO 2009/068627을 참조할 수 있다.
"단리된" CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디), 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 그들이 생산되는 세포 또는 세포 배양물로부터의 다른 생물학적 분자가 적어도 부분적으로 없다. 이러한 생물학적 분자는 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질, 예컨대 세포성 부스러기 및 성장 배지를 포함한다. "단리된" CTLA4 결합제는 추가로, 숙주 세포로부터의 발현 시스템 성분, 예컨대 생물학적 분자 또는 그의 성장 배지가 적어도 부분적으로 없을 수 있다. 일반적으로, 용어 "단리된"은 이러한 생물학적 분자의 완전한 부재 또는 물, 완충제 또는 염의 부재 또는 항체 또는 단편을 포함하는 제약 제형의 성분을 지칭하는 것으로 의도되지 않는다.
"제어 서열"이란 특정한 숙주 유기체 내에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 원핵 생물에 적합한 제어 서열은, 예를 들어, 프로모터, 임의적으로 작동인자 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및 증강인자를 사용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 그것이 또 다른 폴리뉴클레오티드와 기능적 관계로 놓여질 때 "작동가능하게 연결된다". 예를 들어, 프리서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 그것이 특정 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현되는 경우에 상기 폴리펩티드에 대한 DNA와 작동가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 증강인자는 그것이 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 이러한 서열과 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 그것이 번역을 촉진시키도록 위치 설정되는 경우에 코딩 서열과 작동가능하게 연결된다. 항상은 아니지만 일반적으로, "작동가능하게 연결된"이란 연결되는 DNA 서열이 연속되고, 분비 리더의 경우에는, 연속되고 판독 상 내에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 증강인자는 연속되지 않아도 된다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 적응인자 또는 링커가 통상적인 실시에 따라서 사용된다.
본 발명의 "인간 혈청 알부민 결합제" 또는 "HSA 결합제"는 HSA에 결합하는 본원에 기재된 분자 중 임의의 것 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디) 뿐만 아니라 HSA에 결합하는 임의의 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고, 본원에 기재된 HSA 결합 모이어티 중 임의의 것을 포함한다. 개별 HSA 결합제가 더 큰 분자, 예를 들어, 다가 분자, 예컨대 F023700912 또는 F023700914의 일부인 경우에 HSA 결합 모이어티를 갖는 것으로 지칭될 수 있다.
일반적으로, 기본 항체 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 폴리펩티드 쇄의 2개의 동일한 쌍을 포함하며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄" (약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄" (약 50-70 kDa)를 갖는다. 각각의 쇄의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식에 대해 책임이 있는 약 100개 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 중쇄의 카르복시-말단 부분은 주로 이펙터 기능에 대해 책임이 있는 불변 영역을 규정할 수 있다. 전형적으로, 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로서 분류된다. 더욱이, 인간 중쇄는 전형적으로, 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로서 분류되고, 항체의 이소형을 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로서 각각 규정한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 영역과 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로, 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)]을 참조한다.
항원 결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 및 단일 쇄 Fv 분자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하기 특성이 CTLA4 결합제 11F01에서의 표시된 돌연변이와 연관된다:
E1D: 구조물 E1의 첫 번째 아미노산 내에서의 피로글루타민산 형성의 방지
L11V: 프리-항체 결합의 감소
A14P: 인간화
Q45R: 안정성을 증가시키도록 돌연변이됨
A74S: 인간화
K83R: 인간화
I89L: 프리-항체 결합의 감소
M96P,Q 또는 R: M96의 산화의 방지
Q108L: 인간화.
본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4는 인간 CTLA4이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 인간 CTLA4는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
MACLGFQRHK AQLNLATRTW PCTLLFFLLF IPVFCKAMHV AQPAVVLASS
RGIASFVCEY ASPGKATEVR VTVLRQADSQ VTEVCAATYM MGNELTFLDD
SICTGTSSGN QVNLTIQGLR AMDTGLYICK VELMYPPPYY LGIGNGTQIY
VIDPEPCPDS DFLLWILAAV SSGLFFYSFL LTAVSLSKML KKRSPLTTGV
YVKMPPTEPE CEKQFQPYFI PIN
(서열식별번호: 111).
CTLA4 결합제
본 발명은 개선된 CTLA4 결합제, 특히 개선된 CTLA4 ISVD 및 보다 특히 개선된 CTLA4 나노바디를 제공하는 것을 목표로 한다. 본 발명의 CTLA4 결합제는 위치, 예컨대 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서 돌연변이된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 변이체인 폴리펩티드를 포함한다.
CTLA4 결합제 또는 CTLA4 ISVD 또는 CTLA4 나노바디는 CTLA4에 결합하는 결합제, ISVD 또는 나노바디를 각각 지칭한다.
본 발명에 의해 제공된 개선된 CTLA4 결합제는 또한, 본원에서 "본 발명의 CTLA4 결합제" 또는 "CTLA4 결합제"로서 지칭된다. 이들 용어는 CTLA4에 결합하는 본원에 제시되는 분자를 포함하는 임의의 분자를 포괄한다. 예를 들어, 상기 용어는 서열식별번호: 8-43 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 ISVD 뿐만 아니라 서열식별번호: 8-43 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 임의의 폴리펩티드, 나노바디, ISVD, 융합 단백질, 통상적인 항체 또는 그의 항원-결합 단편; 또는 서열식별번호: 8-43 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CTLA4에 결합하며 또한 또 다른 항원 또는 또 다른 에피토프, 예컨대 CD27, LAG3, PD1, 또는 BTLA에 결합하는 임의의 이중특이적 분자 (예를 들어, ISVD)를 포함한다. 본 발명의 CTLA4 결합제는 F023700912 또는 F023700914이다.
본 발명의 범위는 FLAG3 및/또는 HIS6 태그가 임의적으로 결여된, 도 11에 제시된 결합 모이어티의 배열을 포함하는 임의의 CTLA4 결합제; 뿐만 아니라 도 12에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 것을 포함한다.
WO 2008/071447에는 CTLA4에 결합할 수 있는 나노바디 및 그의 용도가 기재되어 있다. WO 2008/071447의 서열식별번호: 1306은 11F01로 불리는 CTLA4 특이적 나노바디 (그의 서열은 서열식별번호: 1로서 본원에 제공됨)를 개시하였다. 이러한 서열 (본원에서 "참조 A"로서 지칭되기도 함) 및 그의 CDR이 또한 아래 표 A-1에 제공된다.
본원에 추가로 기재되는 바와 같이, 본 발명의 한 실시양태에서 본 발명의 다가 및/또는 다중특이적 CTLA4 결합제 (예를 들어, F023700914)인 본 발명의 CTLA4 결합제는 바람직하게, 11F01에 존재하는 바와 동일하거나 또는 11F01의 서열 (서열식별번호: 1)을 포함하는 결합제에 존재하는 바와 동일한 조합의 CDR (즉 CDR1, CDR2 및 CDR3)을 갖는다. 표 A-1을 참조한다.
본 발명은 또한, 아래 표 A-2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 11F01의 변이체인 CTLA4 결합제를 포함한다. 본 발명의 범위는 아래 표 A-2에 제시된 상기 변이체의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 CTLA4 결합제를 포함한다.
또한, 본 발명은 CDR1, CDR2 및 CDR3 또는 11F01의 아미노산 서열 또는 아래 표 A-2에 제시된 그의 변이체 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 결합 모이어티를 포함하는 다중특이적 및/또는 다가 결합제 (예를 들어, F023700914)를 포함한다.
표 A-1. CTLA4 나노바디 11F1 (11F01).
Figure 112018058018500-pct00001
표 A-2. 변이체 CTLA4 나노바디 11F1.
Figure 112018058018500-pct00002
*CDR: 강조되고/거나 볼드체
서열식별번호: 60의 잔기 1은 D 또는 E일 수 있다. 잔기 1이 D인 경우, CTLA4 결합제는 1D로서 지명될 수 있고 잔기 1이 E인 경우, CTLA4 결합제는 1E로서 지명될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 CTLA4 결합제는 N73X 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 N 이외의 임의의 아미노산, 예를 들어, S, V, G, R, Q, M, H, T, D, E, W, F, K, A, Y 또는 P (또는 N 이외의 임의의 아미노산)이다.
본 발명은 CTLA4 결합제의 CDR 중 1개, 2개 또는 3개를 포함하는 [여기서 각각은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환, 예를 들어, 보존적 치환을 포함하고/거나 표 A-1 또는 A-2에 제시된 CTLA4 결합제 서열 (예를 들어, 11F01 (E1D, L11V, A14P, Q45R, A74S, K83R, V89L, M96P, Q108L) 또는 11F01) 내에 있는 CDR과 비교하여 100, 99, 98, 97, 96 또는 95% 서열 동일성을 포함하거나, 또는 서열식별번호: 2-7에 제시된다] CTLA4 결합제를 포함하며, 여기서 이러한 CDR을 갖는 CTLA4 결합제는 CTLA4에 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다.
본원에 제시되는 참조 A에 근거하는 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)의 특정 잔기에 대한 카바트 잔기 번호가 아래 서열에 제시된다:
E 1 VQLVESGGGL 11 V 12 Q 13 A 14 GGSLRLSCAASG 26 G 27 T 28 F 29 S 30 FYGMGW 36 F 37 R 38 Q 39 APGKEQ 45 E 46 F 47 V 48 A 49 DIRTSAGRTYYADSVKGR 66 F 67 T 68 I 69 S 70 RDN 73 A 74 KNTVYLQMN 82a S 82b L 82c K 83 P 84 EDT 87 A 88 V 89 Y 90 Y 91 CAAEM 96 SGISGWDYW 103 G 104 Q 105 G 106 TQ 108 V 109 T 110 V 111 S 112 S 113
(서열식별번호: 1).
본원에 제시되는 CTLA4 결합제 11F01 (E1D, L11V, A14P, Q45R, A74S, K83R, V89L, M96P, Q108L)의 특정 잔기에 대한 카바트 잔기 번호가 아래 서열에 제시된다:
D 1 VQLVESGGGV 11 VQP 14 GGSLRLSCAASGGTFSFYGMG
WFRQAPGKER 45 EFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNS 74 KNTVYLQMNSLR 83 PEDTAL 89 YYCAAEP 96 SGISGWDYWGQGTL 108 VTVSS
(서열식별번호: 60).
본 발명은 서열식별번호: 60의 아미노산 서열 또는 80% 이상 (예를 들어, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 아미노산 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 임의의 CTLA4 결합제를 포함하며, 여기서 CTLA4 결합제는 CTLA4에 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다.
본 발명은 카바트 위치 96에서의 CTLA4 결합제의 CDR3 메티오닌을 임의의 아미노산, 예컨대 프롤린 (Cys, Asp 또는 Asn은 아님), 예를 들어, 하기 아미노산 중 임의의 것으로 치환시킨 실시양태를 포함한다: Leu, Ile, Val, Ala, Gly, Tyr, Trp, Phe, Glu, Gln, Ser, Thr, His, Arg, Lys 또는 Pro.
본 발명의 일부 바람직하지만, 비-제한적 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 서열식별번호: 60이거나 또는 서열식별번호: 8-43으로서 도 2에 열거된다. 도 3은 이들 서열과 참조 A (서열식별번호: 1)의 정렬을 나타낸다. 이들 CTLA4 결합제 중에서, 서열식별번호: 26-43의 결합제가 C-말단 알라닌 연장을 갖는, 즉 통상적인 C-말단 서열 VTVSS (서열식별번호: 57; 참조 A에 제시된 바와 같음)과 비교해서 ISVD-서열의 C-말단 단부 (종종 "위치 114"로서 지칭되기도 함)에 알라닌 잔기를 갖는 본 발명의 CTLA4 결합제의 예이다. WO 2012/175741 (뿐만 아니라 예를 들어 WO 2013/024059 및 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325))에 기재된 바와 같이, 이러한 C-말단 알라닌 연장은 ISV의 C-말단 영역에 있는 추정상의 에피토프에 대한 소위 "선재하는 항체" (IgG인 것으로 추정됨)의 결합을 방지시킬 수 있다. 이러한 에피토프는 다른 잔기 중에서, C-말단 서열 VTVSS (서열식별번호: 57)의 표면-노출된 아미노산 잔기 뿐만 아니라 위치 14에서의 아미노산 잔기 (및 아미노산 서열 내의 상기 위치에서의 잔기에 후속한/인접한 아미노산 잔기, 예컨대 위치 11, 13 및 15)를 포함하는 것으로 추정되며, 또한 위치 83에서의 아미노산 잔기 (및 아미노산 서열 내의 상기 위치에서의 잔기에 후속한/인접한 아미노산 잔기, 예컨대 위치 82, 82a, 82b 및 84) 및/또는 위치 108에서의 아미노산 잔기 (및 아미노산 서열 내의 상기 위치에서의 잔기에 후속한/인접한 아미노산 잔기, 예컨대 위치 107)를 포함할 수 있다.
그러나, 이러한 C-말단 알라닌 (또는 일반적으로 C-말단 연장)의 존재가 일정 범위의 대상체 (건강한 대상체 뿐만 아니라 환자 둘 다)로부터의 혈청에서 발견될 수 있는 "선재하는 항체"의 결합을 크게 저하시킬 수 있지만 (많은 경우에, 심지어 본질적으로 완전히 방지시킬 수 있지만), 일부 대상체로부터의 혈청 (예컨대 일부 면역 질환, 예컨대 SLE 환자로부터의 혈청)은 ISV가 상기 C-말단 알라닌 (또는 보다 일반적으로, 상기 C-말단 연장)을 함유하는 경우일지라도 ISV의 C-말단 영역에 결합할 수 있는 (이러한 영역이 노출되는 경우) 선재하는 항체를 함유할 수 있는 것으로 밝혀졌다. "개선된 이뮤노글로불린 가변 도메인"이란 발명의 명칭으로 2015년 5월 13일에 출원된 아블링스 엔.브이.에 의한 공동-계류중이고 미리 공개되지 않은 PCT 출원 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)을 또한 참조할 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 구체적인 목적은 "참조 A"로서 본원에 지칭된 CTLA4 나노바디의 개선된 변이체이고; 소위 "선재하는 항체" 및 특히 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)에 기재된 종류 (즉, 심지어 C-말단 연장의 존재 하에서도 ISV의 노출된 C-말단 영역에 결합할 수 있는 선재하는 항체)에 의한 결합을 저하시킨 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)를 제공하는 것이다.
본 발명은 서열식별번호: 1의 서열과 비교해서 하기 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는, 서열식별번호: 1의 서열의 변이체인 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 결합제를 제공한다:
- 1D 또는 1E;
- 11V;
- 14P;
- 45R;
- 74S;
- 83R;
- 89L 또는 89T;
- 96P; 또는
- 108L;
예를 들어, 여기서 CTLA4 결합제는 하기 돌연변이 세트 중 하나 이상을 포함한다:
- 11V; 14P; 45R; 74S; 83R; 86P; 108L 및 1E 또는 1D와 조합한 89L;
- 11V와 조합한 89L;
- 110K 또는 110Q와 조합한 89L;
- 112K 또는 112Q와 조합한 89L;
- 11V; 14P; 45R; 74S; 83R; 86P; 108L, 110K 또는 110Q 및 1E 또는 1D와 조합한 89L;
- 11V; 14P; 45R; 74S; 83R; 86P; 108L, 112K 또는 112Q 및 1E 또는 1D와 조합한 89L;
- 11V 및 110K 또는 110Q와 조합한 89L;
- 11V 및 112K 또는 112Q와 조합한 89L;
- 110K 또는 110Q와 조합한 11V; 및/또는
- 112K 또는 112Q와 조합한 11V.
특히, 본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는:
- 위치 1에서의 아미노산이 바람직하게 E 또는 D임;
- 위치 11에서의 아미노산이 바람직하게 L 또는 V임;
- 위치 14에서의 아미노산이 바람직하게 A 또는 P임;
- 위치 45에서의 아미노산이 바람직하게 Q 또는 R임;
- 위치 74에서의 아미노산이 바람직하게 A 또는 S임;
- 위치 83에서의 아미노산이 바람직하게 K 또는 R임;
- 위치 89에서의 아미노산이 바람직하게 T, V 또는 L임;
- 위치 96에서의 아미노산이 바람직하게 M 또는 P임;
- 위치 108에서의 아미노산이 바람직하게 Q 또는 L임;
- 위치 110에서의 아미노산 잔기가 바람직하게, T, K 또는 Q로부터 적합하게 선택되며;
- 위치 112에서의 아미노산 잔기가 바람직하게, S, K 또는 Q로부터 적합하게 선택되므로;
예를 들어, 하기 중 하나 이상이 사실이다:
(i) 위치 89가 T임;
(ii) 위치 89가 L임;
(iii) 위치 1이 D 또는 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 96이 P이고, 위치 108이 L임;
(iv) 위치 89가 L이고 위치 11이 V임;
(v) 위치 89가 L이며 위치 110이 K 또는 Q임;
(vi) 위치 89가 L이고 위치 112가 K 또는 Q임;
(vii) 위치 1이 D 또는 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 96이 P이고, 위치 108이 L이고; 위치 110이 K 또는 Q임;
(viii) 위치 1이 D 또는 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 96이 P이고, 위치 108이 L이고; 위치 112가 K 또는 Q임;
(ix) 위치 89가 L이고 위치 11이 V이며 위치 110이 K 또는 Q임;
(x) 위치 89가 L이고 위치 11이 V이며 위치 112가 K 또는 Q임;
(xi) 위치 11이 V이고 위치 110이 K 또는 Q임; 또는
(xii) 위치 11이 V이고 위치 112가 K 또는 Q이다.
특정한 실시양태에서, 위치 89가 T이거나 또는 위치 1이 D이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 96이 P이며 위치 108이 L이거나 또는 위치 11이 V이고 위치 89가 L인 서열식별번호: 1의 변이체인 아미노산 서열 (임의적으로 110K 또는 110Q 돌연변이 및/또는 112K 또는 112Q 돌연변이와 적합하게 조합하고, 특히 110K 또는 110Q 돌연변이와 조합함)을 포함하는 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)가 특히 바람직하다. 훨씬 더 바람직한 것은 임의적으로 110K 또는 110Q 돌연변이와 조합한, 위치 11이 V이고 위치 89가 L인 아미노산 서열이다.
언급된 바와 같이, 본원에 기재된 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 CTLA4에 결합할 수 있고, 특히 CTLA4와 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제는 CTLA4에 결합할 수 있으므로, 항원 제시 세포 상의 CD80, 및 CD86이 T 세포 상의 CTLA-4에 결합하는 것을 방지할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이로써 생성되는 CTLA-4 신호전달의 차단이 T-세포 활성화를 연장시키고, T-세포 증식을 복원시키므로, T-세포-매개된 면역을 증폭시켜, 이론적으로 항종양 면역 반응을 증가시킬 수 있는 환자의 능력을 증강시켜 준다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 CTLA4 결합제는 하기 특성 중 하나 이상을 갖는다:
ㆍ 예를 들어, 약 1 nM (예를 들어, 1.2 nM)의 KD로 CTLA4 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 CTLA4)에 결합하는 특성 (CTLA4-Fc 융합 단백질);
ㆍ CTLA4를 발현하는 세포, 예를 들어, CHO 세포의 표면 상의 CTLA4에 결합하는 특성;
ㆍ CTLA4 (예를 들어, CHO 세포 상에 발현된 CTLA4)에 대한 CD80 또는 CD86의 결합을 차단하는 특성;
ㆍ BTLA, CD8, PD1, LAG3, 및/또는 CD28에 결합하지 않는 특성;
ㆍ 시험관내 및/또는 생체내에서 인간, 레서스 원숭이 및 마우스 혈청 알부민 (하나 이상의 ALB11002 결합제와 융합된 경우)에 결합하는 특성;
ㆍ 종양 성장 (예를 들어, 췌장 종양, 예를 들어, 인간 면역 세포를 정착시킨 마우스 내의 인간 췌장 종양의 성장)을 억제하는 특성.
표 B에는 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디) 내의 (서열식별번호: 1의) 위치 11, 89, 110 및 112에 존재할 수 있는 아미노산 잔기의 일부 비-제한적 가능한 조합이 열거된다.
표 B. 서열식별번호: 1의 CTLA4 결합제 변이체 내의 아미노산 위치 11, 89, 110 및 112에서의 돌연변이의 가능한 조합.
Figure 112018058018500-pct00003
본 발명에 의해 제공된 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 추가로, 본원의 설명, 실시예 및 도면에 기재된 바와 같은데, 즉 이들 결합제는 본원에 기재된 바와 같은 CDR을 갖고 본원에 개시된 바와 같은 서열식별번호: 1의 서열과 전반적인 정도의 서열 동일성 (본원에 정의된 바와 같음)을 가지며/거나 이들 참조 서열 (중 하나)와 제한된 수의 "아미노산 차이" (본원에 기재된 바와 같음)를 가질 수 있다.
본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 바람직하게, 하기 CDR (카바트 규칙에 따름)을 포함한다:
- 아미노산 서열 FYGMG (서열식별번호: 2)을 포함하는 CDR1 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 DIRTSAGRTYYADSVKG (서열식별번호: 3)을 포함하는 CDR2 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 EPSGISGWDY (서열식별번호: 4)을 포함하는 CDR3 (카바트에 따름); 임의적으로, 여기서 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 치환, 예를 들어, 보존적 치환을 포함한다.
또 다른 한편으론, CDR이 Abm 규칙에 따라서 제공되는 경우, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 바람직하게 하기 CDR을 포함한다:
- 아미노산 서열 GGTFSFYGMG (서열식별번호: 5)을 포함하는 CDR1 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 DIRTSAGRTY (서열식별번호: 6)을 포함하는 CDR2 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 EPSGISGWDY (서열식별번호: 7; 이는 서열식별번호: 4와 동일함)을 포함하는 CDR3 (Abm에 따름); 임의적으로, 여기서 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 치환, 예를 들어, 보존적 치환을 포함한다.
본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 본 발명의 한 실시양태에서, 본원에 논의된 바와 같이, 상기 CDR 및 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이를 가지며, 임의적으로:
- 각각의 참조 서열의 전체 길이 전반에 걸친 각각의 서열 간의 가장 큰 매치를 제공하도록 BLAST 알고리즘의 파라미터 (예를 들어, 예상 한계치: 10; 워드 크기: 3; 조회 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 스코어 매트릭스 조정)를 선택하는 상기 BLAST 알고리즘에 의해 비교를 수행하는 경우, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (여기서 CDR, 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장 뿐만 아니라 관련된 구체적 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음); 및/또는
- 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게 3개 이하, 예컨대 단지 3개, 2개 또는 1개의 "아미노산 차이" (여기서 상기 아미노산 차이가 존재하는 경우, 이는 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게 프레임워크에서만 존재하고 CDR에는 존재하지 않으며; 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장은 고려되지 않고 관련된 구체적 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 고려되지 않음)
를 갖는다.
하기 참고문헌은 서열 분석을 위해 종종 사용되는 BLAST 알고리즘에 관한 것이다: [BLAST ALGORITHMS: Altschul et al. (2005) FEBS J. 272(20): 5101-5109; Altschul, S.F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W., et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L., et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F., et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7:649-656; Wootton, J.C., et al., (1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J.M. et al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M.O., et al., "A model of evolutionary change in proteins." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M., et al., "Matrices for detecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3." M.O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565; States, D.J., et al., (1991) Methods 3:66-70; Henikoff, S., et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877; Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039; and Altschul, S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, New York].
본 발명에 의해 제공된 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)의 다양한 측면 및 바람직한 측면에 관해서, 서열식별번호: 1에 대하여 서열 동일성의 정도 및/또는 이러한 본 발명의 결합제에 존재할 수도 있는 "아미노산 차이" (즉, 서열식별번호: 1의 서열과 비교함)의 수 및 종류에 관해서라면, 그것이 언급될 때, 하기를 인지해야 하며,
(i) 각각의 참조 서열의 전체 길이 전반에 걸친 각각의 서열 간의 가장 큰 매치를 제공하도록 BLAST 알고리즘의 파라미터 (예를 들어, 예상 한계치: 10; 워드 크기: 3; 조회 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 스코어 매트릭스 조정)를 선택하는 상기 BLAST 알고리즘에 의해 비교를 수행하는 경우, 본 발명의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1의 서열과 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (여기서 CDR, 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장 뿐만 아니라 관련된 구체적 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음)를 갖고/거나 그것이 언급될 때, 하기를 인지해야 한다:
(ii) 본 발명의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1의 서열과 7개 이하, 바람직하게 5개 이하, 예컨대 단지 3개, 2개 또는 1개의 "아미노산 차이" (또한, 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장은 고려되지 않고 관련된 구체적 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 고려되지 않음)를 가지므로, 이때
이는 또한, 관련된 구체적 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이 및 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장 이외의, 서열식별번호: 1의 서열과의 아미노산 차이를 갖지 않는 서열을 포함한다.
따라서, 본 발명의 하나의 구체적 측면에서, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하지만, 여기서 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 적어도 1개의 아미노산 돌연변이가 치환되고 (예를 들어, 보존적으로 치환되고), 서열식별번호: 1과 100% 서열 동일성 (CDR은 포함하지만, 본원에 개시된 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이(들) 또는 돌연변이의 조합 및/또는 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장은 고려되지 않음)을 가질 수 있고/거나 서열식별번호: 1과의 아미노산 차이를 갖지 않을 수 있다 (즉, 본원에 개시된 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이(들) 또는 돌연변이의 조합 및 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장 이외).
임의의 아미노산 차이 (즉, 임의의 C-말단 연장 및 관련된 본 발명의 구체적 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이 외에)가 존재하는 경우, 이들 아미노산 차이는 CDR 및/또는 프레임워크 영역에 존재할 수 있지만, 이들은 바람직하게 프레임워크 영역에서만 존재하는데 (Abm 규칙에 의해 정의된 바와 같은데, 즉 Abm 규칙에 따라서 정의된 바와 같이 CDR 내에 존재하지 않음), 즉 이로써 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 서열식별번호: 1 또는 60에 존재하는 바와 동일한 CDR (Abm 규칙에 따라서 정의됨)을 갖는다.
또한, 본 발명의 임의의 측면에 따르는 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)가 서열식별번호: 1의 서열과 1개 이상의 아미노산 차이 (관련된 구체적 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이 외에)를 갖는 경우, 존재할 수도 있는 이러한 돌연변이/아미노산 차이 (즉, 서열식별번호: 1의 서열과 비교함)의 일부 구체적이지만, 비-제한적 예는, 예를 들어 E1D, P41A, P41L, P41S 또는 P41T (및 특히 P41A) 및/또는 T87A (예를 들어, E1D (임의적), L11V, A14P, Q45R, A74S, K83R, V89L, M96P 및 Q108L)이다. 돌연변이의 다른 예는 하나 이상 (그의 적합한 조합)의 적합한 "인간화" 치환, 예컨대 Q108L이고; 예를 들어, WO 2009/138519 (또는 WO 2009/138519에 인용된 선행 기술분야) 및 WO 2008/020079 (또는 WO 2008/020079에 인용된 선행 기술분야) 뿐만 아니라 WO 2008/020079로부터의 표 A-3 내지 A-8 (이는 가능한 인간화 치환을 보여주는 목록임)을 참조할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 CTLA4 결합제는 적어도 Q108L 인간화 치환을 함유한다.
또한, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)가, 이들이 존재하는 CTLA4 결합제의 N-말단 부분에 존재하고/거나 이를 형성하는 경우, 이들은 바람직하게, 위치 1에 D를 함유한다 (즉, 참조 A와 비교해서 E1D 돌연변이). 이러한 N-말단 CTLA4 결합제의 일부 바람직하지만 비-제한적 예가 서열식별번호: 24 및 25 및 60으로서 제공된다. 따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 그의 N-말단 단부에 본 발명의 CTLA4 결합제 (이는 본원에 추가로 기재되는 바와 같음)를 갖는 본 발명의 폴리펩티드 (이는 본원에 추가로 기재되는 바와 같음)에 관한 것인데, 여기서 상기 본 발명의 CTLA4 결합제는 위치 1에 D를 가지며, 바람직하게 서열식별번호: 24 및 25 및 60의 CTLA4 결합제로부터 선택된다.
유사하게, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)가 1가 포맷으로 사용되는 경우, 이는 바람직하게, 본원에 기재된 바와 같은 C-말단 연장 X(n)과 위치 1에서의 D 둘 다를 갖는다. 이러한 1가 CTLA4 결합제의 일부 바람직하지만 비-제한적 예가 서열식별번호: 42 및 43으로서 제공된다. 따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 위치 1에서의 D 및 C-말단 연장 X(n) (이는 바람직하게 단일 Ala 잔기임)을 갖는 본 발명의 1가 CTLA4 결합제 (이는 본원에 추가로 기재되는 바와 같음)에 관한 것이다. 하나의 구체적 측면에서, 상기 1가 CTLA4 결합제는 서열식별번호: 42 또는 43으로부터 선택된다.
바람직하지만 비-제한적 예를 통하여, 서열식별번호: 22-25 및 40-42 및 60은 서열식별번호: 1과 추가의 아미노산 차이, 즉 A14P, Q45R, A74S, K83R 및/또는 Q108L (또한, 앞서의 단락에 표시된 바와 같이, 서열식별번호: 24, 25, 42 및 43은 또한 E1D 돌연변이를 가짐)을 갖는 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)의 예이다. 따라서, 구체적 측면에서, 본 발명은 적어도, 임의적 E1D 돌연변이, A14P 돌연변이, Q45R 돌연변이, A74S 돌연변이, K83R 돌연변이 및 Q108L 돌연변이의 적합한 조합, 및 바람직하게 Q108L과 다른 A14P, Q45R, A74S 및 K83R 돌연변이 중 임의의 1개와의 적합한 조합, 및 바람직하게 이들 다른 돌연변이 중 임의의 2개와 조합하여, 보다 바람직하게 이들 돌연변이 중 임의의 3개와 조합하여 (예컨대, A14P, A74S 및 K83R 또는 E1D, L11V, A14P, Q45R, A74S, K83R, V89L, M96P 및 Q108L과의 조합), 예컨대 이들 돌연변이 모두 (및 또한, CTLA4 결합제가 1가이거나 또는 본 발명의 CTLA4 결합제의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게 또한 E1D 돌연변이)와 조합하여 갖는 본 발명의 CTLA4 결합제 (즉, 본원에 기재된 바와 같고 또한 본원에 추가로 기재되는 바와 같은 위치 11, 89, 110 및/또는 112에서의 돌연변이를 가짐)에 관한 것이다.
본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 이들이 1가 포맷으로 사용되는 경우 및/또는 CTLA4 결합 모이어티가 CTLA4 결합제의 C-말단 단부에 존재하고/거나 이를 형성하는 경우 (또는 이들이 달리, 상기 폴리펩티드 내에 "노출된" C-말단 단부를 가짐으로써, 일반적으로 ISVD의 C-말단 단부가 불변 도메인 (예컨대 CH1 도메인)과 연합되지 않거나 또는 연결되지 않는다는 것을 의미하는 경우; WO 2012/175741 및 PCT/EP2015/060643 (WO 2015/173325)을 또한 참조할 수 있음), 바람직하게 또한, 식 (X)n의 C-말단 연장을 가지며, 여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (바람직하게 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 자연적으로 발생하는 아미노산 잔기로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게 자연적으로 발생하는) 아미노산 잔기이고 (바람직한 한 측면에 따르긴 하지만, 이는 어떠한 시스테인 잔기도 포함하지 않음), 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
이러한 C-말단 연장 X(n)의 일부 바람직하지만 비-제한적 예에 따르면, X 및 n은 하기와 같을 수 있다:
(a) n = 1 및 X = Ala;
(b) n = 2 및 각각의 X = Ala;
(c) n = 3 및 각각의 X = Ala;
(d) n = 2 및 적어도 1개의 X = Ala (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 자연적으로 발생하는 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만, 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨);
(e) n = 3 및 적어도 1개의 X = Ala (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 자연적으로 발생하는 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만, 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨);
(f) n = 3 및 적어도 2개의 X = Ala (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 자연적으로 발생하는 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만, 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨);
(g) n = 1 및 X = Gly;
(h) n = 2 및 각각의 X = Gly;
(i) n = 3 및 각각의 X = Gly;
(j) n = 2 및 적어도 1개의 X = Gly (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 자연적으로 발생하는 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만, 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨);
(k) n = 3 및 적어도 1개의 X = Gly (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 자연적으로 발생하는 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만, 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨);
(l) n = 3 및 적어도 2개의 X = Gly (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 자연적으로 발생하는 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만, 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨);
(m) n = 2 및 각각의 X = Ala 또는 Gly;
(n) n = 3 및 각각의 X = Ala 또는 Gly;
(o) n = 3 및 적어도 1개의 X = Ala 또는 Gly (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 자연적으로 발생하는 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만, 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨); 또는
(p) n = 3 및 적어도 2개의 X = Ala 또는 Gly (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 자연적으로 발생하는 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만, 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨);
측면 (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) 및 (n)이 특히 바람직하고, n = 1 또는 2인 측면이 바람직하며, n = 1인 측면이 특히 바람직하다.
바람직하게, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)에 존재하는 임의의 C-말단 연장은, (유리) 시스테인 잔기가 사용되지 않거나 또는 추가의 기능성화, 예를 들어 PEG화를 위해 의도되지 않는 한, (유리) 시스테인 잔기를 함유하지 않는다는 것을 또한 인지해야 한다.
유용한 C-말단 연장의 일부 구체적이지만 비-제한적 예는 하기 아미노산 서열이다: A, AA, AAA, G, GG, GGG, AG, GA, AAG, AGG, AGA, GGA, GAA 또는 GAG.
본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)가 위치 110 또는 112에서의 돌연변이 (임의적으로 본원에 기재된 바와 같은 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96 및/또는 108에서의 돌연변이와 조합함) (서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 비교함)를 함유하는 경우, 프레임워크 4의 C-말단 아미노산 잔기 (위치 109로부터 출발)는 본 발명의 한 실시양태에서, 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같을 수 있지만, 여기서 5개의 C-말단 잔기는 하기와 같이 치환될 수 있다:
(i) C-말단 연장이 존재하지 않는 경우: VTVKS (서열식별번호: 45), VTVQS (서열식별번호: 46), VKVSS (서열식별번호: 47) 또는 VQVSS (서열식별번호: 48); 또는
(ii) C-말단 연장이 존재하는 경우: VTVKSX(n) (서열식별번호: 49), VTVQSX(n) (서열식별번호: 50), VKVSSX(n) (서열식별번호: 51) 또는 VQVSSX(n) (서열식별번호: 52), 예컨대 VTVKSA (서열식별번호: 53), VTVQSA (서열식별번호: 54), VKVSSA (서열식별번호: 55) 또는 VQVSSA (서열식별번호: 56).
본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)가 위치 110 또는 112에서의 돌연변이를 함유하지 않지만, 오직 본원에 기재된 바와 같은 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96 및/또는 108에서의 돌연변이를 함유하는 경우, 프레임워크 4의 C-말단 아미노산 잔기 (위치 109로부터 출발)는 본 발명의 한 실시양태에서, 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같을 수 있지만, 여기서 5개의 C-말단 잔기는 하기와 같이 치환될 수 있다:
(i) C-말단 연장이 존재하지 않는 경우: VTVSS (서열식별번호: 57) (서열식별번호: 1의 서열에서와 같음); 또는
(ii) C-말단 연장이 존재하는 경우: VTVSSX(n) (서열식별번호: 58), 예컨대 VTVSSA (서열식별번호: 59). 이들 C-말단 서열에서, X 및 n은 C-말단 연장에 대하여 본원에 정의된 바와 같다.
본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)의 일부 바람직하지만 비-제한적 예가 서열식별번호: 9-43 및 60에 제공되고, 이들 서열 각각이 본 발명의 추가 측면을 형성한다 (이들 서열 중 하나를 포함하는 단백질, CTLA4 결합제, 폴리펩티드 또는 다른 화합물 또는 구조물도 마찬가지임). 이들 중에서, 서열식별번호: 9-25 및 60의 CTLA4 결합제는 C-말단 연장을 갖지 않고, 서열식별번호: 26-43의 CTLA4 결합제는 C-말단 알라닌 (이는 본원에 기재된 바와 같은 C-말단 연장의 바람직하지만 비-제한적 예임)을 함유한다.
본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)의 예는 서열식별번호: 22, 23, 24, 25, 40, 41, 42, 43 및 60의 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은
- 아미노산 서열 FYGMG (서열식별번호: 2)인 CDR1 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 DIRTSAGRTYYADSVKG (서열식별번호: 3)인 CDR2 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 EPSGISGWDY (서열식별번호: 4)인 CDR3 (카바트에 따름)
을 갖고;
- 각각의 참조 서열의 전체 길이 전반에 걸친 각각의 서열 간의 가장 큰 매치를 제공하도록 BLAST 알고리즘의 파라미터 (예를 들어, 예상 한계치: 10; 워드 크기: 3; 조회 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 스코어 매트릭스 조정)를 선택하는 상기 BLAST 알고리즘에 의해 비교를 수행하는 경우, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (여기서 CDR, 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장 뿐만 아니라 관련된 구체적 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음); 및/또는
- 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게 3개 이하, 예컨대 단지 3개, 2개 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에 정의된 바와 같고, 존재할 수도 있는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 어떠한 것도 고려되지 않고, 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장은 고려되지 않음) (여기서 상기 아미노산 차이가 존재하는 경우, 이는 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게 프레임워크에서만 존재하고 CDR에는 존재하지 않음)
를 갖고; 임의적으로:
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (및 바람직하게 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는 (바람직하게 자연적으로 발생하는) 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨)
을 갖는 CTLA4 결합제 (예를 들어, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 예컨대 나노바디)에 관한 것이며;
여기서 CTLA4 결합제의 아미노산 서열에서:
- 위치 1에서의 아미노산 잔기는 바람직하게 E 또는 D로부터 선택되고/거나;
- 위치 11에서의 아미노산 잔기는 바람직하게 L 또는 V로부터 선택되고/거나;
- 위치 14에서의 아미노산 잔기는 바람직하게 A 또는 P로부터 선택되고/거나;
- 위치 45에서의 아미노산 잔기는 바람직하게 Q 또는 R로부터 선택되고/거나;
- 위치 74에서의 아미노산 잔기는 바람직하게 A 또는 S로부터 선택되고/거나;
- 위치 83에서의 아미노산 잔기는 바람직하게 K 또는 R로부터 선택되고/거나;
- 위치 89에서의 아미노산 잔기는 바람직하게, T, V 또는 L로부터 적합하게 선택되고/거나;
- 위치 96에서의 아미노산 잔기는 바람직하게 M 또는 P로부터 선택되고/거나;
- 위치 108에서의 아미노산 잔기는 바람직하게 Q 또는 L로부터 선택되고/거나;
- 위치 110에서의 아미노산 잔기는 바람직하게, T, K 또는 Q로부터 적합하게 선택되고/거나
- 위치 112에서의 아미노산 잔기는 바람직하게, S, K 또는 Q로부터 적합하게 선택되므로;
예를 들어, 하기 중 하나 이상이 사실이다:
(i) 위치 1이 E 또는 D임;
(ii) 위치 11이 V임;
(iii) 위치 14가 P임;
(iv) 위치 45가 R임;
(v) 위치 74가 S임;
(vi) 위치 83이 R임;
(vii) 위치 89가 T 또는 L임;
(viii) 위치 96이 P임;
(ix) 위치 108이 L이고/거나;
예를 들어, 여기서 CTLA4 결합제는 하기 돌연변이 세트 중 하나 이상을 포함한다:
a. 위치 11이 V이고 위치 110이 K 또는 Q임;
b. 위치 11이 V이고 위치 112가 K 또는 Q임;
c. 위치 89가 L이고 위치 11이 V임;
d. 위치 89가 L이고 위치 110이 K 또는 Q임;
e. 위치 89가 L이고 위치 112가 K 또는 Q임;
f. 위치 89가 L이고 위치 11이 V이며 위치 110이 K 또는 Q임;
g. 위치 89가 L이고 위치 11이 V이며 위치 112가 K 또는 Q임;
h. 위치 1이 E 또는 D이고; 위치 11이 V이고; 위치 14가 P이고; 위치 45가 R이고; 위치 74가 S이고; 위치 83이 R이고; 위치 89가 L이고; 위치 96이 P이고; 위치 108이 L임;
i. 위치 1이 E 또는 D이고; 위치 11이 V이고; 위치 14가 P이고; 위치 45가 R이고; 위치 74가 S이고; 위치 83이 R이고; 위치 89가 L이고; 위치 96이 P이고; 위치 108이 L이고; 위치 110이 K 또는 Q임;
j. 위치 1이 E 또는 D이고; 위치 11이 V이고; 위치 14가 P이고; 위치 45가 R이고; 위치 74가 S이고; 위치 83이 R이고; 위치 89가 L이고; 위치 96이 P이고; 위치 108이 L이고; 위치 112가 K 또는 Q임;
k. 위치 1이 E 또는 D이고; 위치 11이 V이고; 위치 14가 P이고; 위치 45가 R이고; 위치 74가 S이고; 위치 83이 R이고; 위치 89가 L이고; 위치 96이 P이고; 위치 108이 L이다.
추가 측면에서, 본 발명은
- 아미노산 서열 FYGMG (서열식별번호: 2)인 CDR1 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 DIRTSAGRTYYADSVKG (서열식별번호: 3)인 CDR2 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 EPSGISGWDY (서열식별번호: 4)인 CDR3 (카바트에 따름)
을 갖고;
- 각각의 참조 서열의 전체 길이 전반에 걸친 각각의 서열 간의 가장 큰 매치를 제공하도록 BLAST 알고리즘의 파라미터 (예를 들어, 예상 한계치: 10; 워드 크기: 3; 조회 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 스코어 매트릭스 조정)를 선택하는 상기 BLAST 알고리즘에 의해 비교를 수행하는 경우, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (여기서 CDR, 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장 뿐만 아니라 관련된 구체적 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음); 및/또는
- 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게 3개 이하, 예컨대 단지 3개, 2개 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에 정의된 바와 같고, 존재할 수도 있는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 어떠한 것도 고려되지 않고, 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장은 고려되지 않음) (여기서 상기 아미노산 차이가 존재하는 경우, 이는 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게 프레임워크에서만 존재하고 CDR에는 존재하지 않음)
를 갖고; 임의적으로:
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (및 바람직하게 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는 (바람직하게 자연적으로 발생하는) 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨)
을 갖는 CTLA4 결합제 (예를 들어, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 예컨대 나노바디)에 관한 것이며;
CTLA4 결합제 (예를 들어, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따르는 넘버링)에서 하기 아미노산 잔기 (즉, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 비교한 돌연변이) 중 하나 이상을 포함하며,
- 1D 또는 1E;
- 11V;
- 14P;
- 45R;
- 74S;
- 83R;
- 89T 또는 89L;
- 96P; 또는
- 108L;
예를 들어, 여기서 CTLA4 결합제는 하기 돌연변이 세트 중 하나 이상을 포함한다:
- 11V; 14P; 45R; 74S; 83R; 89L; 96P; 및 108L과 조합한 1D 또는 1E;
- 110K 또는 110Q와 조합한 11V;
- 112K 또는 112Q와 조합한 11V;
- 11V와 조합한 89L;
- 110K 또는 110Q와 조합한 89L;
- 112K 또는 112Q와 조합한 89L;
- 11V; 14P; 45R; 74S; 83R; 89L; 96P; 108L 및 110K 또는 110Q와 조합한 1D 또는 1E;
- 11V; 14P; 45R; 74S; 83R; 89L; 96P; 108L 및 112K 또는 112Q와 조합한 1D 또는 1E;
- 11V 및 110K 또는 110Q와 조합한 89L; 또는
- 11V 및 112K 또는 112Q와 조합한 89L.
언급된 바와 같이, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)가 1가 포맷으로 사용되는 경우 및/또는 CTLA4 결합 모이어티가 본 발명의 CTLA4 결합제 (본원에 정의된 바와 같음)의 C-말단 단부에 존재하는 경우, CTLA4 결합제는 바람직하게 C-말단 연장 X(n)을 가지며, 이러한 C-말단 연장은 본 발명의 CTLA4 결합제에 대해 본원에 기재된 바와 같을 수 있고/거나 WO 2012/175741 또는 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)에 기재된 바와 같을 수 있다.
본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)의 일부 바람직하지만 비-제한적 예가 서열식별번호: 8-43 또는 60에 제공되고, 이들 아미노산 서열 각각이 개별적으로, 본 발명의 추가 측면을 형성한다.
언급된 바와 같이, 본 발명에서, 위치 89가 T인 아미노산 서열; 또는 위치 1이 E 또는 D이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 96이 P이며 위치 108이 L인 아미노산 서열; 또는 위치 11이 V이고 위치 89가 L인 아미노산 서열 (임의적으로, 110K 또는 110Q 돌연변이 및/또는 112K 또는 112Q 돌연변이와 적합하게 조합되고, 특히 110K 또는 110Q 돌연변이와 조합됨)이 특히 바람직하다. 훨씬 더 바람직한 것은 110K 또는 110Q 돌연변이와 임의적으로 조합된, 위치 11이 V이고 위치 89가 L인 아미노산 서열이다.
따라서, 하나의 바람직한 측면에서, 본 발명은
- 아미노산 서열 FYGMG (서열식별번호: 2)인 CDR1 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 DIRTSAGRTYYADSVKG (서열식별번호: 3)인 CDR2 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 EPSGISGWDY (서열식별번호: 4)인 CDR3 (카바트에 따름)
을 갖고;
- 각각의 참조 서열의 전체 길이 전반에 걸친 각각의 서열 간의 가장 큰 매치를 제공하도록 BLAST 알고리즘의 파라미터 (예를 들어, 예상 한계치: 10; 워드 크기: 3; 조회 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 스코어 매트릭스 조정)를 선택하는 상기 BLAST 알고리즘에 의해 비교를 수행하는 경우, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (여기서 CDR, 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장 뿐만 아니라 관련된 구체적 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음); 및/또는
- 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게 3개 이하, 예컨대 단지 3개, 2개 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에 정의된 바와 같고, 존재할 수도 있는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 어떠한 것도 고려되지 않고, 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장은 고려되지 않음) (여기서 상기 아미노산 차이가 존재하는 경우, 이는 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게 프레임워크에서만 존재하고 CDR에는 존재하지 않음)
를 갖고; 임의적으로:
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (및 바람직하게 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는 (바람직하게 자연적으로 발생하는) 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨)
을 갖는 CTLA4 결합제 (예를 들어, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 예컨대 나노바디)에 관한 것이며;
여기서 CTLA4 결합제의 아미노산 서열에서:
- 위치 1에서의 아미노산 잔기는 바람직하게 E 또는 D로부터 선택되고/거나;
- 위치 11에서의 아미노산 잔기는 바람직하게 L 또는 V로부터 선택되고/거나;
- 위치 14에서의 아미노산 잔기는 바람직하게 A 또는 P로부터 선택되고/거나;
- 위치 45에서의 아미노산 잔기는 바람직하게 Q 또는 R로부터 선택되고/거나;
- 위치 74에서의 아미노산 잔기는 바람직하게 A 또는 S로부터 선택되고/거나;
- 위치 83에서의 아미노산 잔기는 바람직하게 K 또는 R로부터 선택되고/거나;
- 위치 89에서의 아미노산 잔기는 바람직하게 T, L 또는 V로부터 선택되고/거나;
- 위치 96에서의 아미노산 잔기는 바람직하게 M 또는 P로부터 선택되고/거나;
- 위치 108에서의 아미노산 잔기는 바람직하게 L 또는 Q로부터 선택되고/거나;
- 위치 110에서의 아미노산 잔기는 바람직하게, T, K 또는 Q로부터 적합하게 선택되고/거나 (바람직하게 T이고/거나);
- 위치 112에서의 아미노산 잔기는 바람직하게, S, K 또는 Q로부터 적합하게 선택된다 (바람직하게 S임).
또 다른 바람직한 측면에서, 본 발명은
- 아미노산 서열 FYGMG (서열식별번호: 2)인 CDR1 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 DIRTSAGRTYYADSVKG (서열식별번호: 3)인 CDR2 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 EPSGISGWDY (서열식별번호: 4)인 CDR3 (카바트에 따름)
을 갖고;
- 각각의 참조 서열의 전체 길이 전반에 걸친 각각의 서열 간의 가장 큰 매치를 제공하도록 BLAST 알고리즘의 파라미터 (예를 들어, 예상 한계치: 10; 워드 크기: 3; 조회 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 스코어 매트릭스 조정)를 선택하는 상기 BLAST 알고리즘에 의해 비교를 수행하는 경우, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (여기서 CDR, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장 뿐만 아니라 관련된 구체적 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음); 및/또는
- 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게 3개 이하, 예컨대 단지 3개, 2개 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에 정의된 바와 같고, 존재할 수도 있는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 어떠한 것도 고려되지 않고, 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장은 고려되지 않음) (여기서 상기 아미노산 차이가 존재하는 경우, 이는 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게 프레임워크에서만 존재하고 CDR에는 존재하지 않음)
를 갖고; 임의적으로:
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (및 바람직하게 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는 (바람직하게 자연적으로 발생하는) 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨)
을 갖는 CTLA4 결합제 (예를 들어, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 예컨대 나노바디)에 관한 것이며;
여기서 예를 들어, CTLA4 결합제는 하기에 따르는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다:
- 위치 1에서의 아미노산 잔기는 E 또는 D임;
- 위치 11에서의 아미노산 잔기는 V임;
- 위치 14에서의 아미노산 잔기는 P임;
- 위치 45에서의 아미노산 잔기는 R임;
- 위치 74에서의 아미노산 잔기는 S임;
- 위치 83에서의 아미노산 잔기는 R임;
- 위치 89에서의 아미노산 잔기는 L임;
- 위치 96에서의 아미노산 잔기는 P임;
- 위치 108에서의 아미노산 잔기는 L임;
- 위치 110에서의 아미노산 잔기는 바람직하게 T, K 또는 Q로부터 선택됨; 또는
- 위치 112에서의 아미노산 잔기는 바람직하게 S, K 또는 Q로부터 선택됨.
하나의 구체적이지만 비-제한적 측면에서, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따르는 넘버링)에서 하기 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 1의 서열과 비교한 돌연변이) 중 하나 이상을 포함하며,
- 89L과 조합한 11V;
- 110K 또는 110Q와 조합한 11V;
- 112K 또는 112Q와 조합한 11V;
- 89L 및 110K 또는 110Q와 조합한 11V;
- 89L 및 112K 또는 112Q와 조합한 11V;
- 1D 또는 1E, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P, 108L 및 110K 또는 110Q와 조합한 11V;
- 1D 또는 1E, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P, 108L 및 112K 또는 112Q와 조합한 11V; 또는
- 1D 또는 1E, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P 및 108L과 조합한 11V;
표 A의 CTLA4 결합제 내에 있는, 예를 들어, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 60 내에 있는 CDR (예를 들어, 카바트에 따름)을 가지며, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 전반적인 정도의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 구체적이지만 비-제한적 측면에서, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따르는 넘버링)에서 하기 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 1의 서열과 비교한 돌연변이) 중 하나 이상을 포함하며,
- 11V와 조합한 89L;
- 110K 또는 110Q와 조합한 89L;
- 112K 또는 112Q와 조합한 89L;
- 11V 및 110K 또는 110Q와 조합한 89L;
- 11V 및 112K 또는 112Q와 조합한 89L;
- 1D 또는 1E, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 96P 및 108L과 조합한 89L;
- 1D 또는 1E, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 96P, 108L 및 110K 또는 110Q와 조합한 89L; 또는
- 1D 또는 1E, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 96P, 108L 및 112K 또는 112Q와 조합한 89L;
표 A의 CTLA4 결합제 내에 있는, 예를 들어, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 60 내에 있는 CDR (예를 들어, 카바트에 따름)을 가지며, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 전반적인 정도의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 구체적이지만 비-제한적 측면에서, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따르는 넘버링)에서 하기 돌연변이의 아미노산 세트 (즉, 서열식별번호: 1의 서열과 비교한 돌연변이) 중 하나 이상을 포함하며,
- 11V와 조합한 110K 또는 110Q;
- 89L와 조합한 110K 또는 110Q;
- 11V 및 89L과 조합한 110K 또는 110Q;
- 1D 또는 1E, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P 및 108L과 조합한 110K 또는 110Q;
표 A의 CTLA4 결합제 내에 있는, 예를 들어, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 60 내에 있는 CDR (예를 들어, 카바트에 따름)을 가지며, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 전반적인 정도의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 구체적이지만 비-제한적 측면에서, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따르는 넘버링)에서 하기 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 1의 서열과 비교한 돌연변이) 중 하나 이상을 포함하며,
- 11V와 조합한 112K 또는 112Q;
- 89L과 조합한 112K 또는 112Q; 또는
- 11V 및 89L과 조합한 112K 또는 112Q; 또는
- 1D 또는 1E, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P 및 108L과 조합한 112K 또는 112Q;
표 A의 CTLA4 결합제 내에 있는, 예를 들어, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 60 내에 있는 CDR (예를 들어, 카바트에 따름)을 가지며, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 전반적인 정도의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 위치 89에서의 T를 포함하고, CDR, 예컨대 서열식별번호: 60에 제시된 CDR (예를 들어, 카바트에 따름)을 가지며, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 전반적인 정도의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 위치 11에서의 V 및 위치 89에서의 L을 포함하고, CDR, 예컨대 서열식별번호: 1 또는 60에 제시된 CDR (예를 들어, 카바트에 따름)을 가지며, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 전반적인 정도의 서열 동일성을 갖는다.
언급된 바와 같이, 상기 측면에 따르는 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 바람직하게, E1D 돌연변이, L11V 돌연변이, A14P 돌연변이, Q45R 돌연변이, A74S 돌연변이, K83R 돌연변이, V89L 돌연변이, M96P 돌연변이 및 Q108L 돌연변이의 적합한 조합, 및 본 발명의 한 실시양태에서, Q108L과 다른 A14P, Q45R, A74S 및 K83R 돌연변이 중 임의의 1개와의 적합한 조합, 및 본 발명의 한 실시양태에서, 이들 다른 돌연변이 중 임의의 2개와 조합하여, 보다 바람직하게 이들 돌연변이 중 임의의 3개와 조합하여 (예컨대, A14P, A74S 및 K83R과의 조합), 예컨대 이들 돌연변이 중 4개 모두 (및 또한, CTLA4 결합제가 1가이거나 또는 본 발명의 CTLA4 결합제의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게 또한 E1D 돌연변이)와 조합하여 추가로 함유한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
- 아미노산 서열 GGTFSFYGMG (서열식별번호: 5)인 CDR1 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 DIRTSAGRTY (서열식별번호: 6)인 CDR2 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 EPSGISGWDY (서열식별번호: 4)인 CDR3 (Abm에 따름)
을 갖고;
- 각각의 참조 서열의 전체 길이 전반에 걸친 각각의 서열 간의 가장 큰 매치를 제공하도록 BLAST 알고리즘의 파라미터 (예를 들어, 예상 한계치: 10; 워드 크기: 3; 조회 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 스코어 매트릭스 조정)를 선택하는 상기 BLAST 알고리즘에 의해 비교를 수행하는 경우, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (여기서 CDR, 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장 뿐만 아니라 관련된 구체적 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음); 및/또는
- 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게 3개 이하, 예컨대 단지 3개, 2개 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에 정의된 바와 같고, 존재할 수도 있는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 어떠한 것도 고려되지 않고, 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장은 고려되지 않음) (여기서 상기 아미노산 차이가 존재하는 경우, 이는 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게 프레임워크에서만 존재하고 CDR에는 존재하지 않음)
를 갖고; 임의적으로:
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (및 바람직하게 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는 (바람직하게 자연적으로 발생하는) 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨)
을 갖는 CTLA4 결합제 (예를 들어, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 예컨대 나노바디)에 관한 것이며; 이는 아미노산 서열을 포함하므로;
- 위치 1에서의 아미노산 잔기가 E 또는 D임;
- 위치 11에서의 아미노산 잔기가 L 또는 V임;
- 위치 14에서의 아미노산 잔기가 P임;
- 위치 45에서의 아미노산 잔기가 R임;
- 위치 74에서의 아미노산 잔기가 S임;
- 위치 83에서의 아미노산 잔기가 R임;
- 위치 89에서의 아미노산 잔기가 바람직하게 T, V 또는 L로부터 선택됨;
- 위치 96에서의 아미노산 잔기가 P임;
- 위치 108에서의 아미노산 잔기가 L임;
- 위치 110에서의 아미노산 잔기가 바람직하게 T, K 또는 Q로부터 선택됨; 및
- 위치 112에서의 아미노산 잔기가 바람직하게 S, K 또는 Q로부터 선택됨;
예를 들어, 하기 중 하나 이상이 사실이며,
(i) 위치 1이 D 또는 E이거나;
(ii) 위치 11이 V임;
(iii) 위치 14가 P임;
(iv) 위치 45가 R임;
(v) 위치 74가 S임;
(vi) 위치 83이 R임;
(vii) 위치 89가 L 또는 T임;
(viii) 위치 96이 P임; 또는
(ix) 위치 108이 L임;
예를 들어, 여기서 CTLA4 결합제는 하기 돌연변이 세트 중 하나 이상을 포함한다:
a. 위치 11이 V이고 위치 110이 K 또는 Q임;
b. 위치 11이 V이고 위치 112가 K 또는 Q임;
c. 위치 89가 L이고 위치 11이 V임;
d. 위치 89가 L이고 위치 110이 K 또는 Q임;
e. 위치 89가 L이고 위치 112가 K 또는 Q임;
f. 위치 89가 L이고 위치 11이 V이며 위치 110이 K 또는 Q임; 또는
g. 위치 89가 L이고 위치 11이 V이며 위치 112가 K 또는 Q이다.
추가 측면에서, 본 발명은
- 아미노산 서열 GGTFSFYGMG (서열식별번호: 5)인 CDR1 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 DIRTSAGRTY (서열식별번호: 6)인 CDR2 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 EPSGISGWDY (서열식별번호: 4)인 CDR3 (Abm에 따름)
을 갖고;
- 각각의 참조 서열의 전체 길이 전반에 걸친 각각의 서열 간의 가장 큰 매치를 제공하도록 BLAST 알고리즘의 파라미터 (예를 들어, 예상 한계치: 10; 워드 크기: 3; 조회 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 스코어 매트릭스 조정)를 선택하는 상기 BLAST 알고리즘에 의해 비교를 수행하는 경우, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (여기서 CDR, 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장 뿐만 아니라 관련된 구체적 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음); 및/또는
- 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게 3개 이하, 예컨대 단지 3개, 2개 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에 정의된 바와 같고, 존재할 수도 있는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 어떠한 것도 고려되지 않고, 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장은 고려되지 않음) (여기서 상기 아미노산 차이가 존재하는 경우, 이는 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게 프레임워크에서만 존재하고 CDR에는 존재하지 않음)
를 갖고; 임의적으로:
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (및 바람직하게 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는 (바람직하게 자연적으로 발생하는) 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨)
을 갖는 CTLA4 결합제 (예를 들어, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 예컨대 나노바디)에 관한 것이며;
CTLA4 결합제 (예를 들어, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따르는 넘버링)에서 하기 아미노산 잔기 (즉, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 비교한 돌연변이) 중 하나 이상을 포함하며,
- 1D 또는 1E;
- 11V;
- 14P;
- 45R;
- 74S;
- 83R;
- 89L 또는 89T;
- 96P; 또는
- 108L;
예를 들어, 여기서 CTLA4 결합제는 하기 돌연변이 세트 중 하나 이상을 포함한다:
- 110K 또는 110Q와 조합한 11V;
- 112K 또는 112Q와 조합한 11V;
- 11V와 조합한 89L;
- 110K 또는 110Q와 조합한 89L;
- 112K 또는 112Q와 조합한 89L;
- 11V 및 110K 또는 110Q와 조합한 89L; 또는
- 11V 및 112K 또는 112Q와 조합한 89L.
언급된 바와 같이, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)가 1가 포맷으로 사용되는 경우 및/또는 CTLA4 결합 모이어티가 본 발명의 CTLA4 결합제 (본원에 정의된 바와 같음)의 C-말단 단부에 존재하는 경우, CTLA4 결합제는 바람직하게 C-말단 연장 X(n)을 가지며, 이러한 C-말단 연장은 본 발명의 CTLA4 결합제에 대해 본원에 기재된 바와 같을 수 있고/거나 WO 2012/175741 또는 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)에 기재된 바와 같을 수 있다.
본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)의 일부 바람직하지만 비-제한적 예가 서열식별번호: 8-43 및 60에 제공되고, 이들 아미노산 서열 각각이 개별적으로, 본 발명의 추가 측면을 형성한다.
언급된 바와 같이, 본 발명에서, 위치 89가 T인 아미노산 서열; 또는 위치 1이 E 또는 D이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 96이 P이며 위치 108이 L인 아미노산 서열; 또는 위치 11이 V이고 위치 89가 L인 아미노산 서열 (임의적으로, 110K 또는 110Q 돌연변이 및/또는 112K 또는 112Q 돌연변이와 적합하게 조합되고, 특히 110K 또는 110Q 돌연변이와 조합됨)이 특히 바람직하다. 훨씬 더 바람직한 것은 110K 또는 110Q 돌연변이와 임의적으로 조합된, 위치 11이 V이고 위치 89가 L인 아미노산 서열이다.
따라서, 하나의 바람직한 측면에서, 본 발명은
- 아미노산 서열 GGTFSFYGMG (서열식별번호: 5)인 CDR1 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 DIRTSAGRTY (서열식별번호: 6)인 CDR2 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 EPSGISGWDY (서열식별번호: 4)인 CDR3 (Abm에 따름)
을 갖고;
- 각각의 참조 서열의 전체 길이 전반에 걸친 각각의 서열 간의 가장 큰 매치를 제공하도록 BLAST 알고리즘의 파라미터 (예를 들어, 예상 한계치: 10; 워드 크기: 3; 조회 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 스코어 매트릭스 조정)를 선택하는 상기 BLAST 알고리즘에 의해 비교를 수행하는 경우, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (여기서 CDR, 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장 뿐만 아니라 관련된 구체적 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음); 및/또는
- 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게 3개 이하, 예컨대 단지 3개, 2개 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에 정의된 바와 같고, 존재할 수도 있는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 어떠한 것도 고려되지 않고, 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장은 고려되지 않음) (여기서 상기 아미노산 차이가 존재하는 경우, 이는 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게 프레임워크에서만 존재하고 CDR에는 존재하지 않음)
를 갖고; 임의적으로:
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (및 바람직하게 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는 (바람직하게 자연적으로 발생하는) 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨)
을 갖는 CTLA4 결합제 (예를 들어, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 예컨대 나노바디)에 관한 것이며;
이는 하기에 따르는 하나 이상의 돌연변이 (서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 비교함)를 갖는 아미노산 서열을 포함한다:
- 위치 1에서의 아미노산 잔기가 바람직하게 E 및 D로부터 선택되고;
- 위치 11에서의 아미노산 잔기가 바람직하게 L 및 V로부터 선택되며;
- 위치 14에서의 아미노산 잔기가 바람직하게 A 및 P로부터 선택되고;
- 위치 45에서의 아미노산 잔기가 바람직하게 Q 및 R로부터 선택되며;
- 위치 74에서의 아미노산 잔기가 바람직하게 A 및 S로부터 선택되고;
- 위치 83에서의 아미노산 잔기가 바람직하게 K 및 R로부터 선택되며;
- 위치 89에서의 아미노산 잔기가 바람직하게 T, L 및 V로부터 선택되고;
- 위치 96에서의 아미노산 잔기가 바람직하게 M 또는 P로부터 선택되며;
- 위치 108에서의 아미노산 잔기가 바람직하게 L 또는 Q로부터 선택되고;
- 위치 110에서의 아미노산 잔기가 바람직하게 T, K 또는 Q로부터 선택되고 (바람직하게 T이고);
- 위치 112에서의 아미노산 잔기가 바람직하게 S, K 또는 Q로부터 선택된다 (바람직하게 S임).
또 다른 바람직한 측면에서, 본 발명은
- 아미노산 서열 GGTFSFYGMG (서열식별번호: 5)인 CDR1 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 DIRTSAGRTY (서열식별번호: 6)인 CDR2 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 EPSGISGWDY (서열식별번호: 4)인 CDR3 (Abm에 따름)
을 갖고;
- 각각의 참조 서열의 전체 길이 전반에 걸친 각각의 서열 간의 가장 큰 매치를 제공하도록 BLAST 알고리즘의 파라미터 (예를 들어, 예상 한계치: 10; 워드 크기: 3; 조회 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 스코어 매트릭스 조정)를 선택하는 상기 BLAST 알고리즘에 의해 비교를 수행하는 경우, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (여기서 CDR, 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장 뿐만 아니라 관련된 구체적 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음); 및/또는
- 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게 3개 이하, 예컨대 단지 3개, 2개 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에 정의된 바와 같고, 존재할 수도 있는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 어떠한 것도 고려되지 않고, 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장은 고려되지 않음) (여기서 상기 아미노산 차이가 존재하는 경우, 이는 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게 프레임워크에서만 존재하고 CDR에는 존재하지 않음)
를 갖고; 임의적으로:
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (및 바람직하게 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는 (바람직하게 자연적으로 발생하는) 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨)
을 갖는 CTLA4 결합제 (예를 들어, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 예컨대 나노바디)에 관한 것이며;
여기서 CTLA4 결합제는 하기 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다:
- 위치 1에서의 아미노산 잔기는 D 또는 E이거나;
- 위치 11에서의 아미노산 잔기는 V임;
- 위치 14에서의 아미노산 잔기는 P임;
- 위치 45에서의 아미노산 잔기는 R임;
- 위치 74에서의 아미노산 잔기는 S임;
- 위치 83에서의 아미노산 잔기는 R임;
- 위치 89에서의 아미노산 잔기는 L임;
- 위치 96에서의 아미노산 잔기는 P임;
- 위치 108에서의 아미노산 잔기는 L임;
- 위치 110에서의 아미노산 잔기는 바람직하게, T, K 또는 Q로부터 적합하게 선택됨; 또는
- 위치 112에서의 아미노산 잔기는 바람직하게, S, K 또는 Q로부터 적합하게 선택됨.
하나의 구체적이지만 비-제한적 측면에서, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따르는 넘버링)에서 하기 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 1의 서열과 비교한 돌연변이) 중 하나 이상을 포함하며,
- 89L과 조합한 11V;
- 1D, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P, 108L과 조합한 11V;
- 1E, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P, 108L과 조합한 11V;
- 110K 또는 110Q와 조합한 11V;
- 110K 또는 110Q, 및 1D 또는 1E 및 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P, 및 108L과 조합한 11V;
- 112K 또는 112Q와 조합한 11V;
- 112K 또는 112Q, 및 1D 또는 1E 및 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P, 및 108L과 조합한 11V;
- 89L 및 110K 또는 110Q와 조합한 11V; 또는
- 89L 및 112K 또는 112Q와 조합한 11V;
표 A의 CTLA4 결합제 내에 있는, 예를 들어, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 60 내에 있는 CDR (예를 들어, Abm에 따름)을 가지며, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 전반적인 정도의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 구체적이지만 비-제한적 측면에서, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따르는 넘버링)에서 하기 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 1의 서열과 비교한 돌연변이)를 포함하며,
- 11V와 조합한 89L;
- 1D 또는 1E, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 96P 및 108L과 조합한 89L;
- 110K 또는 110Q와 조합한 89L;
- 110K 또는 110Q 및 1D 또는 1E 및 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 96P 및 108L과 조합한 89L;
- 112K 또는 112Q와 조합한 89L;
- 112K 또는 112Q 및 1D 또는 1E 및 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 96P 및 108L과 조합한 89L;
- 11V 및 110K 또는 110Q와 조합한 89L; 또는
- 11V 및 112K 또는 112Q와 조합한 89L;
표 A의 CTLA4 결합제 내에 있는, 예를 들어, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 60 내에 있는 CDR (예를 들어, Abm에 따름)을 가지며, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 전반적인 정도의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 구체적이지만 비-제한적 측면에서, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따르는 넘버링)에서 하기 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 1의 서열과 비교한 돌연변이)를 포함하며,
- 11V와 조합한 110K 또는 110Q;
- 89L과 조합한 110K 또는 110Q;
- 11V 및 89L과 조합한 110K 또는 110Q; 또는
- 1D 또는 1E 및 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P 및 108L과 조합한 110K 또는 110Q;
표 A의 CTLA4 결합제 내에 있는, 예를 들어, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 60 내에 있는 CDR (예를 들어, Abm에 따름)을 가지며, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 전반적인 정도의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 구체적이지만 비-제한적 측면에서, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따르는 넘버링)에서 하기 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 1의 서열과 비교한 돌연변이)를 포함하며,
- 11V와 조합한 112K 또는 112Q;
- 89L과 조합한 112K 또는 112Q;
- 11V 및 89L과 조합한 112K 또는 112Q; 또는
- 1D 또는 1E 및 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P 및 108L과 조합한 112K 또는 112Q;
표 A의 CTLA4 결합제 내에 있는, 예를 들어, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 60 내에 있는 CDR (예를 들어, Abm에 따름)을 가지며, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 전반적인 정도의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 위치 89에서의 T를 포함하고, CDR, 예컨대 서열식별번호: 1 또는 60에 제시된 CDR (예를 들어, Abm에 따름)을 가지며, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 전반적인 정도의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 위치 11에서의 V 및 위치 89에서의 L을 포함하고, CDR, 예컨대 서열식별번호: 60에 제시된 CDR (예를 들어, Abm에 따름)을 가지며, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 전반적인 정도의 서열 동일성을 갖는다.
언급된 바와 같이, 상기 측면에 따르는 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 바람직하게, 임의적 E1D 돌연변이, L11V 돌연변이, A14P 돌연변이, Q45R 돌연변이, A74S 돌연변이, K83R 돌연변이, V89L 돌연변이, M96P 돌연변이 및 Q108L 돌연변이의 적합한 조합, 및 바람직하게 Q108L과 다른 A14P, Q45R, A74S 및 K83R 돌연변이 중 임의의 1개와의 적합한 조합, 및 바람직하게 이들 다른 돌연변이 중 임의의 2개와 조합하여, 보다 바람직하게 이들 돌연변이 중 임의의 3개와 조합하여 (예컨대 A14P, A74S 및 K83R과의 조합), 예컨대 이들 돌연변이 모두 (및 또한, CTLA4 결합제가 1가이거나 또는 본 발명의 CTLA4 결합제의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게 또한 E1D 돌연변이)와 조합하여 추가로 함유한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 CTLA4 결합제는 돌연변이 E1D (또는 이러한 돌연변이가 결여되며, 여기서 잔기 1은 E임), L11V, A14P, Q45R, A74S, K83R, V89L, M96P, Q108L을 포함한다.
또 다른 구체적이지만 비-제한적 측면에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열 중 하나로부터 선택된 아미노산 서열이거나 또는 이로 본질적으로 이루어지는 CTLA4 결합제 (예를 들어, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 예컨대 나노바디)에 관한 것이다: 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 28, 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38, 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43 또는 서열식별번호: 60.
또 다른 구체적이지만 비-제한적 측면에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열 중 하나로부터 선택된 아미노산 서열이거나 또는 이로 본질적으로 이루어지는 CTLA4 결합제 (예를 들어, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 예컨대 나노바디)에 관한 것이다: 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43 또는 서열식별번호: 60.
또한, 본원에 이미 표시된 바와 같이, CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)의 아미노산 잔기는 문헌 [Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195]; 또는 여기에 언급된 문헌에서 카멜리드로부터의 VHH 도메인에 적용된 바와 같은, 카바트 등 (문헌 ["Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91])에 의해 제공된 VH에 대한 일반적 넘버링에 따라서 넘버링된다. VH 도메인 및 VHH 도메인에 대하여 관련 기술분야에서 널리 공지되는 바와 같이, CDR 각각에서의 아미노산 잔기의 총 수는 다양할 수 있고, 카바트 넘버링에 의해 표시된 아미노산 잔기의 총수에 상응하지 않을 수 있다는 것 (즉, 카바트 넘버링에 따르는 하나 이상의 위치가 실제 서열에 점유되지 않을 수 있거나, 또는 실제 서열이 카바트 넘버링에 의해 허용된 수보다 더 많은 아미노산 잔기를 함유할 수 있음)는 것을 인지해야 한다. 이는 일반적으로, 카바트에 따르는 넘버링이 실제 서열 내의 아미노산 잔기의 실제 넘버링에 상응할 수 있거나 또는 상응하지 않을 수 있다는 것을 의미한다.
VH 도메인의 아미노산 잔기를 넘버링하기 위한 대체 방법 (이러한 방법은 또한, 카멜리드로부터의 VHH 도메인 및 나노바디에 유사한 방식으로 적용될 수 있음)은 문헌 [Chothia et al., Nature 342, 877-883 (1989)]에 의해 기재된 방법, 소위 "AbM 정의" 및 소위 "접촉 정의"이다. 그러나, 본 발명의 설명, 측면 및 도면에서는, 달리 표시되지 않는 한, 리히만(Riechmann) 및 뮤이더만스(Muyldermans)에 의해 VHH 도메인에 적용된 바와 같은 카바트에 따르는 넘버링이 뒤따를 것이다.
본 발명은 또한, CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디); 본 발명의 CTLA4 결합제를 발현/생산하는 방법; 본 발명의 CTLA4 결합제를 포함하는 조성물 및 생성물 (예컨대 제약 조성물 및 생성물); 본 발명의 CTLA4 결합제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 본 발명의 CTLA4 결합제의 용도 (특히, 치료적, 예방적 및 진단적 용도)에 관한 것이다.
본 발명의 이들 및 다른 측면, 실시양태, 이점, 적용 및 용도는 본원의 추가의 설명으로부터 명백해질 것이다.
따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 적어도 1개 (예컨대 1개, 2개 또는 3개)의 CTLA4 결합 모이어티를 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어지는 폴리펩티드 또는 다른 화학적 실체에 관한 것이다. 이들 분자 자체가 "CTLA4 결합제" 또는 "본 발명의 화합물" 또는 "본 발명의 폴리펩티드"로서 지칭될 수 있다.
본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 1개 이상의 다른 아미노산 서열, 화학적 실체 또는 모이어티를 함유할 수 있다. 이들 다른 아미노산 서열, 화학적 실체 또는 모이어티는 이로써 생성되는 본 발명의 CTLA4 결합제에 하나 이상의 목적하는 특성을 부여할 수 있고/거나 이로써 생성되는 본 발명의 CTLA4 결합제의 특성을 목적하는 방식으로 변경시켜, 예를 들어 이로써 생성되는 본 발명의 CTLA4 결합제에 목적하는 생물학적 및/또는 치료 활성을 제공할 수 있고/거나 (예를 들어, 이로써 생성되는 본 발명의 CTLA4 결합제에 친화성 및 바람직하게 또 다른 치료상 관련된 표적에 대항한 효력을 제공하여, 이로써 생성되는 폴리펩티드가 CTLA4 및 다른 치료상 관련된 표적, 예컨대 PD1, LAG3, BTLA 및/또는 CD27에 대하여 "이중특이적"이 되도록 함), 목적하는 반감기를 제공할 수 있고/거나 약동학적 및/또는 약력학적 특성을 달리 변형 또는 개선시킬 수 있고/거나, CTLA4 결합제가 특이적 세포, 조직 또는 기관 (암 세포 및 암 조직 포함)을 표적으로 할 수 있게 하고/거나, 세포독성 효과를 제공할 수 있고/거나 검출 가능한 태그 또는 표지로서 제공될 수 있다. 이러한 다른 아미노산 서열, 화학적 실체 또는 모이어티의 일부 비-제한적 예는 하기와 같다:
- 하나 이상의 적합한 링커 (예컨대 9GS, 15GS 또는 35GS 링커 (9, 15 또는 35 G 및 S 아미노산의 임의의 조합, 예컨대, 예를 들어, GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)) (서열식별번호: 65). 본 발명의 한 실시양태에서, 링커는 (GGGGS)n (서열식별번호: 118) (여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10임)이고/거나;
- CTLA4 이외의 치료상 관련된 표적에 대항하여 유도되는 하나 이상의 결합 모이어티, 결합 도메인 또는 결합 단위 (즉, CTLA4와 다른 치료상 관련된 표적, 예컨대 CTLA4의 상이한 에피토프, PD1, CD27, LAG3, BTLA, TIM3, ICOS, B7-H3, B7-H4, CD137, GITR, PD-L1, PD-L2, ILT1, ILT2 CEACAM1, CEACAM5, TIM3, TIGIT, VISTA, ILT3, ILT4, ILT5, ILT6, ILT7, ILT8, CD40, OX40, CD137, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, NKG2A, NKG2C, NKG2E, IL-10, IL-17, TSLP 둘 다에 대해 이중특이적인 본 발명의 CTLA4 결합제를 제공하기 위함); 및/또는
- 반감기 상의 증가를 제공해 주는 하나 이상의 결합 도메인 또는 결합 단위 (예를 들어, 혈청 단백질, 예컨대 혈청 알부민에 대항하여 결합할 수 있는 결합 도메인 또는 결합 단위); 및/또는
- CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)가 목적하는 세포, 조직 또는 기관 (예컨대 암세포)을 표적화하는 하나 이상의 결합 모이어티, 결합 도메인 또는 결합 단위; 및/또는
- CTLA4에 대항하여 증가된 특이성을 제공해 주는 하나 이상의 결합 모이어티, 결합 도메인 또는 결합 단위 (통상적으로, 이들은 CTLA4에 결합할 수 있을 것이지만, 일반적으로 이들 자체는 본질적으로, CTLA4에 대항하여 기능적이지 않을 것임); 및/또는
- CTLA4 결합제가 (목적하는) 세포 내로 내재화되도록 허용해주는 결합 모이어티, 결합 도메인, 결합 단위 또는 다른 화학적 실체 (예를 들어, WO 2005/044858에 기재된 바와 같은 내재화 항-EGFR 나노바디); 및/또는
- 반감기를 개선시켜 주는 모이어티, 예컨대 적합한 폴리에틸렌글리콜 기 (즉, PEG화) 또는 증가된 반감기를 제공해 주는 아미노산 서열, 예컨대 인간 혈청 알부민 또는 그의 적합한 단편 (즉, 알부민 융합) 또는 예를 들어 WO 2008/068280에 기재된 바와 같은 혈청 알부민 결합 펩티드; 및/또는
- 페이로드, 예컨대 세포독성 페이로드; 및/또는
- 검출 가능한 표지 또는 태그, 예컨대 방사성 표지 또는 형광성 표지; 및/또는
- CTLA4 결합제의 고정화, 검출 및/또는 정제에 도움을 줄 수 있는 태그, 예컨대 HIS 또는 FLAG3 태그; 및/또는
- 기능성화될 수 있는 태그, 예컨대 C-말단 GGC 또는 GGGC 태그; 및/또는
- 본 발명의 CTLA4 결합제에 대하여 본원에 추가로 기재된 바와 같을 수 있고/거나 WO 2012/175741 또는 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)에 기재된 바와 같을 수 있는 C-말단 연장 X(n).
(바람직하게 인간) 통상적인 항체의 하나 이상의 부분 또는 단편 (예컨대 Fc 부분 또는 그의 기능적 단편 또는 하나 이상의 불변 도메인)을 또한 함유하고/거나 카멜리드 중쇄 단독 항체 (예컨대 하나 이상의 불변 도메인)로부터의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)가 본 발명의 일부이다.
다중특이적 결합제
본 발명은 CTLA4 또는 또 다른 폴리펩티드에 결합하기도 하는 단일 다가 (예를 들어, 다중특이적) 분자에서 융합될 수 있는 CTLA4 결합제를 포함하고, 본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 결합제는 대상체의 신체 내에서 결합제의 반감기를 증가시켜 주는 하나 이상의 반감기 연장제와 연결된다 (예를 들어, 서열식별번호: 62 또는 64에 제시된 아미노산 서열을 포함함). 본 발명의 한 실시양태에서, 반감기 연장제는 인간 혈청 알부민 (HSA)과 특이적으로 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디), 예를 들어, ALB11002이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 다중특이적 결합제는 본원에 기재된 바와 같은 F023700912 또는 F023700914이다.
폴리펩티드는 또 다른 분자와 직접적으로, 링커를 사용하지 않거나, 또는 링커, 예컨대 펩티드 링커, 예를 들어, 35GS를 통하여 "융합"될 수 있다.
다중특이적 결합제는 CTLA4 결합제 뿐만 아니라 부가 항원, 예컨대 CD27, PD1, LAG3, BTLA, TIM3, ICOS, B7-H3, B7-H4, CD137, GITR, PD-L1, PD-L2, ILT1, ILT2, CEACAM1, CEACAM5, TIM3, TIGIT, VISTA, ILT3, ILT4, ILT5, ILT6, ILT7, ILT8, CD40, OX40, CD137, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, NKG2A, NKG2C, NKG2E, IL-10, IL-17 또는 TSLP에 결합하는 하나 이상의 결합제를 포함할 수 있다.
이러한 ISVD-기반 또는 나노바디-기반 생물학적 제제의 일부 구체적이지만 비-제한적 예에 관해서는, 아블링스 엔.브이.에 의한 다양한 출원, 예컨대 예를 들어 제한없이 WO 2004/062551, WO 2006/122825, WO 2008/020079 및 WO 2009/068627, 뿐만 아니라 예를 들어, 제한없이, WO 2006/038027, WO 2006/059108, WO 2007/063308, WO 2007/063311, WO 2007/066016 및 WO 2007/085814와 같은 출원을 참조할 수 있다. 또한, 본원에 추가로 기재되는 바와 같이, 상기 언급된 출원에 제시된 분자의 일부일 수 있는 추가 모이어티는 (인간) 혈청 단백질, 예컨대 (인간) 혈청 알부민에 대항하여 유도된, 본원에 기재된 바와 같은 ISVD 또는 나노바디일 수 있고, 이러한 ISVD 또는 나노바디 (예를 들어, ALB11002)는 또한, 특히 본원에 기재되는 CTLA4 결합제 (및 이를 포함하는 폴리펩티드)의 반감기를 연장시키는데 있어서 및/또는 연장시키기 위한 치료적 용도를 찾아낼 수 있다. 예를 들어, 반감기 연장을 위한 혈청-알부민 결합 나노바디의 용도를 일반적으로 기재하고 있는 WO 2004/041865, WO 2006/122787 및 WO 2012/175400을 참조할 수 있다. WO 2009/138519 (또는 WO 2009/138519에 인용된 선행 기술분야) 또는 WO 2008/020079 (또는 WO 2008/020079에 인용된 선행 기술분야)가 참조로 포함된다. 또한, 특정 방법 또는 기술이 본원에 구체적으로 기재되지 않는 경우, 본 발명의 한 실시양태에서, WO 2009/138519 (또는 WO 2009/138519에 인용된 선행 기술분야) 또는 WO 2008/020079 (또는 WO 2008/020079에 인용된 선행 기술분야)에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)가 하나 이상의 추가 결합 모이어티, 결합 도메인 또는 결합 단위 (예를 들어, CTLA4에 대항하여 증가된 특이성을 제공해 주는 CTLA4에 대항한 추가의 본질적으로 비-기능적 결합 도메인 또는 결합 단위; CTLA4 이외의 치료 표적에 대항한 결합 모이어티, 결합 도메인 또는 결합 단위; 증가된 반감기를 제공해 주는 표적, 예컨대 인간 혈청 알부민에 대항한 결합 모이어티, 결합 도메인 또는 결합 단위; 및/또는 CTLA4 결합제가 특이적 세포, 조직 또는 기관을 표적으로 하게 하고/거나 CTLA4 결합제가 세포 내로 내재화되도록 허용해 주는 결합 모이어티, 결합 도메인 또는 결합 단위)를 함유하는 경우, 이들 다른 결합 모이어티, 결합 도메인 또는 결합 단위는 바람직하게 하나 이상의 ISVD를 포함하고, 보다 바람직하게 모든 ISVD이다. 예를 들어 및 제한 없이, 이들 하나 이상의 추가 결합 도메인 또는 결합 단위는 하나 이상의 나노바디 (VHH, 인간화 VHH 및/또는 카멜화 VH, 예컨대 카멜화 인간 VH 포함); VH 도메인이거나 또는 VH 도메인으로부터 유래되는 (단일 도메인) 항체; VH 도메인이거나 또는 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 VH 도메인으로부터 유래되는 dAb; 또는 심지어 VL 도메인이거나 또는 이로 본질적으로 이루어지는 (단일) 도메인 항체 또는 dAb일 수 있다. 특히, 이들 하나 이상의 결합 도메인 또는 결합 단위는 존재하는 경우, 하나 이상의 나노바디를 포함할 수 있고, 보다 특히 모든 나노바디가다.
본 발명의 CTLA4 결합제가 그의 C-말단 단부에 ISVD를 갖는 경우 (C-말단 ISVD는 본원에 기재된 CTLA4 결합 모이어티일 수 있거나 또는 예를 들어, CTLA4 결합제에 존재하는 경우, CTLA4에 대항하여 증가된 특이성을 제공해 주는 CTLA4에 대항한 추가의 본질적으로 비-기능적 ISVD; CTLA4 이외의 치료 표적에 대항한 ISVD; 증가된 반감기를 제공해 주는 표적, 예컨대 인간 혈청 알부민에 대항한 ISVD; 또는 CTLA4 결합제가 특이적 세포, 조직 또는 기관을 표적으로 하게 하고/거나 CTLA4 결합제가 세포 내로 내재화되도록 허용해 주는 ISVD일 수 있음), CTLA4 결합 모이어티 (즉, 상기 C-말단 ISVD)는 바람직하게 C-말단 연장 X(n)을 가지며, C-말단 연장은 본 발명의 CTLA4 결합제에 대하여 본원에 기재된 바와 같을 수 있고/거나 WO 2012/175741 또는 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)에 기재된 바와 같을 수 있다.
CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)가 본원에 기재된 하나 이상의 CTLA4 결합 모이어티 외에도, 임의의 추가 ISVD (하나 이상의 추가 ISVD는 언급된 바와 같이, CTLA4에 대항하여 증가된 특이성을 제공해 주는 CTLA4에 대항한 추가의 본질적으로 비-기능적 ISVD; CTLA4 이외의 치료 표적에 대항한 ISVD; 증가된 반감기를 제공해 주는 표적, 예컨대 인간 혈청 알부민에 대항한 ISVD; 및/또는 CTLA4 결합제가 특이적 세포, 조직 또는 기관을 표적으로 하게 하고/거나 CTLA4 결합제가 세포 내로 내재화되도록 허용해 주는 ISVD일 수 있음)를 함유하는 경우, 및 이러한 추가 ISVD가 나노바디가거나; 또는 VH 서열이고/거나, 이로 본질적으로 이루어지고/거나 VH 서열로부터 유래되는 ISVD인 경우, 본 발명의 바람직한 측면에 따라서 CTLA4 결합제에 존재하는 상기 하나 이상 (및 바람직하게 모든) 추가 ISVD는 선재하는 항체에 의한 결합을 저하시키는 하나 이상의 프레임워크 돌연변이를 그들의 서열 내에 함유할 것이다. 특히, 본 발명의 상기 측면에 따르면, 이러한 추가 ISVD는 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)에 기재되는 바와 같고/거나 본질적으로 본 발명의 CTLA4 결합제에 대하여 본원에 기재되는 바와 같은 위치 11, 89, 110 및/또는 112에서의 아미노산 잔기/돌연변이 (그의 적합한 조합)를 함유할 수 있다. 하나의 구체적 측면에서, CTLA4 결합제가 그의 C-말단 단부에 이러한 ISVD를 갖는 경우 (즉, 그의 C-말단 단부에 본 발명의 CTLA4 결합 모이어티를 갖지 않는 경우), C-말단 단부에 존재하고/거나 C-말단 단부를 형성하는 적어도 상기 ISVD는 선재하는 항체에 의한 결합을 저하시켜 주는 상기 프레임워크 돌연변이를 갖는다 (그리고 상기 C-말단 ISVD는 바람직하게 또한, 본원에 기재된 바와 같은 C-말단 연장 X(n)을 가질 것임).
언급된 바와 같이, CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)가 증가된 반감기 (즉, 본 발명의 1가 CTLA4 결합제와 비교함)를 가져야 하는 경우, CTLA4 결합제는 바람직하게, 이러한 증가된 반감기를 제공해 주는 적어도 하나 (예컨대 하나)의 ISVD (및 특히 나노바디)를 함유한다. 이러한 ISVD는 통상적으로, 적합한 혈청 단백질, 예컨대 트랜스페린 및 특히 (인간) 혈청 알부민에 대항하여 유도될 것이다. 특히, 이러한 ISVD 또는 나노바디는, 예를 들어 EP 2 139 918, WO 2011/006915, WO 2012/175400, WO 2014/111550에 기재된 바와 같이 인간 혈청 알부민에 대항한 (단일) 도메인 항체 또는 dAb일 수 있고, 특히 WO 2004/041865, WO 2006/122787, WO 2012/175400 또는 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)에 기재된 바와 같은 혈청 알부민 결합 나노바디일 수 있다. 특히 바람직한 혈청 알부민 결합 ISVD는 나노바디 Alb-1 (WO 2006/122787 참조) 또는 그의 인간화 변이체, 예컨대 Alb-8 (WO 2006/122787, 서열식별번호: 62), Alb-23 (WO 2012/175400, 서열식별번호: 1); 및 Alb-1의 다른 인간화 (및 바람직하게 또한 서열-최적화된) 변이체 및/또는 Alb-8 또는 Alb-23의 변이체 (또는 보다 일반적으로, Alb-1, Alb-8 및 Alb-23과 본질적으로 동일한 CDR을 갖는 ISVD)이다.
본 발명의 한 실시양태에서, ISVD (예를 들어, 나노바디)는 인간 혈청 알부민에 결합하는 ALB11002이다. ALB11002는 아래 표 C에 요약된다.
본 발명은, 예를 들어 ALB11002에 존재하거나 또는 서열식별번호: 66의 서열을 포함하는 결합제에 존재하는 바와 동일한 조합의 CDR (즉, CDR1, CDR2 및 CDR3)을 갖는 본 발명의 HSA 결합제를 포함하는 CTLA4 결합제를 포함한다. 표 C를 참조한다.
표 C. 인간 혈청 알부민 (HSA) 결합제 ALB11002
Figure 112018058018500-pct00004
임의적으로, ALB11002에는 C-말단 알라닌이 결여된다. 본 발명의 한 실시양태에서, HSA 결합제는 서열식별번호: 66의 아미노산 서열을 포함하지만, 위치 1, 11, 89, 110 또는 112에서의 돌연변이를 포함하며, 예를 들어, 본원의 표 C에 제시된 돌연변이 세트를 포함한다.
서열식별번호: 66의 잔기 1은 D 또는 E일 수 있다. 잔기 1이 D인 경우, HSA 결합제는 1D로서 지명될 수 있고, 잔기 1이 E인 경우, HSA 결합제는 1E로서 지명될 수 있다.
본 발명은 HSA 결합제의 CDR 중 1개, 2개 또는 3개를 포함하는 [여기서 각각은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환, 예를 들어, 보존적 치환을 포함하고/거나 표 C에 제시된 HSA 결합제 서열 내에 있는 CDR과 비교하여 100, 99, 98, 97, 96 또는 95% 서열 동일성을 포함하거나, 또는 서열식별번호: 67-69에 제시된다] HSA 결합제를 포함하며, 여기서 이러한 CDR을 갖는 HSA 결합제는 HSA에 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 반감기 연장제는
- 아미노산 서열 GFTFSSFGMS (서열식별번호: 67)을 포함하는 CDR1; 및
- 아미노산 서열 SISGSGSDTL (서열식별번호: 68)을 포함하는 CDR2; 및
- 아미노산 서열 GGSLSR (서열식별번호: 69)을 포함하는 CDR3
을 포함하고; 임의적으로:
- 서열식별번호: 66의 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (여기서 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장 뿐만 아니라 CDR은 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음) (여기서 CDR, 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장 뿐만 아니라 관련된 구체적 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 89, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음); 및/또는
- 서열식별번호: 66의 아미노산 서열과 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게 3개 이하, 예컨대 단지 3개, 2개 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에 정의된 바와 같고, 존재할 수도 있는 위치 1, 11, 89, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 어떠한 것도 고려되지 않고, 존재할 수도 있는 임의의 C-말단 연장은 고려되지 않음) (여기서 상기 아미노산 차이가 존재하는 경우, 이는 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게 프레임워크에서만 존재하고 CDR에는 존재하지 않음)
를 갖고; 임의적으로:
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (및 바람직하게 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는 (바람직하게 자연적으로 발생하는) 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨)
을 갖는 항-HSA ISVD (예를 들어, 나노바디)이다.
또한, 언급된 바와 같이, 이러한 혈청 알부민 결합 ISVD가 존재하는 경우, 이는 선재하는 항체에 의한 결합을 저하시키는 하나 이상의 프레임워크 돌연변이를 그의 서열 내에 함유할 수 있다. 특히, 이러한 혈청 알부민 결합 ISVD가 VH 도메인이고/거나, 이로 본질적으로 이루어지고/거나 VH 도메인으로부터 유래되는 (단일) 도메인 항체 또는 나노바디인 경우, 혈청 알부민 결합 ISVD는 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)에 기재된 바와 같고/거나 본질적으로 본 발명의 CTLA4 결합제에 대하여 본원에 기재된 바와 같은 위치 11, 89, 110 및/또는 112에서의 아미노산 잔기/돌연변이 (그의 적합한 조합)를 함유할 수 있다. 예를 들어, PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)에는 본 발명의 CTLA4 결합제에 사용될 수 있는 선재하는 항체에 의한 결합을 저하시키는 위치 11, 89, 110 및/또는 112에서의 아미노산 잔기/돌연변이를 함유하는 Alb-1, Alb-8 및 Alb-23의 수많은 변이체가 기재되어 있다.
또한, 이러한 혈청 알부민 결합 ISVD가 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)의 C-말단 단부에 존재하는 경우, 혈청 알부민 결합 ISVD (및 그 결과로서, 본 발명의 CTLA4 결합제)는 바람직하게 C-말단 연장 X(n)을 가지며, 이러한 C-말단 연장은 본 발명의 CTLA4 결합제에 대하여 본원에 기재된 바와 같을 수 있고/거나 WO 2012/175741 또는 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)에 기재된 바와 같을 수 있다. 이는 또한 바람직하게, PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)에 기재된 위치 11, 89, 110 및/또는 112에서의 아미노산 잔기/돌연변이 (그의 적합한 조합)와 같이, 선재하는 항체의 결합을 저하시키는 돌연변이를 갖는다.
그러나, 언급된 바와 같이, 본 발명의 CTLA4 결합제의 반감기를 증가시키는 다른 수단 (예컨대 PEG화, 인간 알부민 또는 그의 적합한 단편과의 융합, 또는 적합한 혈청 알부민-결합 펩티드의 사용)이 또한, 본 발명의 범위 내에 포함된다.
일반적으로, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)가 증가된 반감기를 갖는 경우 (예를 들어, 반감기 증가성 ISVD의 존재 또는 반감기를 증가시키는 임의의 다른 적합한 방식을 통함), 이로써 생성되는 CTLA4 결합제는 바람직하게, 본 발명의 1가 CTLA4 결합제의 반감기보다 적어도 2배, 바람직하게 적어도 5배, 예를 들어 적어도 10배 또는 20배 초과하여 더 큰 반감기 (본원에 정의된 바와 같음)를 갖는다 (인간 및/또는 적합한 동물 모델, 예컨대 마우스 또는 시노몰구스 원숭이에서 측정된 바와 같음). 특히, 본 발명의 CTLA4 결합제는 바람직하게, 인간 대상체에서 적어도 1일, 바람직하게 적어도 3일, 보다 바람직하게 적어도 7일, 예컨대 적어도 10일의 반감기 (본원에 정의된 바와 같음)를 갖는다.
본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, 하나 이상의 ISVD, 예컨대 나노바디에 근거하는 것)가 상이한 "포맷"을 가질 수 있으며, 즉 본질적으로 1가, 2가 또는 3가일 수 있고, 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 등일 수 있으며, 이중파라토프 (본원 및 예를 들어 WO 2009/068625에 정의된 바와 같음)일 수 있다는 것이 본원의 개시내용으로부터 명백할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 CTLA4 결합제는 하기와 같을 수 있다:
- (본질적으로) 1가, 즉 본 발명의 단일 CTLA4 결합 모이어티를 (본질적으로) 포함한다. 언급된 바와 같이, 1가 포맷으로 사용되는 경우, 본 발명의 CTLA4 결합제는 바람직하게, 본원에 추가로 기재되는 바와 같은 C-말단 연장 X(n)을 갖는다. 이러한 본 발명의 CTLA4 결합제는 또한 반감기 연장될 수 있고;
- (본질적으로) 2가 또는 3가 및 단일특이적. 이러한 본 발명의 CTLA4 결합제는 CTLA4에 대항한 2개 이상의 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD)를 포함할 것인데, 이는 동일하거나 상이할 수 있고, 상이한 경우 CTLA4 상의 동일한 에피토프에 대항하여 유도되거나 또는 CTLA4 상의 상이한 에피토프에 대항하여 유도될 수 있다 (후자의 경우는, 본 발명의 이중파라토프 또는 다중파라토프 CTLA4 결합제를 제공하도록 하기 위함). 이러한 본 발명의 CTLA4 결합제는 또한 반감기 연장될 수 있으며;
- (본질적으로) 2가, 3가 (또는 다가) 및 이중특이적 또는 삼중특이적 (또는 다중특이적). 이러한 본 발명의 CTLA4 결합제는 CTLA4 및 적어도 하나의 다른 표적에 대항하여 유도될 것이다. 본원에 기재된 바와 같이, 상기 다른 표적은, 예를 들어 또 다른 치료상 관련된 표적 (즉, CTLA4 이외), 예컨대, 예를 들어, PD1, LAG3, BTLA 및/또는 CD27이어서, CTLA4 및 상기 다른 치료 표적에 관해서 이중특이적인 CTLA4 결합제를 제공하도록 할 수 있다. 상기 다른 표적은 또한, 증가된 반감기를 제공해 주는 표적 (예컨대 인간 혈청 알부민)이어서, 증가된 반감기를 갖는 본 발명의 CTLA4 결합제를 제공하도록 할 수 있다. 또한 본원에 언급된 바와 같이, 상기 다른 표적은 또한, 본 발명의 CTLA4 결합제가 특이적 세포, 조직 또는 기관을 표적으로 하도록 허용해주고/거나 본 발명의 CTLA4 결합제가 세포 내로 내재화되도록 허용해줄 수 있다. 이들 접근 방식/ISVD를 조합하여, 예를 들어 CTLA4 및 적어도 하나의 다른 치료상 관련된 표적에 대해 이중특이적이고 반감기 연장되는 본 발명의 CTLA4 결합제를 제공하는 것이 또한 가능하다.
또한, 바람직하게, 이들 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)가 본 발명의 적어도 하나의 CTLA4 결합제 이외의 하나 이상의 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD)를 함유하는 경우, 이들 다른 ISVD 중 적어도 하나 및 바람직하게 모두가, 선재하는 항체에 의한 결합을 저하시키는 하나 이상의 프레임워크 돌연변이를 그의 서열 내에 함유할 것이다 (예컨대, 특히, 본 발명의 CTLA4 결합제에 대하여 본원에 기재된 바와 같고/거나 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)에 일반적으로 기재된 바와 같은, 위치 11, 89, 110 및/또는 112에서의 아미노산 잔기/돌연변이의 조합). 또한, 이러한 본 발명의 CTLA4 결합제가 그의 C-말단 단부에 CTLA4 결합 모이어티를 갖는 경우, 상기 C-말단 CTLA4 결합 모이어티 (및 그 결과로서, 본 발명의 CTLA4 결합제)는 바람직하게, 본원에 기재된 바와 같은 C-말단 연장 X(n)을 가질 것이다. 유사하게, 이러한 본 발명의 CTLA4 결합제가 그의 C-말단 단부에 또 다른 ISVD를 갖는 경우 (즉, 본 발명의 CTLA4 결합 모이어티는 아니지만, 예를 들어 반감기 연장 ISVD임), 상기 C-말단 ISVD (및 그 결과로서, 본 발명의 CTLA4 결합제)는 바람직하게, 본원에 기재된 바와 같은 C-말단 연장 X(n)을 가질 것이고/거나 선재하는 항체에 의한 결합을 저하시키는 하나 이상의 프레임워크 돌연변이를 그의 서열 내에 함유할 것이다 (또한, 본원 및 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)에 추가로 기재된 바와 같음).
통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)가 국소 사용 (즉, 피부 상에서 또는 눈 안에)을 목적으로 하거나 또는 예를 들어, GI 관 내의 어딘가에 (즉, 경구 투여 후 또는 좌제에 의한 투여 후) 또는 폐 내에 (즉, 흡입에 의한 투여 후) (국재화된) 치료적 작용을 가지는 것을 의미하거나, 또는 그의 의도된 작용 장소에 직접적으로 적용되는 것으로 (예를 들어, 직접적인 주사에 의함) 달리 의미하는 경우, 본 발명의 CTLA4 결합제는 반감기 연장을 필요로 하지 않을 수 있다. 또한, 특정의 급성 병태 또는 적응증을 치료하는 경우에는, 연장된 반감기를 갖지 않는 것이 바람직할 수 있다. 이들 경우에, 반감기 연장되지 않은 본 발명의 1가 CTLA4 결합제 또는 본 발명의 CTLA4 결합제 (본 발명의 CTLA4 결합 모이어티를 포함함) (예를 들어, CTLA4에 대하여 2가 또는 이중파라토프인 본 발명의 CTLA4 결합제)의 사용이 바람직하다.
이러한 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)의 일부 바람직하지만 비-제한적 예가 아래 표 C-1에 도식적으로 나타나며, 이들 각각이 본 발명의 추가 측면을 형성한다. 반감기 연장되지 않은 본 발명의 적합한 CTLA4 결합제의 다른 예는 본원의 개시내용에 근거하여 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
표 C-1. 반감기 연장 ISVD를 수반하지 않은 본 발명의 일부 CTLA4 결합제의 도식적 표현.
Figure 112018058018500-pct00005
Figure 112018058018500-pct00006
통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)가 전신 투여 및/또는 만성 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 목적으로 하는 경우, 상기 본 발명의 CTLA4 결합제는 증가된 반감기 (본원에 정의된 바와 같음)를 갖는 것이 통상적으로 바람직할 것이다. 보다 바람직하게, 이러한 본 발명의 CTLA4 결합제는 반감기 연장 ISVD, 예컨대, 바람직하게, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD 및 특히 나노바디 (본원에 기재된 바와 같음)를 함유할 것이다.
이러한 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)의 일부 바람직하지만 비-제한적 예가 아래 표 C-2에 도식적으로 나타나며, 이들 각각이 본 발명의 추가 측면을 형성한다. 반감기 연장된 본 발명의 적합한 CTLA4 결합제의 다른 예는 본원의 개시내용에 근거하여 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 일반적으로, 반감기 연장된 본 발명의 CTLA4 결합제에 대해서, C-말단 연장의 존재가 훨씬 바람직하다.
표 C-2. 반감기 연장 ISVD를 수반한 본 발명의 일부 CTLA4 결합제의 도식적 표현.
Figure 112018058018500-pct00007
Figure 112018058018500-pct00008
Figure 112018058018500-pct00009
본 발명은 또한, 하기 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 ISVD, F023700912를 제공한다:
Figure 112018058018500-pct00010
(서열식별번호: 62; 35GS 링커: 점선으로 강조됨; CDR: 강조되고/거나 볼드체). 임의적으로, 분자 내의 임의의 결합제 모이어티의 첫 번째 잔기는 적절히 D 또는 E로 치환된다.
임의적으로, 상기 CTLA4 ISVD는 신호 펩티드, 예컨대 하기를 포함한다:
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTN
NGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKR (서열식별번호: 70)
F023700912는 하기 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다:
Figure 112018058018500-pct00011
(서열식별번호: 61; 뉴클레오티드 1-255의 신호 서열이 임의적으로 결여됨).
F023700912는 하기 모이어티를 포함한다:
ㆍ CTLA4 결합제 11F01(E1D,L11V,A14P,Q45R,A74S,K83R,V89L,M96P,Q108L)
ㆍ 35 GS 링커
ㆍ CTLA4 결합제 11F01(L11V,A14P,Q45R,A74S,K83R,V89L,M96P,Q108L)
ㆍ 35 GS 링커
ㆍ 인간 혈청 알부민 결합제 ALB11002;
ㆍ C-말단 연장 알라닌.
예를 들어:
ㆍ CTLA4 결합제 서열식별번호: 60
ㆍ 35GS 링커 서열식별번호: 65
ㆍ CTLA4 결합제 서열식별번호: 60 (D1E)
ㆍ 35GS 링커 서열식별번호: 65
ㆍ 인간 혈청 알부민 결합제 서열식별번호: 66
ㆍ 알라닌
(본 발명은 이러한 모이어티의 배열을 포함한 임의의 결합제를 포함함).
본 발명은 또한, 하기 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 ISVD, F023700914를 제공한다:
Figure 112018058018500-pct00012
(서열식별번호: 64; 35GS 링커: 점선으로 강조됨; CDR: 강조되고/거나 볼드체). 임의적으로, 분자 내의 임의의 결합제 모이어티의 첫 번째 잔기는 적절히 D 또는 E로 치환된다.
임의적으로, 상기 CTLA4 ISVD는 신호 펩티드, 예컨대 하기를 포함한다:
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTN
NGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKR (서열식별번호: 70)
F023700914는 하기 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다:
Figure 112018058018500-pct00013
(서열식별번호: 63; 뉴클레오티드 1-255의 신호 서열이 임의적으로 결여됨).
F023700912는 하기 모이어티를 포함한다:
ㆍ CTLA4 결합제 11F01 (E1D,L11V,A14P,Q45R,A74S,K83R,V89L,M96P,Q108L);
ㆍ 35 GS 링커;
ㆍ 인간 혈청 알부민 결합제 ALB11002;
ㆍ C-말단 연장 알라닌.
예를 들어:
ㆍ CTLA4 결합제 서열식별번호: 60
ㆍ 35GS 링커 서열식별번호: 65
ㆍ 인간 혈청 알부민 결합제 서열식별번호: 66
ㆍ 알라닌
(본 발명은 이러한 모이어티의 배열을 포함한 임의의 결합제를 포함함).
본 발명은 서열식별번호: 62 또는 64의 아미노산 서열 또는 80% 이상 (예를 들어, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 아미노산 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 임의의 다중특이적 CTLA4 결합제를 포함하며, 이러한 CTLA4 결합제는 CTLA4 및, 임의적으로, HSA에 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다.
에피토프 결합 및 교차-차단
본 발명은 본원에 제시된 CTLA4 결합제 (예를 들어, F023700912 또는 F023700914) 뿐만 아니라, 예를 들어 이러한 결합제의 동일한 CTLA4 에피토프에 결합하는 CTLA4 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함하는 결합제를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 F023700912 또는 F023700914와 동일한 잔기를 접촉시킴으로써 인간 CTLA4에 결합하는 결합제를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 인간 CTLA4의 잔기 VRVTVL (서열식별번호: 110의 잔기 33 - 38), ADSQVTEVC (서열식별번호: 110의 잔기 41-49) 및/또는 CKVELMYPPPYYLG (서열식별번호: 110의 잔기 93-106)에서, 예를 들어, 3가지 부위 모두에서 인간 CTLA4에 결합하는 결합제를 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 결합제는 수소-중수소 교환 검정에서 이들 잔기에서 인간 CTLA4에 결합하는 것을 명확하게 보여주며, 예를 들어, 도 13에 본질적으로 제시된 바와 같은 결합 히트 맵에 의해 나타낸 바와 같이, 예를 들어 중수소, 예컨대 D2O의 존재 하에 잔기가 수소에서 중수소로 교환되지 못하게 한다.
본 발명은 펩티드 서열 VRVTVL (서열식별번호: 110의 잔기 33 - 38), ADSQVTEVC (서열식별번호: 110의 잔기 41-49) 및/또는 CKVELMYPPPYYLG (서열식별번호: 110의 잔기 93-106)을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어, CTLA4에 결합되어 있는 CTLA4 결합제 (예를 들어, F023700912 또는 F023700914 또는 11F01 또는 본원에 제시된 그의 변이체 중 임의의 것)를 포함한다. 임의적으로, 상기 폴리펩티드는 세포, 예를 들어, T-세포의 표면 상에 있고, 이러한 폴리펩티드는 CTLA4 결합제에 의해 결합된다.
본 발명은 또한, 본원에 개시된 결합제 중 임의의 것 (예를 들어, F023700912 또는 F023700914)의 결합을 교차-차단할 수 있는 교차-차단 결합제를 제공한다. 이러한 교차-차단 결합제는 이러한 교차-차단을 나타내는 임의의 분자, 예를 들어, ISVD, 나노바디, 항체 또는 그의 항원-결합 단편일 수 있다.
일반적으로, 참조 결합제를 "교차-차단"시키는 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디) 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 경쟁 검정에서 참조 결합제가 그의 항원에 결합하는 것을 50% 이상 정도 차단하는 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디) 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 지칭하고, 역으로, 참조 결합제는 경쟁 검정에서 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디) 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 그의 항원에 결합하는 것을 50% 이상 정도 차단한다. 교차-차단은 표면 플라스몬 공명 (SPR), ELISA 및 유동 세포계수법을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 임의의 검정으로 결정될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 교차-차단은 비아코어(Biacore) 검정을 사용함으로써 결정된다. 편의상, 2개의 결합제를 참조하지만, 본 발명의 범위는 본 발명의 결합제를 교차-차단하는 항체 및 그의 항원 결합 단편, 예를 들어, Fab 단편을 포함한다. 비아코어 기계 (예를 들어 비아코어 3000)는 제조업자의 권고 사항에 따라서 작동한다.
따라서, 하나의 교차-차단 검정에서는, 표준 아민 커플링 화학을 이용하여 CTLA4를 CM5 비아코어 칩과 커플링시켜 CTLA4-코팅된 표면을 생성시킨다. 예를 들어, 200-800 공명 단위의 CTLA4가 상기 칩과 커플링될 것이다 (또는 용이하게 측정 가능한 수준의 결합을 제공하지만, 사용되는 시험 시약의 농도에 의해 용이하게 포화 가능한 임의의 양).
서로 교차-차단할 수 있는 능력을 알아보기 위하여 평가될 2개의 결합제 (A* 및 B*로 지칭됨)는 적합한 완충제에서 1 대 1 몰 비의 결합 부위에서 혼합하여 시험 혼합물을 창출시킨다.
이러한 시험 혼합물 중의 각각의 결합제의 농도는 비아코어 칩 상에 포획된 CTLA4 분자 상의 그 결합제에 대한 결합 부위를 용이하게 포화시키기에 충분히 높아야 한다. 혼합물 중의 결합제는 동일한 몰 농도 하에 있다.
결합제 A* 단독 및 결합제 B* 단독을 함유하는 별도의 용액을 또한 준비한다. 이들 용액 중의 결합제 A* 및 결합제 B*는 동일한 완충제 내에 있어야 하고 시험 혼합물에서와 동일한 농도 하에 있어야 한다.
시험 화합물을 CTLA4-코팅된 비아코어 칩 상으로 통과시키고, 결합 총량을 기록한다. 이어서, 상기 칩을 칩-결합된 CTLA4에 손상을 가하지 않으면서 결합된 결합제를 제거하도록 하는 방식으로 처리한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이는 상기 칩을 30 mM HCl로 60초 동안 처리함으로써 수행된다.
이어서, 결합제 A* 단독의 용액을 CTLA4-코팅된 표면 상으로 통과시키고, 결합 양을 기록한다. 상기 칩을 다시 처리하여 칩-결합된 CTLA4에 손상을 가하지 않으면서 결합된 결합제를 모두 제거한다.
이어서, 결합제 B* 단독의 용액을 CTLA4-코팅된 표면 상으로 통과시키고, 결합 양을 기록한다.
그 다음, 결합제 A*에 결합제 B*의 혼합물의 최대 이론적 결합을 계산하며, 이는 CTLA4 표면 단독 상으로 통과될 때 각각의 결합제의 결합의 합이다. 혼합물의 실제 기록된 결합이 이러한 이론적 최대치 미만인 경우, 상기 2개의 결합제는 서로 교차-차단된다.
따라서, 일반적으로, 본 발명에 따르는 교차-차단 결합제는 상기 비아코어 교차-차단 검정에서 CTLA4에 결합될 것이므로, 이러한 검정 동안 및 제2 결합제의 존재 하에, 상기 기록된 결합은, 예를 들어, 조합된 두 결합제의 최대 이론적 결합 (상기 정의된 바와 같음)의 80% 내지 0.1% (예를 들어, 80% 내지 4%), 예를 들어 최대 이론적 결합의 75% 내지 0.1% (예를 들어, 75% 내지 4%), 예를 들어, 최대 이론적 결합의 70% 내지 0.1% (예를 들어, 70% 내지 4%)이다.
본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제가 교차-차단하는지의 여부 또는 CTLA4 결합제가 본 발명에 따라서 교차-차단할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 ELISA 검정이 사용된다.
상기 검정의 일반적인 원리는 ELISA 플레이트의 웰 상으로 코팅된 CTLA4 결합제를 가져야 한다는 것이다. 과량의 제2의 잠재적으로 교차-차단하는 CTLA4 결합제를 용액에 부가한다 (즉, ELISA 플레이트에 결합되지 않음). 이어서, 제한된 양의 CTLA4를 상기 웰에 부가한다. 코팅된 결합제와 용액 중의 결합제는 제한된 수의 CTLA4 분자의 결합을 놓고 경쟁한다. 상기 플레이트를 세척하여, 상기 코팅된 결합제에 의해 결합되지 않은 CTLA4를 제거하고, 또한 제2의 용액 상 결합제 뿐만 아니라 제2의 용액 상 결합제와 CTLA4 간에 형성된 어떠한 복합체도 제거한다. 이어서, 적절한 CTLA4 검출 시약을 사용하여, 결합된 CTLA4의 양을 측정한다. 코팅된 결합제를 교차-차단할 수 있는 용액 중의 결합제는 CTLA4 분자의 수에 있어서의 감소를 유발시킬 수 있을 것이므로, 코팅된 결합제는 CTLA4 분자의 수에 비례하여 결합할 수 있어서, 코팅된 결합제는 제2의 용액 상 결합제의 부재 하에 결합할 수 있다.
발현 방법
본 발명은 (i) 본 발명의 CTLA4 결합제의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하며, 예를 들어, 여기서 폴리뉴클레오티드는 벡터 내에 있고/거나 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 단계; (ii) 숙주 세포 (예를 들어, CHO 또는 피키아 또는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris))를 상기 폴리뉴클레오티드의 발현에 유리한 조건 하에 배양하는 단계; 및 (iii) 임의적으로, 숙주 세포 및/또는 상기 숙주 세포가 성장하는 배지로부터 CTLA4 결합제를 단리하는 단계를 포함하는, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디) (예를 들어, F023700912 또는 F023700914)를 제조하는 재조합 방법을 포함한다. 예를 들어, WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 또는 WO 2009/068627을 참조한다.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디) (예를 들어, F023700912 또는 F023700914)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 한 실시양태에서, 하나 이상의 제어 서열과 작동가능하게 연결될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 또는 벡터의 형태 내에 있을 수 있다. 또한, 이러한 폴리뉴클레오티드는 일반적으로, 아블링스 엔.브이.의 공개된 특허 출원, 예컨대 예를 들어 WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 또는 WO 2009/068627에 기재된 바와 같을 수 있다.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 상기 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및/또는 CTLA4 결합제 (예를 들어, F023700912 또는 F023700914)를 함유하는 숙주 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 이러한 숙주 세포는 일반적으로, 아블링스 엔.브이.의 공개된 특허 출원, 예컨대 예를 들어 WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 또는 WO 2009/068627에 기재된 바와 같을 수 있다. 특이적 숙주 세포의 예가 아래에 논의된다.
CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)의 발현을 위한 숙주로서 포유류 세포를 포함한 진핵 및 원핵 숙주 세포는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection; ATCC)으로부터 입수 가능한 많은 불멸화 세포주를 포함한다. 이들은 특히, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, NSO, SP2 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포성 암종 세포 (예를 들어, Hep G2), A549 세포, 3T3 세포, HEK-293 세포 및 수많은 다른 세포주를 포함한다. 포유류 숙주 세포는 인간, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말 및 햄스터 세포를 포함한다. 특별히 선호되는 세포주는 높은 발현 수준을 갖는 세포주를 결정함으로써 선택된다. 사용될 수 있는 다른 세포주는 곤충 세포주 [예를 들어, 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 또는 트리코플루시아 니 (Trichoplusia ni)], 양서류 세포, 박테리아 세포, 식물 세포 및 진균 세포이다. 진균 세포는 효모 및 섬유상 진균 세포, 예를 들어, 피키아 파스토리스, 피키아 핀란디카 (Pichia finlandica), 피키아 트레할로필라 (Pichia trehalophila), 피키아 코클라마에 (Pichia koclamae), 피키아 멤브라나에파시엔스 (Pichia membranaefaciens), 피키아 미누타 (Pichia minuta) (오가타에아 미누타 (Ogataea minuta), 피키아 린드네리 (Pichia lindneri)), 피키아 오푼티아에 (Pichia opuntiae), 피키아 써모톨레란스 (Pichia thermotolerans), 피키아 살릭타리아 (Pichia salictaria), 피키아 구에르쿰 (Pichia guercuum), 피키아 피지페리 (Pichia pijperi), 피키아 스팁티스 (Pichia stiptis), 피키아 메타놀리카 (Pichia methanolica), 피키아 종 (Pichia sp .), 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 종 (Saccharomyces sp .), 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스 종 (Kluyveromyces sp .), 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 아스페르길루스 니둘란스 (Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니거 (Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae), 트리코데르마 레에세이 (Trichoderma reesei), 크리소스포리움 루크노웬세 (Chrysosporium lucknowense), 푸사륨 종 (Fusarium sp.), 푸사륨 그라미네움 (Fusarium gramineum), 푸사륨 베네나툼 (Fusarium venenatum), 피스코미트렐라 파텐스 (Physcomitrella patens) 및 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa), 피키아 종, 임의의 사카로마이세스 종, 한세눌라 폴리모르파, 임의의 클루이베로마이세스 종, 칸디다 알비칸스, 임의의 아스페르길루스 종 (Aspergillus sp .), 트리코데르마 레에세이, 크리소스포리움 루크노웬세, 임의의 푸사륨 종, 야로위아 리포리티카 (Yarrowia lipolytica), 및 뉴로스포라 크라사를 포함한다. 본 발명은 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, F023700912 또는 F023700914)를 함유하거나 또는 이러한 결합제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하거나 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 함유하는 임의의 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포 또는 피키아 세포, 예를 들어, 피키아 파스토리스)를 포함한다.
추가로, 생산 세포주로부터의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)의 발현은 수많은 공지된 기술을 이용하여 증강될 수 있다. 예를 들어, 글루타민 신테타제 유전자 발현 시스템 (GS 시스템)이 특정의 조건 하에 발현을 증강시키기 위한 흔한 접근 방식이다. GS 시스템은 유럽 특허 번호 0 216 846, 0 256 055, 및 0 323 997 및 유럽 특허 출원 번호 89303964.4와 연계해서 전부 또는 부분적으로 논의된다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 포유류 숙주 세포 (예를 들어, CHO)에는 글루타민 신테타제 유전자가 결여되고, 이 세포는 배지에서 글루타민의 부재 하에 성장되지만, 이뮤노글로불린 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서의 상기 유전자의 결여를 보완해 주는 글루타민 신테타제 유전자를 포함한다. 본원에 논의된 바와 같은 결합제 또는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 함유하는 상기 숙주 세포 뿐만 아니라 이러한 숙주 세포를 사용하여 결합제를 제조하기 위한, 본원에 논의된 바와 같은 발현 방법이 본 발명의 일부이다.
본 발명은 CTLA4 결합제를 포함하는 특정 샘플 (예를 들어, 배양 배지, 세포 용해물 또는 세포 용해물 분획, 예를 들어 용해물의 가용성 분획)을 정제 배지 [예를 들어, 양이온-교환 배지, 음이온-교환 배지, 소수성 교환 배지, 친화성 정제 배지 (예를 들어, 단백질-A, 단백질-G, 단백질-A/G, 단백질-L)]에 도입하고; 정제된 CTLA4 결합제를, 상기 배지에 결합되지 않은 상기 샘플의 관류 분획으로부터 수집하거나; 또는 그러한 관류 분획을 폐기하고 결합된 CTLA4 결합제를 상기 배지로부터 용출시키며 이러한 용출액을 수집하는 것을 포함하는, CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)의 정제 방법을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 배지는 샘플이 적용되는 칼럼 내에 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 정제 방법은 숙주 세포에서 항체 또는 단편의 재조합 발현 후에 시행되며, 예를 들어 여기서는 숙주 세포를 먼저 용해시키고, 임의적으로 그 용해물을 배지 상에서 정제하기 전에 불용성 물질로부터 정제하거나; 또는 CTLA4 결합제를 숙주 세포에 의해 배양 배지 내로 분비시키고, 그러한 배지 또는 그의 특정 분획을 정제 배지에 적용한다.
일반적으로, 특정한 세포주 또는 트랜스제닉 동물에게서 생산된 당단백질은 이러한 세포주 또는 트랜스제닉 동물에서 생산된 당단백질에 대해 특징적인 글리코실화 패턴을 가질 것이다. 따라서, CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)의 특정한 글리코실화 패턴은 CTLA4 결합제를 생산하기 위해 사용되는 특정한 세포주 또는 트랜스제닉 동물에 좌우될 것이다. 단지 비-푸코실화 N-글리칸을 포함하는 CTLA4 결합제가 본 발명의 일부이고 유리할 수 있으며, 이는 비-푸코실화 항체가 시험관내와 생체내 둘 다에서 그의 푸코실화 대응물보다 더 강력한 효능을 전형적으로 나타내는 것으로 밝혀졌기 때문이다 (예를 들어, 문헌 [Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003)]; 미국 특허 번호 6,946,292 및 7,214,775 참조). 비-푸코실화 N-글리칸을 수반한 이들 CTLA4 결합제는 면역원성일 가능성이 없으며, 이는 그들의 탄수화물 구조가 인간 혈청 IgG에 존재하는 집단의 정상적인 구성 요소이기 때문이다.
본 발명은 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO N-연결된 글리칸) 또는 조작된 효모 세포 (조작된 효모 N-연결된 글리칸), 예컨대, 예를 들어, 피키아 파스토리스에서 생산된 이뮤노글로불린에 전형적으로 부가되는 N-연결된 글리칸을 포함하는 CTLA4 결합제를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 도 4에 제시되는 "조작된 효모 N-연결된 글리칸" 또는 "CHO N-연결된 글리칸" 중 하나 이상을 포함한다 (예를 들어, G0 및/또는 G0-F 및/또는 G1 및/또는 G1-F 및/또는 G2-F 및/또는 Man5). 본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제는 조작된 효모 N-연결된 글리칸, 즉 G0 및/또는 G1 및/또는 G2를 포함하고, 임의적으로, Man5를 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제는 CHO N-연결된 글리칸, 즉 G0-F, G1-F 및 G2-F를 포함하고, 임의적으로, G0 및/또는 G1 및/또는 G2 및/또는 Man5를 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제 상의 모든 N-연결된 글리칸의 약 80% 내지 약 95% (예를 들어, 약 80-90%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95%)가 조작된 효모 N-연결된 글리칸 또는 CHO N-연결된 글리칸이다. 문헌 [Nett et al. Yeast. 28(3): 237-252 (2011); Hamilton et al. Science. 313(5792): 1441-1443 (2006); Hamilton et al. Curr Opin Biotechnol. 18(5): 387-392 (2007)]을 참조한다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 조작된 효모 세포는 GFI5.0 또는 YGLY8316 또는 미국 특허 번호 7,795,002 또는 문헌 [Zha et al. Methods Mol Biol. 988:31-43 (2013)]에 제시된 균주이다. 또한 국제 특허 출원 공개 번호 WO2013/066765를 참조한다.
조합물
특정한 실시양태에서, 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 임의의 질환, 예컨대 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게서, 상기 질환, 예컨대 예를 들어, 본원에 논의된 바와 같은 암을 치료 또는 예방하기 위하여, 단독으로 사용되거나 또는 다른 추가 치료제 및/또는 치료 절차과 연합하여 사용될 수 있다. 이러한 CTLA4 결합제를 추가 치료제와 연합하여 포함하는 조성물 또는 키트, 예를 들어 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 또한 본 발명의 일부이다.
용어 "와 연합하여"는 구성 요소인 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)를 또 다른 작용제, 예컨대 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙과 함께, 예를 들어 동시 전달을 위하여 단일 조성물로 제형화할 수 있거나, 또는 2개 이상의 조성물로 별도로 제형화할 수 있다 (예를 들어, 키트). 각각의 성분은 다른 성분이 투여되는 시간와 상이한 시간에 대상체에게 투여될 수 있으며; 예를 들어, 각각의 투여는 소정의 기간에 걸쳐 일정 간격으로 비-동시적으로 (예를 들어, 별도로 또는 순차적으로) 제공될 수 있다. 더욱이, 별도의 성분은 동일하거나 또는 상이한 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다 (예를 들어, 본 발명의 CTLA4 결합제는 비경구적으로 투여되고 파클리탁셀은 경구적으로 투여됨).
특정한 실시양태에서, CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 항암 치료제 또는 면역조정 약물, 예컨대 면역조정 수용체 억제제, 예를 들어, 이러한 수용체와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 연합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 억제제 (예를 들어, 작은 유기 분자 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편), 예컨대: MTOR (라파마이신의 포유류 표적) 억제제, 세포독성제, 백금 작용제, BRAF 억제제, CDK4/6 억제제, EGFR 억제제, VEGF 억제제, 미세소관 안정화제, 탁산, CD20 억제제, CD52 억제제, CD30 억제제, RANK (핵 인자 카파-B의 수용체 활성화제) 억제제, RANKL (핵 인자 카파-B 리간드의 수용체 활성화제) 억제제, ERK 억제제, MAP 키나제 억제제, AKT 억제제, MEK 억제제, PI3K 억제제, HER1 억제제, HER2 억제제, HER3 억제제, HER4 억제제, Bcl2 억제제, CD22 억제제, CD79b 억제제, ErbB2 억제제, 또는 파르네실 단백질 트랜스퍼라제 억제제 중 하나 이상과 연합된다.
본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 하기 중 하나 이상과 연합된다: 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 이필리무맙), 항-PD1 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, CT-011), 항-PDL1, 항-CTLA4, 항-TIM3, 항-CS1 [예를 들어, 엘로투주맙(elotuzumab)], 항-KIR2DL1/2/3 [예를 들어, 리릴루맙(lirilumab)], 항-CD27, 항-CD137 [예를 들어, 우렐루맙(urelumab)], 항-GITR (예를 들어, TRX518), 항-PD-L1 (예를 들어, BMS-936559, MSB0010718C 또는 MPDL3280A), 항-PD-L2, 항-ILT1, 항-ILT2, 항-ILT3, 항-ILT4, 항-ILT5, 항-ILT6, 항-ILT7, 항-ILT8, 항-CD40, 항-OX40, 항-CD137, 항-KIR2DL1, 항-KIR2DL2/3, 항-KIR2DL4, 항-KIR2DL5A, 항-KIR2DL5B, 항-KIR3DL1, 항-KIR3DL2, 항-KIR3DL3, 항-NKG2A, 항-NKG2C, 항-NKG2E, 또는 상기 표적의 임의의 작은 유기 분자 억제제; IL-10, 항-IL10, 항-TSLP (흉선 간질 림포포이에틴) 또는 PEG화 IL-10.
본 발명의 한 실시양태에서, PEG화 IL-10 분자 상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티의 분자량은 약 12,000 달톤 또는 약 20,000 달톤이다. 본 발명의 한 실시양태에서, PEG화 IL-10 (예를 들어, PEG화 인간 IL-10)은 링커 (예를 들어, C2-12 알킬, 예컨대 --CH2CH2CH2--)를 통하여 IL-10의 단일 서브유닛의 단일 아미노산 잔기에 공유적으로 부착된 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포함하며, 여기서 상기 아미노산 잔기는 N-말단 아미노산 잔기의 알파 아미노 기 또는 리신 잔기의 엡실론 아미노 기이다. 본 발명의 한 실시양태에서, PEG화 IL-10은 (PEG)b-L-NH-IL-10 (여기서 b는 1-9이고 L은 IL-10의 단일 아미노산 잔기의 질소 (N)에 공유적으로 부착된 C2-12 알킬 링커 모이어티임)이다. 본 발명의 한 실시양태에서, PEG화 IL-10의 IL-10은 하기 식을 갖는다: [X--O(CH2CH2O)n]b-L-NH-IL-10 (여기서 X는 H 또는 C1-4 알킬이고; n은 20 내지 2300이고; b는 1 내지 9이고; L은 1개의 IL-10 서브유닛의 아미노 말단에서 알파 아미노 기의 질소 (N)에 공유적으로 부착되는 C1-11 알킬 링커 모이어티인데; 단 b가 1 초과이면, n의 총수는 2300을 초과하지 않음). US7,052,686을 참조한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항-IL-10 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 인간화 항체)은 아래 제시된 CDR을 포함한다:
CDR-L1: KTSQNIFENLA (서열식별번호: 71);
CDR-L2: NASPLQA (서열식별번호: 72);
CDR-L3: HQYYSGYT (서열식별번호: 73);
CDR-H1: GFTFSDYHMA (서열식별번호: 74);
CDR-H2: SITLDATYTYYRDSVRG (서열식별번호: 75);
CDR-H3: HRGFSVWLDY (서열식별번호: 76);
(US 7,662,379 참조).
본 발명의 한 실시양태에서, 항-TSLP 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 인간화 항체)은 아래 제시된 CDR을 포함한다:
CDR-H1: GYIFTDYAMH (서열식별번호: 77);
CDR-H2: TFIPLLDTSDYNQNFK (서열식별번호: 78);
CDR-H3: MGVTHSYVMDA (서열식별번호: 79);
CDR-L1: RASQPISISVH (서열식별번호: 80);
CDR-L2: FASQSIS (서열식별번호: 81);
CDR-L3: QQTFSLPYT (서열식별번호: 82);
(WO2008/76321 참조).
본 발명의 한 실시양태에서, 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 인간화 항체)은 아래 제시된 CDR을 포함한다:
CDR-H1: GFIIKATYMH (서열식별번호: 83);
CDR-H2: RIDPANGETKYDPKFQV (서열식별번호: 84);
CDR-H3: YAWYFDV (서열식별번호: 85);
CDR-L1: RASENIYSFLA (서열식별번호: 86);
CDR-L2: HAKTLAE (서열식별번호: 87);
CDR-L3: QHYYGSPLT (서열식별번호: 88);
(WO2012/04367 참조).
따라서, 본 발명은 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)를 펨브롤리주맙과 연합하여 포함하는 조성물; 뿐만 아니라 유효량의 CTLA4 결합제를 펨브롤리주맙과 연합하여 (예를 들어, 펨브롤리주맙은 3주마다 1회 200 mg 투여됨) 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다. 임의적으로, 상기 대상체에게 또 다른 추가 치료제와 연합하여 투여하기도 한다.
본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 하기 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 (또는 그의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3):
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열식별번호: 89) 및 하기 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 (또는 그의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3):
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열식별번호: 90)
를 포함하는 펨브롤리주맙 항체와 연합된다.
본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 하기 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 (또는 그의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3):
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열식별번호: 91); 및 하기 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 (또는 그의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3):
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열식별번호: 92)
를 포함하는 항체와 연합된다.
본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제는 하기 중 임의의 하나 이상과 연합된다: 13-시스-레티노산, 3-[5-(메틸술포닐피페라딘메틸)-인돌릴]-퀴놀론, 4-히드록시타목시펜, 5-데옥시우리딘, 5'-데옥시-5-플루오로우리딘, 5-플루오로우라실, 6-메캅토푸린, 7-히드록시스타우로스포린, A-443654, 아비라테론아세테이트, 압락산, ABT-578, 아콜비펜, ADS-100380, 아플리베르셉트, ALT-110, 알트레타민, 아미포스틴, 아미노글루테티미드, 암루비신, 암사크린, 아나그렐리드, 아나스트로졸, 안지오스타틴, AP-23573, ARQ-197, 아르족시펜, AS-252424, AS-605240, 아스파라기나제, ATI3387, AT-9263, 아트라센탄, 악시티닙, AZD1152, 바실루스 칼메트 게랑 (Bacillus Calmette - Guerin; BCG) 백신, 바타불린, BC-210, 베소두톡스, 베바시주맙, BGJ398, 비칼루타미드, 바이오111, BIO140, BKM120, 블레오마이신, BMS-214662, BMS-247550, BMS-275291, BMS-310705, 보르테지밉, 부세렐린, 부술판, 칼시트리올, 캄프토테신, 카네르티닙, 카페시타빈, 카르보플라틴, 카르무스틴, CC8490, CEA (재조합 백시니아-암배아 항원 백신), 세디라닙, CG-1521, CG-781, 클라미도신, 클로람부실, 클로로톡신, 실렌기티드, 시미티딘, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로드로네이트, 코비메트닙, COL-3, CP-724714, 시클로포스파미드, 시프로테론, 시프로테론아세테이트, 시타라빈, 시토신아라비노시드, 다브라페닙, 다카르바진, 다시노스타트, 닥티노마이신, 달로투주맙, 다누세르팁, 다사타닙, 다우노루비신, 데카타닙, 데구엘린, 데니류킨, 데옥시코포르마이신, 뎁시펩티드, 디아릴프로피오니트릴, 디에틸스틸베스트롤, 디프티톡스, DNE03, 도세탁셀, 도비티닙, 독소루비신, 드롤록시펜, 에도테카린, 이트륨-90 표지된 에도트레오티드, 에도트레오티드, EKB-569, EMD121974, 엔코라페닙, 엔도스타틴, 엔잘루타미드, 엔자스타우린, 에피루비신, 에피틸론 B, ERA-923, 에르비툭스, 에를로티닙, 에스트라디올, 에스트라무스틴, 에토포시드, 에베롤리무스, 엑세메스탄, 피클라투주맙, 피나스테리드, 플라보피리돌, 플록수리딘, 플루다라빈, 플루드로코르티손, 플루옥시메스테론, 플루타미드, FOLFOX 요법, 풀베스트란트, 갈레테론, 가네테스핍, 게피티닙, 젬시타빈, 지마테칸, 글루코피라노실 지질 A, 고세렐린, 고세렐린 아세테이트, 고시폴, GSK461364, GSK690693, HMR-3339, 히드록시프로게스테론카프로에이트, 히드록시우레아, IC87114, 이다루비신, 이독시펜, 이포스파미드, IM862, 이마티닙, IMC-1C11, 이미퀴모드, INC280, INCB24360, INO1001, 인터페론, 인터류킨-2, 인터류킨-12, 이필리무맙, 이리노테칸, JNJ-16241199, 케토코나졸, KRX-0402, 라파티닙, 라소폭시펜, LEE011, 레트로졸, 류코보린, 류프롤리드, 류프롤리드 아세테이트, 레바미솔, 리포솜 포착된 파클리탁셀, 로무스틴, 로나파르닙, 루칸톤, LY292223, LY292696, LY293646, LY293684, LY294002, LY317615, LY3009120, 마리마스타트, 메클로르에타민, 메드록시프로게스테론아세테이트, 메게스트롤아세테이트, MEK162, 멜팔란, 메르캅토푸린, 메스나, 메토트렉세이트, 미트라마이신, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 열 사멸된 미코박테리움 오부엔세 (Mycobacterium obuense)의 현탁제, 토자세르팁, MLN8054, 나티토클락스, 네오바스타트, 네라티닙, 뉴라디압, 닐로티닙, 닐루티미드, 놀라트렉세드, NVP-BEZ235, 옵리메르센, 옥트레오티드, 오파투무맙, 오레고보맙, 오르나투주맙, 오르테로넬, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 팔보시클립, 파미드로네이트, 파니투무맙, 파조파닙, PD0325901, PD184352, PEG-인터페론, 페메트렉세드, 펜토스타틴, 페리포신, 페닐알라닌무스타드, PI-103, 픽틸리십, PIK-75, 피펜독시펜, PKI-166, 플리카마이신, 폴리-ICLC, 포르피머, 프레드니손, 프로카르바진, 프로게스틴, PSK 단백질 결합된 폴리사카라이드 [바시디오마이세테 코리올루스 베르시콜로르 (Basidiomycete coriolus versicolor)로부터 유래됨], PLX8394, PX-866, R-763, 랄록시펜, 랄티트렉세드, 라족신, 리다포롤리무스, 리툭시맙, 로미뎁신, RTA744, 루비테칸, 스크립타이드, Sdx102, 셀리시클립, 셀루메티닙, 세막사닙, SF1126, 시롤리무스, SN36093, 소라페닙, 스피로놀락톤, 스쿠알라민, SR13668, 스트렙토조신, SU6668, 수베로일아날리드 히드록삼산, 수니티닙, 합성 에스트로겐, 탈람파넬, 탈리모겐 라헤르파렙벡, 타목시펜, 테모졸로미드, 템시롤리무스, 테니포시드, 테스밀리펜, 테스토스테론, 테트란드린, TGX-221, 탈리도미드, 6-티오구아닌, 티오테파, 티실리무맙, 티피파르닙, 티보자닙, TKI-258, TLK286, TNFα (종양 괴사 인자 알파), 토포테칸, 토레미펜 시트레이트, 트라벡테딘, 트라메티닙, 트라스투주맙, 트레티노인, 트리코스타틴 A, 트리시리빈포스페이트 1수화물, 트립토렐린 파모에이트, TSE-424, 우라실 무스타드, 발프로산, 발루비신, 반데타닙, 바탈라닙, VEGF 트랩, 베무라페닙, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 비탁신, 비테스판, 보리노스타트, VX-745, 워르트만닌, Xr311, 바실루스 투베르쿨로시스 (Bacillus tuberculosis)의 Z-100 온수 추출물, 자놀리무맙, ZK186619, ZK-304709, ZM336372 또는 ZSTK474.
본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 하기를 포함하지만, 그에 제한되지 않는 하나 이상의 항구토제와 연합된다: 카소피탄트 (글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)), 네투피탄트 (MGI-헬신(MGI-Helsinn)) 및 다른 NK-1 수용체 길항제, 팔로노세트론 (MGI 파마(MGI Pharma)가 알록시(Aloxi)로서 판매함), 아프레피탄트 (머크 앤 캄파니(Merck and Co.) (뉴저지주 로웨이)가 에멘드(Emend)로서 판매함), 디펜히드라민 (화이자(Pfizer) (뉴욕주 뉴욕)가 베나드릴(Benadryl)®로서 판매함), 히드록시진 (화이자 (뉴욕주 뉴욕)가 아타락스(Atarax)®로서 판매함), 메토클로프라미드 (AH 로빈스 캄파니(AH Robins Co.) (버지니아주 리치몬드)가 레글란(Reglan)®으로서 판매함), 로라제팜 (와이어스(Wyeth) (뉴저지주 매디슨)가 아티반(Ativan)®으로서 판매함), 알프라졸람 (화이자 (뉴욕주 뉴욕)가 재낵스(Xanax)®로서 판매함), 할로페리돌 (오르토-맥네일(Ortho-McNeil) (뉴저지주 래리턴)이 할돌(Haldol)®로서 판매함), 드로페리돌 (이납신(Inapsine)®), 드로나비놀 (솔베이 파마슈티칼스, 인크.(Solvay Pharmaceuticals, Inc.) (조지아주 매리에타)가 마리놀(Marinol)®로서 판매함), 덱사메타손 (머크 앤 캄파니(뉴저지주 로웨이)가 데카드론(Decadron)®으로서 판매함), 메틸프레드니솔론 (화이자 (뉴욕주 뉴욕)가 메드롤(Medrol)®로서 판매함), 프로클로르페라진 (글락소스미스클라인 (노스캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크)이 콤파진(Compazine)®으로서 판매함), 그라니세트론 (호프만-라 로슈 인크.(Hoffmann-La Roche Inc.) (미국 뉴저지주 너틀리)가 키트릴(Kytril)®로서 판매함), 온단세트론 (글락소스미스클라인 (노스캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크)이 조프란(Zofran)®으로서 판매함), 돌라세트론 (사노피-아벤티스(Sanofi-Aventis) (뉴욕주 뉴욕)가 안제메트(Anzemet)®로서 판매함), 트로피세트론 (노바티스(Novartis) (뉴저지주 이스트 하노버)가 나보반(Navoban)®으로서 판매함).
암 치료의 다른 부작용은 적혈구 및 백혈구 결핍증을 포함한다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 이러한 결핍증을 치료 또는 예방시켜 주는 작용제, 예컨대, 예를 들어, 필그라스팀, PEG-필그라스팀, 에리트로포이에틴, 에포에틴 알파 또는 다르베포에틴 알파와 연합된다.
본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 백신과 연합된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 백신은 항암 백신, 펩티드 백신 또는 DNA 백신이다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 백신은 종양 세포 (예를 들어, 방사선 조사된 종양 세포) 또는 수지상 세포 (예를 들어, 종양 펩티드로 펄스된 수지상 세포)이다.
본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 치료 절차과 연합하여 투여된다. 치료 절차는 하나 이상의 증상 (예를 들어, 암 및/또는 감염성 질환의 하나 이상의 증상)의 퇴행 또는 제거를 유도시키는 것에 의해서든지, 아니면 이러한 증상(들), 예를 들어, 암 증상, 예컨대 종양 성장 또는 전이의 진행을 임의의 임상적으로 측정 가능한 정도로 억제하는 것에 의해서든지 간에, 치료받는 대상체에서 상기 하나 이상의 증상을 경감시키는 것을 목적으로 하는, 대상체를 치료하는데 있어서 의사 또는 임상의에 의해 수행된 하나 이상의 단계이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 치료 절차는 항암 방사선 요법이다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 방사선 요법은 외부 빔 요법 (EBT)인데, 이는 고 에너지 X선의 빔을 종양 위치에 전달하는 방법이다. 이러한 빔은 환자의 외부에 생성되고 (예를 들어, 선형 가속기에 의함), 종양 부위를 표적으로 한다. 이들 X선은 암세포를 파괴시킬 수 있고, 조심스럽게 치료 계획을 세우면 주변의 정상 조직은 보존할 수 있다. 방사선 공급원이 환자의 신체 내부에 놓이지 않는다. 본 발명의 한 실시양태에서, 방사선 요법은 양성자 빔 요법인데, 이는 X선 대신 양성자를 사용하여 병든 조직을 공격하는 입체조형 요법의 한 유형이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 방사선 요법은 입체조형 외부 빔 방사선 요법인데, 이는 방사선 요법이 개개인의 신체 구조에 맞도록 진보된 기술을 사용하는 시술이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 방사선 요법은 근접조사 요법인데, 이는 방사성 물질을 신체 내에 일시적으로 배치하는 것으로, 통상적으로 특정 부위에 추가 선량 또는 부스트의 방사선을 제공하며 이용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)와 연합하여 투여된 외과적 시술은 외과적 종양절제술이다.
치료적 용도
본 발명은 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)를 임의적으로 추가 치료제 또는 치료 절차과 연합하여 사용함으로써 예방 또는 치료될 수 있는 적어도 하나의 질환 또는 장애를 예방 및/또는 치료하는 방법을 포함하며, 이러한 방법은 상기 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에게, 제약상 활성 양의 CTLA4 결합제, 및/또는 이를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
"치료" 또는 "치료하는" 것은 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)를, 예를 들어, 암 또는 감염성 질환이 있거나, 또는 암 또는 감염성 질환이 있는 것으로 의심되는 (그에 대한 작용제가 치료 활성을 가짐) 대상체를 치료하는데 있어서 CTLA4 결합제가 유효한 질환의 하나 이상의 증상을 갖는 대상체 (예를 들어, 포유류, 예컨대 인간)에게 투여하는 것을 의미한다. 전형적으로, CTLA4 결합제는 하나 이상의 증상 (예를 들어, 암 또는 감염성 질환의 하나 이상의 증상)의 퇴행 또는 제거를 유도하는 것에 의해서든지, 아니면 이러한 증상(들), 예를 들어, 암 증상, 예컨대 종양 성장 또는 전이의 진행을 임의의 임상적으로 측정 가능한 정도로 억제하는 것에 의해서든지 간에, 치료받는 대상체 또는 집단에게서 상기 하나 이상의 증상을 경감시켜 줄 "유효량" 또는 "유효한 용량"으로 투여된다. CTLA4 결합제의 유효량은 질환 병기, 환자의 연령 및 체중, 및 대상체에서 목적하는 반응을 유발시킬 수 있는 약물의 능력과 같은 요인에 따라서 다양할 수 있다.
치료하고자 하는 대상체는 임의의 온혈 동물일 수 있지만, 특히 포유류, 보다 특히 인간이다. 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 치료하고자 하는 대상체는 특히, 본원에 언급된 질환 및 장애를 앓고 있거나, 또는 이러한 질환 또는 장애에 걸릴 위험이 있는 사람일 것이다. 일반적으로, 치료 요법은 목적하는 치료 효과가 달성될 때까지 및/또는 목적하는 치료 효과가 유지되어야 하는 한은 수행될 것이다. 또한, 이는 임상의에 의해 결정될 수 있다.
본원에 기재된 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디), 폴리펩티드, 화합물, 및 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 벡터)는 바람직하게, 순환계에 투여된다. 따라서, 이들은 CTLA4 결합제, 폴리펩티드, 화합물, 및 폴리뉴클레오티드를 순환계 내로 유입될 수 있게 해주는 임의의 적합한 방식으로, 예컨대 주사 또는 주입을 통하여 정맥내로 투여될 수 있거나, 또는 CTLA4 결합제, 폴리펩티드, 화합물, 및 폴리뉴클레오티드를 순환계 내로 유입될 수 있게 해주는 임의의 다른 적합한 방식 (경구 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 피부를 통한 투여, 비내 투여, 폐를 통한 투여 등 포함)으로 투여될 수 있다. 적합한 투여 방법 및 투여 경로는 통상의 기술자에게 명백할 것인데, 이는 또한, 예를 들어 아블링스 엔.브이.의 공개된 특허 출원, 예컨대 예를 들어 WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 또는 WO 2009/068627의 교시로부터 명백할 것이다.
본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)의 제약 또는 멸균성 조성물을 제조하기 위하여, CTLA4 결합제를 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합한다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)]을 참조한다. 이러한 조성물은 본 발명의 일부이다.
본 발명의 범위는 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)를 포함하는 건조된, 예를 들어, 동결 건조된 조성물; 또는 제약상 허용되는 담체를 포함하지만 물이 실질적으로 결여된 그의 제약 조성물을 포함한다.
치료제 및 진단제의 제형은 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제와 혼합함으로써, 예를 들어, 동결건조된 산제, 슬러리, 수성 용제 또는 현탁제의 형태로 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY] 참조).
일반적으로, 본원에 언급된 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료를 위하여 및 치료하고자 하는 특이적 질환 또는 장애, 사용될 특이적 융합 단백질 또는 구조물의 효력 및/또는 반감기, 구체적 투여 경로 및 사용된 특이적 제약 제형 또는 조성물에 따라서, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩티드는 일반적으로, 1일 체중 kg당 1 그램 내지 0.01 마이크로그램, 바람직하게 1일 체중 kg당 0.1 그램 내지 0.1 마이크로그램, 예컨대 1일 체중 kg당 약 1, 10, 100 또는 1000 마이크로그램의 양으로 투여될 것인데, 이는 단일 1일 용량으로서 연속적으로 (예를 들어, 주입에 의함) 투여되거나 또는 그날 동안 수회 용량 분으로 나누어서 투여될 것이다. 임상의는 일반적으로, 본원에 언급된 요인에 따라서 적합한 1일 용량을 결정할 수 있을 것이다. 구체적인 경우에, 임상의는, 예를 들어 상기 인용된 요인을 기준으로 하고 자신의 전문적 판단에 근거하여, 이들 양을 벗어나서 선택할 수 있다는 것이 또한 명백할 것이다. 일반적으로, 투여될 양에 관한 일부 가이드라인은 본질적으로 동일한 경로를 통하여 투여된 동일한 표적에 대항한 거의 동등한 수준의 통상적인 항체 또는 항체 단편에 대하여 통상적으로 투여되는 양으로부터 수득될 수 있지만, 친화도/결합 활성도, 효능, 생체내 분포, 반감기 및 통상의 기술자에게 널리 공지된 유사한 요인 상의 차이를 고려할 수 있다.
CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)를 대상체에게 투여하는 방식은 다양할 수 있다. 투여 경로는 경구, 직장, 경점막, 장내, 비경구; 근육내, 피하, 피내, 수질내, 척추강내, 직접 뇌실내, 정맥내, 복강내, 비내, 안내, 흡입, 취입, 국소, 피부, 경피 또는 동맥내를 포함한다.
적절한 용량의 결정은, 예를 들어, 치료에 영향을 미치는 것으로 관련 기술분야에 공지되어 있거나 또는 추정되는 파라미터 또는 인자를 이용하여, 임상의에 의해 이루어진다. 일반적으로, 용량을 결정하는데 있어서, 그 용량은 최적의 용량보다 다소 적은 양으로 시작하고, 임의의 부정적 부작용과 비교하여 목적하거나 또는 최적의 효과가 달성될 때까지 그 후 소량씩 증가시킨다. 중요한 진단 측정치는, 예를 들어, 염증의 증상 또는 생산된 염증성 시토카인의 수준을 포함한다. 일반적으로, 사용될 생물학적 제제는 치료를 위해 표적화된 동물과 동일한 종으로부터 유래됨으로써, 시약에 대한 어떠한 면역 반응도 최소화시키는 것이 바람직하다. 인간 대상체의 경우, 예를 들어, 키메라, 인간화 및 완전한 인간 항체가 바람직할 수 있다. 적절한 용량을 선택하는데 있어서의 가이드라인은 입수 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom et al. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602] 참조).
특정 질환 증상이 경감되었는지의 여부는 그러한 증상의 중증도 또는 진행 상태를 평가하기 위하여 의사 또는 다른 전문 헬스케어 제공자에 의해 전형적으로 사용되는 임의의 임상 측정에 의해 평가될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태 (예를 들어, 치료 방법 또는 제조 물품)가 모든 대상체에서 표적 질환 증상(들)을 완화하는데 효과적이지 않을 수 있지만, 이는 관련 분야에 공지된 임의의 통계적 테스트 예컨대 스튜던트(Student) t 테스트, chi2-테스트, 만 & 휘트니(Mann & Whitney)에 따른 U-테스트, 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 테스트 (H-테스트), 존키어-테릅스트라(Jonckheere-Terpstra)-테스트 및 윌콕슨(Wilcoxon)-테스트에 의해 결정된 바와 같이 통계적으로 유의한 수의 대상체에서 표적 질환 증상(들)을 완화하여야 한다.
일반적으로, 치료 요법은 목적하는 치료 효과가 달성될 때까지 및/또는 목적하는 치료 효과가 유지되어야 하는 한은 수행될 것이다. 또한, 이는 임상의에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 CTLA4에 결합할 수 있기 때문에, 이는 특히, 암, 전이성 암, 고형 종양, 혈액암, 백혈병, 림프종, 골육종, 횡문근육종, 신경모세포종, 신장암, 백혈병, 신장 이행 세포암, 방광암, 윌름스암, 난소암, 췌장암, 유방암, 전립선암, 골암, 폐암, 비소세포 폐암, 위암, 결장직장암, 자궁경부암, 활막 육종, 두경부암, 편평 세포 암종, 다발성 골수종, 신세포암, 망막모세포종, 간모세포종, 간세포성 암종, 흑색종, 신장의 횡문근양 종양, 유잉 육종, 연골육종, 뇌암, 교모세포종, 수막종, 뇌하수체 선종, 전정 슈반세포종, 원시 신경외배엽 종양, 수모세포종, 성상세포종, 역형성 성상세포종, 핍지교종, 상의세포종, 맥락총 유두종, 진성 다혈구혈증, 혈소판혈증, 특발성 골수섬유증, 연부 조직 육종, 갑상선암, 자궁내막암, 카르시노이드 암 또는 간암, 유방암 및 위암의 치료 또는 예방을 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)는 감염성 질환, 예컨대, 예를 들어, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염 또는 기생충 감염의 치료 또는 예방을 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 바이러스 감염은 인간 면역결핍증 바이러스 (HIV), 에볼라 바이러스, 간염 바이러스 (A, B, 또는 C), 포진 바이러스 (예를 들어, VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II, 및 CMV, 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파르보바이러스, 백시니아 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기 바이러스, 유두종 바이러스, 물사마귀 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 또는 아르보바이러스성 뇌염 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로의 감염이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 박테리아 감염은 클라미디아 (Chlamydia), 리케치아 박테리아, 미코박테리아, 스타필로코쿠스, 스트렙토코쿠스, 뉴모노코쿠스, 메닝고코쿠스 및 고노코쿠스, 클레브시엘라, 프로테우스, 세라티아, 슈도모나스, 레지오넬라(Legionella), 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae), 살모넬라(Salmonella), 바실루스, 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 클로스트리디움 테탄(Clostridium tetan), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 바실루스 안트리시스(Bacillus anthricis), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 미코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 미코박테리움 레프로마토시스(Mycobacterium lepromatosis), 및 보리엘라(Borriella)로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아로의 감염이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 진균 감염은 칸디다(Candida) (알비칸스(albicans), 크루세이(krusei), 글라브라타(glabrata), 트로피칼리스(tropicalis) 등), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 아스페르길루스 (푸미가투스(fumigatus), 니거(niger) 등), 무코랄레스(Mucorales) 속 (무코르(mucor), 압시디아(absidia), 리조푸스(rhizopus)), 스포로트릭스 스켄키이(Sporothrix schenkii), 블라스토마이세스 데르마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 파라코시디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 코시디오이데스 임미티스(Coccidioides immitis) 및 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 진균으로의 감염이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 기생충 감염은 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 발란티디움 콜리(Balantidium coli), 나에글레리아 포울레리(Naegleria fowleri), 아칸타모에바(Acanthamoeba), 기아르디아 람비아(Giardia lambia), 크립토스포리디움(Cryptosporidium), 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii), 플라스모디움 비박스(Plasmodium vivax), 바베시아 미크로티(Babesia microti), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 리슈마니아 도노바니(Leishmania donovani), 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii), 닙포스트롱길루스 브라실리엔시스(Nippostrongylus brasiliensis)로 이루어진 군으로부터 선택된 기생충으로의 감염이다.
본 발명은 또한
CTLA4 결합제 (예를 들어, F023700912 또는 F023700914)를 대상체에게 투여함으로써 이러한 대상체의 신체 내에서; 또는 CTLA4를 CTLA4 결합제와 접촉시킴으로써 시험관내에서
ㆍ T-세포 공동-자극성 신호전달; T-세포 활성화, T-세포 증식의 CTLA4 매개된 억제를 방지하기 위한;
ㆍ CTLA4가 B7-1 (CD80) 또는 B7-2 (CD86)에 결합하는 것을 방지하기 위한; 및/또는
ㆍ T-세포 활성화를 증강시키기 위한
방법을 포함한다. 이러한 활성은 CTLA4 결합제를 통하여 매개될 수 있다. 따라서, 상기 방법은 또한, CTLA4 결합제를 포함하는 임의의 결합제를 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명은 또한, 전술된 질환 및 장애의 치료를 필요로 하는 (즉, 전술된 질환 중 하나를 앓고 있는) 대상체에게 치료상 유효량의 본 발명의 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디)를 일반적으로 투여하는 것을 포함하는, 전술된 질환 및 장애의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 전술된 질환 또는 장애 중 하나의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 CTLA4 결합제에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 본원에 제시된 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예컨대 나노바디), 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것 또는 그의 제약 조성물을 포함하는 주사 장치를 제공한다. 주사 장치는 특정 물질을 비경구 경로, 예를 들어, 근육내, 피하 또는 정맥내를 통하여 환자의 체내로 도입시켜 주는 장치이다. 예를 들어, 주사 장치는, 예를 들어, 주사하고자 하는 유체 (예를 들어, CTLA4 결합제 또는 그의 제약 조성물을 포함함)를 보유하기 위한 실린더 또는 배럴, 피부를 뚫기 위한 바늘 및/또는 유체를 주사하기 위한 혈관; 및 상기 실린더로부터 상기 바늘 구멍을 통해 유체를 밀어 내기 위한 플런저를 포함하는 주사기 (예를 들어, 제약 조성물이 미리 충전됨, 예컨대 자동-주사기)일 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제 또는 그의 제약 조성물을 포함하는 주사 장치는 정맥내 (IV) 주사 장치이다. 이러한 장치는 캐눌라 또는 트로카/바늘을 통하여 대상체의 신체 내로 도입된 유체 (예를 들어, 식염수; 또는 NaCl, 소듐 락테이트, KCl, CaCl2를 포함하고, 임의적으로 글루코스를 포함하는 락트산을 가한 링거 용액)를 보유하기 위한 봉지 또는 저장소에 부착될 수 있는 튜브에 부착될 수 있는 캐눌라 또는 트로카/바늘에 CTLA4 결합제 또는 그의 제약 조성물을 포함한다. CTLA4 결합제 또는 그의 제약 조성물은 본 발명의 한 실시양태에서, 일단 트로카 및 캐눌라를 대상체의 정맥 내로 삽입하고 이와 같이 삽입된 캐눌라로부터 트로카를 제거하면 상기 장치 내로 도입될 수 있다. IV 장치는, 예를 들어, 말초 정맥 (예를 들어, 손 또는 팔) 내로; 상대 정맥 또는 하대 정맥, 또는 심장의 우심방 내에 (예를 들어, 중추 IV); 또는 쇄골 하, 내부 경정 또는 대퇴 정맥 내로, 및 예를 들어, 그것이 상대 정맥 또는 우심방에 도달할 때까지 심장을 향하여 진행하여 (예를 들어, 중추 정맥 라인) 삽입될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 주사 장치는 자동 주사기; 제트 주사기 또는 외부 주입 펌프이다. 제트 주사기는 CTLA4 결합제 또는 그의 제약 조성물을 환자의 체내에 도입하기 위해 표피를 관통하는 액체의 고압 협소 제트를 이용한다. 외부 주입 펌프는 CTLA4 결합제 또는 그의 제약 조성물을 제어된 양으로 환자의 체 내로 전달시켜 주는 의료 장치이다. 외부 주입 펌프는 전기적으로 또는 기계적으로 전력을 공급받을 수 있다. 상이한 펌프는 상이한 방식으로 작동되며, 예를 들어, 주사기 펌프가 주사기의 저장소에 유체를 보유하고, 움직일 수 있는 피스톤이 유체 전달을 제어하고, 탄성중합체성 펌프가 신축성 있는 풍선 저장소에 유체를 보유하고, 풍선의 탄성 벽으로부터의 압력이 유체 전달을 구동시킨다. 연동식 펌프에서는, 일련의 롤러가 일정 길이의 유연한 튜빙에 끼어 유체를 앞으로 밀어낸다. 다중 채널 펌프에서는, 유체가 여러 속도로 다중 저장소로부터 전달될 수 있다.
또한, 도면, 임의의 서열 목록 및 실험 부분/실시예는 단지 본 발명을 추가로 예시하기 위해 제공되며, 본원에서 달리 명료하게 표시되지 않는 한, 본 발명의 범위 및/또는 첨부된 청구 범위를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 해석되거나 또는 간주되서는 안된다는 것에 주목해야 한다.
본 발명의 다른 측면, 실시양태, 이점 및 적용은 본원의 추가의 설명으로부터 명백해질 것이다.
실시예
이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이고, 이를 제한하지 않는다. 본 실시예에 제시된 조성물 및 방법은 본 발명의 일부를 형성한다.
실시예 1 : CTLA -4- Fc에 대한 F023700906 나노바디 결합.
F023700912의 빌딩 블록인 1가 F023700906 나노바디 11F01 (L11V,A14P,Q45R,A74S,K83R,V89L,M96P,Q108L)-FLAG3-HIS6)은 인간과 시노몰구스 원숭이 둘 다로부터의 CTLA-4-Fc 융합 분자에 결합하는 것으로 입증된다. 인간 CTLA-4-hFc 및 시노몰구스 원숭이 CTLA4-hFc를 사용하여 프로테온(ProteOn) XPR36 [바이오라드(BioRad) 670BR0166] 상에서 작동 속도, 이탈 속도 및 친화도를 결정하였다 (아래 표 D). 이들 결과는 인간 및 시노몰구스 원숭이 CTLA-4에 대한 상기 나노바디의 고 친화도 결합을 입증해 주며, 이는 CTLA-4의 기능을 조정할 수 있는 상기 나노바디에 대한 잠재력과, 시노몰구스 원숭이가 독성학 종으로서 사용될 수 있다는 것을 암시한다.
표 D-1. 인간 또는 시노몰구스 원숭이 CTLA -4- Fc에 대한 나노바디 결합
Figure 112018058018500-pct00014
표 D-2. 시약
Figure 112018058018500-pct00015
실시예 2 : 세포 표면 CTLA4에 대한 F023700912 나노바디 결합.
F023700912는 세포 표면 상에 발현된 인간 CTLA-4에 결합하는 것으로 입증된다. (a) 일괄 분류된 hCTLA4-과다발현 jurkat JE6.2.11 세포 또는 (b) hCTLA4-과다발현 CHO-K1 세포에 대한 F023700912 (11F01 (E1D,L11V,A14P,Q45R,A74S,K83R,V89L,M96P,Q108L)-35GS-11F01 (L11V,A14P,Q45R,A74S,K83R,V89L,M96P,Q108L)-35GS-ALB11002-A]) (채워진 원형), F023700925 (PD1 결합제-35GS-PD1 결합제-35GS-11F01 (L11V,A14P,Q45R,A74S,K83R,V89L,M96P,Q108L)-35GS-11F01 (L11V,A14P,Q45R,A74S,K83R,V89L,M96P,Q108L)-35GS-ALB11002-A]) (채워진 사각형) 및 무관한 Nb (채워진 삼각형)의 배치의 결합을 유동 세포계수법에 의해 연구하였다. ALB11002-결합 mAB ABH0074를 통하여 나노바디를 검출하였다. 이들 실험에서 생성된 데이터가 도 5 (a-b)에 제시된다. 이들 결과는 F023700912 및 F023700925가 세포 표면 상에 발현된 CTLA-4에 결합한다는 것을 입증시켜 주며, 이는 이들 나노바디가 CTLA-4의 기능을 조정한다는 것을 암시한다.
도 5 (a-b)는 (a) 2E4 일괄 분류된 인간 CTLA4-과다발현 jurkat JE6.2.11 세포/웰 또는 (b) 2E4 인간 CTLA4-과다발현 CHO-K1 세포/웰에 부가되었고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한, 200 μl FACS 완충제 [PBS (라이프 테크놀로지(Life Technologies), 14190-094), 10% 열 불활성화 태아 소 혈청 (시그마(Sigma), F7524), 0.05% NaN3 (써모사이언티픽, 19038)] 중의 반감기 연장된 (ALB0011 빌딩 블록) Nb F023700912 (채워진 원형), F023700925 (채워진 사각형) 및 음성 대조군 Nb IRR00051 (채워진 삼각형)의 배치의 희석 시리즈 (출발 농도 1 μM, 1/4 일련의 희석, 12 pts)이다.
3가지 세척 단계 (1 세척 단계 = Nb 희석물의 제거, 100 μl 찬 FACS 완충제의 부가, 250 g 하에 5분 동안 원심분리) 후, 반감기-연장된 나노바디의 검출을 위하여 상기 세포를 찬 FACS 완충제 중의 3 μg/ml 항-ALB11002 마우스 mAb ABH00074와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
3가지 세척 단계 후, 상기 세포를 PE 염소 F(ab')2 항-마우스 IgG [잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), 115-116-071]의 찬 FACS 완충제 중의 1/100 희석물과 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
3가지 세척 단계 후, 상기 세포를, 5 nM TO-PRO-3 [몰레큘라 프로브(Molecular Probes), T3605]을 보충시킨 50 μl 찬 FACS 완충제에 재현탁시키고, FACS 칸토로 분석하였다.
먼저, FSC-SSC 분포에 근거하여 P1 집단을 선별한다. 정지 게이트는 P1 내의 10000개 세포 상에 설정되었다. 이러한 집단으로부터 TO-PRO-3+ 세포 (죽은 세포)를 배제한다. 이러한 P1/TO-PRO-3-음성 집단에 대해서는 중앙 PE 값을 계산한다.
실시예 3 : F023700912 나노바디는 CD80 및 CD86에 대한 CTLA -4의 결합을 차단한다.
F023700912는 인간 CTLA-4가 그의 리간드 CD80 및 CD86에 결합하는 것을 차단한다. hCTLA4-과다발현 CHO-K1 세포 상의 (a) hCD80-hFc 또는 (b) hCD86-hFc의 고정 농도 (10xEC30)를 이용한 F023700912 (채워진 원형)와 이필리무맙 (채워진 사각형)의 경쟁 실험의 유동 세포계수법 분석. 이들 리간드는 인간 IgG Fc 융합 단백질을 통하여 검출하였다. 이들 실험에서 생성된 데이터가 도 6 (a-b)에 제시된다. 이들 결과는 CTLA-4가 그의 리간드 CD80 및 CD86에 결합하는 것을 차단할 수 있는 F023700912의 능력을 입증시켜 주며, 이는 CTLA-4에 의해 조정된 면역 반응과, CD80 및 CD86과의 그의 상호 작용에 영향을 미칠 수 있는 F023700912의 능력을 예시해 준다.
도 6 (a-b)는 고정 농도의 (a) FITC-표지된 인간 CD80-hFc-HIS6 또는 (b) FITC-표지된 인간 CD86-hFc-HIS6 (FITC 표지화는 각각 3.6 및 2의 표지화 정도; 농도 = 10x EC30, 각각 3.71E-08 M 또는 4.35E-08 M을 이용하여 수행하였음)의 존재 하에 1E5 인간 CTLA4-과다발현 CHO-K1 세포/웰에 부가되었고 4℃에서 90분 동안 인큐베이션한, 100μl FACS 완충제 [PBS (라이프 테크놀로지, 14190-094), 10% 열 불활성화 태아 소 혈청 (시그마, F7524), 0.05% NaN3 (써모사이언티픽, 19038)] 중의 Nb F023700912 (채워진 원형) 및 이필리무맙 (채워진 사각형)의 희식 시리즈 (출발 농도 1 μM, 1/3 일련의 희석, 12 pts)이다.
3가지 세척 단계 (1 세척 단계 = Nb 희석물의 제거, 100 μl 찬 FACS 완충제의 부가, 250 g 하에 5분 동안 원심분리) 후, 상기 세포를, 5 nM TO-PRO-3 (몰레큘라 프로브, T3605)을 보충시킨 50 μl 찬 FACS 완충제에 재현탁시키고, FACS 칸토로 분석하였다.
먼저, FSC-SSC 분포에 근거하여 P1 집단을 선별한다. 정지 게이트는 P1 내의 10000개 세포 상에 설정되었다. 이러한 집단으로부터 TO-PRO-3+ 세포 (죽은 세포)를 배제한다. 이러한 P1/TO-PRO-3-음성 집단에 대해서는 중앙 FITC 값을 계산한다.
실시예 4 : F023700912 특이성 평가.
F023700912의 특이성 평가는 CTLA-4와 선택적으로 결합하는 것으로 입증되었다. BTLA, CD8, PD1, CTLA4, LAG3, CD28에 대항한 특이성 평가는 유동 세포계수법을 사용하여 과다발현 세포 상에서 수행한 반면, ICOS 결합은 재조합 단백질 (hICOS-hFc)로서 ELISA에서 평가하였다. BTLA, CD8, PD1, CTLA4, LAG3, CD28의 발현은 직접적으로 표지된 표적-특이적 Ab를 통하여 확증하였다. 항-hICOS 및 항-hCTLA4/항-hPD1 양성 대조군은 모두 양성이었다. ELISA 검정에서는 hICOS에 결합하지 않는 것으로 관찰되었다. 도 7 (a-h)는 음성 대조군 L 세포, 음성 대조군 CHO-K1 세포, huCD28+ L 세포, huCD8알파+ L 세포, huLAG-3+ CHO-K1 세포, huBTLA+ CHO-K1 세포, huCTLA-4+ CHO-K1 세포, 및 huPD-1+ CHO-K1 세포 각각에 대한 결합을 평가한다. F023700912의 경우에는 BTLA, CD8, PD1, LAG3, CD28에 결합하지 않는 것으로 관찰될 수 있었던 반면, CTLA-4+ CHO-K1 세포 상에서는 F023700912의 강력한 결합이 관찰되었다. 이들 실험에서 생성된 데이터가 도 7 (a-h)에 제시된다. 이들 결과는 F023700912가 CTLA-4와 선택적으로 결합한다는 것을 예시하며, 이는 생체내 투여시 최소한의 표적을 벗어난 효과를 예측해 준다.
도 7 (a-h)은 (a) 2E4 L-세포/웰, (b) 2E4 CHO-K1 세포/웰, (c) 인간 CD28-과다발현 L-세포 또는 (d) 인간 CD8 알파-과다발현 L-세포, (e) 2E4 인간 LAG3-과다발현 CHO-K1/웰, (f) 2E4 인간 BTLA-과다발현 CHO-K1 세포/웰, (g) 인간 CTLA4-과다발현 CHO-K1 세포/웰 또는 (h) 인간 PD1-과다발현 CHO-K1 세포/웰에 부가되었고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한, 200 μl FACS 완충제 [PBS (라이프 테크놀로지, 14190-094), 10% 열 불활성화 태아 소 혈청 (시그마, F7524), 0.05% NaN3 (써모사이언티픽, 19038)] 중의 반감기 연장된 (ALB0011 빌딩 블록) Nb F023700912 (채워진 원형), F023700925 (채워진 사각형) 및 음성 대조군 Nb IRR00051 (채워진 삼각형)의 배치의 희석 시리즈 (출발 농도 1 μM, 1/4 일련의 희석, 12 pts)이다.
3가지 세척 단계 (1 세척 단계 = Nb 희석물의 제거, 100 μl 찬 FACS 완충제의 부가, 250 g 하에 5분 동안 원심분리) 후, 반감기-연장된 Nb의 검출을 위하여 상기 세포를 찬 FACS 완충제 중의 3 μg/ml 항-ALB0011 마우스 mAb ABH00074와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
3가지 세척 단계 후, 상기 세포를 PE 염소 F(ab')2 항-마우스 IgG (잭슨 이뮤노리서치, 115-116-071)의 찬 FACS 완충제 중의 1/100 희석물과 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
3가지 세척 단계 후, 상기 세포를, 5 nM TO-PRO-3 (몰레큘라 프로브, T3605)을 보충시킨 50 μl 찬 FACS 완충제에 재현탁시키고, FACS 칸토로 분석하였다.
먼저, FSC-SSC 분포에 근거하여 P1 집단을 선별한다. 정지 게이트는 P1 내의 10000개 세포 상에 설정되었다. 이러한 집단으로부터 TO-PRO-3+ 세포 (죽은 세포)를 배제한다. 이러한 P1/TO-PRO-3-음성 집단에 대해서는 중앙 PE 값을 계산한다.
실시예 5 : 인간, 레서스 원숭이 및 마우스 알부민에 대한 F023700912 나노 바디 결합.
F023700912는 인간, 레서스 원숭이 및 마우스 알부민에 결합하며, 이는 비-알부민-결합 나노바디와 비교한 경우에 연장된 반감기를 예측해 준다. 표면 플라스민 공명 (SPR)을 사용하여 분석한 경우에, 인간, 레서스 원숭이 및 마우스 혈청 알부민에 결합하는 것이 관찰되었다. 그 데이터가 아래 표 E에 제시된다. F023700912의 알부민 결합은 생체내 투여시 나노바디의 클리어런스를 저하시켜, 그의 치료적 잠재력을 개선시키는 것으로 예상된다.
표 E. 알부민에 대한 나노바디의 결합.
Figure 112018058018500-pct00016
기기: 비아코어 T100 [GE 헬스케어(GE Healthcare); 센서 칩: CM5 (ID T160713-2, GE 헬스케어, 로트 10242599]
실시예 6 : 나노바디 F023700906 N73 변이체 .
CTLA-4 발현 CHO-K1 세포에 대한 (a) CD80 또는 (b) CD86의 결합을 차단할 수 있는 능력을 알아보기 위하여 변이체 F023701051 (11F01(L11V,A14P,Q45R,N73Q,A74S,K83R,V89L,M96P,Q108L)-FLAG3-HIS6), F023701054 (11F01(L11V,A14P,Q45R,N73T,A74S,K83R,V89L,M96P,Q108L)-FLAG3-HIS6), 및 F023701061 (11F01(L11V,A14P,Q45R,N73Y,A74S,K83R,V89L,M96P,Q108L)-FLAG3-HIS6)을 F023700906과 비교하였다. 이들 모든 변이체는 CTLA-4에 대한 CD80 및 CD86의 결합을 차단할 수 있었다. CD80 및 CD86에 대한 CTLA4의 결합은 이들 변이체 중 몇 가지에 대하여 결정하였다. 이들 차단 데이터가 도 8 (a-b)에 제시된다. 이들 결과는 CTLA-4에 대한 CD80 또는 CD86의 결합을 차단할 수 있는 나노바디의 능력에 상당한 영향을 미치지 않고서 위치 N73에서의 아미노산을 다양화하는 타당성을 예시해준다. 이러한 변이체는 N73에서의 탈아미드화를 회피할 수 있게 해줄 것이다.
실시예 7 : F023700912는 인간화 마우스 내에 정립된 고형 종양을 박멸시킨다.
인간화 마우스 [잭슨 래보러토리즈(Jackson Laboratories)]에게 Panc 08.13 종양 세포 (인간 췌장 선암종)를 체내 이식하였다. 정립된 종양을 수반한 마우스 (~ 100 mm3, n=9-10/군)를 하기와 같이 시험하였다: 1-이소형 대조군 (hIgG1-2 mg/kg 및 hIgG4-3 mg/kg); 2-이필리무맙-N297A (3 mg/kg); 3-이필리무맙 (3 mg/kg); 4-펨브롤리주맙 (2 mg/kg); 5-이필리무맙 (3 mg/kg) + 펨브롤리주맙 (2 mg/kg); 6-F023700912 (5 mg/kg; CTLA4-Nab 5로서 표시됨), 7-F023700912 (15 mg/kg; CTLA4-Nab-15로서 표시됨), 및 8-F023700912 (15 mg/kg) + 펨브롤리주맙 (2 mg/kg). 모든 항체를 6회 용량에 대해 7일마다 동시에 주사하였다. F023700912는 11회 용량에 대해 3.5일마다 동시에 투여하였다. 종양 용적과 체중을 4-5일마다 측정하였다. 도 9 (a-b)에는 평균 종양 용적 ± SEM, 제37일의 개별 종양 용적, 및 실험 과정 전반에 걸친 개별 마우스 내에서의 종양 용적이 도시된다. 각각의 처리군에 대한 종양 용적이 또한 도 9 (c-j)에 도시된다. 각각의 처리 군에서의 평균 (평균±SEM) 및 개별 체중 변화가 또한 측정되었다 (도 9 (k-s)). 체중 감소로 인해 죽었거나 또는 인도적으로 안락사시킨 마우스의 수는 '#'로서 표시되었다. '↑'는 항체를 표시하고, '*'는 나노바디 투여 스케줄을 표시하였다. 이들 데이터는 인간 면역 세포를 정착시킨 동물에게서 생체내 항-인간 종양 반응을 유도시킬 수 있는 F023700912의 능력을 예시하였다. 이들 데이터는 인간의 암을 치료하는데 있어서의 F023700912의 잠재력을 뒷받침해준다.
실시예 8 : 건강한 대상체 및 암 환자로부터 선재하는 항체에 대한 F023700912 및 F023700925의 결합.
3가 참조 나노바디인 013700112 (선재하는 항체의 결합을 저하시키기 위해 변형되지 않음)는 (도 10a) 건강한 대상체 또는 (도 10b) 암 환자로부터 유래된 몇 가지 혈청 샘플에 결합한다는 것을 명확히 보여준다. 유사한 크기의 서열 최적화된 3가 나노바디인 F023700912는 동일한 혈청 샘플과 더 낮은 결합 빈도를 명확히 보여준다. F023700925는 F023700912와 동일한 빌딩 블록을 포함한다. 더 큰 크기에도 불구하고, 5가 F023700925 나노바디는 참조 나노바디 013700112보다 기존 Ab와 더 많이 결합하지는 않는 것으로 나타난다. 인간 혈청 알부민 (HSA) 상에 포획된 나노바디에 대한 선재하는 항체의 결합은 프로테온 XPR36 [바이오-라드 래보러토리즈, 인크. (Bio-Rad Laboratories, Inc.)]을 사용하여 평가하였다. PBS/트윈(Tween) (인산염 완충 식염수, pH 7.4, 0.005% 트윈20)을 실행 완충제로서 사용하였고, 실험을 25℃에서 수행하였다. 프로테온 GLC 센서 칩의 리간드 레인을 EDC/NHS로 활성화시키고 (유속 30 μl/min), HSA를 프로테온 아세테이트 완충제 pH 4.5 중의 10 μg/ml로 주사하여 (유속 100 μl/min) 대략 3600 RU의 고정화 수준이 되도록 하였다. 고정화 후, 표면을 에탄올아민 HCl로 탈활성화시켰다 (유속 30 μl/min). 나노바디를 HSA 표면 전반에 걸쳐 45 μl/min으로 2분 동안 주사하여, 3가 F023700912의 경우에는 대략 600 RU의 나노바디 포획 수준이 되도록 하고 5가 F023700925의 경우에는 대략 1000 RU의 나노바디 포획 수준이 되도록 하였다. 선재하는 항체를 함유하는 샘플을 PBS-트윈20 (0.005%)에서 1:10으로 희석시킨 후에, 2분 동안 45 μl/min으로 주사한 다음 후속 400초 해리 단계를 수행하였다. 각각의 주기 후 (즉, 새로운 나노바디 포획 및 혈액 샘플 주사 단계 전), 45 μl/min으로 HCl (100 mM)을 2분 주사하여 HSA 표면을 재생시켰다. 프로테온 매니저 3.1.0 (바이오-라드 래보러토리즈, 인크.)을 이용하여, 센서그램 프로세싱과 데이터 분석을 수행하였다. 선재하는 항체 결합을 보여주는 센서그램은 1) 나노바디-HSA 해리 및 2) HSA만을 함유하는 참조 리간드 레인에 대한 비-특이적 결합을 공제함으로써 이중 참조 후 수득하였다. 선재하는 항체의 결합 수준은 보고 시점을 125초 (연합의 종료 후 5초)로 설정하여 결정하였다. 참조로서, 선재하는 항체를 함유하는 샘플을 대상으로 하여 또한, 이들 선재하는 항체 (T013700112)의 결합을 저하시키기 위해 변형되지 않은 3가 나노바디에 대한 결합을 알아보기 위하여 시험하였다.
실시예 9 : 수소 중수소 교환 질량 분광분석법에 의한 항- hCTLA4 나노바디의 에피토프 맵핑
항-hCTLA4 나노바디인 F023700912 사이의 접촉 면적은 수소 중수소 교환 질량 분광분석법 (HDX-MS) 분석을 사용함으로써 결정되었다. HDX-MS는 단백질의 아미드 주쇄 내로의 중수소의 혼입을 측정하고, 이러한 혼입에 있어서의 변화는 수소의 용매 노출에 의해 영향을 받는다. 항원-단독 샘플과 나노바디-결합된 샘플에서의 중수소 교환 수준의 비교를 수행하여, 나노바디와 접촉 중일 수 있는 항원 영역을 확인하였다.
나노바디 F023700912에 의해 중수소화되지 못하게 가장 강력하게 보호된 인간 CTLA4 잔기는 VRVTVL (서열식별번호: 110의 잔기 33 - 38), ADSQVTEVC (서열식별번호: 110의 잔기 41-49) 및 CKVELMYPPPYYLG (서열식별번호: 110의 잔기 93-106)였다. F023700912가 CTLA4에 결합한다는 것을 입증해 주는 히트 맵이 도 13에 제시된다.
표 F. 아미노산 서열 (서열식별번호: 110)
Figure 112018058018500-pct00017
SEQUENCE LISTING <110> Merck, Sharp & Dohme Corp. <120> CTLA4 BINDERS <130> 24237 <150> 62/257,001 <151> 2015-11-18 <160> 111 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Gln Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Met Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Lama <400> 2 Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr Gly Met Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Lama <400> 3 Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Lama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is M or P <400> 4 Glu Xaa Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Lama <400> 5 Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr Gly Met Gly 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Lama <400> 6 Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Lama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is M or P <400> 7 Glu Xaa Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr 1 5 10 <210> 8 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Gln Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Met Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Gln Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Met Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Lys Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Gln Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Met Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Gln Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Gln Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Met Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Thr Val Lys Ser 115 <210> 12 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Gln Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Met Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Thr Val Gln Ser 115 <210> 13 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Gln Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Met Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Lys Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Gln Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Met Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Gln Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Gln Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Met Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Thr Val Lys Ser 115 <210> 16 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Gln Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Met Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Thr Val Gln Ser 115 <210> 17 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Gln Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Met Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Gln Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Met Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Lys Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Gln Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 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Ala Ala Glu Met Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 23 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Met Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 24 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly 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Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp His Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Pro Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp His Asp 115 120 125 Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 130 135 140 Gly Ala Ala His His His His His His 145 150 <210> 101 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 101 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Pro Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp His Asp 115 120 125 Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 130 135 140 Gly Ala Ala His His His His His His 145 150 <210> 102 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 102 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Pro Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp His Asp 115 120 125 Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 130 135 140 Gly Ala Ala His His His His His His 145 150 <210> 103 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 103 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Pro Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp His Asp 115 120 125 Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 130 135 140 Gly Ala Ala His His His His His His 145 150 <210> 104 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 104 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Trp Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Pro Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp His Asp 115 120 125 Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 130 135 140 Gly Ala Ala His His His His His His 145 150 <210> 105 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 105 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Phe Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Pro Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp His Asp 115 120 125 Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 130 135 140 Gly Ala Ala His His His His His His 145 150 <210> 106 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 106 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Pro Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp His Asp 115 120 125 Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 130 135 140 Gly Ala Ala His His His His His His 145 150 <210> 107 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 107 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ala Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Pro Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp His Asp 115 120 125 Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 130 135 140 Gly Ala Ala His His His His His His 145 150 <210> 108 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 108 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Pro Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp His Asp 115 120 125 Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 130 135 140 Gly Ala Ala His His His His His His 145 150 <210> 109 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized lama <400> 109 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Pro Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Pro Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp His Asp 115 120 125 Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 130 135 140 Gly Ala Ala His His His His His His 145 150 <210> 110 <211> 138 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly 1 5 10 15 Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu 20 25 30 Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val 35 40 45 Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp 50 55 60 Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile 65 70 75 80 Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu 85 90 95 Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln 100 105 110 Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe His His 115 120 125 His His His His His His His Gly Gly Gln 130 135 <210> 111 <211> 223 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala 1 5 10 15 Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro 20 25 30 Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala 35 40 45 Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly 50 55 60 Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln 65 70 75 80 Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr 85 90 95 Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val 100 105 110 Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile 115 120 125 Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly 130 135 140 Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser 145 150 155 160 Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe 165 170 175 Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys 180 185 190 Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu 195 200 205 Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn 210 215 220

Claims (29)

  1. 인간 CTLA4에 결합하는 하나 이상의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD)을 포함하고, 여기서 ISVD가 아미노산 서열:
    XVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFSFYGMG
    WFRQAPGKEREFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAEPSGISGWDYWGQGTLVTVSS (여기서 X는 D 또는 E임) (서열식별번호: 60)를 포함하는 것인 CTLA4 결합제.
  2. 인간 CTLA4에 결합하는 하나 이상의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD)을 포함하고, 여기서 ISVD가 서열식별번호: 93-109로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 CTLA4 결합제.
  3. 제1항에 있어서, 반감기 연장제를 포함하는 CTLA4 결합제.
  4. 제3항에 있어서, 반감기 연장제가, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD인 CTLA4 결합제.
  5. 제4항에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD가 ALB11002인 CTLA4 결합제.
  6. 제1항에 있어서,
    ㆍ 서열식별번호: 60에 제시된 아미노산 서열 (여기서 X는 D 또는 E임)을 포함하는, CTLA4에 결합하는 ISVD;
    ㆍ 펩티드 링커;
    ㆍ 서열식별번호: 60에 제시된 아미노산 서열 (여기서 X는 D 또는 E임)을 포함하는, CTLA4에 결합하는 ISVD;
    ㆍ 펩티드 링커; 및
    ㆍ 반감기 연장제
    를 포함하는 CTLA4 결합제.
  7. 제1항에 있어서,
    ㆍ 서열식별번호: 60에 제시된 아미노산 서열 (여기서 X는 D 또는 E임)을 포함하는, CTLA4에 결합하는 ISVD;
    ㆍ 펩티드 링커; 및
    ㆍ 반감기 연장제
    를 포함하는 CTLA4 결합제.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 펩티드 링커가 아미노산 서열 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 65)를 포함하는 것인 CTLA4 결합제.
  9. 하기 아미노산 서열을 포함하는 인간 CTLA4에 결합하는 하나 이상의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD)을 포함하는 CTLA4 결합제:
    DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFSFYGMG
    WFRQAPGKEREFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYY
    CAAEPSGISGWDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSE
    VQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEREFVADIRTSAGRTYYA
    DSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAEPSGISGWDYWGQGTLVTVSSGG
    GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGF
    TFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLR
    PEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA (서열식별번호: 62).
  10. 하기 아미노산 서열을 포함하는 인간 CTLA4에 결합하는 하나 이상의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD)을 포함하는 CTLA4 결합제:
    DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFSFYGMG
    WFRQAPGKEREFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYY
    CAAEPSGISGWDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSE
    VQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYA
    DSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA (서열식별번호: 64).
  11. 제1항에 있어서, 다가인 CTLA4 결합제.
  12. 제1항의 CTLA4 결합제가 인간 CTLA4에 결합하는 것을 교차-차단하는 결합제.
  13. 제1항의 CTLA4 결합제를 포함하는 주사 장치 또는 용기.
  14. 제1항의 CTLA4 결합제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  15. 제14항에 있어서, 서열식별번호: 61 또는 63의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  16. 제14항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  17. 제14항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
  18. 제1항의 CTLA4 결합제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 것 및 상기 숙주 세포를 상기 폴리뉴클레오티드로부터의 상기 CTLA4 결합제의 발현에 유리한 조건 하에 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 제1항의 CTLA4 결합제를 제조하는 방법.
  19. 제18항의 방법에 의해 생산된 CTLA4 결합제.
  20. CTLA4를 제1항의 CTLA4 결합제와 접촉시키는 것을 포함하는, CTLA4가 CD80 또는 CD86에 결합하는 것을 방지하는 시험관내 방법.
  21. 제1항의 CTLA4 결합제의 유효량을 포함하는, 인간 대상체의 신체 내에서 암 또는 감염성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 제약 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 암이 전이성 암, 고형 종양, 혈액암, 백혈병, 림프종, 골육종, 횡문근육종, 신경모세포종, 신장암, 신장 이행 세포암, 방광암, 윌름스암, 난소암, 췌장암, 유방암, 전립선암, 골암, 폐암, 비소세포 폐암, 위암, 결장직장암, 자궁경부암, 활막 육종, 두경부암, 편평 세포 암종, 다발성 골수종, 신세포암, 망막모세포종, 간모세포종, 간세포성 암종, 흑색종, 신장의 횡문근양 종양, 유잉 육종, 연골육종, 뇌암, 교모세포종, 수막종, 뇌하수체 선종, 전정 슈반세포종, 원시 신경외배엽 종양, 수모세포종, 성상세포종, 역형성 성상세포종, 핍지교종, 상의세포종, 맥락총 유두종, 진성 다혈구혈증, 혈소판혈증, 특발성 골수섬유증, 연부 조직 육종, 갑상선암, 자궁내막암, 카르시노이드 암 또는 간암인 제약 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 감염성 질환이 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 진균 감염인 제약 조성물.
  24. 제21항에 있어서, 추가 치료제 또는 치료 절차를 CTLA4 결합제와 연합하여 포함하는 제약 조성물.
  25. 제1항에 있어서, 반감기 연장제 및/또는 C-말단 연장제를 포함하는 CTLA4 결합제.
  26. 제2항에 있어서, ISVD의 신호 서열 (아미노산 AAADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGAAHHHHHH (서열식별번호: 93의 아미노산 120-153))이 결여된 CTLA4 결합제
  27. 제6항에 있어서, C-말단 연장 알라닌을 포함하는 CTLA4 결합제.
  28. 제13항에 있어서, 추가 치료제를 포함하는 주사 장치 또는 용기.
  29. 제18항에 있어서, 상기 숙주 세포 및/또는 상기 배지로부터 CTLA4 결합제를 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
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