TW201726741A - Ctla4結合劑 - Google Patents

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Abstract

本發明提供結合至CTLA4或人類血清白蛋白之分子，諸如ISVDs及奈米抗體。此等分子已經工程改造以減少投與此分子之個體身體中預先存在抗體之結合發生。提供用此分子增加免疫反應、治療癌症及/或治療感染性疾病之方法。

Description

CTLA4結合劑
本發明部分係關於結合至細胞毒性T-淋巴細胞相關蛋白質4(「CTLA4」)，例如人類CTLA4之胺基酸序列及多肽。特定言之，本發明部分係關於結合至CTLA4之改良之重鏈免疫球蛋白單一可變域(在本文中亦稱為「ISV」或「ISVD」)，以及包含此類ISVD之蛋白質、多肽及其他構築體、化合物、分子或化學實體。本發明之其他態樣、實施例、特徵、使用及優勢將為熟習此項技術者基於本文中之揭示內容所瞭解。
消除免疫調節分子(諸如細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CTLA-4))代表藉由操縱免疫系統誘導腫瘤消退、穩定疾病及延長存活率之新穎及有前景的策略。抗CTLA-4抗體伊匹單抗(ipilimumab)目前出售用於包括黑素瘤之適應症。已經在接受CTLA-4抗體之有黑素瘤之患者中發現腫瘤消退之跡象，伴隨達至進程之時間延長，且在伊匹單抗之情況下在有黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌及腎細胞癌之患者中已觀測到持久反應。
完全T細胞活化需要兩種信號。第一藉由與抗原呈遞細胞(APC)呈遞之腫瘤相關抗原結合的T細胞受體經由主要組織相容複合物I及II引發。當T細胞上之主要共刺激受體CD28結合至APC上之B7配位體亞型CD80及CD86時產生第二信號。所得雙重信號傳導誘導包括T細胞增殖及細胞因 子釋放之變化，觸發且隨後擴增免疫反應。回應於T細胞活化，CTLA-4上調且與CD28競爭APC上之CD80及CD86結合但具有顯著較高親和力，因此下調或去活化T細胞(圖1)。因此，CTLA-4下調T細胞反應及APC功能，引起降低之對腫瘤相關抗原之免疫反應及免疫耐受性。
CTLA4及PD1發揮其對T細胞活化之抑制效果之機制為多方面的。CTLA4主要地起限制T細胞活化及無性擴增之作用，而PD1主要地起限制周邊組織中之效應T細胞功能之作用。其獨特分子結構、調節、信號傳導路徑、配位體分佈及對Treg及其他免疫細胞之功能表明CTLA4及PD1之組合治療阻斷可協同作用以介導抗腫瘤免疫性。Intlekofer及Thompson,J.Leuko.Biol.94(1)：25-39(2013)；Hurwitz等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：10067-10071(1998)；Parry等人Mol.Cell.Biol.25(21)：9543-9553(2005)；Callahan等人Front.Oncol.第4卷，Art.385(2015)。
抑制CTLA4介導之下調之一種方法為藉由經由使其與奈米抗體結合來干擾其與其配位體之相互作用。存在源於駱馬之奈米抗體可引起不需要的抗藥物免疫反應(例如藉由經由患者血清中預先存在之抗體結合奈米抗體)之可能性。因此，使奈米抗體人類化以便減少或消除此類反應之新穎方法及藉由此類方法產生之奈米抗體為尤其有價值的。
本發明提供藉由在以下殘基VRVTVL(SEQ ID NO：110之胺基酸33-38)、ADSQVTEVC(SEQ ID NO：110之胺基酸41-49)及CKVELMYPPPYYLG(SEQ ID NO：110之胺基酸93-106)中之一或多者(例如所有三個位點)處接觸人類CTLA4而結合至人類CTLA4之多特異性免疫球蛋白單一可變域(ISVD)，諸如奈米抗體。舉例而言，結合劑防止 殘基在氘源(諸如D2O)存在下進行氫-氘交換。在本發明之一實施例中，ISVD結合至人類CTLA4且產生基本上如圖13中所述之結合熱圖(例如如在氫-氘交換分析中產生)。
本發明提供包含有包含SEQ ID NO：1中所述之胺基酸序列的免疫球蛋白之CDR1、CDR2及CDR3的CTLA4結合劑(例如ISVD，例如奈米抗體)，其中該CTLA4結合劑相對於SEQ ID NO：1中所述之胺基酸序列包含至少一種突變，其中該至少一種突變在選自由11、89、110及112組成之群的位置處，其中該等位置根據Kabat來編號；及視情況包括多種在本文所述之其他突變或另外，例如至多10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)種其他突變(例如點突變、取代、缺失、插入)。舉例而言，在本發明之一實施例中，CDR1包含以下胺基酸序列：FYGMG(SEQ ID NO：2)或GGTFSFYGMG(SEQ ID NO：5)；CDR2包含以下胺基酸序列：DIRTSAGRTYYADSVKG(SEQ ID NO：3)或DIRTSAGRTY(SEQ ID NO：6)；及CDR3包含以下胺基酸序列：EMSGISGWDY(SEQ ID NO：4)。舉例而言，在本發明之一實施例中，CTLA4結合劑相對於SEQ ID NO：1具有突變，其中位置11處之胺基酸殘基係選自L或V；位置89處之胺基酸殘基適合地選自T、V或L；位置110處之胺基酸殘基適合地選自T、K或Q；及/或位置112處之胺基酸殘基適合地選自S、K或Q；例如其中突變為89T；89L與11V之組合；89L與110K或110Q之組合；89L與112K或112Q之組合；89L與11V及110K或110Q之組合；89L與11V及112K或112Q之組合；11V與110K或110Q之組合；及/或11V與112K或112Q之組合。在本發明之一實施例中，位置11、89、110及/或112處之突變如表B中所述。在本發明之一實施例中，CTLA4結合劑相對於SEQ ID NO：1， 在位置1、14、45、74、83及/或108處進一步包含一或多種突變。在本發明之一實施例中，CTLA4結合劑具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸之C端延長部分。舉例而言，在本發明之實施例中，C端延長部分具有式-X(n)，其中X及n如下：(a)n=1且X=Ala；(b)n=2且各X=Ala；(c)n=3且各X=Ala；(d)n=2且至少一個X=Ala(其餘胺基酸殘基X獨立地選自任何天然存在之胺基酸)；(e)n=3且至少一個X=Ala(其餘胺基酸殘基X獨立地選自任何天然存在之胺基酸)；(f)n=3且至少兩個X=Ala(其餘胺基酸殘基X獨立地選自任何天然存在之胺基酸)；(g)n=1且X=Gly；(h)n=2且各X=Gly；(i)n=3且各X=Gly；(j)n=2且至少一個X=Gly(其餘胺基酸殘基X獨立地選自任何天然存在之胺基酸)；(k)n=3且至少一個X=Gly(其餘胺基酸殘基X獨立地選自任何天然存在之胺基酸)；(1)n=3且至少兩個X=Gly(其餘胺基酸殘基X獨立地選自任何天然存在之胺基酸)；(m)n=2且各X=Ala或Gly；(n)n=3且各X=Ala或Gly；(o)n=3且至少一個X=Ala或Gly(其餘胺基酸殘基X獨立地選自任何天然存在之胺基酸)；或(p)n=3且至少兩個X=Ala或Gly(其餘胺基酸殘基X獨立地選自任何天然存在之胺基酸)。舉例而言，在本發明之一實施例中，C端延長部分為A、AA、AAA、G、GG、GGG、AG、GA、AAG、AGG、AGA、GGA、GAA或GAG。本發明包括CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)，其包含與選自由SEQ ID NO：8-43組成之群的成員中所述之胺基酸序列具有至少85%(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%)序列一致性的胺基酸序列，其中CTLA4結合劑或ISVD包含有包含SEQ ID NO：1中所述之胺基酸序列的免疫球蛋白 之CDR1、CDR2及CDR3，其中該CTLA4結合劑或ISVD相對於SEQ ID NO：1中所述之胺基酸序列包含至少一種突變，其中該至少一種突變在選自由11、89、110及112組成之群的位置處，其中該等位置根據Kabat來編號。本發明亦提供包含選自由SEQ ID NO：9-40組成之群的胺基酸序列的CTLA4結合劑、ISVD、奈米抗體或多肽。本發明亦提供包含結合至CTLA4之CTLA4結合部分(例如ISVD，諸如奈米抗體)的多特異性結合劑，該結合部分連接至一或多個分子，該等分子結合至不為CTLA4結合部分所結合之抗原決定基的抗原決定基(例如PD1、CTLA4、LAG3、BTLA及/或CD27)。
本發明亦提供與另一治療劑組合之任何此類CTLA4結合劑、多肽、免疫球蛋白單一可變域(ISVD)或多特異性結合劑。
本發明亦提供包含CTLA4結合劑、免疫球蛋白單一可變域(ISVD)、奈米抗體、多肽或多特異性結合劑視情況與另一治療劑之組合的注射裝置(例如皮下注射針及針筒)或容器。
本發明亦提供編碼CTLA4結合劑、免疫球蛋白單一可變域(ISVD)、奈米抗體、多肽或多特異性結合劑之聚核苷酸，例如其在載體中。本發明亦提供包含聚核苷酸或載體之宿主細胞(例如CHO細胞或畢赤酵母(Pichia)細胞)。
本發明亦提供製備CTLA4結合劑、免疫球蛋白單一可變域(ISVD)、奈米抗體、多肽或多特異性結合劑之方法，其包含將編碼CTLA4結合劑、免疫球蛋白單一可變域(ISVD)、奈米抗體、多肽或多特異性結合劑之聚核苷酸引入至宿主細胞(例如CHO細胞或畢赤酵母細胞)中且在培養基中在有利於自該聚核苷酸表現該免疫球蛋白之條件下培養宿主細胞，及視 情況自該宿主細胞及/或該培養基純化免疫球蛋白。藉由此類方法產生之任何免疫球蛋白單一可變域(ISVD)、奈米抗體、多肽、多特異性結合劑或CTLA4結合劑。
本發明亦提供防止T細胞上之CTLA4結合至抗原呈遞細胞上之CD80及/或CD86的方法，其包含使該CTLA4與免疫球蛋白單一可變域(ISVD)、奈米抗體、多肽、多特異性結合劑或CTLA4結合劑視情況與另一治療劑之組合接觸。本發明亦提供增強個體體內之免疫反應之方法，其包含向個體(例如哺乳動物，諸如人類)投與有效量之免疫球蛋白單一可變域(ISVD)、奈米抗體、多肽、多特異性結合劑或CTLA4結合劑視情況與另一治療劑之組合。本發明亦提供治療或預防個體體內之癌症或感染性疾病之方法，其包含向個體投與有效量之免疫球蛋白單一可變域(ISVD)、奈米抗體、多肽、多特異性結合劑或CTLA4結合劑視情況與另一治療劑之組合。在本發明之一實施例中，癌症為轉移性癌症、實體腫瘤、血液癌、白血病、淋巴瘤、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、神經母細胞瘤、腎癌、白血病、腎移行細胞癌、膀胱癌、威爾姆氏癌症(Wilm's Cancer)、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、滑膜肉瘤、頭頸癌、鱗狀細胞癌、多發性骨髓瘤、腎細胞癌、視網膜母細胞瘤、肝母細胞瘤、肝細胞癌、黑素瘤、腎臟之桿狀腫瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、軟骨肉瘤、腦癌、神經膠母細胞瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤、前庭神經鞘瘤、原始神經外胚層瘤、神經管胚細胞瘤、星形細胞瘤、退行性星形細胞瘤、少突神經膠質瘤、室管膜瘤、脈絡叢乳頭狀瘤、真性紅血球增多症、血小板增多症、特發性骨髓纖維化、軟組織肉瘤、甲狀腺癌、子宮內膜癌、類癌或肝癌、乳癌或胃癌。在本發明 之一實施例中，感染性疾病為細菌感染、病毒感染或真菌感染。舉例而言，在本發明之一實施例中，向個體投與另一治療劑或治療程序與免疫球蛋白單一可變域(ISVD)、奈米抗體、多肽、多特異性結合劑或CTLA4結合劑之組合。
本發明提供結合至CTLA4之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)，其包含：包含胺基酸序列FYGMG(SEQ ID NO：2)或GGTFSFYGMG(SEQ ID NO：5)之CDR1；包含胺基酸序列DIRTSAGRTYYADSVKG(SEQ ID NO：3)或DIRTSAGRTY(SEQ ID NO：6)之CDR2；及包含胺基酸序列EPSGISGWDY(SEQ ID NO：4)之CDR3，例如包含以下胺基酸序列：XVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEREFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAEPSGISGWDYWGQGTLVTVSS，其中X為D或E(SEQ ID NO：60)。在本發明之一實施例中，CTLA4結合劑融合至與人類血清白蛋白結合之半衰期延長劑，諸如ISVD(例如奈米抗體)，例如ALB11002。在本發明之一實施例中，CTLA4結合劑包含以下部分(例如以所顯示之順序)：●CTLA4結合劑；●肽連接子(例如GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：65))；●CTLA4結合劑；●肽連接子(例如GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：65))；●半衰期延長劑；及視情況， ●C端延長部分丙胺酸；或包含：●CTLA4結合劑；●肽連接子(例如GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：65))；●半衰期延長劑；及視情況，●C端延長部分丙胺酸。
在本發明之一實施例中，CTLA4結合劑包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：62)；或包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：64)。
本發明亦提供結合至人類血清白蛋白之人類血清白蛋白結合劑，其包含：包含胺基酸序列GFTFSSFGMS(SEQ ID NO：67)之CDR1；包含胺基酸序列SISGSGSDTL(SEQ ID NO：68)之CDR2；及包含胺基酸序列GGSLSR(SEQ ID NO：69)之CDR3，例如包含以下胺基酸序列：EVQLVESGGG VVQPGNSLRL SCAASGFTFS SFGMSWVRQA PGKGLEWVSS ISGSGSDTLY
ADSVKGRFTI SRDNAKTTLY LQMNSLRPED TALYYCTIGG SLSRSSQGTL VTVSSA；視情況缺乏C端丙胺酸殘基。在本發明之一實施例中，包含CTLA4結合劑之分子中之半衰期延長劑為本文所述之HSA結合劑。
在本發明之一實施例中，CTLA4結合劑在注射裝置或容器中，視情況與另一治療劑組合。此類裝置或容器為本發明之一部分。
本發明亦提供編碼本文所述之結合劑中之任一者之聚核苷酸(例如SEQ ID NO：61或63)以及任何包含聚核苷酸之載體(例如質體)以及任何包含聚核苷酸或載體之宿主細胞(例如CHO或真菌細胞，諸如畢赤酵母，例如甲醇酵母(P.pastoris))，例如異位或整合至一或多個宿主細胞染色體中。
本發明亦提供製備本文所述之結合劑中之任一者的方法，其包含將編碼結合劑之聚核苷酸引入至宿主細胞(例如CHO或真菌細胞，諸如畢赤酵母，例如甲醇酵母)中且在培養基中在有利於自該聚核苷酸表現該結合劑之條件下培養宿主細胞，及視情況自該宿主細胞及/或該培養基純化結合劑。視情況，將載體或聚核苷酸整合至一或多個宿主細胞染色體中。任何藉由此類方法產生之結合劑亦為本發明之一部分。
本發明提供防止CTLA4結合至B7-1(CD80)或B7-2(CD86)之方法，其包含接觸本發明之CTLA4結合劑視情況與另一治療劑之組合。本發明亦提供增強個體(例如人類)體內之免疫反應之方法，其包含向個體投與有效量之本發明之CTLA4結合劑視情況與另一治療劑(例如派立珠單抗(pembrolizumab))之組合。本發明亦提供治療或預防個體(例如人類)體內之癌症(例如轉移性癌症、實體腫瘤、血液癌、白血病、淋巴瘤、骨肉 瘤、橫紋肌肉瘤、神經母細胞瘤、腎癌、白血病、腎移行細胞癌、膀胱癌、威爾姆氏癌症、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、滑膜肉瘤、頭頸癌、鱗狀細胞癌、多發性骨髓瘤、腎細胞癌、視網膜母細胞瘤、肝母細胞瘤、肝細胞癌、黑素瘤、腎臟之桿狀腫瘤、尤文氏肉瘤、軟骨肉瘤、腦癌、神經膠母細胞瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤、前庭神經鞘瘤、原始神經外胚層瘤、神經管胚細胞瘤、星形細胞瘤、退行性星形細胞瘤、少突神經膠質瘤、室管膜瘤、脈絡叢乳頭狀瘤、真性紅血球增多症、血小板增多症、特發性骨髓纖維化、軟組織肉瘤、甲狀腺癌、子宮內膜癌、類癌或肝癌、乳癌或胃癌)或感染性疾病(例如細菌感染、病毒感染或真菌感染)之方法，其包含向個體投與有效量之本發明CTLA4結合劑視情況與另一治療劑(例如派立珠單抗)之組合。在本發明之一實施例中，當向個體投與CTLA4結合劑時，向個體投與另一治療劑或治療程序(例如外科腫瘤切除術)與結合劑之組合。
圖1.列舉一些將在本文中特定提及之胺基酸位置及其根據一些替代編號系統(諸如Aho及IMGT)之編號的表。
圖2(1-5).CTLA4結合劑序列。
圖3(A-B).11F1序列與SEQ ID NO：8-43之序列之比對。
圖4.中國倉鼠卵巢細胞(CHO N-連接聚糖)及經工程改造之酵母細胞(經工程改造之酵母N-連接聚糖)中產生之單株抗體之主要N-連接聚糖：正方形：N-乙醯基葡糖胺(GlcNac)；圓形：甘露糖(Man)；菱形：半乳糖(Gal)；三角形：海藻糖(Fuc)。
圖5(A-B).與表現hCTLA4之(A)Jurkat及(B)CHO-K1細胞結合之奈 米抗體F023700912及F023700925之bFACS分析。
圖6(A-B).奈米抗體F023700912或伊匹單抗與(A)CD80或(B)CD86之間的對結合至在CHO-K1細胞上表現之人類CTLA4之競爭。
圖7(A-H).奈米抗體F023700912或F023700925之結合至BTLA、CD8、PD1、CTLA4、LAG3、CD28或對照細胞之特異性評定。測定奈米抗體與(A)陰性對照L細胞、(B)陰性對照CHO-K1細胞、(C)huCD28+ L細胞、(D)huCD8α+ L細胞、(E)huLag-3+ CHO-K1細胞、(F)huBTLA+ CHO-K1細胞、(G)huCTLA-4+ CHO-K細胞及(H)huPD-1+ CHO-K1細胞之結合。
圖8(A-B).奈米抗體F023700906、F023701051、F02371054或F023701061與(A)人類CD80或(B)人類CD86之間的對結合至在CHO-K1細胞上表現之人類CTLA-4之競爭。
圖9(A-S).奈米抗體對人類化小鼠中之panc 08.13腫瘤之效果。在第37天在用同型對照、伊匹單抗(N297A)、伊匹單抗、派立珠單抗、伊匹單抗+派立珠單抗、5mpk劑量下之F023700912(CTLA4奈米抗體-5)、15mpk劑量下之F023700912(CTLA4奈米抗體-15)或派立珠單抗+ CTLA4奈米抗體-15處理之小鼠中之(A)平均腫瘤體積±SEM及(B)個別腫瘤體積；及在實驗過程中在用(C)同型對照抗體、(D)伊匹單抗(N297A)、(E)伊匹單抗、(F)派立珠單抗、(G)伊匹單抗+派立珠單抗、(H)CTLA4奈米抗體-5、(I)CTLA4奈米抗體-15或(J)CTLA4奈米抗體-15+派立珠單抗處理之小鼠中個別小鼠中之腫瘤體積。顯示(K-S)平均體重變化。
圖10(A-B).(A)健康人類個體血清及(B)癌症患者血清之血清預抗體對F023700912及F023700925及對照奈米抗體T013700112之反應性。
圖11.CTLA4結合劑構築體。
圖12(A-C).CTLA4結合劑序列。
圖13.藉由F023700912 CTLA4結合劑之人類CTLA4結合之氘標記差異熱圖。
本發明提供包含突變之ISVD，該等突變阻斷ISVD內預先存在之抗體(預抗體)對新抗原決定基之反應性。新抗原決定基為蛋白質內當蛋白質經突變(例如截斷)或其摺疊改變時顯露之抗原決定基。預先存在之抗體為在接受ISVD之前患者體內存在之抗體。本發明之ISVD部分基於駱馬抗體，其C端恆定域已經移除；因此，將所得VHH之C端中之新抗原決定基曝露於預抗體結合。已發現殘基11及89之突變(例如L11V及I89L或V89L)之組合引起預抗體結合之出人意料的缺乏。殘基112中之突變亦已顯示顯著減少預抗體結合。Buyse及Boutton(WO2015/173325)包括顯示L11V及V89L突變之組合與僅L11V突變或僅V89L突變相比在減少預抗體結合中提供顯著改良之資料。舉例而言，Buyse及Boutton第97頁之表H顯示僅具有V89L突變之ISVD(有或無C端延長部分)及具有V89L突變與L11V突變之組合的相同ISVD(同樣，有或無C端延長部分)之比較資料。此外，儘管在兩個單獨實驗中產生，與僅L11V突變(在相同ISVD中)之在表B中給出之資料相比，L11V/V89L組合之在表H中顯示之資料顯示藉由L11V/V89L組合獲得之預抗體結合減少大於僅L11V突變。因為駱馬抗體骨架結構已知為極高度保守，對於任何ISVD，位置11及89處之突變之效果極可能存在。實際上，在圖10中，在顯示為展示極低水準之預抗體結合的本發明結合劑F023700912及F023700925之情況下展現效果。
在本申請案中，免疫球蛋白重鏈可變域中之胺基酸殘基/位置將用根據Kabat之編號指示。為方便起見，圖1給出表，其列舉一些將在本文中特定提及之胺基酸位置及其根據一些替代編號系統(諸如Aho及IMGT。註釋：除非另外明確指示，否則對於本說明書及申請專利範圍，Kabat編號為決定性；其他編號系統僅為了參考而給出)的編號。
關於CDR，如此項技術中熟知，存在多種定義及描述VH或VHH片段之CDR的慣例，諸如Kabat定義(其係基於序列變異性且最常用)及Chotia定義(其係基於結構環區之位置)。參考例如網站www.bioinf.org.uk/abs/。出於本說明書及申請專利範圍的目的，即使亦可提及根據Kabat之CDR，CDR最佳基於Abm定義(其係基於Oxford Molecular之AbM抗體建模軟體)來定義，因為此視為Kabat與Chotia定義之間的最佳折衷。同樣參考網站www.bioinf.org.uk/abs/。
術語「免疫球蛋白單一可變域」(亦稱為「ISV」或「ISVD」)大體上用以指可在不與另一可變域相互作用的情況下(例如在無如習知4-鏈單株抗體之VH及VL域之間所需要的VH/VL相互作用的情況下)形成功能性抗原結合位點之免疫球蛋白可變域(其可為重鏈或輕鏈域，包括VH、VHH或VL域)。ISVD之實例將為熟習此項技術者所瞭解且例如包括奈米抗體(包括VHH、人類化VHH及/或駱駝化VH，諸如駱駝化人類VH)、IgNAR、域、作為VH域或衍生自VH域之(單一域)抗體(諸如dAbsTM)及作為VL域或衍生自VL域之(單一域)抗體(諸如dAbsTM)。基於及/或衍生自重鏈可變域(諸如VH或VHH域)之ISVD大體上較佳。最佳，ISVD將為奈米抗體。
術語「奈米抗體」大體上如WO 2008/020079或WO 2009/138519中 所定義，且因此在一特定態樣中，大體上表示VHH、人類化VHH或駱駝化VH(諸如駱駝化人類VH)或大體上為序列優化之VHH(諸如針對化學穩定性及/或溶解性、與已知人類構架區之最大重疊及最大表現經優化)。應注意術語奈米抗體(Nanobody/Nanobodies)為Ablynx N.V.之註冊商標且因此亦可稱為Nanobody®及/或Nanobodies®。
多特異性結合劑為包含第一CTLA4結合部分(例如ISVD或奈米抗體)及一或多個(例如1、2、3、4、5個)結合至除第一CTLA4結合部分之抗原決定基外之抗原決定基(例如CTLA4、CD27、LAG3、PD1或BTLA之不同抗原決定基)的其他結合部分(例如ISVD或奈米抗體)的分子。
結合部分或結合域或結合單元為結合至諸如CTLA4之抗原之分子，諸如ISVD或奈米抗體(例如SEQ ID NO：8-43中之任一者)。結合部分或結合域或結合單元可為包括多於一個部分、域或單元之可包含另一功能元件(諸如半衰期延長劑(HLE)、靶向單元及/或小分子(諸如聚乙二醇(PEG))之較大分子(諸如多價或多特異性結合劑)之一部分。
單價CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)為包含單一抗原結合域之分子。二價CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)包含兩個抗原結合域。多價CTLA4結合劑包含多於一個抗原結合域(例如1、2、3、4、5、6或7個)。
單特異性CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)結合單一抗原；雙特異性CTLA4結合劑結合至兩種不同抗原且多特異性CTLA4結合劑結合至多於一種抗原。
雙互補位CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)為單特異性，但結合至同一抗原之兩個不同抗原決定基。多互補位CTLA4結合劑結合同 一抗原但結合至抗原中之多於一個抗原決定基。
如此處關於CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)或其他分子所使用之術語「半衰期」可一般如WO 2008/020079之第57頁之段落o)中所描述及如其中所提及來定義，係指胺基酸序列、CTLA4結合劑、化合物或多肽之血清濃度活體內例如由於藉由天然機制，序列或化合物之降解及/或序列或化合物之清除或螯合作用而減少50%所花費的時間。本發明之胺基酸序列、CTLA4結合劑、化合物或多肽之活體內半衰期可以任何本身已知之方式，諸如藉由藥物動力學分析測定。適合之技術將為熟習此項技術者所瞭解，且可例如大體上如WO 2008/020079之第57頁之段落o)中所描述。如亦在WO 2008/020079之第57頁之段落o)中提及，半衰期可使用諸如t1/2-α、t1/2-β及曲線下面積(AUC)之參數表示。就此而言，應注意如本文所用之術語「半衰期」尤其係指t1/2-β或終半衰期(其中t1/2-α及/或AUC或兩者可不考慮)。參考例如以下實驗部分，以及標準手冊，諸如Kenneth,A等人：Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists及Peters等人，Pharmacokinete analysis：A Practical Approach(1996)。亦參考「Pharmacokinetics」，M Gibaldi及D Perron,由Marcel Dekker出版，第2修訂版(1982)。類似地，術語「半衰期增加」或「增加之半衰期」亦如WO 2008/020079之第57頁之段落o)中所定義且尤其係指t1/2-β增加，伴隨或不伴隨t1/2-α及/或AUC或兩者增加。
當術語在本文中未特定定義時，其具有其在此項技術中之常用含義，其將為熟習此項技術者所瞭解。參考例如標準手冊，諸如Sambrook等人，「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」(第2版),第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；F.Ausubel等人，編， 「Current protocols in molecular biology」，Green Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)；Lewin,「Genes II」，John Wiley & Sons,New York,N.Y.,(1985)；Old等人，「Principles of Gene Manipulation：An Introduction to Genetic Engineering」，第2版，University of California Press,Berkeley,CA(1981)；Roitt等人，「Immunology」(第6版),Mosby/Elsevier,Edinburgh(2001)；Roitt等人，Roitt's Essential Immunology,第10版Blackwell Publishing,UK(2001)；及Janeway等人，「Immunobiology」(第6版),Garland Science Publishing/Churchill Livingstone,New York(2005)，以及本文中引用之通用先前技術。
關於含有一或多種奈米抗體之多價及多特異性多肽及其製備之通用描述，亦參考Conrath等人，J.Biol.Chem.,第276卷，10.7346-7350,2001；Muyldermans,Reviews in Molecular Biotechnology 74(2001),277-302；以及例如WO 1996/34103、WO 1999/23221、WO 2004/041862、WO 2006/122786、WO 2008/020079、WO 2008/142164或WO 2009/068627。
「經分離」CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)、多肽、聚核苷酸及載體至少部分不含來自產生其之細胞或細胞培養物的其他生物分子。此類生物分子包括核酸、蛋白質、脂質、碳水化合物或其他物質，諸如細胞碎片及生長培養基。「經分離」CTLA4結合劑可進一步至少部分不含表現系統組分，諸如來自宿主細胞或其生長培養基之生物分子。一般而言，術語「經分離」不意欲指此類生物分子完全不存在或水、緩衝液或鹽不存在，或包括抗體或片段之醫藥調配物之組分。
片語「控制序列」係指在特定宿主生物體中表現可操作地連接之編碼序列所需之聚核苷酸。適合於原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況選用之操縱序列及核糖體結合位點。已知真核細胞使用啟動子、聚腺苷酸化信號及強化子。
當核酸或聚核苷酸置於與另一聚核苷酸之功能關係中時，其為「可操作地連接」。舉例而言，若前序列或分泌性前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則其與該多肽之DNA可操作地連接；若啟動子或強化子影響編碼序列之轉錄，則其與該序列可操作地連接；或若核糖體結合位點經定位以便有助於轉譯，則其與編碼序列可操作地連接。一般而言，但未必總是，「可操作地連接」意謂連接之DNA序列相鄰，且在分泌前導序列之情況下，相鄰且在閱讀相中。然而，強化子不必為相鄰的。連接係藉由在適宜限制性位點處接合來實現。若此類位點不存在，則根據慣例使用合成寡核苷酸接附子或連接子。
本發明之「CTLA4結合劑」為本文中描述之結合至CTLA4之分子中之任一者(例如ISVD，諸如奈米抗體)以及結合至CTLA4且包括本文中描述之CTLA4結合部分中之任一者之任何抗體或其抗原結合片段。若個別CTLA4結合劑為較大分子(例如多價分子，諸如F023700912或F023700914)之一部分，則其可稱為具有CTLA4結合部分。
本發明之「人類血清白蛋白結合劑」或「HSA結合劑」為本文中描述之結合至HSA之分子中之任一者(例如ISVD，諸如奈米抗體)以及結合至HSA且包括本文中描述之HSA結合部分中之任一者之任何抗體或其抗原結合片段。若個別HSA結合劑為較大分子(例如多價分子，諸如F023700912或F023700914)之一部分，則其可稱為具有HSA結合部分。
一般而言，基本抗體結構單元包含四聚體。各四聚體包括兩對相同之多肽鏈，各對具有一個「輕」鏈(約25kDa)及一個「重」鏈(約50-70kDa)。各鏈之胺基端部分包括主要負責抗原識別之具有約100至110個或更多個胺基酸之可變區。重鏈之羧基端部分可界定主要負責效應功能之恆定區。通常，人類輕鏈分類為κ及λ輕鏈。此外，人類重鏈通常分類為μ、δ、γ、α或ε，且將抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。在輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區由具有約12個或更多個胺基酸之「J」區接合，其中重鏈亦包括具有多於約10個胺基酸之「D」區。通常參見Fundamental Immunology第7章(Paul,W.編，第2版Raven Press,N.Y.(1989)。
抗原結合片段之實例包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段及單鏈Fv分子。
出於以下目的進行抗CTLA4結合劑11F1之變異體中之突變：E1D：防止在構築體E1之第一胺基酸中形成焦麩胺酸
L11V：減少預抗體結合
A14P：人類化
Q45R：突變以增加穩定性
A74S：人類化
K83R：人類化
I89L：減少預抗體結合
M96P、Q或R：防止M96氧化
Q108L：人類化
在本發明之一實施例中，CTLA4為人類CTLA4。在本發明之一實施 例中，人類CTLA4包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：111)
CTLA4結合劑
本發明旨在提供改良之CTLA4結合劑，特定言之改良之抗CTLA4ISVD且更特定言之改良之抗CTLA4奈米抗體。本發明之CTLA4結合劑包括作為包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的多肽之變異體在諸如1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112之位置處突變之多肽。
由本發明提供之改良之CTLA4結合劑在本文中亦稱為「本發明之CTLA4結合劑」或「CTLA4結合劑」。此等術語包涵任何包含本文所述之結合至CTLA4之分子的分子。舉例而言，術語包括包含選自由SEQ ID NO：8-43及60組成之群的成員中所述之胺基酸序列的ISVD以及任何包括選自由SEQ ID NO：8-43及60組成之群的成員中所述之胺基酸序列的奈米抗體、ISVD、融合蛋白、習知抗體或其抗原結合片段；或任何包含選自由SEQ ID NO：8-43及60組成之群的成員中所述之胺基酸序列的雙特異性分子(例如ISVD)，其結合至CTLA4以及結合至另一抗原或另一抗原決定基，諸如CD27、LAG3、PD1或BTLA。
WO 2008/071447描述可結合至CTLA4之奈米抗體及其用途。WO 2008/071447之SEQ ID NO：1306揭示CTLA4特異性奈米抗體，稱作11F01，其序列在本文中以SEQ ID NO：1給出。此序列(在本文中亦稱為「參考A」)及其CDR亦在下表A中給出。
本發明之範疇包括任何包含圖11中闡述之結合部分之排列，視情況 缺乏FLAG3及/或HIS6標籤之CTLA4結合劑；以及圖12中闡述之胺基酸序列中之任一者。
SEQ ID NO：60之殘基1可為D或E。若殘基1為D，則CTLA4結合劑 可稱為1D且若殘基1為E，則CTLA4結合劑可稱為1E。
在本發明之一實施例中，本發明之CTLA4結合劑包含N73X突變，其中X為除N外之任何胺基酸，例如S、V、G、R、Q、M、H、T、D、E、W、F、K、A、Y或P。
本發明包括CTLA4結合劑，其包含如下CTLA4結合劑之CDR中之一者、兩者或三者，其中相對於表A之CTLA4結合劑序列(例如11F01(E1D、L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)或11F01)中闡述或SEQ ID NO：2-7中闡述之CDR各包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種胺基酸取代，例如保守性取代，及/或包含100%、99%、98%、97%、96%或95%序列一致性，其中具有此類CDR之CTLA4結合劑保留結合至CTLA4之能力。
基於參考A之在本文所述之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)之某些殘基之Kabat殘基編號顯示在以下序列中： (SEQ ID NO：1)
CTLA4結合劑11F01(E1D、L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)之在本文所述之某些殘基之Kabat殘基編號顯示在以下序列中： (SEQ ID NO：60)
本發明包括任何包含SEQ ID NQ：60之胺基酸序列或包含80%或更多(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)胺基酸序列一致性之 胺基酸序列的CTLA4結合劑，其中CTLA4結合劑保留結合至CTLA4之能力。
本發明包括CTLA4結合劑之在Kabat位置96處之CDR3甲硫胺酸經任何胺基酸，諸如脯胺酸(但不經Cys、Asp或Asn)取代，例如經以下胺基酸中之任一者取代的實施例：Leu、Ile、Val、Ala、Gly、Tyr、Trp、Phe、Glu、Gln、Ser、Thr、His、Arg、Lys或Pro。
本發明之一些較佳但非限制性CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)為SEQ ID NO：60或在圖2中以SEQ ID NO：8-43列出。圖3顯示此等序列與參考A(SEQ ID NO：1)之比對。在此等CTLA4結合劑中，SEQ ID NO：26-43之結合劑為本發明之與常見C端序列VTVSS(SEQ ID NO：57，如存在於參考A中)相比，在ISVD序列之C端(有時亦稱作「位置114」)具有C端丙胺酸延長部分，即丙胺酸殘基的CTLA4結合劑之實例。如WO 2012/175741中(且亦例如WO 2013/024059及PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)中)所描述，此C端丙胺酸延長部分可防止所謂的「預先存在抗體」(假設為IgG)與位於ISV之C端區之推定抗原決定基之結合。假設此抗原決定基尤其包括C端序列VTVSS(SEQ ID NO：57)之表面曝露胺基酸殘基以及位置14處之胺基酸殘基(及在胺基酸序列中緊接著/接近其之胺基酸殘基，諸如位置11、13及15)且亦可包含位置83處之胺基酸殘基(及在胺基酸序列中緊接著/接近其之胺基酸殘基，諸如位置82、82a、82b及84)及/或位置108處之胺基酸殘基(及在胺基酸序列中緊接著/接近其之胺基酸殘基，諸如位置107)。
然而，儘管此類C端丙胺酸(或一般而言C端延長部分)之存在可極大地減少(且在許多情況下，甚至基本上完全防止)可在來自一系列個體(健 康個體以及患者)之血清中發現之「預先存在的抗體」之結合，已發現即使當ISV含有此類C端丙胺酸(或更一般而言，此類C端延長部分)時，來自一些個體之血清(諸如來自患有一些免疫疾病(諸如SLE)之患者的血清)可含有可結合至ISV之C端區(當此類區曝露時)的預先存在的抗體。同樣參考Ablynx N.V.於2015年5月13日申請且名稱為「Improved immunoglobulin variable domains」之同在申請中之未預先公開之PCT申請案PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)。
因此，本發明之一個特定目標為提供CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)，其為在本文中稱為「參考A」之抗CTLA4奈米抗體之改良之變異體且具有與所謂的「預先存在抗體」，且詳言之PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)中描述之種類之抗體(亦即甚至在C端延長部分存在下可結合至ISV之曝露C端區的彼等預先存在抗體)的減少之結合。
本發明提供包含作為SEQ ID NO：1之序列之變異體之胺基酸序列的CTLA4結合劑，與SEQ ID NO：1之序列相比，該等變異體包含以下突變中之一或多者：-1D或1E；-11V；-14P；-45R；-74S；-83R；-89L或89T； -96P；或-108L；例如，其中CTLA4結合劑包含以下突變組中之一或多者：-89L與11V、14P、45R、74S、83R、86P、108L及1E或1D之組合；-89L與11V之組合；-89L與110K或110Q之組合；-89L與112K或112Q之組合；-89L與11V、14P、45R、74S、83R、86P、108L、110K或110Q及1E或1D之組合；-89L與11V、14P、45R、74S、83R、86P、108L、112K或112Q及1E或1D之組合；-89L與11V及110K或110Q之組合；-89L與11V及112K或112Q之組合；-11V與110K或110Q之組合；及/或-11V與112K或112Q之組合。
特定言之，在本發明之一實施例中，CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)包含：-位置1處之胺基酸較佳為E或D；-位置11處之胺基酸較佳為L或V；-位置14處之胺基酸較佳為A或P；-位置45處之胺基酸較佳為Q或R；-位置74處之胺基酸較佳為A或S； -位置83處之胺基酸較佳為K或R；-位置89處之胺基酸較佳為T、V或L；-位置96處之胺基酸較佳為M或P；-位置108處之胺基酸較佳為Q或L；-位置110處之胺基酸殘基較佳適合地選自T、K或Q；及-位置112處之胺基酸殘基較佳適合地選自S、K或Q；使得例如以下中之一或多者為真：(i)位置89為T；(ii)位置89為L；(iii)位置1為D或E，位置11為V，位置14為P，位置45為R，位置74為S，位置83為R，位置89為L，位置96為P，且位置108為L；(iv)位置89為L且位置11為V；(v)位置89為L且位置110為K或Q；(vi)位置89為L且位置112為K或Q；(vii)位置1為D或E，位置11為V，位置14為P，位置45為R，位置74為S，位置83為R，位置89為L，位置96為P，位置108為L；且位置110為K或Q；(viii)位置1為D或E，位置11為V，位置14為P，位置45為R，位置74為S，位置83為R，位置89為L，位置96為P，位置108為L；且位置112為K或Q；(ix)位置89為L且位置11為V且位置110為K或Q；(x)位置89為L且位置11為V且位置112為K或Q；(xi)位置11為V且位置110為K或Q；或 (xii)位置11為V且位置112為K或Q。
在特定實施例中，包含作為SEQ ID NO：1之變異體的胺基酸序列的本發明CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)尤其較佳，其中位置89為T或其中位置1為D，位置11為V，位置14為P，位置45為R，位置74為S，位置83為R，位置89為L，位置96為P且位置108為L或其中位置11為V且位置89為L(視情況與110K或110Q突變及/或112K或112Q突變適合的組合，且詳言之與110K或110Q突變組合)。甚至更佳為位置11為V且位置89為L，視情況具有110K或110Q突變之胺基酸序列。
如所提及，本文中描述之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)可結合(且詳言之，可特異性結合)至CTLA4。在本發明之一實施例中，CTLA4結合劑可結合至CTLA4且藉此防止抗原呈遞細胞上之CD80及CD86結合至T細胞上之CTLA-4。在本發明之一實施例中，CTLA-4信號傳導之所得阻斷延長T細胞活化，恢復T細胞增殖，且因此擴增T細胞介導之免疫性，其理論上增強患者建立抗腫瘤免疫反應之能力。
表B列舉可存在於本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)中之(SEQ ID NO：1之)位置11、89、110及112處之胺基酸殘基之一些非限制性可能組合。
由本發明提供之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)進一步如本說明書、本文中之實例及圖式中所描述，即其具有如本文所描述之CDR且具有與如本文中所揭示之SEQ ID NO：1之序列的整體序列一致性程度(如本文所定義)及/或可具有有限數目之與此等參考序列(中之一者)的「胺基酸差異」(如本文所描述)。
本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)較佳包含以下CDR(根據Kabat慣例)：-包含胺基酸序列FYGMG(SEQ ID NO：2)之CDR1(根據Kabat)；及-包含胺基酸序列DIRTSAGRTYYADSVKG(SEQ ID NO：3)之CDR2(根據Kabat)；及-包含胺基酸序列EPSGISGWDY(SEQ ID NO：4)之CDR3(根據Kabat)；視情況，其中CDR1、CDR2及/或CDR3包含1、2、3、4、5、5、6、7、8、9或10種取代，例如保守性取代。
替代地，當根據Abm慣例給出CDR時，本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)較佳包含以下CDR：-CDR1(根據Abm)，其為胺基酸序列GGTFSFYGMG(SEQ ID NO：5)；及 -CDR2(根據Abm)，其為胺基酸序列DIRTSAGRTY(SEQ ID NO：6)；及-CDR3(根據Abm)，其為胺基酸序列EPSGISGWDY(SEQ ID NO：7，其與SEQ ID NO：4相同)；視情況，其中CDR1、CDR2及/或CDR3包含1、2、3、4、5、5、6、7、8、9或10種取代，例如保守性取代。
在本發明之一實施例中，本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)具有此類CDR及如本文所論述之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之突變，及視情況：-當藉由BLAST演算法進行比較時，至少85%，較佳至少90%，更佳至少95%之與SEQ ID NO：1之胺基酸序列的序列一致性程度(其中對於測定序列一致性程度，不考慮CDR、任何可能存在之C端延長部分以及涉及之特定態樣所需之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之突變)，其中演算法之參數經選擇以跨越各別參考序列之整個長度給出各別序列之間的最大匹配(例如預期臨限值：10；字長：3；查詢範圍內之最大匹配：0；BLOSUM 62矩陣；空位罰分：存在11，延長1；條件性組成分數矩陣調節)；及/或-不超過7種，諸如不超過5種，較佳不超過3種，諸如僅3、2或1種與SEQ ID NO：1之胺基酸序列的「胺基酸差異」(其中該等胺基酸差異若存在，可存在於構架及/或CDR中但較佳僅存在於構架中且不存在於CDR中；不考慮任何可能存在之C端延長部分且不考慮涉及之特定態樣所需之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之突變)。
以下參考文獻係關於通常用於序列分析之BLAST演算法：BLAST演 算法：Altschul等人(2005)FEBS J.272(20)：5101-5109；Altschul,S.F.,等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；Gish,W.,等人，(1993)Nature Genet.3：266-272；Madden,T.L.,等人，(1996)Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul,S.F.,等人，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang,J.,等人，(1997)Genome Res.7：649-656；Wootton,J.C.,等人，(1993)Comput.Chem.17：149-163；Hancock,J.M.等人，(1994)Comput.Appl.Biosci.10：67-70；比對計分系統：Dayhoff,M.O.,等人，「A model of evolutionary change in proteins.」Atlas of Protein Sequence and Structure中，(1978)第5卷，增刊3.M.O.Dayhoff(編),第345-352頁,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Schwartz,R.M.,等人，「Matrices for detecting distant relationships.」Atlas of Protein Sequence and Structure中，(1978)第5卷，增刊3.M.O.Dayhoff(編),第353-358頁，Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Altschul,S.F.,(1991)J.Mol.Biol.219：555-565；States,D.J.,等人,(1991)Methods 3：66-70；Henikoff,S.,等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919；Altschul,S.F.,等人.,(1993)J.Mol.Evol.36：290-300；比對統計學：Karlin,S.,等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268；Karlin,S.,等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877；Dembo,A.,等人，(1994)Ann.Prob.22：2022-2039；及Altschul,S.F.「Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments.」Theoretical and Computational Methods in Genome Research(S.Suhai,編)中，(1997)第1-14頁，Plenum,New York。
關於由本發明提供之本發明CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)之各種態樣及較佳態樣，就相對於SEQ ID NO：1之序列一致性程度及/或可存在於本發明之此類結合劑中之「胺基酸差異」(亦即與SEQ ID NO：1之序列相比)之數目及種類而論，應注意當據稱：(i)當藉由BLAST演算法進行比較時，本發明之胺基酸序列與SEQ ID NO：1之序列的序列一致性程度為至少85%，較佳至少90%，更佳至少95%(其中對於測定序列一致性程度，不考慮CDR、任何可能存在之C端延長部分以及涉及之特定態樣所需之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之突變)時，其中演算法之參數經選擇以跨越各別參考序列之整個長度給出各別序列之間的最大匹配(例如預期臨限值：10；字長：3；查詢範圍內之最大匹配：0；BLOSUM 62矩陣；空位罰分：存在11，延長1；條件性組成分數矩陣調節)；及/或當據稱：(ii)本發明之胺基酸序列與SEQ ID NO：1之序列的「胺基酸差異」不超過7種，較佳不超過5種，諸如僅3、2或1種(同樣，不考慮任何可能存在之C端延長部分且不考慮涉及之特定態樣所需之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之突變)時，則此亦包括除涉及之特定態樣所需之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之突變及任何可能存在之C端延長部分外，與SEQ ID NO：1之序列不具有胺基酸差異之序列。
因此，在本發明之一個特定態樣中，本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列但其中位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之至少1種胺基酸突 變經取代(例如經保守取代)且可具有與SEQ ID NO：1之100%序列一致性(包括CDR，但不考慮本文所揭示之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之突變或突變之組合及/或任何可能存在之C端延長部分)及/或可不具有與SEQ ID NO：1之胺基酸差異(亦即除本文所揭示之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之突變或突變之組合及任何可能存在之C端延長部分外)。
當存在任何胺基酸差異(亦即除任何C端延長部分及涉及之本發明特定態樣所需之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之突變以外)時，此等胺基酸差異可存在於CDR及/或構架區中，但其較佳僅存在於構架區中(如由Abm慣例所定義，即不在如根據Abm慣例所定義之CDR中)，即使得本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)具有與SEQ ID NO：1或60中存在之CDR相同的CDR(根據Abm慣例來定義)。
此外，當根據本發明之任何態樣之本發明CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)具有一或多種與SEQ ID NO：1之序列的胺基酸差異(除涉及之特定態樣所需之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之突變以外)時，則可存在之此類突變/胺基酸差異(亦即與SEQ ID NO：1之序列相比)之一些特定但非限制性實例為例如E1D、P41A、P41L、P41S或P41T(且詳言之P41A)及/或T87A(例如E1D(視情況存在)、L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P及Q108L)。突變之其他實例為一或多種適合之「人類化」取代(諸如Q108L)(其適合組合)；參考例如WO 2009/138519(或在WO 2009/138519中引用之先前技術中)及WO 2008/020079(或在WO 2008/020079中引用之先前 技術中)，以及WO 2008/020079之表A-3至A-8(其為顯示可能人類化取代的清單)。較佳地，本發明之CTLA4結合劑至少含有Q108L人類化取代。
此外，當本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)存在於其所存在之CTLA4結合劑之N端部分及/或形成N端部分時，則其較佳在位置1處含有D(亦即與參考A相比之E1D突變)。此類N端CTLA4結合劑之一些較佳但非限制性實例以SEQ ID NO：24及25及60給出。因此，在另一態樣中，本發明係關於在其N端具有本發明之CTLA4結合劑(其如本文進一步描述)的本發明多肽(其如本文進一步描述)，其中本發明之該CTLA4結合劑在位置1處具有D，且較佳選自SEQ ID NO：24及25及60之CTLA4結合劑。
類似地，當本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)以單價形式使用時，其較佳具有如本文所描述之C端延長部分X(n)及位置1處之D兩者。此類單價CTLA4結合劑之一些較佳但非限制性實例以SEQ ID NO：42及43給出。因此，在另一態樣中，本發明係關於具有位置1處之D及C端延長部分X(n)(其較佳為單個Ala殘基)之本發明單價CTLA4結合劑(其如本文進一步描述)。在一個特定態樣中，該單價CTLA4結合劑係選自SEQ ID NO：42或43。
藉助於較佳但非限制性實例，SEQ ID NO：22-25及40-42及60為本發明之具有與SEQ ID NO：1之其他胺基酸差異(即A14P、Q45R、A74S、K83R及/或Q108L(此外，如先前段落中所指示，SEQ ID NO：24、25、42及43亦具有E1D突變))之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)之實例。因此，在一特定態樣中，本發明係關於本發明之CTLA4結合劑(亦即具有如本文所描述之在位置11、89、110及/或112處之突變以及進一步 如本文所描述)，其至少具有視情況存在之E1D突變、A14P突變、Q45R突變、A74S突變、K83R突變及Q108L突變之適合的組合，且較佳Q108L與其他A14P、Q45R、A74S及K83R突變中之任一者之適合的組合，且較佳與此等其他突變中之任兩者組合，更佳與此等突變中之任何三種(諸如具有組合A14P、A74S及K83R或E1D、L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P及Q108L)，諸如與所有此等突變(且同樣，當CTLA4結合劑為單價或存在於本發明之CTLA4結合劑之N端時，較佳亦E1D突變)。
當本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)以單價形式使用時及/或當CTLA4結合部分存在於CTLA4結合劑之C端及/或形成C端時(或當其在此類多肽中另外具有「曝露」C端時，此一般意謂ISVD之C端不結合或連接至恆定域(諸如CH1域)；同樣參考WO 2012/175741及PCT/EP2015/060643(WO 2015/173325))，其較佳亦具有式(X)n之C端延長部分，其中n為1至10，較佳1至5，諸如1、2、3、4或5(且較佳1或2，諸如1)；且各X為(較佳天然存在之)胺基酸殘基，其獨立地選自天然存在之胺基酸殘基(但根據一個較佳態樣，其不包含任何半胱胺酸殘基)，且較佳獨立地選自由丙胺酸(A)、甘胺酸(G)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)或異白胺酸(I)組成之群。
根據此類C端延長部分X(n)之一些較佳但非限制性實例，X及n可為如下：(a)n=1且X=Ala；(b)n=2且各X=Ala；(c)n=3且各X=Ala； (d)n=2且至少一個X=Ala(其餘胺基酸殘基X獨立地選自任何天然存在之胺基酸，但較佳獨立地選自Val、Leu及/或Ile)；(e)n=3且至少一個X=Ala(其餘胺基酸殘基X獨立地選自任何天然存在之胺基酸但較佳獨立地選自Val、Leu及/或Ile)；(f)n=3且至少兩個X=Ala(其餘胺基酸殘基X獨立地選自任何天然存在之胺基酸，但較佳獨立地選自Val、Leu及/或Ile)；(g)n=1且X=Gly；(h)n=2且各X=Gly；(i)n=3且各X=Gly；(j)n=2且至少一個X=Gly(其餘胺基酸殘基X獨立地選自任何天然存在之胺基酸，但較佳獨立地選自Val、Leu及/或Ile)；(k)n=3且至少一個X=Gly(其餘胺基酸殘基X獨立地選自任何天然存在之胺基酸但較佳獨立地選自Val、Leu及/或Ile)；(l)n=3且至少兩個X=Gly(其餘胺基酸殘基X獨立地選自任何天然存在之胺基酸，但較佳獨立地選自Val、Leu及/或Ile)；(m)n=2且各X=Ala或Gly；(n)n=3且各X=Ala或Gly；(o)n=3且至少一個X=Ala或Gly(其餘胺基酸殘基X獨立地選自任何天然存在之胺基酸，但較佳獨立地選自Val、Leu及/或Ile)；或(p)n=3且至少兩個X=Ala或Gly(其餘胺基酸殘基X獨立地選自任何天然存在之胺基酸，但較佳獨立地選自Val、Leu及/或Ile)；其中態樣(a)、(b)、(c)、(g)、(h)、(i)、(m)及(n)尤其較佳，其中n=1或2之態樣較佳且n=1之態樣尤其較佳。
亦應注意，除非(游離)半胱胺酸殘基用於或意欲用於進一步功能化，例如聚乙二醇化，較佳地，本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)中存在之任何C端延長部分不含有該半胱胺酸殘基。
適用之C端延長部分之一些特定但非限制性實例為以下胺基酸序列：A、AA、AAA、G、GG、GGG、AG、GA、AAG、AGG、AGA、GGA、GAA或GAG。
當本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)含有在位置110或112處之突變(視情況與如本文所描述之在位置1、11、14、45、74、83、89、96及/或108處之突變組合)(相對於SEQ ID NO：1之胺基酸序列)時，在本發明之一實施例中，構架4之C端胺基酸殘基(自位置109開始)可如SEQ ID NO：1中所述但其中5個C端殘基可如下經取代：(i)若不存在C端延長部分：VTVKS(SEQ ID NO：45)、VTVQS(SEQ ID NO：46)、VKVSS(SEQ ID NO：47)或VQVSS(SEQ ID NO：48)；或(ii)若存在C端延長部分：VTVKSX(n)(SEQ ID NO：49)、VTVQSX(n)(SEQ ID NO：50)、VKVSSX(n)(SEQ ID NO：51)或VQVSSX(n)(SEQ ID NO：52)，諸如VTVKSA(SEQ ID NO：53)、VTVQSA(SEQ ID NO：54)、VKVSSA(SEQ ID NO：55)或VQVSSA(SEQ ID NO：56)。
當本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)不含有在位置110或112處之突變(但僅如本文所描述之在位置1、11、14、45、74、83、89、96及/或108處之突變)時，在本發明之一實施例中，構架4之C端胺基酸殘基(自位置109開始)可如SEQ ID NO：1中所述但其中5個C端殘基 可如下經取代：(i)當不存在C端延長部分時：VTVSS(SEQ ID NO：57)(如在SEQ ID NO：1之序列中)；或(ii)當存在C端延長部分時：VTVSSX(n)(SEQ ID NO：58)，諸如VTVSSA(SEQ ID NO：59)。在此等C端序列中，X及n如本文關於C端延長部分所定義。
本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)之一些較佳但非限制性實例以SEQ ID NO：9-43及60給出，且此等序列中之每一者形成本發明之另一態樣(包含此等序列中之一者的蛋白質、CTLA4結合劑、多肽或其他化合物或構築體亦如此)。在此等中，SEQ ID NO：9-25及60之CTLA4結合劑不具有C端延長部分，且SEQ ID NO：26-43之CTLA4結合劑含有C端丙胺酸(其為如本文所描述之C端延長部分之較佳但非限制性實例)。
本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)之實例包含SEQ ID NO：22、23、24、25、40、41、42、43及60之胺基酸序列。
因此，在第一態樣中，本發明係關於具有以下之CTLA4結合劑(例如免疫球蛋白單一可變域，諸如奈米抗體)：-CDR1(根據Kabat)，其為胺基酸序列FYGMG(SEQ ID NO：2)；及-CDR2(根據Kabat)，其為胺基酸序列DIRTSAGRTYYADSVKG(SEQ ID NO：3)；及-CDR3(根據Kabat)，其為胺基酸序列EPSGISGWDY(SEQ ID NO：4)； 且具有：-當藉由BLAST演算法進行比較時，至少85%，較佳至少90%，更佳至少95%之與SEQ ID NO：1之胺基酸序列的序列一致性程度(其中對於測定序列一致性程度，不考慮CDRs、任何可能存在之C端延長部分以及涉及之特定態樣所需之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112之突變)，其中演算法之參數經選擇以跨越各別參考序列之整個長度給出各別序列之間的最大匹配(例如預期臨限值：10；字長：3；查詢範圍內之最大匹配：0；BLOSUM 62矩陣；空位罰分：存在11，延長1；條件性組成分數矩陣調節)；及/或；及/或-不超過7種，諸如不超過5種，較佳不超過3種，諸如僅3、2或1種與SEQ ID NO：1之胺基酸序列的「胺基酸差異」(如本文所定義，且不考慮以上列出之可能存在之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112之突變中的任一者且不考慮任何可能存在之C端延長部分)(其中該等胺基酸差異(若存在)可存在於構架及/或CDRs中，但較佳僅存在於構架中且不存在於CDRs中)；及視情況具有：-C端延長部分(X)n，其中n為1至10，較佳1至5，諸如1、2、3、4或5(且較佳1或2，諸如1)；且各X為(較佳天然存在之)胺基酸殘基，其獨立地選自，且較佳獨立地選自由丙胺酸(A)、甘胺酸(G)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)或異白胺酸(I)組成之群；其中，在CTLA4結合劑之胺基酸序列中：-位置1之胺基酸殘基較佳選自E或D； -位置11之胺基酸殘基較佳選自L或V；-位置14之胺基酸殘基較佳選自A或P；-位置45之胺基酸殘基較佳選自Q或R；-位置74之胺基酸殘基較佳選自A或S；-位置83之胺基酸殘基較佳選自K或R；-位置89之胺基酸殘基較佳適合地選自T、V或L；-位置96之胺基酸殘基較佳選自M或P；-位置108之胺基酸殘基較佳選自Q或L；-位置110之胺基酸殘基較佳適合地選自T、K或Q；及/或-位置112之胺基酸殘基較佳適合地選自S、K或Q；使得例如以下中之一或多者為真：(i)位置1為E或D；(ii)位置11為V；(iii)位置14為P；(iv)位置45為R；(v)位置74為S；(vi)位置83為R；(vii)位置89為T或L；(viii)位置96為P；(ix)位置108為L；及/或例如，其中CTLA4結合劑包含以下突變組中之一或多者a.位置11為V且位置110為K或Q；b.位置11為V且位置112為K或Q； c.位置89為L且位置11為V；d.位置89為L且位置110為K或Q；e.位置89為L且位置112為K或Q；f.位置89為L且位置11為V且位置110為K或Q；g.位置89為L且位置11為V且位置112為K或Q；h.位置1為E或D；位置11為V；位置14為P；位置45為R；位置74為S；位置83為R；位置89為L；位置96為P；且位置108為L；i.位置1為E或D；位置11為V；位置14為P；位置45為R；位置74為S；位置83為R；位置89為L；位置96為P；位置108為L；且位置110為K或Q；j.位置1為E或D；位置11為V；位置14為P；位置45為R；位置74為S；位置83為R；位置89為L；位置96為P；位置108為L；且位置112為K或Q；k.位置1為E或D；位置11為V；位置14為P；位置45為R；位置74為S；位置83為R；位置89為L；位置96為P；且位置108為L。
在另一態樣中，本發明係關於具有以下之CTLA4結合劑(例如免疫球蛋白單一可變域，諸如奈米抗體)：-CDR1(根據Kabat)，其為胺基酸序列FYGMG(SEQ ID NO：2)；及-CDR2(根據Kabat)，其為胺基酸序列DIRTSAGRTYYADSVKG(SEQ ID NO：3)；及-CDR3(根據Kabat)，其為胺基酸序列EPSGISGWDY(SEQ ID NO：4)； 且具有：-當藉由BLAST演算法進行比較時，至少85%，較佳至少90%，更佳至少95%之與SEQ ID NO：1之胺基酸序列的序列一致性程度(其中對於測定序列一致性程度，不考慮CDR、任何可能存在之C端延長部分以及涉及之特定態樣所需之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之突變)，其中演算法之參數經選擇以跨越各別參考序列之整個長度給出各別序列之間的最大匹配(例如預期臨限值：10；字長：3；查詢範圍內之最大匹配：0；BLOSUM 62矩陣；空位罰分：存在11，延長1；條件性組成分數矩陣調節)；及/或-不超過7種，諸如不超過5種，較佳不超過3種，諸如僅3、2或1種與SEQ ID NO：1之胺基酸序列的「胺基酸差異」(如本文所定義，且不考慮以上列出之可能存在之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之突變中的任一者且不考慮任何可能存在之C端延長部分)(其中該等胺基酸差異若存在，可存在於構架及/或CDR中但較佳僅存在於構架中且不存在於CDR中)；及視情況具有：-C端延長部分(X)n，其中n為1至10，較佳1至5，諸如1、2、3、4或5(且較佳1或2，諸如1)；且各X為(較佳天然存在之)胺基酸殘基，其獨立地選自，且較佳獨立地選自由丙胺酸(A)、甘胺酸(G)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)或異白胺酸(I)組成之群；該CTLA4結合劑(例如免疫球蛋白單一可變域，諸如奈米抗體)在所提及之位置(根據Kahat之編號)處包含以下胺基酸殘基中之一或多者(亦即 與SEQ ID NO：1之胺基酸序列相比之突變)：-1D或1E；-11V；-14P；-45R；-74S；-83R；-89T或89L；-96P；或-108L；例如，其中CTLA4結合劑包含以下突變組中之一或多者：-1D或1E與11V、14P、45R、74S、83R、89L、96P及108L之組合；-11V與110K或110Q之組合；-11V與112K或112Q之組合；-89L與11V之組合；-89L與110K或110Q之組合；-89L與112K或112Q之組合；-1D或1E與11V、14P、45R、74S、83R、89L、96P、108L及110K或110Q之組合；-1D或1E與11V、14P、45R、74S、83R、89L、96P、108L及112K或112Q之組合；-89L與11V及110K或110Q之組合；或 -89L與11V及112K或112Q之組合；如所提及，當本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)以單價形式使用及/或其中CTLA4結合部分存在於本發明之CTLA4結合劑(如本文所定義)之C端時，CTLA4結合劑較佳具有C端延長部分X(n)，該C端延長部分可如本文關於本發明之CTLA4結合劑所描述及/或如WO2012/175741或PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)中所描述。
本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)之一些較佳但非限制性實例以SEQ ID NO：8-43或60給出，且此等胺基酸序列中之每一者單獨地形成本發明之另一態樣。
如所提及，在本發明中，如下胺基酸序列尤其較佳：其中位置89為T；或其中位置1為E或D，位置11為V，位置14為P，位置45為R，位置74為S，位置83為R，位置89為L，位置96為P且位置108為L；或其中位置11為V且位置89為L(視情況與110K或110Q突變及/或112K或112Q突變適合的組合，且詳言之與110K或110Q突變組合)。甚至更佳為位置11為V且位置89為L，視情況具有110K或110Q突變之胺基酸序列。
因此，在一個較佳態樣中，本發明係關於具有以下之CTLA4結合劑(例如免疫球蛋白單一可變域，諸如奈米抗體)：-CDR1(根據Kabat)，其為胺基酸序列FYGMG(SEQ ID NO：2)；及-CDR2(根據Kabat)，其為胺基酸序列DIRTSAGRTYYADSVKG(SEQ ID NO：3)；及-CDR3(根據Kabat)，其為胺基酸序列EPSGISGWDY(SEQ ID NO：4)； 且具有：-當藉由BLAST演算法進行比較時，至少85%，較佳至少90%，更佳至少95%之與SEQ ID NO：1之胺基酸序列的序列一致性程度(其中對於測定序列一致性程度，不考慮CDR、任何可能存在之C端延長部分以及涉及之特定態樣所需之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之突變)，其中演算法之參數經選擇以跨越各別參考序列之整個長度給出各別序列之間的最大匹配(例如預期臨限值：10；字長：3；查詢範圍內之最大匹配：0；BLOSUM 62矩陣；空位罰分：存在11，延長1；條件性組成分數矩陣調節)；及/或；及/或-不超過7種，諸如不超過5種，較佳不超過3種，諸如僅3、2或1種與SEQ ID NO：1之胺基酸序列的「胺基酸差異」(如本文所定義，且不考慮以上列出之可能存在之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之突變中的任一者且不考慮任何可能存在之C端延長部分)(其中該等胺基酸差異若存在，可存在於構架及/或CDR中但較佳僅存在於構架中且不存在於CDR中)；及視情況具有：-C端延長部分(X)n，其中n為1至10，較佳1至5，諸如1、2、3、4或5(且較佳1或2，諸如1)；且各X為(較佳天然存在之)胺基酸殘基，其獨立地選自，且較佳獨立地選自由丙胺酸(A)、甘胺酸(G)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)或異白胺酸(I)組成之群；其中，在CTLA4結合劑之胺基酸序列中：-位置1處之胺基酸殘基較佳選自E或D； -位置11處之胺基酸殘基較佳選自L或V；-位置14處之胺基酸殘基較佳選自A或P；-位置45處之胺基酸殘基較佳選自Q或R；-位置74處之胺基酸殘基較佳選自A或S；-位置83處之胺基酸殘基較佳選自K或R；-位置89處之胺基酸殘基較佳選自T、L或V；-位置96處之胺基酸殘基較佳選自M或P；-位置108處之胺基酸殘基較佳選自L或Q；-位置110處之胺基酸殘基較佳適合地選自T、K或Q(且較佳為T)；及/或-位置112處之胺基酸殘基較佳適合地選自S、K或Q(且較佳為S)。
在另一較佳態樣中，本發明係關於具有以下之CTLA4結合劑(例如免疫球蛋白單一可變域，諸如奈米抗體)：-CDR1(根據Kabat)，其為胺基酸序列FYGMG(SEQ ID NO：2)；及-CDR2(根據Kabat)，其為胺基酸序列DIRTSAGRTYYADSVKG(SEQ ID NO：3)；及-CDR3(根據Kabat)，其為胺基酸序列EPSGISGWDY(SEQ ID NO：4)；且具有：-當藉由BLAST演算法進行比較時，至少85%，較佳至少90%，更佳至少95%之與SEQ ID NO：1之胺基酸序列的序列一致性程度(其中對於測定序列一致性程度，不考慮CDR、任何可能存在之C端延長部分以及涉及 之特定態樣所需之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之突變)，其中演算法之參數經選擇以跨越各別參考序列之整個長度給出各別序列之間的最大匹配(例如預期臨限值：10；字長：3；查詢範圍內之最大匹配：0；BLOSUM 62矩陣；空位罰分：存在11，延長1；條件性組成分數矩陣調節)；及/或-不超過7種，諸如不超過5種，較佳不超過3種，諸如僅3、2或1種與SEQ ID NO：1之胺基酸序列的「胺基酸差異」(如本文所定義，且不考慮以上列出之可能存在之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之突變中的任一者且不考慮任何可能存在之C端延長部分)(其中該等胺基酸差異若存在，可存在於構架及/或CDR中但較佳僅存在於構架中且不存在於CDR中)；及視情況具有：-C端延長部分(X)n，其中n為1至10，較佳1至5，諸如1、2、3、4或5(且較佳1或2，諸如1)；且各X為(較佳天然存在之)胺基酸殘基，其獨立地選自，且較佳獨立地選自由丙胺酸(A)、甘胺酸(G)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)或異白胺酸(I)組成之群；其中，例如，CTLA4結合劑包含一或多種根據以下之突變：-位置1處之胺基酸殘基為E或D；-位置11處之胺基酸殘基為V；-位置14處之胺基酸殘基為P；-位置45處之胺基酸殘基為R；-位置74處之胺基酸殘基為S； -位置83處之胺基酸殘基為R；-位置89處之胺基酸殘基為L；-位置96處之胺基酸殘基為P；-位置108處之胺基酸殘基為L；-位置110處之胺基酸殘基較佳選自T、K或Q；或-位置112處之胺基酸殘基較佳選自S、K或Q。
在一個特定但非限制性態樣中，本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)在所提及之位置(根據Kabat之編號)處包含以下突變組中之一或多者(亦即與SEQ ID NO：1之序列相比之突變)：-11V與89L之組合；-11V與110K或110Q之組合；-11V與112K或112Q之組合；-11V與89L及110K或110Q之組合；-11V與89L及112K或112Q之組合；-11V與1D或1E、14P、45R、74S、83R、89L、96P、108L及110K或110Q之組合；-11V與1D或1E、14P、45R、74S、83R、89L、96P、108L及112K或112Q之組合；或-11V與1D或1E、14P、45R、74S、83R、89L、96P及108L之組合。
且具有表A之CTLA4結合劑中，例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：60中之CDR(例如根據Kabat)且具有與如本文所描述之SEQ ID NO：1之胺基酸序列的整體序列一致性程度。
在另一特定但非限制性態樣中，本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)在所提及之位置(根據Kabat之編號)處包含以下突變組中之一或多者(亦即與SEQ ID NO：1之序列相比之突變)：-89L與11V之組合；-89L與110K或110Q之組合；-89L與112K或112Q之組合；-89L與11V及110K或110Q之組合；-89L與11V及112K或112Q之組合；-89L與1D或1E、11V、14P、45R、74S、83R、96P及108L之組合；-89L與1D或1E、11V、14P、45R、74S、83R、96P、108L及110K或110Q之組合；或-89L與1D或1E、11V、14P、45R、74S、83R、96P、108L及112K或112Q之組合，且具有表A之CTLA4結合劑中，例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：60中之CDR(例如根據Kabat)且具有與如本文所描述之SEQ ID NO：1之胺基酸序列的整體序列一致性程度。
在另一特定但非限制性態樣中，本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)在所提及之位置(根據Kabat之編號)處包含以下胺基酸突變組中之一或多者(亦即與SEQ ID NO：1之序列相比之突變)：-110K或110Q與11V之組合；-110K或110Q與89L之組合；-110K或110Q與11V及89L之組合； -110K或110Q與1D或1E、11V、14P、45R、74S、83R、89L、96P及108L之組合。
且具有表A之CTLA4結合劑中，例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：60中之CDR(例如根據Kabat)且具有與如本文所描述之SEQ ID NO：1之胺基酸序列的整體序列一致性程度。
在另一特定但非限制性態樣中，本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)在所提及之位置(根據Kabat之編號)處包含以下突變組中之一或多者(亦即與SEQ ID NO：1之序列相比之突變)：-112K或112Q與11V之組合；-112K或112Q與89L之組合；或-112K或112Q與11V及89L之組合；或-112K或112Q與1D或1E、11V、14P、45R、74S、83R、89L、96P及108L之組合。
且具有表A之CTLA4結合劑中，例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：60中之CDR(例如根據Kabat)且具有與如本文所描述之SEQ ID NO：1之胺基酸序列的整體序列一致性程度。
在另一態樣中，本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)在位置89處包含T且具有諸如SEQ ID NO：60中闡述之彼等CDR的CDR(例如根據Kabat)且具有與如本文所描述之SEQ ID NO：1之胺基酸序列的整體序列一致性程度。
在另一態樣中，本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)在位置11處包含V且在位置89處包含L且具有諸如SEQ ID NO：1或60中闡述之彼等CDR的CDR(例如根據Kabat)且具有與如本文所描述之SEQ ID NO：1之胺基酸序列的整體序列一致性程度。
如所提及，根據以上態樣，本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)較佳進一步含有E1D突變、L11V突變、A14P突變、Q45R突變、A74S突變、K83R突變、V89L突變、M96P突變及Q108L突變之適合的組合，且在本發明之一實施例中，Q108L與其他A14P、Q45R、A74S及K83R突變中之任一者之適合的組合，且在本發明之一實施例中，與此等其他突變中之任兩者組合，更佳與此等突變中之任三者(諸如具有組合A14P、A74S及K83R)，諸如與此等突變中之所有四者(且同樣，當CTLA4結合劑為單價或存在於本發明之CTLA4結合劑之N端時，較佳亦E1D突變)。
在另一態樣中，本發明係關於具有以下之CTLA4結合劑(例如免疫球蛋白單一可變域，諸如奈米抗體)：-CDR1(根據Abm)，其為胺基酸序列GGTFSFYGMG(SEQ ID NO：5)；及-CDR2(根據Abm)，其為胺基酸序列DIRTSAGRTY(SEQ ID NO：6)；及-CDR3(根據Abm)，其為胺基酸序列EPSGISGWDY(SEQ ID NO：4)；且具有：-當藉由BLAST演算法進行比較時，至少85%，較佳至少90%，更佳至少95%之與SEQ ID NO：1之胺基酸序列的序列一致性程度(其中對於測定序列一致性程度，不考慮CDR、任何可能存在之C端延長部分以及涉及之特定態樣所需之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110 及/或112處之突變)，其中演算法之參數經選擇以跨越各別參考序列之整個長度給出各別序列之間的最大匹配(例如預期臨限值：10；字長：3；查詢範圍內之最大匹配：0；BLOSUM 62矩陣；空位罰分：存在11，延長1；條件性組成分數矩陣調節)；及/或-不超過7種，諸如不超過5種，較佳不超過3種，諸如僅3、2或1種與SEQ ID NO：1之胺基酸序列的「胺基酸差異」(如本文所定義，且不考慮以上列出之可能存在之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之突變中的任一者且不考慮任何可能存在之C端延長部分)(其中該等胺基酸差異若存在，可存在於構架及/或CDR中但較佳僅存在於構架中且不存在於CDR中)；及視情況具有：-C端延長部分(X)n，其中n為1至10，較佳1至5，諸如1、2、3、4或5(且較佳1或2，諸如1)；且各X為(較佳天然存在之)胺基酸殘基，其獨立地選自，且較佳獨立地選自由丙胺酸(A)、甘胺酸(G)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)或異白胺酸(I)組成之群；包含胺基酸序列，其中：-位置1處之胺基酸殘基為E或D；-位置11處之胺基酸殘基為L或V；-位置14處之胺基酸殘基為P；-位置45處之胺基酸殘基為R；-位置74處之胺基酸殘基為S；-位置83處之胺基酸殘基為R； -位置89處之胺基酸殘基較佳選自T、V或L；-位置96處之胺基酸殘基為P；-位置108處之胺基酸殘基為L；-位置110處之胺基酸殘基較佳選自T、K或Q；及-位置112處之胺基酸殘基較佳選自S、K或Q；例如使得以下中之一或多者為真：(i)位置1為D或E；(ii)位置11為V；(iii)位置14為P；(iv)位置45為R；(v)位置74為S；(vi)位置83為R；(vii)位置89為L或T；(viii)位置96為P；或(ix)位置108為L。
例如，其中CTLA4結合劑包含以下突變組中之一或多者：a.位置11為V且位置110為K或Q；b.位置11為V且位置112為K或Q；c.位置89為L且位置11為V；d.位置89為L且位置110為K或Q；e.位置89為L且位置112為K或Q；f.位置89為L且位置11為V且位置110為K或Q；或g.位置89為L且位置11為V且位置112為K或Q。
在另一態樣中，本發明係關於具有以下之CTLA4結合劑(例如免疫球蛋白單一可變域，諸如奈米抗體)：-CDR1(根據Abm)，其為胺基酸序列GGTFSFYGMG(SEQ ID NO：5)；及-CDR2(根據Abm)，其為胺基酸序列DIRTSAGRTY(SEQ ID NO：6)；及-CDR3(根據Abm)，其為胺基酸序列EPSGISGWDY(SEQ ID NO：4)；且具有：-當藉由BLAST演算法進行比較時，至少85%，較佳至少90%，更佳至少95%之與SEQ ID NO：1之胺基酸序列的序列一致性程度(其中對於測定序列一致性程度，不考慮CDR、任何可能存在之C端延長部分以及涉及之特定態樣所需之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之突變)，其中演算法之參數經選擇以跨越各別參考序列之整個長度給出各別序列之間的最大匹配(例如預期臨限值：10；字長：3；查詢範圍內之最大匹配：0；BLOSUM 62矩陣；空位罰分：存在11，延長1；條件性組成分數矩陣調節)；及/或-不超過7種，諸如不超過5種，較佳不超過3種，諸如僅3、2或1種與SEQ ID NO：1之胺基酸序列的「胺基酸差異」(如本文所定義，且不考慮以上列出之可能存在之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之突變中的任一者且不考慮任何可能存在之C端延長部分)(其中該等胺基酸差異若存在，可存在於構架及/或CDR中但較佳僅存在於 構架中且不存在於CDR中)；及視情況具有：-C端延長部分(X)n，其中n為1至10，較佳1至5，諸如1、2、3、4或5(且較佳1或2，諸如1)；且各X為(較佳天然存在之)胺基酸殘基，其獨立地選自，且較佳獨立地選自由丙胺酸(A)、甘胺酸(G)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)或異白胺酸(I)組成之群；該CTLA4結合劑(例如免疫球蛋白單一可變域，諸如奈米抗體)在所提及之位置(根據Kabat之編號)處包含以下胺基酸殘基中之一或多者(亦即與SEQ ID NO：1之胺基酸序列相比之突變)：-1D或1E；-11V；-14P；-45R；-74S；-83R；-89L或89T；-96P；或-108L；例如，其中CTLA4結合劑包含以下突變組中之一或多者：-11V與110K或110Q之組合；-11V與112K或112Q之組合；-89L與11V之組合；-89L與110K或110Q之組合； -89L與112K或112Q之組合；-89L與11V及110K或110Q之組合；或-89L與11V及112K或112Q之組合。
如所提及，當本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)以單價形式使用及/或其中CTLA4結合部分存在於本發明之CTLA4結合劑(如本文所定義)之C端時，CTLA4結合劑較佳具有C端延長部分X(n)，該C端延長部分可如本文關於本發明之CTLA4結合劑所描述及/或如WO2012/175741或PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)中所描述。
本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)之一些較佳但非限制性實例以SEQ ID NO：8-43及60給出，且此等胺基酸序列中之每一者單獨地形成本發明之另一態樣。
如所提及，在本發明中，如下胺基酸序列尤其較佳：其中位置89為T；或其中位置1為E或D，位置11為V，位置14為P，位置45為R，位置74為S，位置83為R，位置89為L，位置96為P，或位置108為L；或其中位置11為V且位置89為L(視情況與110K或110Q突變及/或112K或112Q突變適合的組合，且詳言之與110K或110Q突變組合)。甚至更佳為位置11為V且位置89為L，視情況具有110K或110Q突變之胺基酸序列。
因此，在一個較佳態樣中，本發明係關於具有以下之CTLA4結合劑(例如免疫球蛋白單一可變域，諸如奈米抗體)：-CDR1(根據Abm)，其為胺基酸序列GGTFSFYGMG(SEQ ID NO：5)；及-CDR2(根據Abm)，其為胺基酸序列DIRTSAGRTY(SEQ ID NO：6)；及 -CDR3(根據Abm)，其為胺基酸序列EPSGISGWDY(SEQ ID NO：4)；且具有：-當藉由BLAST演算法進行比較時，至少85%，較佳至少90%，更佳至少95%之與SEQ ID NO：1之胺基酸序列的序列一致性程度(其中對於測定序列一致性程度，不考慮CDR、任何可能存在之C端延長部分以及涉及之特定態樣所需之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之突變)，其中演算法之參數經選擇以跨越各別參考序列之整個長度給出各別序列之間的最大匹配(例如預期臨限值：10；字長：3；查詢範圍內之最大匹配：0；BLOSUM 62矩陣；空位罰分：存在11，延長1；條件性組成分數矩陣調節)；及/或-不超過7種，諸如不超過5種，較佳不超過3種，諸如僅3、2或1種與SEQ ID NO：1之胺基酸序列的「胺基酸差異」(如本文所定義，且不考慮以上列出之可能存在之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之突變中的任一者且不考慮任何可能存在之C端延長部分)(其中該等胺基酸差異若存在，可存在於構架及/或CDR中但較佳僅存在於構架中且不存在於CDR中)；及視情況具有：-C端延長部分(X)n，其中n為1至10，較佳1至5，諸如1、2、3、4或5(且較佳1或2，諸如1)；且各X為(較佳天然存在之)胺基酸殘基，其獨立地選自，且較佳獨立地選自由丙胺酸(A)、甘胺酸(G)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)或異白胺酸(I)組成之群； 包含具有一或多種根據以下之突變(相對於SEQ ID NO：1之胺基酸序列)的胺基酸序列：-位置1處之胺基酸殘基較佳選自E及D；-位置11處之胺基酸殘基較佳選自L及V；-位置14處之胺基酸殘基較佳選自A及P；-位置45處之胺基酸殘基較佳選自Q及R；-位置74處之胺基酸殘基較佳選自A及S；-位置83處之胺基酸殘基較佳選自K及R；-位置89處之胺基酸殘基較佳選自T、L及V；-位置96處之胺基酸殘基較佳選自M或P；-位置108處之胺基酸殘基較佳選自L或Q；-位置110處之胺基酸殘基較佳選自T、K或Q(且較佳為T)；及-位置112處之胺基酸殘基較佳選自S、K或Q(且較佳S)。
在另一較佳態樣中，本發明係關於具有以下之CTLA4結合劑(例如免疫球蛋白單一可變域，諸如奈米抗體)：-CDR1(根據Abm)，其為胺基酸序列GGTFSFYGMG(SEQ ID NO：5)；及-CDR2(根據Abm)，其為胺基酸序列DIRTSAGRTY(SEQ ID NO：6)；及-CDR3(根據Abm)，其為胺基酸序列EPSGISGWDY(SEQ ID NO：4)；且具有：-當藉由BLAST演算法進行比較時，至少85%，較佳至少90%，更佳 至少95%之與SEQ ID NO：1之胺基酸序列的序列一致性程度(其中對於測定序列一致性程度，不考慮CDR、任何可能存在之C端延長部分以及涉及之特定態樣所需之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之突變)，其中演算法之參數經選擇以跨越各別參考序列之整個長度給出各別序列之間的最大匹配(例如預期臨限值：10；字長：3；查詢範圍內之最大匹配：0；BLOSUM 62矩陣；空位罰分：存在11，延長1；條件性組成分數矩陣調節)；及/或-不超過7種，諸如不超過5種，較佳不超過3種，諸如僅3、2或1種與SEQ ID NO：1之胺基酸序列的「胺基酸差異」(如本文所定義，且不考慮以上列出之可能存在之在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110及/或112處之突變中的任一者且不考慮任何可能存在之C端延長部分)(其中該等胺基酸差異若存在，可存在於構架及/或CDR中但較佳僅存在於構架中且不存在於CDR中)；及視情況具有：-C端延長部分(X)n，其中n為1至10，較佳1至5，諸如1、2、3、4或5(且較佳1或2，諸如1)；且各X為(較佳天然存在之)胺基酸殘基，其獨立地選自，且較佳獨立地選自由丙胺酸(A)、甘胺酸(G)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)或異白胺酸(I)組成之群；其中CTLA4結合劑包含以下突變中之一或多者：-位置1處之胺基酸殘基為D或E；-位置11處之胺基酸殘基為V；-位置14處之胺基酸殘基為P； -位置45處之胺基酸殘基為R；-位置74處之胺基酸殘基為S；-位置83處之胺基酸殘基為R；-位置89處之胺基酸殘基為L；-位置96處之胺基酸殘基為P；-位置108處之胺基酸殘基為L；-位置110處之胺基酸殘基較佳適合地選自T、K或Q；或-位置112處之胺基酸殘基較佳適合地選自S、K或Q。
在一個特定但非限制性態樣中，本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)在所提及之位置(根據Kabat之編號)處包含以下突變組中之一或多者(亦即與SEQ ID NO：1之序列相比之突變)：-11V與89L之組合；-11V與1D、14P、45R、74S、83R、89L、96P、108L之組合；-11V與1E、14P、45R、74S、83R、89L、96P、108L之組合；-11V與110K或110Q之組合；-11V與110K或110Q及1D或1E及14P、45R、74S、83R、89L、96P及108L之組合；-11V與112K或112Q之組合；-11V與112K或112Q及1D或1E及14P、45R、74S、83R、89L、96P及108L之組合；-11V與89L及110K或110Q之組合；或-11V與89L及112K或112Q之組合，且具有表A之CTLA4結合劑中，例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO： 60中之CDR(例如根據Abm)且具有與如本文所描述之SEQ ID NO：1之胺基酸序列的整體序列一致性程度。
在另一特定但非限制性態樣中，本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)在所提及之位置(根據Kabat之編號)處包含以下突變組(亦即與SEQ ID NO：1之序列相比之突變)：-89L與11V之組合；-89L與1D或1E、11V、14P、45R、74S、83R、96P及108L之組合；-89L與110K或110Q之組合；-89L與110K或110Q及1D或1E及11V、14P、45R、74S、83R、96P及108L之組合；-89L與112K或112Q之組合；-89L與112K或112Q及1D或1E及11V、14P、45R、74S、83R、96P及108L之組合；-89L與11V及110K或110Q之組合；或-89L與11V及112K或112Q之組合；且具有表A之CTLA4結合劑中，例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：60中之CDR(例如根據Abm)且具有與如本文所描述之SEQ ID NO：1之胺基酸序列的整體序列一致性程度。
在另一特定但非限制性態樣中，本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)在所提及之位置(根據Kabat之編號)處包含以下突變組(亦即與SEQ ID NO：1之序列相比之突變)：-110K或110Q與11V之組合； -110K或110Q與89L之組合；-110K或110Q與11V及89L之組合；或-110K或110Q與1D或1E及11V、14P、45R、74S、83R、89L、96P及108L之組合，且具有表A之CTLA4結合劑中，例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：60中之CDR(例如根據Abm)且具有與如本文所描述之SEQ ID NO：1之胺基酸序列的整體序列一致性程度。
在另一特定但非限制性態樣中，本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)在所提及之位置(根據Kabat之編號)處包含以下突變組(亦即與SEQ ID NO：1之序列相比之突變)：-112K或112Q與11V之組合；-112K或112Q與89L之組合；-112K或112Q與11V及89L之組合；或-112K或112Q與1D或1E及11V、14P、45R、74S、83R、89L、96P及108L之組合，且具有表A之CTLA4結合劑中，例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：60中之CDR(例如根據Abm)且具有與如本文所描述之SEQ ID NO：1之胺基酸序列的整體序列一致性程度。
在另一態樣中，本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)在位置89處包含T且具有諸如SEQ ID NO：1或60中闡述之彼等CDR的CDR(例如根據Abm)且具有與如本文所描述之SEQ ID NO：1之胺基酸序列的整體序列一致性程度。
在另一態樣中，本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體) 在位置11處包含V且在位置89處包含L且具有諸如SEQ ID NO：60中闡述之彼等CDR的CDR(例如根據Abm)且具有與如本文所描述之SEQ ID NO：1之胺基酸序列的整體序列一致性程度。
如所提及，根據以上態樣，本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)較佳進一步為使得其含有視情況存在之E1D突變、L11V突變、A14P突變、Q45R突變、A74S突變、K83R突變、V89L突變、M96P突變及Q108L突變之適合的組合，且較佳Q108L與其他A14P、Q45R、A74S及K83R突變中之任一者之適合的組合，且較佳與此等其他突變中之任兩者組合，更佳與此等突變中之任三者(諸如具有組合A14P、A74S及K83R)，諸如與所有此等突變(且同樣，當CTLA4結合劑為單價或存在於本發明之CTLA4結合劑之N端時，較佳亦E1D突變)。在本發明之一實施例中，本發明之CTLA4結合劑包含突變E1D(或缺乏此類突變，其中殘基1為E)、L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L。
在另一特定但非限制性態樣中，本發明係關於如下CTLA4結合劑(例如免疫球蛋白單一可變域，諸如奈米抗體)，其為選自以下胺基酸序列中之一者的胺基酸序列或基本上由其組成：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO： 37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：60。
在另一特定但非限制性態樣中，本發明係關於如下CTLA4結合劑(例如免疫球蛋白單一可變域，諸如奈米抗體)，其為選自以下胺基酸序列中之一者的胺基酸序列或基本上由其組成：SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：60。
此外，如本文中已指示，CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)之胺基酸殘基根據由Kabat等人(「Sequence of proteins of immunological interest」，US Public Health Services,NIH Bethesda,MD,出版號91)給出之用於VH之通用編號來編號，如適用於Riechmann及Muyldermans,J.Immunol.Methods 2000 Jun 23；240(1-2)：185-195之文章中之駱駝的VHH域；或在本文中提及。應注意如此項技術中對於VH域及VHH域所熟知，CDR中之每一者中之胺基酸殘基之總數可變化且可不對應於由Kabat編號指示之胺基酸殘基之總數(亦即，在實際序列中可不佔據一或多個根據Kabat編號之位置，或實際序列可含有比Kabat編號所允許之數目多的胺基酸殘基)。此意謂一般而言，根據Kabat之編號可或可不對應於實際序列中之胺基酸殘基之實際編號。
將VH域之胺基酸殘基編號之替代方法(該等方法亦可以類似方式應用於來自駱駝之VHH域及奈米抗體)為Chothia等人(Nature 342,877-883(1989)描述之方法，所謂的「AbM定義」及所謂的「接觸定義」。然而，在本說明書、態樣及圖式中，除非另外指示，否則將遵循根據Kabat之如適用於Riechmann及Muyldermans之VHH域的編號。
本發明亦關於CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)；表現/產生本發明之CTLA4結合劑之方法；包含本發明之CTLA4結合劑的組合物及產品(諸如醫藥組合物及產品)；編碼本發明之CTLA4結合劑的聚核苷酸；及本發明之CTLA4結合劑之用途(且詳言之，治療、預防及診斷用途)。
本發明之此等及其他態樣、實施例、優勢、應用及用途將自本文中之進一步描述變得明顯。
因此，在另一態樣中，本發明係關於包含至少一個(諸如一個、兩個或三個)在本文中描述之CTLA4結合部分或基本上由其組成的多肽或其他化學實體。此等分子自身可稱為「CTLA4結合劑」或「本發明化合物」或「本發明之多肽」。
本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)可含有一或多個其他胺基酸序列、化學實體或部分。此等其他胺基酸序列、化學實體或部分可向本發明之所得CTLA4結合劑賦予一或多種所需特性及/或可以所需方式改變本發明之所得CTLA4結合劑之特性，例如以向本發明之所得CTLA4結合劑提供所需生物及/或治療活性(例如，以向本發明之所得CTLA4結合劑提供針對另一治療相關標靶之親和力且較佳效能，使得就CTLA4及該另一治療相關標靶(諸如PD1、LAG3、BTLA及/或CD27)而言所得多肽變為「雙特異性」)，以提供所需半衰期及/或另外改變或改良藥物動力學及/或藥效學特性，以將CTLA4結合劑靶向至特定細胞、組織或器官(包括癌細胞及癌組織)，以提供細胞毒性效果及/或充當可偵測標籤或標記。此類其他胺基酸序列、化學實體或部分之一些非限制性實例為：-一或多個適合的連接子(諸如9GS、15GS或35GS連接子(9、15或35個G及S胺基酸之任何組合，諸如 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS))(SEQ ID NO：65)。在本發明之一實施例中，連接子為(GGGGS)n(SEQ ID NO：118)，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；及/或-一或多個針對除CTLA4外之治療相關靶向的結合部分、結合域或結合單元(亦即以便提供本發明之對CTLA4及另一治療相關標靶(諸如CTLA4之不同抗原決定基、PD1、CD27、LAG3、BTLA、TIM3、ICOS、B7-H3、B7-H4、CD137、GITR、PD-L1、PD-L2、ILT1、ILT2 CEACAM1、CEACAM5、TIM3、TIGIT、VISTA、ILT3、ILT4、ILT5、ILT6、ILT7、ILT8、CD40、OX40、CD137、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、NKG2A、NKG2C、NKG2E、IL-10、IL-17、TSLP)兩者具有雙特異性的CTLA4結合劑)；及/或-一或多個提供半衰期增加之結合域或結合單元(例如，可針對血清蛋白質(諸如血清白蛋白)結合之結合域或結合單元)；及/或-一或多個將CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)靶向至所需細胞、組織或器官(諸如癌細胞)之結合部分、結合域或結合單元；及/或-一或多個提供針對CTLA4之增加之特異性的結合部分、結合域或結合單元(通常，此等將能夠結合至CTLA4但將一般而言自身基本上不對CTLA4具有功能性)；及/或-允許CTLA4結合劑內化至(所需)細胞中之結合部分、結合域、結合單元或其他化學實體(例如，如WO 2005/044858中所描述之內化抗EGFR奈米抗體)；及/或-改良半衰期之部分，諸如適合的聚乙二醇基團(亦即聚乙二醇化)， 或提供增加之半衰期的胺基酸序列，諸如人類血清白蛋白或其適合的片段(亦即白蛋白融合體)或例如如WO 2008/068280中所描述之血清白蛋白結合肽；及/或-有效負載物，諸如細胞毒性有效負載物；及/或-可偵測標記或標籤，諸如放射性標記或螢光標記；及/或-可幫助固定、偵測及/或純化CTLA4結合劑之標籤，諸如HIS或FLAG3標籤；及/或-可功能化之標籤，諸如C端GGC或GGGC標籤；及/或-C端延長部分X(n)，其可如本文關於本發明之CTLA4結合劑進一步描述及/或如WO 2012/175741或PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)中所描述。
亦含有(較佳人類)習知抗體之一或多個部分或片段(諸如Fc部分或其功能片段或一或多個恆定域)及/或來自駱駝僅重鏈抗體之一或多個部分或片段(諸如一或多個恆定域)的CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)為本發明之一部分。
多特異性結合劑
本發明包括可以亦結合至CTLA4或另一多肽之單個多價(例如多特異性)分子稠合的CTLA4結合劑，且在本發明之一實施例中，此類結合劑連接至一或多種增加結合劑在個體體內之半衰期的半衰期延長劑。在本發明之一實施例中，半衰期延長劑為特異性結合至人類血清白蛋白(HSA)之ISVD(例如奈米抗體)，例如ALB11002。在本發明之一實施例中，多特異性結合劑為如本文所描述之F023700912或F023700914。
多肽可直接、在無連接子之情況下或經由連接子(諸如肽連接子，例 如35GS)「融合至」另一分子。
多特異性結合劑可包括CTLA4結合劑以及一或多種結合至另一抗原之結合劑，另一抗原諸如CD27、PD1、LAG3、BTLA、TIM3、ICOS、B7-H3、B7-H4、CD137、GITR、PD-L1、PD-L2、ILT1、ILT2 CEACAM1、CEACAM5、TIM3、TIGIT、VISTA、ILT3、ILT4、ILT5、ILT6、ILT7、ILT8、CD40、OX40、CD137、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、NKG2A、NKG2C、NKG2E、IL-10、IL-17或TSLP。
關於此類基於ISVD或基於奈米抗體之生物製劑之一些特定但非限制性實例，參考Ablynx N.V.之各種申請案，諸如且不限於WO 2004/062551、WO 2006/122825、WO 2008/020079及WO 2009/068627，以及例如，且不限於諸如以下之申請案：WO 2006/038027、WO 2006/059108、WO 2007/063308、WO 2007/063311、WO 2007/066016及WO 2007/085814。此外，如本文進一步描述，可為在上文所提及之申請案中闡述之分子之一部分的另一部分可為如本文所描述之針對(人類)血清蛋白質(諸如(人類)血清白蛋白)之ISVD或奈米抗體，且此類ISVD或奈米抗體(例如ALB11002)亦可尤其在延長本文中描述之CTLA4結合劑(及包含其之多肽)之半衰期中及/或對於延長半衰期具有治療性用途。參考例如WO 2004/041865、WO 2006/122787及WO 2012/175400，其一般描述使用血清白蛋白結合奈米抗體用於半衰期延長。WO 2009/138519(或在WO 2009/138519中引用之先前技術中)或WO 2008/020079(或在WO 2008/020079中引用之先前技術中)以引用之 方式併入。此外，當方法或技術不在本文中特定描述時，在本發明之一實施例中，其可如WO 2009/138519中(或WO 2009/138519中引用之先前技術中)或WO 2008/020079中(或WO 2008/020079中引用之先前技術中)所描述來進行。
當CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)含有一或多個其他結合部分、結合域或結合單元(例如另一針對CTLA4之提供針對CTLA4之增加之特異性的基本上非功能結合域或結合單元、針對除CTLA4外之治療標靶的結合部分、結合域或結合單元、針對諸如人類血清白蛋白之標靶之提供增加之半衰期的結合部分、結合域或結合單元及/或將CTLA4結合劑靶向至特定細胞、組織或器官及/或允許CTLA4結合劑內化至細胞中之結合部分、結合域或結合單元)時，此等其他結合部分、結合域或結合單元較佳包含一或多個ISVD，且更佳為所有ISVD。舉例而言且非限制性地，此一或多個其他結合域或結合單元可為一或多種奈米抗體(包括VHH、人類化VHH及/或駱駝化VH，諸如駱駝化人類VH)、作為VH域或衍生自VH域之(單一域)抗體、作為VH域或基本上由VH域組成或衍生自VH域之dAb或甚至作為VL域或基本上由VL域組成之(單一)域抗體或dAb。特定言之，當存在時，此一或多個結合域或結合單元可包含一或多種奈米抗體，且更特定言之為所有奈米抗體。
當本發明之CTLA4結合劑在其C端具有ISVD(該C端ISVD可為本文中描述之CTLA4結合部分或若存在於CTLA4結合劑中，可例如為另一針對CTLA4之提供針對CTLA4之增加之特異性的基本上非功能ISVD、針對除CTLA4外之治療標靶的ISVD、針對諸如人類血清白蛋白之標靶的提供增加之半衰期的ISVD或將CTLA4結合劑靶向至特定細胞、組織或器官及/ 或允許CTLA4結合劑內化至細胞中之ISVD)時，則CTLA4結合部分(亦即該C端ISVD)較佳具有C端延長部分X(n)，該C端延長部分可如本文關於本發明之CTLA4結合劑所描述及/或如WO 2012/175741或PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)中所描述。
當除本文中描述之一或多個CTLA4結合部分以外，CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)含有任何其他ISVD(該一或多個其他ISVD可如所提及，為另一針對CTLA4之提供針對CTLA4之增加之特異性的基本上非功能ISVD、針對除CTLA4外之治療標靶的ISVD、針對諸如人類血清白蛋白之標靶的提供增加之半衰期的ISVD及/或將CTLA4結合劑靶向至特定細胞、組織或器官及/或允許CTLA4結合劑內化至細胞中之ISVD)時，且當此類其他ISVD為奈米抗體或為作為VH序列、基本上由VH序列組成及/或衍生自VH序列之ISVD時，則根據本發明之一較佳態樣，該一或多個(且較佳所有)存在於CTLA4結合劑中之其他ISVD將在其序列內含有一或多種減少預先存在抗體之結合的構架突變。特定言之，根據本發明之此態樣，此類其他ISVD可含有如PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)中所描述及/或基本上如本文關於本發明之CTLA4結合劑所描述之在位置11、89、110及/或112處之胺基酸殘基/突變(其適合的組合)。在一個特定態樣中，當CTLA4結合劑在其C端具有此類ISVD(亦即在其C端不具有本發明之CTLA4結合部分)時，則至少存在於C端及/或形成C端之該ISVD具有減少預先存在抗體之結合的構架突變(且該C端ISVD將較佳亦具有如本文所描述之C端延長部分X(n))。
如所提及，當CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)將具有增加之半衰期(亦即與本發明之單價CTLA4結合劑相比)時，CTLA4結合劑較 佳含有至少一個(諸如一個)提供此類增加之半衰期的ISVD(且詳言之奈米抗體)。此類ISVD將通常針對適合之血清蛋白質(諸如轉鐵蛋白)且詳言之針對(人類)血清白蛋白。特定言之，此類ISVD或奈米抗體可為如例如EP 2 139 918、WO 2011/006915、WO 2012/175400、WO 2014/111550中所描述之針對人類血清白蛋白之(單一)域抗體或dAb，且可特定言之為如WO 2004/041865、WO 2006/122787、WO 2012/175400或PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)中所描述之血清白蛋白結合奈米抗體。尤其較佳之血清白蛋白結合ISVD為奈米抗體Alb-1(參見WO 2006/122787)、或其人類化變異體(諸如Alb-8(WO 2006/122787，SEQ ID NO：62)、Alb-23(WO 2012/175400，SEQ ID NO：1))及Alb-1之其他人類化(且較佳亦經序列優化)變異體及/或Alb-8或Alb-23之變異體(或更一般而言，具有基本上與Alb-1、Alb-8及Alb-23相同之CDR的ISVD)。
在本發明之一實施例中，ISVD(例如奈米抗體)為結合至人類血清白蛋白之ALB11002。ALB11002以下在表C中概述。
視情況，ALB11002缺乏C端丙胺酸。在本發明之一實施例中，HSA結合劑包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列但在位置1、1、89、110或112處包括突變，例如包含一組在本文中之表B中闡述之突變。
SEQ ID NO：66之殘基1可為D或E。若殘基1為D，則CTLA4結合劑可稱為1D且若殘基1為E，則CTLA4結合劑可稱為1E。
本發明包括HSA結合劑，其包含如下HSA結合劑之CDR中之一者、兩者或三者，其中各包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種胺基酸取代，例如保守性取代，及/或相對於表C之HSA結合劑序列中闡述或SEQ ID NO：67-69中闡述之CDR，包含100%、99%、98%、97%、96%或95%序列一致性，其中具有此類CDR之HSA結合劑保留結合至HSA之能力。
在本發明之一實施例中，半衰期延長劑為包含以下之抗HSA ISVD(例如奈米抗體)：-包含胺基酸序列GFTFSSFGMS(SEQ ID NO：67)之CDR1；及-包含胺基酸序列SISGSGSDTL(SEQ ID NO：68)之CDR2；及-包含胺基酸序列GGSLSR(SEQ ID NO：69)之CDR3；及視情況具有：-至少85%，較佳至少90%，更佳至少95%(其中對於測定序列一致性程度，不考慮CDR、任何可能存在之C端延長部分以及涉及之特定態樣所需之在位置1、11、89、110及/或112處之突變)之與SEQ ID NO：66之胺基酸序列的序列一致性程度(其中對於測定序列一致性程度，不考慮任何可 能存在之C端延長部分以及CDR)；及/或-不超過7種，諸如不超過5種，較佳不超過3種，諸如僅3、2或1種與SEQ ID NO：66之胺基酸序列的「胺基酸差異」(如本文所定義，且不考慮以上列出之可能存在之在位置1、11、89、110及/或112處之突變中的任一者且不考慮任何可能存在之C端延長部分)(其中該等胺基酸差異若存在，可存在於構架及/或CDR中但較佳僅存在於構架中且不存在於CDR中)；及視情況具有：-C端延長部分(X)n，其中n為1至10，較佳1至5，諸如1、2、3、4或5(且較佳1或2，諸如1)；且各X為(較佳天然存在之)胺基酸殘基，其獨立地選自，且較佳獨立地選自由丙胺酸(A)、甘胺酸(G)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)或異白胺酸(I)組成之群。
同樣，如所提及，當存在時，此類血清白蛋白結合ISVD可在其序列內含有一或多種減少預先存在抗體之結合的構架突變。特定言之，當此類血清白蛋白結合ISVD為奈米抗體或作為VH域、基本上由VH域組成及/或衍生自VH域之(單一)域抗體時，血清白蛋白結合ISVD可含有如PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)中所描述及/或基本上如本文關於本發明之CTLA4結合劑所描述之在位置11、89、110及/或112處之胺基酸殘基/突變(其適合的組合)。舉例而言，PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)描述Alb-1、Alb-8及Alb-23之許多變異體，其含有在位置11、89、110及/或112處之減少預先存在抗體之結合的可在本發明之CTLA4結合劑中使用的胺基酸殘基/突變。
同樣，當此類血清白蛋白結合ISVD存在於本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)之C端時，血清白蛋白結合ISVD(且因此，本發明之CTLA4結合劑)較佳具有C端延長部分X(n)，該C端延長部分可如本文關於本發明之CTLA4結合劑所描述及/或如WO 2012/175741或PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)中所描述。其較佳亦具有減少預先存在抗體之結合的突變，如PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)中描述之在位置11、89、110及/或112處之胺基酸殘基/突變(其適合的組合)。
然而，如所提及，其他增加本發明之CTLA4結合劑之半衰期之方式(諸如聚乙二醇化、與人類白蛋白或其適合片段融合或使用適合之血清白蛋白結合肽)亦包括於本發明之範疇中。
一般而言，當本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)具有增加之半衰期(例如經由增加半衰期之ISVD之存在或任何其他增加半衰期之適合的方式)時，所得CTLA4結合劑較佳具有比本發明之單價CTLA4結合劑之半衰期大至少2倍，較佳至少5倍，例如至少10倍或大於20倍的半衰期(如本文所定義)(如在人類及/或適合之動物模型(諸如小鼠或食蟹獼猴)中量測)。特定言之，本發明之CTLA4結合劑較佳具有在人類個體中至少1天、較佳至少3天、更佳至少7天，諸如至少10天之半衰期(如本文所定義)。
將自本文中之揭示內容瞭解本發明之CTLA4結合劑(例如基於一或多個ISVD，諸如奈米抗體)可具有不同「形式」，即基本上為單價、二價或三價，可為單特異性、雙特異性、三特異性等，且可為雙互補位(如本文及例如WO 2009/068625中所定義)。舉例而言，本發明之CTLA4結合劑 可為：-(基本上)單價，即(基本上)包含本發明之單個CTLA4結合部分。如所提及，當以單價形式使用時，本發明之CTLA4結合劑較佳具有如本文進一步描述之C端延長部分X(n)。本發明之此類CTLA4結合劑亦可為半衰期延長的；-(基本上)二價或三價及單特異性。本發明之此類CTLA4結合劑將包含兩個或多於兩個針對CTLA4之結合部分(例如ISVD)，其可相同或不同且當不同時可針對CTLA4上之同一抗原決定基或針對CTLA4上之不同抗原決定基(在後一情況中，以便提供本發明之雙互補位或多互補位CTLA4結合劑)。本發明之此類CTLA4結合劑亦可為半衰期延長的；-(基本上)二價、三價(或多價)及雙特異性或三特異性(或多特異性)。本發明之此CTLA4結合劑將針對CTLA4及至少一種其他標靶。如本文所描述，該其他標靶可例如為另一治療相關標靶(亦即除CTLA4外)，諸如PD1、LAG3、BTLA及/或CD27，以提供對於CTLA4及該其他治療標靶具有雙特異性之CTLA4結合劑。該其他標靶亦可為提供增加半衰期的標靶(諸如人類血清白蛋白)，以提供本發明之具有增加半衰期的CTLA4結合劑。亦如本文中所提及，此其他標靶亦可允許本發明之CTLA4結合劑靶向特定細胞、組織或器官或可允許本發明之CTLA4結合劑內化至細胞中。亦可能組合此等方法/ISVD，例如以提供本發明之對CTLA4及至少一種其他治療相關標靶具有雙特異性且半衰期延長之CTLA4結合劑。
同樣，較佳地，當本發明之此等CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)含有一或多個除本發明之至少一種CTLA4結合劑外之結合部分(例如ISVD)時，此等其他ISVD中之至少一者且較佳全部將在其序列內含有 一或多種減少預先存在抗體結合的構架突變(諸如特別如本文關於本發明之CTLA4結合劑所述及/或如PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)中一般描述在位置11、89、110及/或112之胺基酸殘基/突變之組合)。此外，當本發明之此CTLA4結合劑在其C端具有CTLA4結合部分時，則該C端CTLA4結合部分(且因此，本發明之CTLA4結合劑)將較佳具有如本文所描述之C端延長部分X(n)。類似地，當本發明之此CTLA4結合劑在其C端具有另一ISVD(亦即不為本發明之CTLA4結合部分，而為例如延長半衰期之ISVD)時，則該C端ISVD(且因此，本發明之CTLA4結合劑)將較佳具有如本文所描述之C端延長部分X(n)及/或將在其序列內含有一或多種減少預先存在抗體結合的構架突變(同樣，如本文及PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)中進一步描述)。
如熟習此項技術者將瞭解，當本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)欲用於局部用途(亦即皮膚上或眼睛中)或例如意謂在例如胃腸道中(亦即在經口投與或藉由栓劑投與之後)或在肺中(亦即在藉由吸入投與之後)某處具有(局部)治療作用或另外意謂直接施用至其預期作用位置(例如藉由直接注射)時，本發明之CTLA4結合劑可不需要半衰期延長。此外，對於治療某些急性病狀或適應症，其可較佳不具有延長之半衰期。在此等情況下，使用本發明單價CTLA4結合劑或無半衰期延長之本發明CTLA4結合劑(包含本發明之CTLA4結合部分)(例如，對於CTLA4為二價或雙互補位之本發明CTLA4結合劑)為較佳。
本發明之此類CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)之一些較佳但非限制性實例示意性地表示在下表C-1中，且此等中之每一者形成本發明之另一態樣。本發明之無半衰期延長的適合CTLA4結合劑之其他實例 將為熟習此項技術者基於本文中之揭示內容所瞭解。
如熟習此項技術者將瞭解，當本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)意欲用於全身性投與及/或用於預防及/或治療慢性疾病或病症時，將通常較佳的為本發明之該CTLA4結合劑具有增加之半衰期(如本文所定義)。更佳地，本發明之此類CTLA4結合劑將含有延長半衰期之ISVD，諸如較佳地，結合至人類血清白蛋白之ISVD且詳言之奈米抗體(如本文所描述)。
本發明之此類CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)之一些較佳但非限制性實例示意性地表示在下表C-2中，且此等中之每一者形成本發明之另一態樣。本發明之具有半衰期延長的適合CTLA4結合劑之其他實例將為熟習此項技術者基於本文中之揭示內容所瞭解。一般而言，對於本發明之具有半衰期延長之CTLA4結合劑，存在C端延長部分較佳得多。
本發明亦提供CTLA4/HSA ISVD，F023700912，其包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：62；35GS連接子用虛線加底線；CDR加底線及/或粗體)。視情況，分子中之任何結合劑部分之第一殘基視需要經D或E取代。
視情況，CTLA4/HSA ISVD包含信號肽，諸如： (SEQ ID NO：70)
F023700912由包含以下核苷酸之聚核苷酸編碼： (SEQ ID NO：61；視情況缺乏核苷酸1至255之信號序列)
F023700912包含以下部分：
●CTLA4結合劑11F01(E1D、L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)
●35GS連接子
●CTLA4結合劑11F01(L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)
●35GS連接子
●人類血清白蛋白結合劑ALB11002；
●C端延長部分丙胺酸。
舉例而言：
●CTLA4結合劑SEQ ID NO：60
●35GS連接子SEQ ID NO：65
●CTLA4結合劑SEQ ID NO：60(D1E)
●35GS連接子SEQ ID NO：65
●人類血清白蛋白結合劑SEQ ID NO：66
●丙胺酸
(本發明包括任何包括此類部分排列之結合劑)
本發明亦提供CTLA4/HSA ISVD，F023700914，其包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：64；35GS連接子用虛線加底線；CDR加底線及/或粗體)。視情況，分子中之任何結合劑部分之第一殘基視需要經D或E取代。
視情況，CTLA4/HSA ISVD包含信號肽，諸如： (SEQ ID NO：70)
F023700914由包含以下核苷酸之聚核苷酸編碼： (SEQ ID NO：63；視情況缺乏核苷酸1至255之信號序列)
F023700912包含以下部分：●CTLA4結合劑11F01(E1D、L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)；●35GS連接子；●人類血清白蛋白結合劑ALB11002；●C端延長部分丙胺酸。
舉例而言：
●CTLA4結合劑SEQ ID NO：60
●35GS連接子SEQ ID NO：65
●人類血清白蛋白結合劑SEQ ID NO：66
●丙胺酸
(本發明包括任何包括此類部分排列之結合劑)
本發明包括任何包含SEQ ID NO：62或64之胺基酸序列或包含80%或更多(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)胺基酸序列一致性之胺基酸序列的多特異性CTLA4結合劑，其中該CTLA4結合劑保留結合至CTLA4及視情況HSA之能力。
抗原決定基結合及交叉阻斷
本發明提供本發明之CTLA4結合劑(例如F023700912或F023700914)以及結合至此類結合劑之同一CTLA4抗原決定基之結合劑，例如ISVD(例如奈米抗體)。舉例而言，本發明包括藉由接觸與F023700912或F023700914相同之殘基結合至人類CTLA4之結合劑。舉例而言，本發明 提供在人類CTLA4之殘基VRVTVL(SEQ ID NO：110之殘基33-38)、ADSQVTEVC(SEQ ID NO：110之殘基41-49)及/或CKVELMYPPPYYLG(SEQ ID NO：110之殘基93-106)(例如所有三個位點)處結合至人類CTLA4的結合劑。在本發明之一實施例中，在氫-氘交換分析中結合劑展現在此等殘基處結合至人類CTLA4，例如防止殘基在氘(諸如D2O)存在下用氫交換氘，例如如由基本上如圖13中所述之結合熱圖表示。
本發明亦提供能夠交叉阻斷本文所揭示之結合劑(例如F023700912或F023700914)中之任一者之結合的交叉阻斷結合劑。此類交叉阻斷結合劑可為任何展示此類交叉阻斷之分子，例如ISVD、奈米抗體、抗體或其抗原結合片段。
一般而言，「交叉阻斷」參考結合劑之結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)或抗體或其抗原結合片段係指在競爭分析中將參考結合劑與其抗原之結合阻斷50%或更多之結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)或抗體或其抗原結合片段，且相反在競爭分析中參考結合劑將結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)或抗體或其抗原結合片段與其抗原之結合阻斷50%或更多。交叉阻斷可用此項技術中已知之任何分析(包括表面電漿子共振(SPR)、ELISA及流式細胞測量術)測定。
在本發明之一實施例中，交叉阻斷藉由使用Biacore分析測定。為方便起見，參考兩種結合劑，然而，本發明之範疇包括交叉阻斷本發明之結合劑的抗體及其抗原結合片段，例如Fab片段。根據製造商的建議操作Biacore機器(例如Biacore 3000)。
因此，在一個交叉阻斷分析中，使用標準胺偶合化學方法將CTLA4 偶合至CM5 Biacore晶片以產生經CTLA4塗佈之表面。舉例而言，200-800共振單位之CTLA4將偶合至晶片(或給出結合之可容易量測的水準但可容易藉由使用之測試試劑之濃度飽和的任何量)。
將待評定彼此交叉阻斷之能力的兩種結合劑(稱為A*及B*)在適合的緩衝液中以一比一結合位點莫耳比混合以產生測試混合物。
各結合劑在測試混合物中之濃度應足夠高以容易地使在Biacore晶片上捕獲之CTLA4分子上該結合劑之結合位點飽和。混合物中之結合劑在相同莫耳濃度下。
亦製備僅含有結合劑A*及僅含有結合劑B*之單獨溶液。此等溶液中之結合劑A*及結合劑B*應在相同緩衝液中且在與測試混合物中相同之濃度下。
將測試混合物穿過經CTLA4塗佈之Biacore晶片且記錄總結合量。隨後以使得移除結合之結合劑而不損壞晶片結合CTLA4之方式處理晶片。在本發明之一實施例中，此藉由用30mM HCl處理晶片60秒進行。
隨後將僅結合劑A*之溶液穿過經CTLA4塗佈之表面且記錄結合量。再次處理晶片以移除所有結合之結合劑而不損壞晶片結合CTLA4。
隨後將僅結合劑B*之溶液穿過經CTLA4塗佈之表面且記錄結合量。
隨後計算結合劑A*與結合劑B*之混合物之最大理論結合，且為當僅穿過CTLA4表面時各結合劑之結合之總和。若混合物之實際記錄之結合小於此理論最大值，則兩種結合劑彼此交叉阻斷。
因此，一般而言，根據本發明之交叉阻斷結合劑為將在以上Biacore交叉阻斷分析中結合至CTLA4使得在分析期間及在第二結合劑存在下，記錄之結合在呈組合之兩種結合劑之例如最大理論結合之80%與0.1%之間 (例如80%至4%)，例如最大理論結合之75%與0.1%之間(例如75%至4%)，例如最大理論結合之70%與0.1%之間(例如70%至4%)(正如上文所定義)的結合劑。
在本發明之一實施例中，ELISA分析用於判定根據本發明CTLA4結合劑是否交叉阻斷或能夠交叉阻斷。
分析之通用原理為將抗CTLA4結合劑塗佈至ELISA盤之孔上。添加過量呈溶液(亦即不結合至ELISA盤)之第二潛在交叉阻斷抗CTLA4結合劑。隨後向孔中添加有限量之CTLA4。經塗佈結合劑及呈溶液之結合劑競爭有限數目之CTLA4分子之結合。洗滌盤以移除尚未由經塗佈結合劑結合之CTLA4且亦移除第二溶液相結合劑以及任何在第二溶液相結合劑與CTLA4之間形成的複合物。隨後使用合適CTLA4偵測試劑量測結合CTLA4之量。呈溶液之能夠交叉阻斷經塗佈結合劑之結合劑將能夠相對於經塗佈結合劑可在不存在第二溶液相結合劑的情況下結合之CTLA4分子之數目，引起經塗佈結合劑可結合之CTLA4分子之數目減少。
表現方法
本發明包括製備本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)(例如F023700912或F023700914)之重組方法，其包含(i)引入編碼該CTLA4結合劑之胺基酸序列的聚核苷酸，例如，其中聚核苷酸在載體中及/或可操作地連接於啟動子；(ii)在有利於表現聚核苷酸之條件下培養宿主細胞(例如CHO或畢赤酵母或甲醇酵母)，及(iii)視情況，自宿主細胞及/或宿主細胞生長之培養基分離CTLA4結合劑。參見例如WO 04/041862、WO 2006/122786、WO 2008/020079、WO 2008/142164或WO 2009/068627。
本發明亦關於編碼如本文所描述之本發明CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)(例如F023700912或F023700914)之聚核苷酸。在本發明之一實施例中，聚核苷酸可操作地連接於一或多個控制序列。聚核苷酸可呈質體或載體形式。同樣，此類聚核苷酸可一般如Ablynx N.V.之公開之專利申請案，諸如WO 04/041862、WO 2006/122786、WO 2008/020079、WO 2008/142164或WO 2009/068627中所描述。
本發明亦關於含有本文中描述之此類聚核苷酸、載體及/或CTLA4結合劑(例如F023700912或F023700914)之宿主或宿主細胞。同樣，此類宿主細胞可一般如Ablynx N.V.之公開之專利申請案，諸如WO 04/041862、WO 2006/122786、WO 2008/020079、WO 2008/142164或WO 2009/068627中所描述。特定宿主細胞之實例在下文論述。
作為表現CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)之宿主的真核及原核宿主細胞(包括哺乳動物細胞)在此項技術中熟知且包括許多可購自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection；ATCC)之永生化細胞株。此等尤其包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO、SP2細胞、海拉細胞(HeLa Cell)、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如Hep G2)、A549細胞、3T3細胞、HEK-293細胞及許多其他細胞株。哺乳動物宿主細胞包括人類、小鼠、大鼠、犬、猴、豬、山羊、牛、馬及倉鼠細胞。尤其較佳之細胞株經由確定何種細胞株具有高表現水準來選擇。其他可使用之細胞株為昆蟲細胞株(例如草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)或粉紋夜蛾(Trichoplusia ni))、兩棲動物細胞、細菌細胞、植物細胞及真菌細胞。真菌細胞包括酵母及絲狀真菌細胞，包括例如甲醇酵母、芬蘭畢赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖畢赤酵母 (Pichia trehalophila)、考拉姆畢赤酵母(Pichia koclamae)、膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)、微小畢赤酵母(Pichia minuta)(甲醇誘導型酵母(Ogataea minuta)、林氏畢赤酵母(Pichia lindneri))、仙人掌畢赤酵母(Pichia opuntiae)、耐熱畢赤酵母(Pichia thermotolerans)、千屈菜畢赤酵母(Pichia salictaria)、松櫟畢赤酵母(Pichia guercuum)、皮傑普氏畢赤酵母(Pichia pijperi)、具柄畢赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、畢赤酵母屬(Pichia sp.)、釀酒酵母(SaccharomycesCerevisiae)、酵母屬(Saccharomyces sp.)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces sp.)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、小巢狀麴菌(Aspergillus nidulans)、黑麴菌(Aspergillus niger)、米麴菌(Aspergillus oryzae)、里氏木菌(Trichoderma reesei)、金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、鐮刀菌屬(Fusarium sp.)、禾穀鐮孢菌(Fusarium gramineum)、鐮孢黴(Fusarium venenatum)、小立碗蘚(Physcomitrella patens)及粗厚神經胞子菌(NeurosporaCrassa)。畢赤酵母屬，任何酵母屬、多形漢遜酵母、任何克魯維酵母屬、白色念珠菌、任何麴菌屬、里氏木菌、金孢子菌、任何鐮刀菌屬、解脂耶氏酵母及粗厚神經胞子菌。本發明包括任何含有本發明之CTLA4結合劑(例如F023700912或F023700914)或含有編碼此類結合劑之聚核苷酸或含有了含有聚核苷酸之載體的宿主細胞(例如CHO細胞或畢赤酵母細胞，例如甲醇酵母)。
另外，可使用許多已知技術增強CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)自生產細胞株之表現。舉例而言，麩醯胺酸合成酶基因表現系統(GS系統)為用於增強在某些條件下表現之常用方法。GS系統整體或部分 結合歐洲專利第0 216 846號、第0 256 055號及第0 323 997號及歐洲專利申請案第89303964.4號論述。因此，在本發明之一實施例中，哺乳動物宿主細胞(例如CHO)缺乏麩醯胺酸合成酶基因且在培養基中不存在麩醯胺酸下生長，然而其中，編碼免疫球蛋白鏈之聚核苷酸包含彌補宿主細胞中基因缺乏之麩醯胺酸合成酶基因。此類含有如本文所論述之結合劑或聚核苷酸或載體之宿主細胞以及如本文所論述之用於使用此類宿主細胞製備結合劑之表現方法為本發明之一部分。
本發明包括純化CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)之方法，其包含將包含CTLA4結合劑之樣品(例如培養基、細胞溶解物或細胞溶解物溶離份，例如溶解物之可溶溶離份)引入至純化培養基(例如陽離子交換培養基、陰離子交換培養基、疏水交換培養基、親和力純化培養基(例如蛋白質-A、蛋白質-G、蛋白質-A/G、蛋白質-L))中且自該樣品之不結合至培養基之流通溶離份收集經純化CTLA4結合劑；或丟棄流通溶離份且自培養基溶離結合之CTLA4結合劑且收集溶離液。在本發明之一實施例中，培養基在施加樣品之管柱中。在本發明之一實施例中，在宿主細胞中在抗體或片段之重組表現之後進行純化方法，例如其中首先溶解宿主細胞且視情況純化溶解物中之不可溶物質，隨後在培養基上進行純化；或其中藉由宿主細胞將CTLA4結合劑分泌至培養基中且向純化培養基施用培養基或其溶離份。
一般而言，在特定細胞株或轉殖基因動物中產生之糖蛋白將具有為細胞株或轉殖基因動物中產生之糖蛋白所特有的糖基化模式。因此，CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)之特定糖基化模式將視用於產生CTLA4結合劑之特定細胞株或轉殖基因動物而定。僅包含未經海藻糖 基化之N-聚糖的CTLA4結合劑為本發明之一部分且可為有利的，因為未經海藻糖基化之抗體已顯示通常活體外及活體內均展示比其海藻糖基化對應物更有效之功效(參見例如Shinkawa等人，J.Biol.Chem.278：3466-3473(2003)；美國專利第6,946,292號及第7,214,775號)。此等具有未經海藻糖基化之N-聚糖的CTLA4結合劑可能不為免疫原性，因為其碳水化合物結構為人類血清IgG中存在之群體之正常組分。
本發明包括包含通常添加至在中國倉鼠卵巢細胞中產生之免疫球蛋白(CHO N連接聚糖)或經工程改造酵母細胞(經工程改造酵母N連接聚糖)(諸如甲醇酵母)之N連接聚糖的CTLA4結合劑。舉例而言，在本發明之一實施例中，CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)包含圖4中闡述之「經工程改造酵母N連接聚糖」或「CHO N連接聚糖」中之一或多者(例如G0及/或G0-F及/或G1及/或G1-F及/或G2-F及/或Man5)。在本發明之一實施例中，CTLA4結合劑包含經工程改造酵母N連接聚糖，即G0及/或G1及/或G2，視情況進一步包括Man5。在本發明之一實施例中，CTLA4結合劑包含CHO N連接聚糖，即G0-F、G1-F及G2-F，視情況進一步包括G0及/或G1及/或G2及/或Man5。在本發明之一實施例中，CTLA4結合劑上之所有N連接聚糖中之約80%至約95%(例如約80-90%、約85%、約90%或約95%)為經工程改造酵母N連接聚糖或CHO N連接聚糖。參見Nett等人Yeast.28(3)：237-252(2011)；Hamilton等人Science.313(5792)：1441-1443(2006)；Hamilton等人Curr Opin Biotechnol.18(5)：387-392(2007)。舉例而言，在本發明之一實施例中，經工程改造酵母細胞為GFI5.0或YGLY8316或美國專利第7,795,002號或Zha等人Methods Mol Biol.988：31-43(2013)中闡述之株系。亦參見國際專利申請公開案第 WO2013/066765號。
組合
在特定實施例中，本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)可單獨，或與其他、另外治療劑及/或治療程序組合使用以治療或預防需要此類治療或預防之個體之任何疾病(諸如癌症，例如如本文所論述)。包含此類CTLA4結合劑與其他治療劑之組合的組合物或套組，例如包含醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物，亦為本發明之一部分。
術語「與……組合」指示組分本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)以及另一藥劑(諸如派立珠單抗或尼沃單抗(nivolumab))可調配成單一組合物(例如以便同時遞送)或單獨地調配成兩種或多於兩種組合物(例如套組)。各組分可在不同於其他組分投與之時間投與個體；舉例而言，每次投藥可在既定時段內以若干時間間隔非同時給與(例如分開或依序)。此外，單獨組分可藉由相同或藉由不同途徑向個體投與(例如其中非經腸投與本發明之CTLA4結合劑且經口投與太平洋紫杉醇)。
在特定實施例中，CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)可與抗癌治療劑或免疫調節藥物(諸如免疫調節受體抑制劑，例如特異性結合至受體之抗體或其抗原結合片段)組合使用。
在本發明之一實施例中，CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)與諸如以下之抑制劑(例如較小有機分子或抗體或其抗原結合片段)中之一或多者組合：MTOR(哺乳動物雷帕黴素標靶)抑制劑、細胞毒性劑、鉑試劑、BRAF抑制劑、CDK4/6抑制劑、EGFR抑制劑、VEGF抑制劑、微管穩定劑、紫杉烷、CD20抑制劑、CD52抑制劑、CD30抑制劑、RANK(核因子κ-B之受體活化因子)抑制劑、RANKL(核因子κ-B配位體之受體活化 因子)抑制劑、ERK抑制劑、MAP激酶抑制劑、AKT抑制劑、MEK抑制劑、PI3K抑制劑、HER1抑制劑、HER2抑制劑、HER3抑制劑、HER4抑制劑、Bcl2抑制劑、CD22抑制劑、CD79b抑制劑、ErbB2抑制劑或法呢基蛋白質轉移酶抑制劑。
在本發明之一實施例中，CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)與以下中之一或多者組合：抗CTLA4抗體或其抗原結合片段(例如伊匹單抗)、抗PD1抗體或其抗原結合片段(例如派立珠單抗、尼沃單抗、CT-011)、抗PDL1、抗CTLA4、抗TIM3、抗CS1(例如埃羅妥珠單抗(elotuzumab))、抗KIR2DL1/2/3(例如利瑞路單抗(lirilumab))、抗CD27、抗CD137(例如優瑞路單抗(urelumab))、抗GITR(例如TRX518)、抗PD-L1(例如BMS-936559、MSB0010718C或MPDL3280A)、抗PD-L2、抗ILT1、抗ILT2、抗ILT3、抗ILT4、抗ILT5、抗ILT6、抗ILT7、抗ILT8、抗CD40、抗OX40、抗CD137、抗KIR2DL1、抗KIR2DL2/3、抗KIR2DL4、抗KIR2DL5A、抗KIR2DL5B、抗KIR3DL1、抗KIR3DL2、抗KIR3DL3、抗NKG2A、抗NKG2C、抗NKG2E，或此類標靶之任何較小有機分子抑制劑；IL-10、抗IL10、抗TSLP(胸腺基質淋巴生成素)或聚乙二醇化IL-10。
在本發明之一實施例中，聚乙二醇化IL-10分子上之聚乙二醇(PEG)部分之分子量為約12,000道爾頓或約20,000道爾頓。在本發明之一實施例中，聚乙二醇化IL-10(例如聚乙二醇化人類IL-10)包含一或多個聚乙二醇分子，其經由連接子(例如C2-12烷基，諸如--CH2CH2CH2--)共價連接至IL-10之單個子單元之單個胺基酸殘基，其中該胺基酸殘基為N端胺基酸殘基之α胺基或離胺酸殘基之ε胺基。在本發明之一實施例中，聚乙二醇化IL- 10為：(PEG)b-L-NH-IL-10；其中b為1-9且L為C2-12烷基連接子部分，其共價連接至IL-10之單個胺基酸殘基之氮(N)。在本發明之一實施例中，聚乙二醇化IL-10之IL-10具有式：[X--O(CH2CH2O)n]b-L-NH-IL-10，其中X為H或C1-4烷基；n為20至2300；b為1至9；且L為C1-11烷基連接子部分，其共價連接至一個IL-10子單元之胺基端處之α胺基之氮(N)；其限制條件為當b大於1時，n之總和不超過2300。參見US7,052,686。
在本發明之一實施例中，抗IL-10抗體或其抗原結合片段(例如人類化抗體)包含以下闡述之CDR：CDR-L1：KTSQNIFENLA(SEQ ID NO：71)；CDR-L2：NASPLQA(SEQ ID NO：72)；CDR-L3：HQYYSGYT(SEQ ID NO：73)；CDR-H1：GFTFSDYHMA(SEQ ID NO：74)；CDR-H2：SITLDATYTYYRDSVRG(SEQ ID NO：75)；CDR-H3：HRGFSVWLDY(SEQ ID NO：76)；(參見US7,662,379)
在本發明之一實施例中，抗TSLP抗體或其抗原結合片段(例如人類化抗體)包含以下闡述之CDR：CDR-H1：GYIFTDYAMH(SEQ ID NO：77)；CDR-H2：TFIPLLDTSDYNQNFK(SEQ ID NO：78)；CDR-H3：MGVTHSYVMDA(SEQ ID NO：79)；CDR-L1：RASQPISISVH(SEQ ID NO：80)；CDR-L2：FASQSIS(SEQ ID NO：81)；CDR-L3：QQTFSLPYT(SEQ ID NO：82)； (參見WO2008/76321)
在本發明之一實施例中，抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如人類化抗體)包含以下闡述之CDR：CDR-H1：GFIIKATYMH(SEQ ID NO：83)；CDR-H2：RIDPANGETKYDPKFQV(SEQ ID NO：84)；CDR-H3：YAWYFDV(SEQ ID NO：85)；CDR-L1：RASENIYSFLA(SEQ ID NO：86)；CDR-L2：HAKTLAE(SEQ ID NO：87)；CDR-L3：QHYYGSPLT(SEQ ID NO：88)；(參見WO2012/04367)。
因此，本發明包括包含CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)與派立珠單抗之組合的組合物；以及治療或預防個體之癌症之方法，其包含向個體投與有效量之CTLA4結合劑與派立珠單抗(例如以200mg每三週一次給藥之派立珠單抗)之組合。視情況，亦與另一其他治療劑組合向個體投與。
在本發明之一實施例中，CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)與派立珠單抗抗體組合，該抗體包含：包含以下胺基酸序列之免疫球蛋白重鏈(或其CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)： ；(SEQ ID NO：89)及包含以 下胺基酸序列之免疫球蛋白輕鏈(或其CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)： (SEQ ID NO：90)。
在本發明之一實施例中，CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)與包含以下之抗體組合：包含以下胺基酸序列之免疫球蛋白重鏈(或其CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)： (SEQ ID NO：91)；及包含以下胺基酸序 列之免疫球蛋白輕鏈(或其CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)： (SEQ ID NO：92)。
在本發明之一實施例中，CTLA4結合劑與以下中之任何一或多者組合：13-順-視黃酸、3-[5-(甲磺醯基哌啶甲基)-吲哚基]-喹諾酮、4-羥基他莫昔芬(hydroxytamoxifen)、5-去氧尿苷、5'-去氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、7-羥基星孢菌素(hydroxystaurosporine)、A-443654、乙酸阿比特龍(abirateroneacetate)、阿布拉生(abraxane)、ABT-578、阿考比芬(acolbifene)、ADS-100380、阿柏西普(aflibercept)、ALT-110、六甲蜜胺(altretamine)、阿米福汀(amifostine)、胺魯米特(aminoglutethimide)、胺柔比星(amrubicin)、安吖啶(amsacrine)、阿那格雷(anagrelide)、阿那曲唑(anastrozole)、血管生長抑素、AP-23573、ARQ-197、阿佐昔芬(arzoxifene)、AS-252424、AS-605240、天冬醯胺酶、ATI3387、AT-9263、阿曲生坦(atrasentan)、阿西替尼(axitinib)、AZD1152、卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin；BCG)疫苗、巴他布林(batabulin)、BC-210、貝索托克(besodutox)、貝伐單抗(bevacizumab)、BGJ398、比卡魯胺(bicalutamide)、Bio111、BIO140、BKM120、博萊黴素(bleomycin)、BMS-214662、BMS-247550、BMS-275291、BMS-310705、硼替佐米(bortezimib)、布舍瑞林(buserelin)、硫酸布他卡因(busulfan)、骨化三醇、喜樹鹼(camptothecin)、卡奈替尼(canertinib)、卡培他濱(capecitabine)、卡鉑(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、CC8490、CEA(重組牛痘癌胚抗原疫苗)、西地尼布(cediranib)、CG-1521、CG-781、克拉米多辛(chlamydocin)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、氯毒素(chlorotoxin)、西侖吉肽(cilengitide)、西米替丁 (cimitidine)、順鉑(cisplatin)、克拉屈濱(cladribine)、氯屈膦酸鹽(clodronate)、克比替尼(cobimetnib)、COL-3、CP-724714、環磷醯胺(cyclophosphamide)、環丙孕酮(cyproterone)、乙酸環丙孕酮、阿糖胞苷(cytarabine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosinearabinoside)、達拉菲尼(dabrafenib)、達卡巴嗪(dacarbazine)、達欣斯特(dacinostat)、放線菌素d(dactinomycin)、達洛圖單抗(dalotuzumab)、達魯舍替(danusertib)、達沙替尼(dasatanib)、道諾黴素(daunorubicin)、德卡替尼(decatanib)、魚藤素(deguelin)、地尼介白素(denileukin)、脫氧柯福黴素(deoxycoformycin)、縮肽(depsipeptide)、二芳基丙腈、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、迪夫托斯(diftitox)、DNE03、多烯紫杉醇(docetaxel)、多韋替尼(dovitinib)、小紅莓(doxorubicin)、曲洛昔芬(droloxifene)、艾特咔林(edotecarin)、釔-90標記之艾多替德、艾多替德(edotreotide)、EKB-569、EMD121974、恩拉菲尼(encorafenib)、內皮生長抑素(endostatin)、恩雜魯胺(enzalutamide)、恩紮妥林(enzastaurin)、表柔比星(epirubicin)、埃博黴素(epithilone)B、ERA-923、艾必妥(erbitux)、埃羅替尼(erlotinib)、雌二醇(estradiol)、雌氮芥(estramustine)、依託泊苷(etoposide)、依維莫司(everolimus)、依西美坦(exemestane)、費拉妥珠單抗(ficlatuzumab)、非那雄安(finasteride)、夫拉平度(flavopiridol)、氟尿苷(floxuridine)、氟達拉賓(fludarabine)、氟氫可的松(fludrocortisone)、氟羥甲基睾酮(fluoxymesterone)、氟他胺(flutamide)、弗福克斯療程(FOLFOX regimen)、氟維司群(fulvestrant)、加利特隆(galeterone)、加利特皮(ganetespib)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他濱(gemcitabine)、吉馬替康(gimatecan)、葡萄哌喃糖基脂質A、戈舍 瑞林(goserelin)、乙酸戈舍瑞林、棉子酚、GSK461364、GSK690693、HMR-3339、己酸羥基孕酮、羥基脲、IC87114、艾達黴素(idarubicin)、艾度昔芬(idoxyfene)、異環磷醯胺(ifosfamide)、IM862、伊馬替尼(imatinib)、IMC-1C11、咪喹莫特(imiquimod)、INC280、INCB24360、INO1001、干擾素、介白素-2、介白素-12、伊匹單抗、伊立替康(irinotecan)、JNJ-16241199、酮康唑(ketoconazole)、KRX-0402、拉帕替尼(lapatinib)、拉索昔芬(lasofoxifene)、LEE011、來曲唑(letrozole)、甲醯四氫葉酸、亮丙瑞林(leuprolide)、乙酸亮丙瑞林、左旋咪唑(levamisole)、脂質體包覆之太平洋紫杉醇、洛莫司汀(lomustine)、洛那法尼(lonafarnib)、硫蒽酮(lucanthone)、LY292223、LY292696、LY293646、LY293684、LY294002、LY317615、LY3009120、馬立馬司他(marimastat)、二氯甲二乙胺、乙酸甲羥孕酮、乙酸甲地孕酮、MEK162、美法侖(melphalan)、巰基嘌呤、美司鈉(mesna)、甲胺喋呤(methotrexate)、光神黴素(mithramycin)、絲裂黴素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、熱滅活奧布分支桿菌(heat killed Mycobacterium obuense)之懸浮液、陶紮色替(tozasertib)、MLN8054、納替克斯(natitoclax)、鯊癌靈(neovastat)、來那替尼(Neratinib)、紐拉迪布(neuradiab)、尼羅替尼(nilotinib)、尼魯米德(nilutimide)、諾拉曲特(nolatrexed)、NVP-BEZ235、奧利默森(oblimersen)、奧曲肽(octreotide)、奧伐木單抗(ofatumumab)、奧戈伏單抗(oregovomab)、奧納圖單抗(ornatuzumab)、奧特羅那(orteronel)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、太平洋紫杉醇、帕博西里(palbociclib)、帕米膦酸鹽(pamidronate)、帕尼單抗(panitumumab)、帕唑帕尼(pazopanib)、PD0325901、PD184352、 PEG-干擾素、培美曲塞(pemetrexed)、噴司他汀(pentostatin)、哌立福新(perifosine)、苯丙胺酸氮芥(phenylalaninemustard)、PI-103、皮克立西(pictilisib)、PIK-75、派多西芬(pipendoxifene)、PKI-166、普卡黴素(plicamycin)、聚ICLC、卟吩姆(porfimer)、潑尼松(prednisone)、丙卡巴肼(procarbazine)、孕酮、PSK蛋白質結合多醣(衍生自雲芝擔子菌(Basidiomycete coriolus versicolor))、PLX8394、PX-866、R-763、雷諾昔酚(raloxifene)、雷替曲塞(raltitrexed)、拉佐欣(razoxin)、瑞達莫司(ridaforolimus)、利妥昔單抗(rituximab)、羅米地辛(romidepsin)、RTA744、盧比替康(rubitecan)、斯克太德(scriptaid)、Sdx102、塞利希布(seliciclib)、司美替尼(selumetinib)、司馬沙尼(semaxanib)、SF1126、西羅莫司(sirolimus)、SN36093、索拉非尼(sorafenib)、螺內酯(spironolactone)、角鯊胺(squalamine)、SR13668、鏈脲佐菌素(streptozocin)、SU6668、辛二醯基苯胺異羥肟酸、舒尼替尼(sunitinib)、合成雌激素、他侖帕奈(talampanel)、塔里默拉赫帕(talimogene laherparepvec)、他莫昔芬、替莫唑胺(temozolomide)、坦羅莫司(temsirolimus)、替尼泊甙(teniposide)、替米利芬(tesmilifene)、睪固酮(testosterone)、漢防己鹼(tetrandrine)、TGX-221、撒利多胺(thalidomide)、6-硫鳥嘌呤、噻替派(thiotepa)、替西單抗(ticilimumab)、替吡法尼(tipifarnib)、替沃紮尼(tivozanib)、TKI-258、TLK286、TNFα(腫瘤壞死因子α)、拓朴替康(topotecan)、檸檬酸托瑞米芬(toremifene citrate)、曲貝替定(trabectedin)、曲美替尼(trametinib)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、維甲酸(tretinoin)、曲古黴素A(trichostatin A)、磷酸曲西立濱單水合物(triciribinephosphate monohydrate)、雙羥萘 酸曲普瑞林(triptorelin pamoate)、TSE-424、尿嘧啶氮芥、丙戊酸、伐柔比星(valrubicin)、凡德他尼(vandetanib)、凡塔藍尼(vatalanib)、VEGF捕獲劑、維羅非尼(vemurafenib、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine)、維他欣(vitaxin)、維特斯潘(vitespan)、伏立諾他(vorinostat)、VX-745、渥曼青黴素(wortmannin)、Xr311、Z-100結核桿菌(Bacillus tuberculosis)之熱水提取物、紮木單抗(zanolimumab)、ZK186619、ZK-304709、ZM336372或ZSTK474。
在本發明之一實施例中，CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)與一或多種止吐藥組合，包括(但不限於)：卡索匹坦(casopitant)(GlaxoSmithKline)、奈妥吡坦(Netupitant)(MGI-Helsinn)及其他NK-1受體拮抗劑、帕洛諾司瓊(palonosetron)(由MGI Pharma以Aloxi出售)、阿匹坦(aprepitant)(由Merck and Co.以Emend出售；Rahway,NJ)、苯海拉明(diphenhydramine)(由Pfizer以Benadryl®出售；New York,NY)、安泰樂(hydroxyzine)(由Pfizer以Atarax®出售；New York,NY)、甲氧氯普胺(metoclopramide)(由AH Robins Co以Reglan®出售；Richmond,VA)、勞拉西泮(lorazepam)(由Wyeth以Ativan®出售；Madison,NJ)、阿普唑侖(alprazolam)(由Pfizer以Xanax®出售；New York,NY)、氟哌啶醇(haloperidol)(由Ortho-McNeil以Haldol®出售；Raritan,NJ)、氟哌啶(droperidol)(Inapsine®)、屈大麻酚(dronabinol)(由Solvay Pharmaceuticals,Inc.以Marinol®出售；Marietta,GA)、地塞米松(dexamethasone)(由Merck and Co.以Decadron®出售；Rahway,NJ)、甲基潑尼龍(methylprednisolone)(由Pfizer以Medrol®出售；New York, NY)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)(由Glaxosmithkline以Compazine®出售；Research Triangle Park,NC)、格拉司瓊(granisetron)(由Hoffmann-La Roche Inc.以Kytril®出售；Nutley,NJ)、昂丹司瓊(ondansetron)(由Glaxosmithkline以Zofran®出售；Research Triangle Park,NC)、多拉司瓊(dolasetron)(由Sanofi-Aventis以Anzemet®出售；New York,NY)、特比司瓊(tropisetron)(由Novartis以Navoban®出售；East Hanover,NJ)。
癌症治療之其他副作用包括紅血球及白血球缺乏。因此，在本發明之一實施例中，CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)與治療或預防此類缺乏之藥劑(諸如非格司亭(filgrastim)、PEG-非格司亭、紅血球生成素、阿法依泊汀(epoetin alfa)或阿法達貝泊汀(darbepoetin alfa))組合。
在本發明之一實施例中，CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)與疫苗組合。在本發明之一實施例中，疫苗為抗癌疫苗、肽疫苗或DNA疫苗。舉例而言，在本發明之一實施例中，疫苗為腫瘤細胞(例如輻射腫瘤細胞)或樹突狀細胞(例如由腫瘤肽脈動之樹突狀細胞)。
在本發明之一實施例中，CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)與治療程序組合投與。治療程序為一或多個由治療個體之醫師或臨床醫師執行之步驟，其意欲緩解所治療之個體中之一或多種症狀(例如癌症及/或感染性疾病之症狀)，其藉由引起此類症狀之消退或消除或藉由抑制此類症狀(例如癌症症狀，諸如腫瘤生長或癌轉移)之進程達到任何臨床上可量測之程度。
在本發明之一實施例中，治療程序為抗癌放射療法。舉例而言，在本發明之一實施例中，放射療法為外部光束療法(EBT)：遞送一束高能X射線至腫瘤位置之方法。光束在患者外部產生(例如藉由線性加速器)且靶 向腫瘤部位。此等X射線可破壞癌細胞且謹慎的治療計劃允許繞過周圍正常組織。不將放射性來源置放於患者體內。在本發明之一實施例中，放射療法為質子束療法：以質子代替X-射線轟擊患病組織之一種保形療法。在本發明之一實施例中，放射療法為保形外部光束放射療法：使用先進技術將放射療法針對個體身體結構調整的程序。
在本發明之一實施例中，放射療法為近接療法：放射性物質暫時置放於體內，通常用於將超劑量或增強劑量之放射線給與某一區域。
在本發明之一實施例中，與CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)組合投與之外科程序為外科腫瘤切除術。
治療性用途
本發明包括預防及/或治療至少一種可藉由使用本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)視情況與另一治療劑或治療程序之組合預防或治療之疾病或病症的方法，該方法包含向有需要的個體投與醫藥活性量之CTLA4結合劑及/或包含其之醫藥組合物。
「治療(treat/treating)」意謂將本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)投與有CTLA4結合劑對其有效之疾病之一或多種症狀的個體(例如哺乳動物，諸如人類)，例如在治療患有癌症或感染性疾病，或懷疑患有癌症或感染性疾病之個體中，對於癌症或感染性疾病該藥劑具有治療活性。通常，CTLA4結合劑以「有效量」或「有效劑量」投與，其將緩解所治療之個體或群體中之一或多種症狀(例如癌症或感染性疾病之症狀)，其藉由引起此類症狀之消退或消除或藉由抑制此類症狀(例如癌症症狀，諸如腫瘤生長或癌轉移)之進程達到任何臨床上可量測之程度。CTLA4結合劑之有效量可根據諸如以下之因素而變化：患者之疾病階 段、年齡及體重及藥物在個體中引發所需反應之能力。
待治療之個體可為任何溫血動物，但特定言之為哺乳動物，且更特定言之為人類。如熟習此項技術者將瞭解，待治療之個體將特定言之為罹患本文中提及之疾病及病症或處於其風險下之個體。一般而言，將遵循治療方案直至實現所需治療效果及/或持續與維持所需治療效果一樣長的時間。同樣，此可由臨床醫師確定。
本文中描述之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)、多肽、化合物及聚核苷酸(例如載體)較佳向循環投與。因而，其可以允許CTLA4結合劑、多肽、化合物及聚核苷酸進入循環中之任何適合之方式(諸如靜脈內、經由注射或輸注)投與，或以允許CTLA4結合劑、多肽、化合物及聚核苷酸進入循環中之任何其他適合之方式(包括經口投與、皮下投與、肌肉內投與、經由皮膚投與、鼻內投與、經由肺投與等)投與。適合之投與方法及途徑將為熟習此項技術者瞭解，同樣例如亦自Ablynx N.V.之公開之專利申請案，諸如WO 04/041862、WO 2006/122786、WO 2008/020079、WO 2008/142164或WO 2009/068627之教示瞭解。
為了製備本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)之醫藥或無菌組合物，將CTLA4結合劑與醫藥學上可接受之載劑或賦形劑摻和。參見例如雷明頓氏醫藥科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)及美國藥典：國家處方集(U.S.Pharmacopeia：National Formulary),Mack Publishing Company,Easton,PA(1984)。此類組合物為本發明之一部分。
本發明之範疇包括包含CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)之乾燥(例如冷凍乾燥)組合物或包括醫藥學上可接受之載劑但基本上不具有 水之其醫藥組合物。
治療劑及診斷劑之調配物可藉由與可接受之呈例如凍乾粉末、漿料、水溶液或懸浮液形式的載劑、賦形劑或穩定劑混合來製備(參見例如，Hardman,等人(2001)Goodman and Gilman之The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams及Wilkins,New York,NY；Avis等人(編)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(編)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(編)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner及Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY)。
一般而言，為了預防及/或治療本文中提及之疾病及病症且視待治療之特定疾病或病症、將使用之特定融合蛋白或構築體之效能及/或半衰期、使用之特定投藥途徑及特定醫藥調配物或組合物而定，本發明之奈米抗體及多肽將一般以每日每公斤體重1公克與0.01微克之間，較佳每日每公斤體重0.1公克與0.1微克之間，諸如每日每公斤體重約1、10、100或1000微克的量持續(例如藉由輸注)、以單一日劑量或以在一天期間的多種分次劑量投與。臨床醫師將一般能夠視本文中提及之因素而定，確定適合的日劑量。亦將瞭解在特定情況下，臨床醫師可例如基於上文所引用之因素及其專業判斷選擇偏離此等量。一般而言，一些關於待投與之量的指南可獲自經由基本上相同途徑投與之針對相同靶向之類似習知抗體或抗體片段通常所投與的量，然而考慮親和力/親合力、功效、生物分佈、半衰期 差異及熟習此項技術者眾所周知之類似因素。
CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)向個體投與之模式可變化。投與途徑包括經口、直腸、經黏膜、經腸、非經腸；肌肉內、皮下、皮內、髓內、鞘內、直接心室內、靜脈內、腹膜內、鼻內、眼內、吸入、吹入、局部、皮膚、經皮或動脈內。
適當劑量之確定由臨床醫師，例如使用此項技術中已知或懷疑影響治療之參數或因素進行。一般而言，在確定劑量方面，劑量以稍微低於最佳劑量之量開始且在其之後其以較小增量增加直至相對於任何負面副作用實現所要或最佳效果。重要診斷量測包括例如發炎症狀或產生之發炎性細胞因子之量的量測。一般而言，需要將使用之生物製劑來源於與靶向治療之動物相同的物種，藉此使對試劑之任何免疫反應降至最低。在人類個體之情況下，例如嵌合抗體、人類化抗體及完全人類抗體可為合乎需要的。選擇合適劑量之指南為可獲得的(參見例如Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(編)(1991)Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(編)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY；Baert等人(2003)New Engl.J.Med.348：601-608；Milgrom等人(1999)New Engl.J.Med.341：1966-1973；Slamon等人(2001)New Engl.J.Med.344：783-792；Beniaminovitz等人(2000)New Engl.J.Med.342：613-619；Ghosh等人(2003)New Engl.J.Med.348：24-32；Lipsky等人(2000)New Engl.J.Med.343：1594-1602)。
疾病症狀是否已緩解可藉由醫師或其他熟練醫療保健提供者通常用 以評定該症狀之嚴重程度或進程狀態的任何臨床量測來評定。雖然本發明之一實施例(例如，治療方法或製品)可能無法有效緩解每一個體中之標靶疾病症狀，但其應緩解如藉由此項技術中已知之任何統計測試所測定的統計學上顯著數目之個體中的標靶疾病症狀，統計測試諸如學生t測試、chi2測試、根據曼(Mann)及惠特尼(Whitney)之U測試、克拉斯卡-瓦立斯測試(Kruskal-Wallis test；H測試)、約克希雷-特普斯特拉測試(Jonckheere-Terpstra-test)及威爾科克森測試(Wilcoxon-test)。
一般而言，將遵循治療方案直至實現所需治療效果及/或持續與維持所需治療效果一樣長的時間。同樣，此可由臨床醫師確定。
因為本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)能夠結合至CTLA4，其可尤其用於治療或預防癌症、轉移性癌症、實體腫瘤、血液癌、白血病、淋巴瘤、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、神經母細胞瘤、腎癌、白血病、腎移行細胞癌、膀胱癌、威爾姆氏癌症、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、滑膜肉瘤、頭頸癌、鱗狀細胞癌、多發性骨髓瘤、腎細胞癌、視網膜母細胞瘤、肝母細胞瘤、肝細胞癌、黑素瘤、腎臟之桿狀腫瘤、尤文氏肉瘤、軟骨肉瘤、腦癌、神經膠母細胞瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤、前庭神經鞘瘤、原始神經外胚層瘤、神經管胚細胞瘤、星形細胞瘤、退行性星形細胞瘤、少突神經膠質瘤、室管膜瘤、脈絡叢乳頭狀瘤、真性紅血球增多症、血小板增多症、特發性骨髓纖維化、軟組織肉瘤、甲狀腺癌、子宮內膜癌、類癌或肝癌、乳癌及胃癌。
本發明之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)可用於治療或預防感染性疾病，諸如病毒感染、細菌感染、真菌感染或寄生蟲感染。在本 發明之一實施例中，病毒感染為選自由以下組成之群的病毒的感染：人類免疫缺乏病毒(HIV)、埃博拉病毒(ebola virus)、肝炎病毒(A、B或C)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-I、HAV-6、HSV-II及CMV、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流感病毒、黃病毒(flaviviruses)、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒(rhinovirus)、科沙奇病毒(coxsackie virus)、冠狀病毒(coronavirus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)、流行性腮腺炎病毒(mumps virus)、輪狀病毒(rotavirus)、麻疹病毒(measles virus)、風疹病毒(rubella virus)、細小病毒(parvovirus)、牛痘病毒(vaccinia virus)、HTLV病毒、登革熱病毒(dengue virus)、乳突狀瘤病毒(papillomavirus)、軟疣病毒(molluscum virus)、脊髓灰白質炎病毒(poliovirus)、狂犬病病毒(rabies virus)、JC病毒或蟲媒病毒性腦炎病毒(arboviral encephalitis virus)。在本發明之一實施例中，細菌感染為選自由以下組成之群的細菌的感染：衣原體(Chlamydia)、立克次體細菌(rickettsial bacteria)、分枝桿菌(mycobacteria)、葡萄狀球菌(staphylococci)、鏈球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、腦膜炎球菌(meningococci)及淋球菌(gonococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、變形桿菌(proteus)、沙雷菌屬(serratia)、假單胞菌(pseudomonas)、軍團菌屬(Legionella)、白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、沙門氏菌(Salmonella)、桿菌(bacilli)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、破傷風梭菌(Clostridium tetan)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、炭疽桿菌(Bacillus anthricis)、鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis)、麻風分支桿菌(Mycobacterium leprae)、彌漫型痲瘋分枝桿菌(Mycobacterium lepromatosis)及包柔體屬(Borriella)。在本發明之一實施例中，真菌感染 為選自由以下組成之群的真菌的感染：念珠菌屬(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克魯斯氏念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、熱帶念珠菌(tropicalis)等)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、麴菌屬(Aspergillus)(煙麯黴(fumigatus)、黑麯黴(niger)等)、毛黴屬(Genus Mucorales)(白黴菌屬(mucor)、犁頭黴屬(absidia)、根黴菌屬(rhizopus))、申克氏胞絲菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)及莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)。在本發明之一實施例中，寄生蟲感染為選自由以下組成之群的寄生蟲的感染：溶組織內阿米巴(Entamoeba histolytica)、大腸纖毛蟲(Balantidium coli)、變形纖毛蟲(Naegleria fowleri)、棘阿米巴蟲屬(Acanthamoeba)、蘭比亞梨形鞭毛蟲(Giardia lambia)、隱胞子蟲屬(Cryptosporidium)、肺炎肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、微小巴倍蟲(Babesia microti)、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)及巴西日圓線蟲(Nippostrongylus brasiliensis)。
本發明亦包括用於以下之方法：●防止CTLA4介導之對以下之抑制：T細胞共刺激信號傳導、T細胞活化、T細胞增殖；●防止CTLA4結合至B7-1(CD80)或B7-2(CD86)；及/或●增強T細胞活化
其係在個體體內藉由向個體投與CTLA4結合劑(例如F023700912或 F023700914)；或活體外藉由使CTLA4與CTLA4結合劑接觸進行。此類活性可經由CTLA4結合劑介導。因此，此類方法亦可用任何包括CTLA4結合劑之結合劑進行。
本發明亦關於治療前述疾病及病症之方法，其一般包含向有需要(亦即罹患前述疾病中之一者)之個體投與治療有效量之本發明CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)。本發明亦關於本發明之用於預防或治療前述疾病或病症中之一者之CTLA4結合劑。
本發明亦提供注射裝置，其包含本文所述之CTLA4結合劑(例如ISVD，諸如奈米抗體)、多肽或聚核苷酸或其醫藥組合物中之任一者。注射裝置為經由非經腸途徑，例如肌肉內、皮下或靜脈內，將物質引入患者體內之裝置。舉例而言，注射裝置可為注射器(例如預填有醫藥組合物，諸如自動注射器)，其例如包括用於容納待注射之流體(例如包含CTLA4結合劑或其醫藥組合物)的針筒或圓筒、用於刺穿皮膚及/或血管以注射流體之針及用於推動流體自針筒出來且穿過針孔之推桿。在本發明之一實施例中，包含CTLA4結合劑或其醫藥組合物之注射裝置為靜脈內(IV)注射裝置。此類裝置包括套管或套管針/針中之CTLA4結合劑或其醫藥組合物，套管或套管針/針可附接至管，該管可附接至用於容納經由套管或套管針/針引入個體體內的流體(例如生理食鹽水；或包含NaCl、乳酸鈉、KCl、CaCl2且視情況包括葡萄糖之乳酸化林格氏溶液(lactated ringer solution))之袋子或儲槽。在本發明之一實施例中，可在將套管針及套管插入個體之靜脈中後將CTLA4結合劑或其醫藥組合物引入裝置中且自插入之套管移除套管針。IV裝置可例如插入周邊靜脈(例如，手或臂中)；上腔靜脈或下腔靜脈，或心臟右心房內(例如，中心IV)；或鎖骨下、頸內靜脈或股靜 脈，且例如前進至心臟，直至其達到上腔靜脈或右心房(例如，中心靜脈導管)。在本發明之一實施例中，注射裝置為自動注射器、噴射注射器或外部輸注泵。噴射注射器使用液體之高壓狹窄噴射，其穿透表皮以將CTLA4結合劑或其醫藥組合物引入患者體內。外部輸注泵為將CTLA4結合劑或其醫藥組合物以控制量遞送至患者體內的醫學裝置。外部輸注泵可為電動或機械動力。不同泵以不同方式操作，例如注射泵將流體保持在注射器之儲槽中，且可移動活塞控制流體遞送，彈性泵將流體保持在可拉伸氣囊儲槽中，且來自氣囊之彈性壁的壓力驅動流體遞送。在蠕動泵中，一組滾筒沿可撓性導管長度向下夾捏，推動流體向前。在多通道泵中，流體可自多個儲槽以多個速率遞送。
亦應注意除非本文中另外明確指示，否則圖式、任何序列表及實驗部分/實例僅為了進一步說明本發明而給出且不應解釋或理解為以任何方式限制本發明及/或所附申請專利範圍之範疇。
本發明之其他態樣、實施例、優勢及應用將自本文中之其他描述變得明顯。
實例
此等實例意欲舉例說明本發明不限於實例。實例中所述之組合物及方法形成本發明之一部分。
實例1：F023700906奈米抗體與CTLA-4-Fc之結合.
單價F023700906奈米抗體11F01(L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)-FLAG3-HIS6)(F023700912之構築嵌段)展現與來自入類及食蟹獼猴之CTLA-4-Fc融合分子之結合。在ProteOn XPR36(BioRad 670BR0166)上使用人類CTLA-4-hFc及食蟹獼猴CTLA4- hFc測定締合速率、解離速率及親和力(下表D)。此等結果展現奈米抗體對人類及食蟹獼猴CTLA-4之高親和力結合，表明奈米抗體調節CTLA-4之功能之潛能及食蟹獼猴可用作毒理學物種。
實例2：F023700912奈米抗體與細胞表面CTLA4之結合.
F023700912展現與在細胞表面上表現之人類CTLA-4之結合。藉由流式細胞測量術研究F023700912(11F01(E1D、L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)-35GS-11F01(L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)-35GS-ALB11002-A])(實心圓)、F023700925(102C12(E1D、L11V、A14P、A74S、K83R、I89L)-35GS-102C12(L11V、A14P、A74S、K83R、I89L)-35GS-11F01(L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)-35GS-11F01(L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)- 35GS-ALB11002-A])(實心正方形)及不相關奈米抗體(實心三角形)之CMC批料與(A)粗分選之hCTLA4過度表現jurkat JE6.2.11細胞或(B)hCTLA4過度表現CHO-K1細胞之結合。經由ALB11002結合mAB ABH0074偵測奈米抗體。在此等實驗中產生之資料闡述在圖5(a-b)中。此等結果展現F023700912及F023700925與在細胞表面上表現之CTLA-4之結合，表明此等奈米抗體調節CTLA-4之功能。
圖5(a-b)為半衰期延長之(ALB0011構築嵌段)奈米抗體F023700912(實心圓)、F023700925(實心正方形)及陰性對照奈米抗體IRR00051(實心三角形)之CMC批料於200μl FACS緩衝液(PBS(Life Technologies，14190-094)、10%熱滅活胎牛血清(Sigma，F7524)、0.05% NaN3(ThermoScientific，19038))中之稀釋系列(起始濃度1μM，1/4連續稀釋，12pts)，將其添加至(A)2E4粗分選之人類CTLA4過度表現jurkat JE6.2.11細胞/孔或(B)2E4人類CTLA4過度表現CHO-K1細胞/孔且在4℃下培育30分鐘。
在三個洗滌步驟(1個洗滌步驟=移除奈米抗體稀釋液，添加100μl冷FACS緩衝液，在250g下離心5分鐘)之後，在4℃下用含3μg/ml抗ALB11002小鼠mAb ABH00074之冷FACS緩衝液培育細胞30分鐘以便偵測半衰期延長之奈米抗體。
在三個洗滌步驟之後，在4℃下用PE山羊F(ab')2抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，115-116-071)於冷FACS緩衝液中之1/100稀釋液培育細胞30分鐘。
在三個洗滌步驟之後，使細胞再懸浮於補充有5nM TO-PRO-3(Molecular Probes，T3605)之50μl冷FACS緩衝液中且用FACS Canto分 析。
首先，基於FSC-SSC分佈選擇P1群體。終止門設定在P1中10000個細胞上。自此群體中排除TO-PRO-3+細胞(死亡細胞)。計算此P1/TO-PRO-3-陰性群體之中間PE值。
實例3：F023700912奈米抗體阻斷CTLA-4與CD80及CD86之結合.
F023700912阻斷人類CTLA-4與其配位體CD80及CD86之結合。hCTLA4過度表現CHO-K1細胞上F023700912(實心圓)及伊匹單抗(實心正方形)與固定濃度(10×EC30)之(A)hCD80-hFc或(B)hCD86-hFc之競爭實驗之流式細胞測量術分析。經由人類IgG Fc融合蛋白偵測配位體。在此等實驗中產生之資料闡述在圖6(a-b)中。此等結果展現F023700912阻斷CTLA-4與其配位體CD80及CD86之結合之能力，說明F023700912影響藉由CTLA-4調節之免疫反應及其與CD80及CD86之相互作用之能力。
圖6(a-b)為奈米抗體F023700912(實心圓)及伊匹單抗(實心正方形)於100μl FACS緩衝液(PBS(Life Technologies，14190-094)、10%熱滅活胎牛血清(Sigma，F7524)、0.05% NaN3(ThermoScientific，19038))中之稀釋液系列(起始濃度1μM，1/3連續稀釋液，12pts)，在固定濃度之(A)FITC標記之人類CD80-hFc-HIS6或(B)FITC標記之人類CD86-hFc-HIS6(分別在3.6及2之標記度下進行FITC標記；濃度=10×EC30，分別為3.71E-08M或4.35E-08M)存在下將其添加至1E5人類CTLA4過度表現CHO K1細胞/孔且在4℃下培育90分鐘。
在三個洗滌步驟(1個洗滌步驟=移除奈米抗體稀釋液，添加100μl冷FACS緩衝液，在250g下離心5分鐘)之後，使細胞再懸浮於補充有5nM TO-PRO-3(Molecular Probes，T3605)之50μl冷FACS緩衝液中且用 FACS Canto分析。
首先，基於FSC-SSC分佈選擇P1群體。終止門設定在P1中10000個細胞上。自此群體中排除TO-PRO-3+細胞(死亡細胞)。計算此P1/TO-PRO-3-陰性群體之中間FITC值。
實例4：F023700912特異性評定.
特異性評定F023700912展現與CTLA-4之選擇性結合。在過度表現細胞上使用流式細胞測量術進行對BTLA、CD8、PD1、CTLA4、LAG3、CD28之特異性評定，而ICOS結合在ELISA中以重組蛋白(hICOS-hFc)評定。經由直接標記之標靶特異性抗體確認BTLA、CD8、PD1、CTLA4、LAG3、CD28之表現。抗hICOS及抗hCTLA4/抗hPD1陽性對照均為陽性。在ELISA分析中未觀測到與hICOS之結合。圖7(a-h)分別顯示與陰性對照L細胞、陰性對照CHO-K1細胞、huCD28+ L細胞、huCD8α+ L細胞、huLag-3+ CHO-K1細胞、huBTLA+ CHO-K1細胞、huCTLA-4+ CHO-K細胞及huPD-1+ CHO-K1細胞之結合。對於F023700912，不可觀測與BTLA、CD8、PD1、LAG3、CD28之結合，而在CTLA-4+ CHO-K1細胞上觀測到F023700912之有效結合。在此等實驗中產生之資料闡述在圖7(a-h)中。此等結果說明F023700912與CTLA-4之選擇性結合，預測在活體內投與後之最小脫靶效果。
圖7(a-h)為半衰期延長之(ALB0011構築嵌段)奈米抗體F023700912(實心圓)、F023700925(實心正方形)及陰性對照奈米抗體IRR00051(實心三角形)之CMC批料於200μl FACS緩衝液(PBS(Life Technologies，14190-094)、10%熱滅活胎牛血清(Sigma，F7524)、0.05% NaN3(ThermoScientific，19038))中之稀釋液系列(起始濃度1μM，1/4連續稀 釋液，12pts)，將其添加至(A)2E4 L細胞/孔、(B)2E4 CHO-K1細胞/孔、(C)人類CD28過度表現L細胞或(D)人類CD8 α過度表現L細胞、(E)2E4人類LAG3過度表現CHO-K1/孔、(F)2E4人類BTLA過度表現CHO-K1細胞/孔、(G)人類CTLA4過度表現CHO-K1細胞/孔或(H)人類PD1過度表現CHO-K1細胞/孔且在4℃下培育30分鐘。
在三個洗滌步驟(1個洗滌步驟=移除奈米抗體稀釋液，添加100μl冷FACS緩衝液，在250g下離心5分鐘)之後，在4℃下用含3μg/ml抗ALB0011小鼠mAb ABH00074之冷FACS緩衝液培育細胞30分鐘以便偵測半衰期延長之奈米抗體。
在三個洗滌步驟之後，在4℃下用PE山羊F(ab')2抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，115-116-071)於冷FACS緩衝液中之1/100稀釋液培育細胞30分鐘。
在三個洗滌步驟之後，使細胞再懸浮於補充有5nM TO-PRO-3(Molecular Probes，T3605)之50μl冷FACS緩衝液中且用FACS Canto分析。
首先，基於FSC-SSC分佈選擇P1群體。終止門設定在P1中10000個細胞上。自此群體中排除TO-PRO-3+細胞(死亡細胞)。計算此P1/TO-PRO-3-陰性群體之中間PE值。
實例5：F023700912奈米抗體與人類、恆河猴及小鼠白蛋白之結合.
F023700912結合至人類、恆河猴及小鼠白蛋白，當與非白蛋白結合奈米抗體相比時預測延長之半衰期。當使用表面纖維蛋白溶酶共振(SPR)分析時，觀測到與人類、恆河猴及小鼠血清白蛋白之結合。資料以下在表E中闡述。在活體內投與後F023700912之白蛋白結合預期降低奈米抗體之 清除率，改良其治療潛能。
儀器：Biacore T100(GE Healthcare)；感測器晶片：CM5(ID T160713-2，GE Healthcare，批號10242599)
實例6：奈米抗體F023700906 N73變異體.
比較變異體F023701051(11F01(L11V、A14p、Q45R、N73Q、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)-FLAG3-HIS6)、F023701054(11F01(L11V、A14P、Q45R、N73T、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)-FLAG3-HIS6)及F023701061(11F01(L11V、A14P、Q45R、N73Y、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)-FLAG3-HIS6)與F023700906之阻斷(A)CD80或(B)CD86與表現CTLA-4之CHO-K1細胞之結合的能力。所有此等變異體能夠阻斷CD80及CD84與CTLA-4之結合。針對數種變異體測定CTLA4與CD80及CD86之阻斷。此等阻斷資料闡述在圖8(a-b)中。此等結果說明在無對奈米抗體阻斷CD80或CD86與CTLA-4之結合之能力的主要影響下改變位置N73中之胺基酸之可行性。此類變異體將允許避免N73處之去醯胺。
實例7：F023700912根除人類化小鼠中之確定的實體腫瘤.
人類化小鼠(Jackson Laboratories)植入有panc 08.13腫瘤細胞(人類胰臟癌)。如下處理有確定腫瘤(約100mm3，n=9-10/組)之小鼠：1-同型 對照(hIgG1-2mg/kg及hIgG4-3mg/kg)；2-伊匹單抗-N297A(3mg/kg)；3-伊匹單抗(3mg/kg)；4-派立珠單抗(2mg/kg)；5-伊匹單抗(3mg/kg)+派立珠單抗(2mg/kg)；6-F023700912(5mg/kg；指示為CTLA4-奈米抗體5)，7-F023700912(15mg/kg；指示為CTLA4-奈米抗體-15)，及8-F023700912(15mg/kg)+派立珠單抗(2mg/kg)。所有抗體每7天皮下注射持續6次給藥。F023700912每3.5天皮下投與持續11次給藥。每4-5天量測腫瘤體積及體重。圖9(a-b)中所示為平均腫瘤體積±SEM、第37天之個別腫瘤體積及在實驗過程中個別小鼠中之腫瘤體積。各處理組之腫瘤體積亦顯示於圖9(c-j)中。亦量測各處理組中之平均(平均值±SEM)及個別體重變化(圖9(k-s))。由於體重減輕而發現死亡或人道地安樂死之小鼠之數目指示為「#」。「↑」指示抗體且「*」指示奈米抗體給藥時程。此等資料說明F023700912活體內在具有人類免疫細胞之動物中誘導抗人類腫瘤反應之能力。此等資料證明F023700912在治療人類癌症中之潛能。
實例8：F023700912及F023700925與來自健康個體及癌症患者之預先存在抗體之結合.
三價參考奈米抗體013700112(未經修飾用於減少預先存在抗體之結合)展現與來源於(圖10A)健康個體或(圖10B)癌症患者之數種血清樣品之結合。類似尺寸之序列優化三價奈米抗體F023700912展現較低頻率之與相同血清樣品之結合。F023700925包含與F023700912相同之構築嵌段。儘管尺寸較大，五價F023700925奈米抗體展示不超過參考奈米抗體013700112之與預先存在抗體之結合。使用ProteOn XPR36(Bio-Rad Laboratories,Inc.)評估預先存在抗體與在人類血清白蛋白(HSA)上捕獲之奈米抗體之結合。PBS/Tween(磷酸鹽緩衝鹽水，pH 7.4，0.005% Tween20)用作電泳緩衝液且在25℃下進行實驗。ProteOn GLC感測器晶片之配位體泳道用EDC/NHS(流動速率30μl/min)活化且以於ProteOn乙酸鹽緩衝液pH 4.5(流動速率100μl/min)中10μg/ml注射HSA以使得固定水準為大約3600RU。在固定之後，表面用乙醇胺HCl(流動速率30μl/min)去活化。在HSA表面上以45μl/min注射奈米抗體持續2分鐘以使得三價F023700912之奈米抗體捕獲水準為大約600RU且五價F023700925之奈米抗體捕獲水準為大約1000RU。含有預先存在抗體之樣品在PBS-Tween20(0.005%)中1：10稀釋，隨後以45μl/min注射2分鐘，接著為隨後400秒解離步驟。在各循環之後(亦即在新奈米抗體捕獲及血液樣品注射步驟之前)，用HCl(100mM)之在45μl/min下之2分鐘注射再生HSA表面。用ProteOn管理器3.1.0(Bio-Rad Laboratories,Inc.)進行感測器圖譜處理及資料分析。在雙參考之後藉由減去1)奈米抗體-HSA解離及2)與僅含有HSA之參考配位體泳道之非特異性結合獲得顯示預先存在抗體結合之感測器圖譜。藉由將報導點設定在125秒(締合結束之後5秒)測定預先存在抗體之結合水準。作為參考，亦測試含有預先存在抗體之樣品與未經修飾用於減少此等預先存在抗體之結合的三價奈米抗體(T013700112)之結合。
實例9：藉由氫氘交換質譜進行之抗hCTLA4奈米抗體之抗原決定基定位.
藉由使用氫氘交換質譜(HDX-MS)分析測定抗hCTLA4奈米抗體F023700912之間的接觸區域。HDX-MS量測氘至蛋白質之醯胺主鏈中之併入且此併入之變化受氫之溶劑曝露影響。進行僅抗原樣品及奈米抗體結合樣品中氘交換水準之比較以鑑定可與奈米抗體接觸之抗原區域。
受奈米抗體F023700912最強保護免於氘化之人類CTLA4殘基為VRVTVL(SEQ ID NO：110之殘基33-38)、ADSQVTEVC(SEQ ID NO： 110之殘基41-49)及CKVELMYPPPYYLG(SEQ ID NO：110之殘基93-106)。展現F023700912與CTLA4之結合的熱圖闡述在圖13中。
<110> 美商默沙東藥廠
<120> CTLA4結合劑
<130> 24237
<160> 111
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 1
<210> 2
<211> 5
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<213> 美洲駝
<400> 2
<210> 3
<211> 17
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<210> 4
<211> 10
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X為M或P
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<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X為M或P
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<210> 8
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<210> 29
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 29
<210> 30
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 30
<210> 31
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 31
<210> 32
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 32
<210> 33
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 33
<210> 34
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 34
<210> 35
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 35
<210> 36
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 36
<210> 37
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 37
<210> 38
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 38
<210> 39
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 39
<210> 40
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 40
<210> 41
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 41
<210> 42
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 42
<210> 43
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 43
<210> 44
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His6-FLAG3標籤
<400> 44
<210> 45
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C端延長劑
<400> 45
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C端延長劑
<400> 46
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C端延長劑
<400> 47
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C端延長劑
<400> 48
<210> 49
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C端延長劑
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X為1-10個天然胺基酸之任何序列
<400> 49
<210> 50
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C端延長劑
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X為1-10個天然胺基酸之任何序列
<400> 50
<210> 51
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C端延長劑
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X為1-10個天然胺基酸之任何序列
<400> 51
<210> 52
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C端延長劑
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X為1-10個天然胺基酸之任何序列
<400> 52
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C端延長劑
<400> 53
<210> 54
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C端延長劑
<400> 54
<210> 55
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C端延長劑
<400> 55
<210> 56
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C端延長劑
<400> 56
<210> 57
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C端延長劑
<400> 57
<210> 58
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C端延長劑
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X為1-10個天然胺基酸之任何序列
<400> 58
<210> 59
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C端延長劑
<400> 59
<210> 60
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X為D或E
<400> 60
<210> 61
<211> 1272
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 61
<210> 62
<211> 424
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 62
<210> 63
<211> 810
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 63
<210> 64
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 64
<210> 65
<211> 3w
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 65
<210> 66
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X為L或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> X為L或V
<400> 66
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 美洲駝
<400> 67
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> 美洲駝
<400> 68
<210> 69
<211> 6
<212> PRT
<213> 美洲駝
<400> 69
<210> 70
<211> 85
<212> PRT
<213> 釀酒酵母
<400> 70
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> 大鼠屬
<400> 71
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> 大鼠屬
<400> 72
<210> 73
<211> 8
<212> PRT
<213> 大鼠屬
<400> 73
<210> 74
<211> 10
<212> PRT
<213> 大鼠屬
<400> 74
<210> 75
<211> 17
<212> PRT
<213> 大鼠屬
<400> 75
<210> 76
<211> 10
<212> PRT
<213> 大鼠屬
<400> 76
<210> 77
<211> 10
<212> PRT
<213> 大鼠屬
<400> 77
<210> 78
<211> 16
<212> PRT
<213> 大鼠屬
<400> 78
<210> 79
<211> 11
<212> PRT
<213> 大鼠屬
<400> 79
<210> 80
<211> 11
<212> PRT
<213> 大鼠屬
<400> 80
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> 大鼠屬
<400> 81
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 大鼠屬
<400> 82
<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠屬
<400> 83
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠屬
<400> 84
<210> 85
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠屬
<400> 85
<210> 86
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠屬
<400> 86
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<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠屬
<400> 87
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠屬
<400> 88
<210> 89
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化小鼠
<400> 89
<210> 90
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化小鼠
<400> 90
<210> 91
<211> 440
<212> PRT
<213> 智人
<400> 91
<210> 92
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 92
<210> 93
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 93
<210> 94
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 94
<210> 95
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 95
<210> 96
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 96
<210> 97
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 97
<210> 98
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 98
<210> 99
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 99
<210> 100
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 100
<210> 101
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 101
<210> 102
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 102
<210> 103
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 103
<210> 104
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 104
<210> 105
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 105
<210> 106
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 106
<210> 107
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 107
<210> 108
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 108
<210> 109
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化美洲駝
<400> 109
<210> 110
<211> 138
<212> PRT
<213> 智人
<400> 110
<210> 111
<211> 223
<212> PRT
<213> 智人
<400> 111

Claims (28)

  1. 一種免疫球蛋白單一可變域(ISVD)，其藉由在以下殘基中之一或多者接觸人類CTLA4而結合至人類CTLA4：VRVTVL(SEQ ID NO：110之胺基酸33-38)，ADSQVTEVC(SEQ ID NO：110之胺基酸41-49)，及CKVELMYPPPYYLG(SEQ ID NO：110之胺基酸93-106)；或一種交叉阻斷該ISVD結合CTLA4之交叉阻斷結合劑。
  2. 一種結合至CTLA4之免疫球蛋白單一可變域(ISVD)，其包含SEQ ID NO：1中所述之胺基酸序列但在殘基包含一或多種選自由以下組成之群的突變：E1D、L11V、A14P、Q45R、A74S、N73X(其中X為S、V、G、R、Q、M、H、T、D、E、W、F、K、A、Y或P)、K83R、V89L、M96P、Q108L；其中該等殘基編號為Kabat殘基編號；及視情況，半衰期延長劑及/或C端延長劑；或一種交叉阻斷該ISVD結合CTLA4之交叉阻斷結合劑。
  3. 如請求項1或2之ISVD，其包含以下胺基酸序列： 其中X為D或E(SEQ ID NO：60)；視情況包含半衰期延長劑及/或C端延長劑。
  4. 如請求項1或2之ISVD，其包含選自SEQ ID NO：93-109之胺基酸序列；視情況缺乏其胺基酸AAADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGAAHHHHHH(120-153)。
  5. 如請求項1或2之ISVD，其融合至半衰期延長劑。
  6. 如請求項1或2之ISVD，其融合至與人類血清白蛋白結合之ISVD。
  7. 如請求項6之ISVD，其中該與人類血清白蛋白結合之ISVD為ALB11002。
  8. 一種ISVD，其包含：如請求項1至4中任一項之結合至CTLA4之ISVD；肽連接子；如請求項1至4中任一項之結合至CTLA4之ISVD；肽連接子；半衰期延長劑；及視情況，C端延長部分丙胺酸。
  9. 一種ISVD，其包含：如請求項1至4中任一項之結合至CTLA4之ISVD；肽連接子； 半衰期延長劑；及視情況，C端延長部分丙胺酸。
  10. 如請求項8或9之ISVD，其中該肽連接子包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：65)。
  11. 如請求項1、2、8及9中任一項之ISVD，其包含以下胺基酸序列： (SEO ID NO：62)。
  12. 如請求項1、2、8及9中任一項之ISVD，其包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：64)。
  13. 如請求項1、2、8及9中任一項之ISVD，其為奈米抗體。
  14. 如請求項1、2、8及9中任一項之ISVD，其結合至CTLA4。
  15. 一種注射裝置或容器，其包含如請求項1至14中任一項之ISVD視情況與另一治療劑組合。
  16. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項1至14中任一項之ISVD。
  17. 如請求項16之聚核苷酸，其包含SEQ ID NO：61或63之核苷酸序列。
  18. 一種載體，其包含如請求項16至17中任一項之聚核苷酸。
  19. 一種宿主細胞，其包含如請求項16至17中任一項之聚核苷酸或如請求項18之載體。
  20. 一種製備如請求項1至14中任一項之ISVD之方法，其包含將編碼該ISVD之聚核苷酸引入宿主細胞中且該宿主細胞在培養基中在有利於自該聚核苷酸表現該ISVD之條件下培養，及視情況自該宿主細胞及/或該培養基純化該ISVD。
  21. 一種ISVD，其係由如請求項20之方法產生。
  22. 一種防止CTLA4結合至CD80或CD86之方法，其包含使該CTLA4與如請求項1至14中任一項之ISVD視情況與另一治療劑之組合接觸。
  23. 一種增強個體體內免疫反應之方法，其包含向該個體投與有效量之如請求項1至14中任一項之ISVD視情況與另一治療劑之組合。
  24. 一種如請求項1至14中任一項之ISVD在製造用於治療或預防個體體內之癌症或感染性疾病之藥物之用途，其中該藥物視情況包含另一治療劑或與另一治療劑組合使用。
  25. 如請求項24之用途，其中該癌症為轉移性癌症、實體腫瘤、血液癌、白血病、淋巴瘤、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、神經母細胞瘤、腎癌、白血病、腎移行細胞癌、膀胱癌、威爾姆氏癌症(Wilm'sCancer)、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、滑膜肉瘤、頭頸癌、鱗狀細胞癌、多發性骨髓瘤、腎細胞癌、視網膜母細胞瘤、肝母細胞瘤、肝細胞癌、黑素瘤、腎臟之桿狀腫瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、軟骨肉瘤、腦癌、神經膠母細胞瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤、前庭神經鞘瘤、原始神經外胚層瘤、神經管胚細胞瘤、星形細胞瘤、退行性(anaplastic)星形細胞瘤、少突神經膠質瘤、室管膜瘤、脈絡叢乳頭狀瘤、真性紅血球增多症、血小板增多症、特發性骨髓纖維化、軟組織肉瘤、甲狀腺癌、子宮內膜癌、類癌或肝癌、乳癌或胃癌。
  26. 如請求項24之用途，其中該感染性疾病為細菌感染、病毒感染或真菌感染。
  27. 如請求項24至26中任一項之用途，其中該藥物與另一治療劑或治療程序組合使用。
  28. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至14中任一項之ISVD。
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