KR102091852B1 - Peg 대사산물 및 peg 분해 생성물 검정을 위한 화합물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

PEG의 대사산물 또는 분해 생성물을 확인하고 정량화하기 위한 화합물 및 방법이 개시되어 있다. 샘플은 질량 분광기와 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 PEG 대사산물 또는 분해 생성물에 대해 검정될 수 있다. 음성 화학 이온화 방식 액체 크로마토그래피와 함께 펜타플루오로벤조일 클로라이드를 사용한 샘플내 PEG 대사산물 또는 분해 생성물의 유도체화는 검정을 최적화시킨다.

Description

PEG 대사산물 및 PEG 분해 생성물 검정을 위한 화합물 및 방법
폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 완하제(laxative)로서 일반적으로 사용되는 폴리에테르이다. 예를 들면, PEG는 의학 또는 외과 수술용 제제에서 개체의 GI 관을 퍼징(purge)하는데 사용될 수 있다.
PEG는 예를 들면, 분해 공정 또는 다른 이유의 결과로서, 이의 성분 요소로 분해될 수 있다. PEG의 분해 생성물은 에틸렌 글리콜 및 디에틸렌 글리콜을 포함한다. 개체에 의한 PEG 또는 PEG 함유 물질의 소화는 에틸렌 글리콜 및 디에틸렌 글리콜을 포함하는 특정의 PEG 대사산물의 생산을 가져올 수 있다. PEG의 분해 후, PEG 대사산물은 예를 들면, 소화된 PEG를 가진 개체의 혈액, 소변, 또는 소화계 중에 존재할 수 있다.
PEG 분해는 또한 PEG 함유 생성물 또는 용액 내에서 일어날 수 있다. 예를 들면, PEG 함유 장 제제는, PEG 함유 생성물 또는 용액이 소화되기 전에도 특정량의 PEG 분해 생성물을 함유할 수 있다.
일반적으로, 소화된 화합물의 대사산물 및 또한 화합물의 분해 생성물은 샘플 중에서 검정될 수 있다. 대사산물은 소화된 상기 화합물을 지닌 대상체로부터 취한 샘플 중에서 검정될 수 있다. 분해 생성물은 상기 분해 생성물을 함유하는 화합물 또는 용액으로부터 취한 샘플 중에서 검정될 수 있다. 이러한 검정은 예를 들면, 샘플 중에서 상기 대사산물 또는 분해 생성물의 존재 및 양을 측정하기 위해 사용될 수 있다.
고도의 민감성, 정밀성, 및 재생산성으로 PEG 대사산물 및 PEG 분해 생성물을 검출하고 정량화하기 위한 화합물 및 방법이 본원에 제공된다. PEG 대사산물의 검출은 소화된 PEG를 지닌 개체의 체내에서 PEG 대사산물의 존재를 평가하는데 유용할 수 있다. PEG 분해 생성물을 검출하는 것은 PEG 함유 화합물 또는 혼합물이 소화되기 전에 PEG 분해 생성물의 존재를 평가하는데 유용할 수 있다. 개체로부터 취한 샘플 중에서 대사산물을 검출하고 정량화하는 것은 일반적으로, 예를 들면, 물질 또는 이의 대사산물의 독성을 측정하는데 유용할 수 있다. 유사하게, 예를 들면, 물질의 분해 생성물을 검출하고 정량화하는 것은 예를 들면, 물질 및 이의 분해 생성물의 독성을 측정하는데 유용하다.
본원에는 화합물을 검출하여 정량화하는 방법이 기술되어 있다. 당해 방법은 샘플을 수득하는 단계를 포함하며, 여기서, 당해 샘플은 에틸렌 글리콜 및 디에틸렌 글리콜 중 하나 이상을 함유한다. 샘플은 수성 수산화물 함유 염의 존재 하에서 수성 펜타플루오로벤조일 클로라이드와 합함으로써 펜타플루오로벤조에이트 에스테르 유도체를 포함하는 수용액을 생성한다. 액체 상 상층액은 수용액으로부터 분리되며, 상층액은 액체 크로마토그래피 및 질량 분광계(LC/MS)를 사용하여 분석함으로써 둘 다 생산되었던 펜타플루오로벤조에이트 에스테르 유도체를 검출하함으로써 펜타플루오로벤조에이트 에스테르 유도체를 검출하고 정량화한다.
개체로부터 수득된 샘플은 소화된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 지닌 개체로부터 취한 표본을 포함할 수 있다. 소화된 PEG를 지닌 개체로부터 수득된 표본은 체액 샘플의 조직 샘플을 포함할 수 있다. 조직 또는 체액 샘플은 기관 또는 이의 일부, 혈액, 혈장, 소변, 대변 샘플, 뇌척수액 또는 다른 조직 또는 체액을 포함할 수 있다.
기술된 방법에 사용된 펜타플루오로벤조일 클로라이드는 헥산 중에 용해시킬 수 있다. 수산화물 함유 염은 수산화나트륨을 포함할 수 있다. 사용된 수산화물 염이 수산화나트륨인 경우, 이는 5M 농도를 포함할 수 있다. 또한, 수산화물 함유 염은 수산화칼륨을 포함할 수 있다.
소화된 PEG를 지닌 개체로부터 수득된 샘플을 포함하는, 검정의 수용액은 약 100 내지 10,000ng/ml의 에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 에틸렌 글리콜은 샘플당 약 100ng/ml의 에틸렌 글리콜의 농도에서 정량화될 수 있다.
소화된 PEG를 지닌 개체로부터 수득된 샘플을 포함하는, 검정의 수용액은 약 20 내지 2,000ng/ml의 디에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 디에틸렌 글리콜은 샘플당 약 20ng/ml의 에틸렌 글리콜의 농도에서 정량화될 수 있다.
검정의 분리 단계는 수용액을 원심분리하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 검정은 상기 수용액을 스냅 동결(snap freezing)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
사용된 LC/MS 방식은 음성 화학 이온화 방식을 포함할 수 있다.
펜타플루오로벤조에이트 에스테르 유도체 생성물은 에탄-1,2-디일 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)를 포함할 수 있으며, 에탄-1,2-디일 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)는 0.8 내지 1.4분의 보유 시간(retention time)을 가질 수 있다. 보다 구체적으로, 에탄-1,2-디일 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)는 보유 시간이 약 1.05분일 수 있다.
펜타플루오로벤조에이트 에스테르 유도체 생성물은 2,2'-옥시비스(에탄-2,1-디일)비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)를 포함할 수 있으며, 2,2'-옥시비스(에탄-2,1-디일) 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)는, 보유 시간이 0.8 내지 1.4분이다. 보다 구체적으로, 2,2'-옥시비스(에탄-2,1-디일)비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)는, 보유 시간이 약 0.96분일 수 있다.
또한, 에탄-1,2-디일 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)를 포함하는 화합물이 본원에 기술되어 있다. 에탄-1,2-디일 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)는, 액체 크로마토그래피 보유 시간이 0.8 내지 1.4분일 수 있다. 보다 구체적으로, 에탄-1,2-디일 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)는, 액체 크로마토그래피 보유 시간이 약 1.05분일 수 있다.
또한, 에탄-1,2-디일 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)를 포함하는 화합물이 본원에 기술되어 있다. 2,2'-옥시비스(에탄-2,1-디일)비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)는, 액체 크로마토그래피 보유 시간이 0.8 내지 1.4분일 수 있다. 보다 구체적으로, 2,2'-옥시비스(에탄-2,1-디일) 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)는, 액체 크로마토그래피 보유 시간이 약 0.96분이다.
참고에 의한 포함
본 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허, 및 특허원은, 각각의 개개 공보, 특허, 또는 특허원이 참고에 의해 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 나타내는 경우와 동일한 정도로 참고에 의해 본원에 포함된다.
개개 문제의 신규 특징은 첨부된 청구범위에 특수성과 함께 설정되어 있다. 본 발명의 특징 및 장점의 보다 나은 이해는 예증적 구현예에 설정된 다음의 상세한 설명을 참고로 수득될 것이며, 여기서 본 발명의 원리가 활용되고, 이의 첨부된 도면은 다음과 같다:
도 1은 샘플 중에서 PEG 대사물질 또는 PEG 분해 생성물을 정밀하게 검출하고 정량화하기 위한 예시적인 방법의 개략도를 나타내고;
도 2는 유도체화제 펜타플루오로벤조일 클로라이드의 화학 구조를 나타내며;
도 3은 유도체 생성물 에탄-1,2-디일 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)를 생산하는 화학 공정의 개략도를 나타내고;
도 3a는 유도체 생성물 2,2'-옥시비스(에탄-2,1-디일) 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)를 생산하는 화학 공정의 개략도를 나타내며;
도 4는 유도체 생성물 에탄-1,2-디일 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)의 크로마토그램의 예를 나타내고;
도 5는 유도체 생성물 2,2'-옥시비스(에탄-2,1-디일) 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)의 크로마토그램의 예를 나타내며;
도 6은 공지된 양의 에틸렌 글리콜에 대한 교정 데이타의 예시적인 표를 나타내고;
도 7은 공지된 양의 디에틸렌 글리콜에 대한 교정 데이타의 예시적인 표를 나타낸다.
본원에 상세히 개시된 개개 문제를 기술하기 전에, 개개 문제는 이의 출원을 다음의 설명에 설정되거나, 도면에 나타낸 구조, 실험, 예시적인 데이타, 및/또는 성분의 배열로 한정하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 기술된 주제는 다른 변화를 포함할 수 있으므로, 본원에 기술된 변화는 어떠한 방식으로도 설명의 개개 문제의 영역을 한정하는 것으로 고려되어서는 안된다. 또한, 본원에 사용된 어법 및 전문용어는 설명의 목적만을 위한 것이며 어떠한 방식으로도 한정하는 것으로 고려되어서는 안된다.
기술된 주제의 구현예의 다음의 상세한 설명에서, 다수의 구체적인 세부사항은 본 발명의 개념의 보다 완전한 이해를 제공하기 위해 설정된다. 그러나, 당해 분야의 통상의 기술자에게는, 개시내용 내의 본 발명의 개념이 이들 구체적인 세부사항없이 실시될 수 있음이 명백할 것이다. 다른 예에서, 잘-공지된 특징은 본 개시내용을 불필요하게 복잡하도록 하지 않기 위해 상세히 기술되어 있지 않다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "대상체"는 사람 또는 어떠한 동물 종도 포함할 수 있다.
추가로, 달리 표현하여 기술하지 않는 한, "또는"은 포괄적인 또는 을 말하며 배타적인 또는 이 아니다. 예를 들면, 조건 A 또는 B는 다음 중의 어느 하나에 의해 만족된다: A는 사실(또는 존재)이고 B는 거짓(또는 부재)이고, A는 거짓(또는 부재)이고 B는 사실(또는 존재)이며, A 및 B 둘 다는 사실(또는 존재)이다.
또한, 단수("a" 또는 "an")의 사용은 본원의 구현예의 요소들 및 성분들을 기술하기 위해 사용된다. 이는 단지 편의성을 위해서 및 본 발명의 개념의 일반적인 의미를 제공하기 위해 수행된다. 당해 설명은 하나 또는 적어도 하나를 포함하는 것으로 판독되어야 하며 단수는 또한 이것이 다른 것을 의미함이 명백하지 않는 한, 복수를 포함한다.
최종적으로, 본원에 사용된 것으로서, "일 구현예" 또는 "구현예"에 대한 어떠한 참고도, 구현예와 관련하여 기술된 특수한 요소, 특성, 구조, 또는 특징이 적어도 하나의 구현예에 포함됨을 의미한다. 명세서내 다양한 위치에서 어구 "하나의 구현예에서"의 출현은 동일한 구현예를 모두 필수적으로 언급하지 않는다.
본원에는 개체의 조직 또는 체액 샘플 속의 PEG 대사물질 및 또한 생성물 또는 용액이 소화되기 전에 PEG 함유 생성물 또는 용액 중에 존재할 수 있는 PEG 분해 생성물을 검출하고, 확인하여, 정량화하기 위한 검정 및 화합물이 기술되어 있다.
PEG 대사산물은 PEG를 섭취하는 개체의 소화계를 통해 흡수될 수 있는 PEG의 물질대사 생성물이다. 일반적으로, 일단 대사물질이 소화계를 통해 흡수되면, 대사물질은 예를 들면, 신체를 통해 순환되거나 특수한 기관 중에 농축된다. 본원에 기술된 검정 및 화합물은 섭취한 PEG를 지닌 개체의 조직 또는 체액 샘플 중에서 PEG 대사산물을 검출하여 정량화함으로써, 예를 들면, 소화된 PEG를 지닌 개체에서 흡수된 PEG 대사산물의 분포를 연구하는데 사용될 수 있다.
PEG 분해 생성물은 PEG로부터 생성되는 화학물질 및 화합물이다. 이러한 분해 생성물은 예를 들면, PEG의 분해의 결과로서 생성될 수 있다. 예를 들면, PEG 화합물을 포함하는 치료제는 PEG의 분해 생성물을 또한 포함할 수 있다. 이들 분해 생성물은, PEG 함유 치료제가, 예를 들면 약국에서 선반 위에 있는 경우 존재할 수 있다.
PEG는 화학식 H-(0-CH2-CH2)n-OH를 갖는 에틸렌 옥사이드의 중합체이다. PEG 변이체는 여기에 함유된 에틸렌 옥사이드 분자의 숫자 "n"에 의해 서로 구조적으로 상이하다. 에틸렌 옥사이드 단위의 숫자 "n"이 증가함에 따라, PEG 분자의 분자량도 증가한다.
PEG 변이체는 흔히 이들의 평균 분자량을 나타내는 숫자와 함께 나타낸다. 예를 들면, PEG 3350은, 평균 분자량이 3350 달톤(Dalton)인 PEG 화합물을 나타낸다.
분자량이 상이한, 상이한 PEG 화합물은 의학 및 상업적 응용을 포함하는 다양한 적용에 사용된다. 예를 들면, PEG 3350은 다수의 경구 및 직장 투여된 완하제 속의 활성 약제학적 성분으로서 사용된다. PEG 3350은 또한 직장경검사를 포함하는 다수의 의학 및 외과 수술에서 장을 세척하거나 자극하는데 사용된 장 제제 제형 속의 활성 약제학적 성분이다.
PEG 3350의 작용 메카니즘은 개체의 GI 관내로 유액의 삼투성 드로윙(osmotic drawing)이다. PEG의 작용에 의해 GI 관내로 드로윙된 GI 관 속의 증가된 유액은 개체의 대변 중에 보유되므로, 개체의 대변이 부드러워진다. 개체의 GI 관내 유액의 증가된 양은 또한 GI 관을 효과적으로 세정한다.
개체에 의해 경구 섭취된 PEG는 전형적으로 소화관 중에서 흡수됨으로써 개체의 조직 또는 체액 중에서 발견될 수 있는 대사산물로 분해된다.
개체의 조직 또는 체액 중에서 발견된 PEG 대사산물을 검출 및 정량화하는 것은 이의 표적화된 활성 부위(즉, GI 관)를 넘어선 개체의 신체 전체를 통한 PEG의 분포에 관한 정보를 제공한다.
유사하게, 생성물 또는 PEG를 함유하는 용액 중에서 PEG 분해 생성물을 검출하고 정량화하는 검정은 이러한 PEG 함유 생성물 또는 용액 중에서 잠재적으로 독성인 PEG 분해 생성물에 관한 정보를 제공한다. 예를 들면, PEG를 함유하는 치료제 또는 PEG를 함유하는 식품은 검정을 사용하여 검출하고 정량화할 수 있는 PEG 분해 생성물의 양을 함유할 수 있다.
PEG 대사산물의 예의 비-제한적 목록은 에틸렌 글리콜, 디에틸렌 글리콜, 글리콜산, 및 디글리콜산을 포함할 수 있다. 이들 PEG 대사산물은 예를 들면, 소화된 PEG를 지닌 개체의 혈액 또는 GI 시스템 중에서 발견될 수 있으며, 여기서, GI 시스템은 GI 시스템의 모든 기관, 및 또한 예를 들면, 담즙, 소화 효소, 및 대변과 같은 GI 생성물을 포함할 수 있다. PEG 대사산물은 또한 예를 들면 모든 기관, 혈액, 혈장, 림프, 타액, 뇌척수액, 소변, 및 땀을 포함하는 예를 들면, 개체의 어떠한 조직 또는 체액에서도 발견될 수 있다.
PEG 분해 생성물의 예의 비-제한적인 목록은 에틸렌 글리콜, 디에틸렌 글리콜, 글리콜산, 및 디글리콜산을 포함한다. 이들 분해 생성물은 PEG 함유 화합물 및 혼합물 중에서 발견될 수 있다. 예를 들면, PEG 분해 생성물은 PEG를 포함하는 치료학적 화합물을 포함하는 샘플 중에서 검정될 수 있다. 예를 들면, PEG 분해 생성물은 PEG 만을 실질적으로 포함하는 샘플 중에서 검정될 수 있다. 예를 들면, PEG 분해 생성물은 PEG와 함계 혼합된 식품 또는 PEG와 함께 식품을 포함하는 성분과 함께 혼합함으로써 제조된 식물 중에서 검정될 수 있다.
소화된 PEG를 지닌 개체의 조직 또는 체액은 예를 들면, 상기 대상체로부터 혈액 샘플을 수득함으로써 샘플링될 수 있다. 개체의 조직은 예를 들면, 전체 기관 또는 생검을 포함할 수 있는, 상기 대상체로부터의 기관 표본을 수득함으로써 샘플링될 수 있다. 소화된 PEG를 지닌 개체의 체액은 예를 들면, 상기 대상체로부터 담즙 샘플, 소변 샘플, 또는 다른 체액 샘플을 수득함으로써 샘플링될 수 있다.
일단 수득되면, 조직 또는 체액 샘플은 본원에 기술된 분석 방법 및 화합물을 사용하여 상이한 방식으로 분석될 수 있다. 예를 들면, PEG 대사산물 에틸렌 글리콜은 소화된 PEG를 지닌 개체의 혈액 샘플내에서 고도의 민감성, 정밀성, 및 재생산성으로 본원에 기술된 분석 방법 및 화합물을 사용하여 검출되고 정량화될 수 있다.
PEG 샘플을 함유하는 생성물 중에서 분해 생성물에 대한 샘플링의 경우에는 예를 들면, 적합한 용매 중에서 PEG 함유 화합물을 용해시켜 수득할 수 있다. PEG 함유 화합물을 우선 PEG 함유 화합물의 파쇄 및 분쇄를 포함하는 다른 수단에 의해 파쇄시키거나 크기를 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 다음 단계들을 포함한다. 조직 또는 유액 샘플(또는 다수의 조직 또는 체액 샘플)을 소화된 PEG를 지닌 개체로부터 수집한다. PEG 대사산물은 샘플로부터 추출될 수 있다. 샘플 또는 추출된 대사산물을 이후에 유도체화제와 반응시켜 PEG 대사산물 및 유도체화제 둘 다를 포함하는 생성물 화합물을 형성시킨다. 이후에, 생성물 화합물을 예를 들면 샘플을 원심분리함으로써 샘플로부터 분리하여 PEG 대사산물에 결합된 유도체화제를 포함하는 새로이 형성된 화합물을 포함하는 상층액 층을 생성시킨다. 상층액을 분리하고, 트레이(tray) 중에 두고, 액체 크로마토그래피 컬럼 및 질량 분광계(즉, LC/MS)를 통과시켜 2D 크로마토그램을 생성시킨다. 2D 크로마토그램은 각각의 PEG 대사산물 각각에 대한 양호하게 예측가능한 보유 시간으로 판독물을 제공한다. 공지된 양의 PEG 대사산물에 대한 판독물을 포함하는 교정 데이타를 생성시킨다. 교정 샘플의 반응을 이들 각각의 농도에 대해 플롯팅하고 이후에 점들을 이의 반응이 공지된 경우 미지의 샘플의 농도를 측정하기 위해 사용될 수 있는 방정식으로 조정한다. 이후에, 교정 데이타를 사용하여 PEG를 소화한 대상체로부터 수득한 다양한 샘플 중에서 미지의 대사산물 양을 정량화한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 다음의 단계를 포함한다. PEG 함유 화합물(예를 들면, PEG 함유 치료학적 생성물)의 샘플을 수득한다. PEG 분해 생성물을 샘플로부터 추출할 수 있다. 샘플 또는 추출된 PEG 분해 생성물을 이후에 유도체화제와 반응시켜 PEG 분해 생성물 및 유도체화제 둘 다를 포함하는 생성물 화합물을 형성시킬 수 있다. 이후에, 생성물 화합물을 예를 들면, 샘플을 원심분리함으로써 샘플로부터 분리하여 PEG 대사산물에 결합된 유도체화제를 포함하는 새로이 형성된 화합물을 포함하는 상층액 층을 생성시킨다. 상층액을 분리하고, 트레이에 두고, 액체 크로마토그래피 컬럼 및 분광 광도계(즉, LC/MS)를 통과시켜 2D 크로마토그램을 생성한다. 2D 크로마토그램은 각각의 PEG 대사산물 각각에 대해 양호하게 예측가능한 보유 시간으로 판독물을 제공한다. 공지된 양의 PEG 대사산물에 대한 판독물을 포함하는 교정 데이타가 생성된다. 교정 샘플의 반응을 이들 각각의 농도에 대해 플롯팅한 후 점들을 이의 반응이 공지되어 있는 경우 미지의 샘플 농도를 측정하는데 사용될 수 있는 방정식을 사용하여 조정한다. 이후에, 교정 데이타를 PEG를 소화한 대상체로부터 수득한 다양한 샘플 중에서 미지의 대사산물 양을 정량화하는데 사용한다.
기술한 바와 같이, 2D LC/MS 크로마토그램은 물질의 보유 시간(크로마토그래피 사용) 및 강도(질량 분광계를 사용)를 포함할 수 있다. 샘플이 크로마토그래피 컬럼을 통과하는데 걸리는 시간은 일반적으로 물질의 보유 시간으로 공지되어 있다.
샘플 물질의 보유 시간은 컬럼을 통해 물질을 이동시키는데 사용된 컬럼의 특성 및 조건에 적어도 부분적으로 의존하여 컬럼에 따라 유의적으로 변할 수 있다.
보유 시간은 전형적으로 2D LC/MS 크로마토그램의 x-축에서 측정한다. 물질의 보유 시간은 물질의 극성에 의해 적어도 부분적으로 측정할 수 있다. LC 컬럼에서 물질의 보유 시간은 일반적으로 가스 크로마토그래피(GC)와 같은 다른 일반적인 크로마토그래피 방법으로 수득된 것보다 더 짧다.
질량 분광분석법에서 물질의 강도는 물질의 이온화 효능에 의해 적어도 부분적으로 측정할 수 있다.
강도는 전형적으로 2D LC/MS 크로마토그램의 y-축에서 측정한다. 전자분무 이온화(ESI)와 같은 LC/MS에 대해 일반적인 이온화 방법은 물질의 강력한 단편화를 생성하는 GC에 사용된 고-에너지 이온화 방법과는 대치되는 것으로서, 물질의 완전한 분자를 생성한다.
일반적으로, PEG 대사산물 및 PEG 분해 생성물 함유 샘플은 PEG 대사산물 및 PEG 분해 생성물의 질량 대 전하 비 및 극성과 유사한 것들을 갖는 다수의 다른 물질을 포함함으로써 생산되는 크로마토그램에서 조직 샘플 중에 함유된 다른 물질들로부터 분석될 물질을 분리하는 것을 어렵게 한다. 즉, 유사한 극성 및 질량 대 전하 비를 갖는 물질은 다른 물질에 의해 생성된 배경 노이즈(background noise)로부터 목적한 물질을 확인하는 것을 어렵게 할 수 있는 배경 노이즈를 생성하는 2D 크로마토그램의 동일한 분획 주변에 무리를 이룰 것이다. LC/MS에서 배경 노이즈는 조직 또는 체액 샘플 중에서 PEG 대사산물을 분석하는 경우 문제가 된다.
물질은 예를 들면, 당해 물질을 유도체화제에 결합시켜, 물질 단독보다 상이한 보유 시간 또는 강도를 갖는 새로운 화합물(유도체화제에 결합된 물질을 포함함)을 생성함으로써 LC/MS에서 배경 노이즈로부터 분리될 수 있다. 예를 들면, 이를 유도체화 시약과 반응시켜 분석될 목적한 물질을 화학적으로 개질시키는 것은 화학적으로 개질된 물질의 극성에 영향을 미침으로써 물질의 보유 시간에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 목적한 물질과 유도체화 시약의 반응은 또한 화학적으로 개질된 물질의 질량에 영향을 미침으로써 질량 분광기에서 측정된 질량 대 전하 비 및 물질의 강도에 영향을 미친다. 즉, 유도체화제와 목적한 물질의 생성물은 자체적으로 목적한 물질과 상이한 특성을 가지므로 유도체화제와 목적한 물질의 생성물은 샘플 중에서 다른 물질의 존재에 의해 생성된 배경 노이즈로부터 제거된 2D 크로마토그래피 상의 외관을 가질 수 있다. 즉, 유도체화제와 목적한 물질의 생성물은 특정의 분석 플랫폼에서 물질 단독보다 더 높은 민감성으로 검출되고 정량화될 수 있다.
유도체화제와 에틸렌 글리콜 및 디에틸렌 글리콜과 같은 PEG 대사산물의 화학 생성물은 PEG 대사산물 및 PEG 분해 생성물의 LC/MS를 보다 민감하고 재생가능하도록 한다. 대사산물 또는 분해 생성물의 유도체화제에 대한 결합은, 대사산물의 화학적 개질이 표본 중에서 다른 물질에 의해 생성된 배경 노이즈로부터 대사산물을 적어도 분리하기 때문에, LC/MS를 보다 민감하고 재생가능하도록 한다. 예를 들면, 에틸렌 글리콜 또는 디에틸렌 글리콜과 유도체화 시약 사이의 반응은 물질 단독보다 더 높은 보유 시간을 지닌 생성물을 형성하므로, 생성물은 일반적으로 단독으로 나타날 수 있는 PEG 대사산물보다 x-축을 따라 추가의 위치에서 크로마토그램에 나타날 수 있다. 유사하게, 에틸렌 글리콜 또는 디에틸렌 글리콜과 유도체화 시약 사이의 반응은 질량 분광분석법에서 보다 큰 강도를 지닌 생성물을 형성하므로 일반적으로 단독으로 나타날 수 있는 PEG 대사산물보다 y-축을 따라 추가로 나타난다.
펜타플루오로벤조일 클로라이드는 NaOH의 존재하에서 PEG 대사산물 및 PEG 분해 생성물과 반응하여 펜타플루오로벤조에이트 에스테르 유도체를 생성하는 분자이다. 전형적으로, 2개의 펜타플루오로벤조일 클로라이드 분자는 단일의 에틸렌 글리콜 분자 또는 단일의 디에틸렌 글리콜 분자와 반응한다. 펜타플루오로벤조일 클로라이드는 다수의 불소 원자를 함유하며, 이는 2개의 펜타플루오로벤조일 클로라이드 분자와 음성-방식의 화학 이온화(NCI) 액체 크로마토그래피와 함께 사용하기에 최적인 단일의 PEG 대사산물 또는 PEG 분해 생성물의 고 불소 함유 생성물을 만든다. NCI는 고 전자 포획 효능을 지닌 물질에 대해 효과적인 이온화 방법이며, 할로겐 원자의 고 전기음성도로 인하여, 할로겐 원자를 함유하는 화합물은 고 전자 포획 효능을 소유할 수 있다. 따라서, NCI는 PEG 대사산물 또는 PEG 분해 생성물과 펜타플루오로벤조일 클로라이드의 반응 생성물 중에서 불소의 존재로 인해 PEG 대사산물 및 PEG 분해 생성물 검정의 민감성을 최적화하는데 효과적이다.
본원에 기술된 검정 방법은 또한 공지된 양의 PEG 대사산물 또는 PEG 분해 생성물에 대한 교정 데이타를 생성하는 것을 포함한다. 예를 들면, LC/MS 교정 데이타는, 충분한 교정 데이타가 생성될 때까지, 100ng/ml의 에틸렌 글리콜, 250ng/ml의 에틸렌 글리콜, 500ng/ml의 에틸렌 글리콜 등에 대해 수집될 수 있다. 미지의 양의 PEG 대사산물 또는 PEG 분해 생성물 에틸렌 글리콜을 포함하는 표본을 LC/MS에 이동시키는 경우, 공지된 양의 에틸렌 글리콜의 교정 값에 대한 비교는 샘플 중에 존재하는 에틸렌 글리콜의 양의 외삽을 허용할 것이다.
본원에 기술된 방법 및 화합물은 고도의 민감성, 정밀성, 및 재생능으로 PEG 대사산물 및 PEG 분해 생성물을 검출하고 정량화하기 위한 수단을 제공한다. 에틸렌 글리콜은 예를 들면, 약 100ng/ml 정도로 낮은 양의 샘플 중에서 정밀하게 검출되어 정량화될 수 있으며 디에틸렌 글리콜은 예를 들면, 약 20ng/ml 정도로 낮은 양으로 샘플 중에서 정밀하게 검출되고 정량화될 수 있다.
도 1은 샘플 중에서 PEG 대사산물 및 PEG 분해 생성물을 정밀하게 검출하고 정량화하기 위한 예시적인 방법 (100)의 개략도를 나타낸다. 단계 (102)에서, 샘플은 개체로부터 수득된다. 또한, 단계 (102)에서, 샘플은 PEG 함유 화합물로부터 수득될 수 있다. 대상체는 사람 및 동물 대상체 둘 다를 포함할 수 있다. 기술된 방법과 함께 사용하기에 적합한 광범위한 샘플 유형은 대상체 조직 및 체액 표본을 포함한다. 바람직하게는, 혈액 중에서 PEG 대사산물의 농도로서 분석될 수 있는 혈액 표본은 일반적으로 개체에서 PEG 대사산물의 전신계 분포도를 나타낼 수 있다. 그러나, 예를 들면, 뇌 척수액(CSF)과 같은 다른 샘플형 속에서 PEG 대사산물에 대한 검정은 CNS 노출을 반영할 수 있거나 담즙은 PEG 대사산물의 간 부하를 반영할 수 있다. 예를 들면, 소변 속에서 PEG 대사산물에 대한 검정은 또한 일반적으로 대사된 PEG의 양을 반영할 수 있다. 샘플은 개체로부터 직접 수득될 수 있거나, 샘플은 미리 동결되어질 수 있다. PEG 함유 화합물의 샘플은 실질적으로 PEG, PEG가 다른 화합물 또는 부형제에 결합되어 있는 화합물, 또는 PEG가 다른 물질과 함께 혼합되어 있는 화합물을 포함할 수 있다. 샘플이 이미 동결된 경우, 단계 (102)는 또한 주위 온도에서 상기 동결된 샘플을 해동시킴을 포함할 것이다.
단계 (104)에서, 샘플은 예를 들면, 와동(vortex)에 의해 혼합하여, 샘플의 성분들이 샘플 전체에 균일하게 분포되도록 한다.
단계 (106)에서, 샘플은 바이알, 튜브, 또는 다른 유사한 용기로 이전될 수 있다. 또한, 표준 샘플, 및 블랭크(blank)는 또한 각각의 튜브에 가해진다. 따라서, 각각의 검정은 다수의 바이알을 포함할 수 있다. 다수의 바이알은 각각 상이한 샘플, 표준 샘플, 및 블랭크를 함유할 수 있다.
단계 (108)에서, 작업 내부 표준은 검정에 사용된 바이알 모두에 가해진다.
단계 (110)에서, 물은 임의로 동일한 측정으로 다수의 바이알 각각에 첨가된다. 첨가된 물의 양은 예를 들면, 150μL를 포함할 수 있다.
단계 (112)에서, 수산화물 함유 염은 검정에 사용된 다수의 바이알에 가해진다. 본원에 기술된 검정에 사용하기에 적합한 수산화물 함유 염의 비-제한적 예는 수산화나트륨 및 수산화칼륨을 포함한다. 수산화염(salt hydroxide) 함유 염은 바람직하게는 검정에서 사용된 다수의 바이알에 첨가하는 경우 용액 중에 이미 존재한다. 수산화나트륨을 사용하는 경우 약 5M NaOH의 용액이 바람직하지만, 다른 몰농도도 당해 분야의 숙련가에 의해 이해될 것으로서 적합하다. 다수의 바이알 각각에 첨가된 5M NaOH의 양은 예를 들면 약 200μL를 포함할 수 있다.
단계 (114)에서, 물은 다수의 바이알 각각에 동일한 용적으로 임의로 첨가된다. 첨가된 물의 양은 예를 들면, 다수의 바이알에 첨가된 수산화물 함유 염의 몰농도를 강하시킬 용적의 물을 포함할 수 있다.
단계 (116)에서, 유도체화제는 다수의 바이알에 첨가된다. 바람직하게는, 유도체화제 펜타플루오로벤조일 클로라이드가 사용된다. 펜타플루오로벤조일 클로라이드는 헥산 중에 용해될 수 있지만, 다른 용매는 당해 분야의 지식을 가진 자에 의해 이해되기에 적합하다. 바람직하게는 헥산 중 1.00ml의 4% 펜타플루오로벤조일 클로라이드를 검정에 사용된 다수의 바이알 각각에 첨가한다. 유기 용매(펜타플루오로벤조일 클로라이드 함유)와 수성 용매의 조합은 2개의 비혼화성 액체 상을 포함하는 이상(biphasic) 액체 시스템을 생성한다. 당해 분야의 지식을 가진 자에 의해 본원에 기술된 검정 및 방법이 이상 액체 시스템 만으로 한정될 필요가 없으며 다른 다수상 액체 시스템이 또한 사용하기에 적합함이 이해될 것이다.
단계 (118)에서, 검정에 사용된 다수의 바이알은 바람직하게는 수평 진탕기(horizontal shaker)로 진탕시킨다. 수평 진탕기는 바람직하게는 다수의 바이알의 성분을 온화하게 진탕시키기 위해 최저 설정으로 세팅된다.
단계 (120)에서, 다수의 바이알이 원심분리된다. 바람직한 설정은 10℃에서 4,500rpm으로 20분 동안이다. 원심분리는 개체 또는 다수의 대상체로부터 수득된 샘플을 함유하는 바이알 중에 상층액을 생산한다. 형성된 상층액은 유도체화제 및 PEG 대사산물 또는 PEG 분해 생성물을 포함하는 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 펜타플루오로벤조일 클로라이드를 유도체화제로 사용하는 경우, 상층액은 펜타플루오로벤조에이트 에스테르 유도체를 포함한다.
단계 (122)에서, 다수의 바이알은 드라이 아이스 욕과 같은 냉욕 속에 둔 직 후, 원심분리하여 수성 층을 스냅 동결시킨다.
단계 (124)에서, 각각의 바이알로부터의 상층액은 자동샘플러 플레이트(autosampler plate)로 이전시킨다. 적합한 자동샘플러 플레이트는 예를 들면, 96웰의 1mL 자동샘플러 플레이트를 포함할 수 있다.
단계 (126)에서, 자동샘플러 플레이트 속의 샘플은 자동샘플러 플레이트를 예를 들면, 45℃ 및 60L/분으로 설정된 증발기 속에 샘플이 건조될 때까지 둠으로써 건조시킬 수 있다.
단계 (128)에서, MeOH를 각각의 웰(well)에 가하고, 자동샘플러 플레이트를 플레이트 와동기로 와동시킬 수 있다.
단계 (130)에서, 샘플은, 표준물, 및 블랭크와 함께 LC-MS/MS를 사용하여 분석한다.
도 2는 유도체화제 펜타플루오로벤조일 클로라이드의 화학 구조를 나타낸다. 일반적으로, 유도체화는 화학적 화합물을 유도체라고 불리는 유사한 화학 구조의 생성물(반응 유도체)로 전환시키는 화학에 사용된 기술이다. 유도체는 유도체화되지 않는 화학적 화합물보다 상이한 화학적 특성을 가질 수 있다. 유도체화는 예를 들면, 화학적 화합물의 융점 또는 비등점, 가용성, 또는 반응성에 영향을 미칠 수 있다.
전통적인 GC-MS/MS 시도를 사용한 에틸렌 글리콜(EG) 및 디에틸렌 글리콜(DEG) 단독에 대한 생물분석 검정은 전자 이온화에 의해 필요한 민감성을 가지지 않는다. 또한, 관찰된 단편의 저 분자량은 챌린지(challenge)를 다수의 반응 모니터링(MRM)함으로써 분석하도록 할 것이다.
PEG 대사산물 또는 분해 생성물은 펜타플루오로벤조일 클로라이드로 유도체화하여 음성-방식 화학적 이온화(NCI)를 사용하여 LC/MS로 분석을 적어도 부분적으로 촉진시킬 수 있었다. 펜타플루오로벤조일 클로라이드는 다수의 불소 원자를 함유하며, 불소는 할로겐이다. 할로겐 원자의 고 전기음성도로 인하여, 할로겐 함유 화합물은 NCI를 사용한 분석에 특히 적합하다.
도 3 및 3a는 각각의 PEG 대사산물 또는 분해 생성물의 유도체화된 생성물을 생성하는 화학 반응물을 나타낸다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 에틸렌 글리콜을 NaOH의 존재하에서 펜타플루오로벤조일 클로라이드와 혼합하는 경우, 반응은 단일의 에틸렌 글리콜 분자에 결합된 2개의 펜타플루오로벤조일 클로라이드를 포함하는 유도 생성물 에탄-1,2-디일 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)를 생산한다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, 디에틸렌 글리콜을 NaOH의 존재하에서 펜타플루오로벤조일 클로라이드와 혼합하는 경우, 반응은 단일의 디에틸렌 글리콜 분자에 결합된 2개의 펜타플루오로벤조일 클로라이드를 포함하는 유도 생성물 2,2'-옥시비스(에탄-2,1-디일)비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)를 생산한다.
도 4는 100ng/ml를 포함하는 공지된 출발 농도의 에틸렌 글리콜로부터 생성된 유도체화 생성물 에탄-1,2-디일 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)의 크로마토그램의 예를 나타낸다. 크로마토그램 곡선의 정점에 상응하는 x-축을 따른 점은 에탄-1,2-디일 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트) 402의 보유 시간이다. 도 4의 예에서, 에탄-1,2-디일 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)의 보유 시간은 대략 1.05분이다. 크로마토그램 곡선의 정점에 상응하는 y-축에 따른 점은 에탄-1,2-디일 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트) 402의 강도이다. 도 4의 예에서, 에탄-1,2-디일 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)의 강도는 대략 24600 CPS이다.
도 5는 20ng/ml를 포함하는 공지된 출발 농도의 디에틸렌 글리콜로부터 생성된 유도체화 생성물 2,2'-옥시비스(에탄-2,1-디일) 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)의 크로마토그램의 예를 나타낸다. 크로마토그램 곡선의 정점에 상응하는 x-축에 따른 점은 2,2'-옥시비스(에탄-2,1-디일) 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트) 502의 보유 시간이다. 도 4의 예에서, 2,2'-옥시비스(에탄-2,1-디일) 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)의 보유 시간은 대략 0.96분이다. 크로마토그램 곡선의 정점에 상응하는 y-축에 따른 점은 2,2'-옥시비스(에탄-2,1-디일) 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트) 504의 강도이다. 도 5의 예에서, 에탄-1,2-디일 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)의 강도는 대략 8790 CPS이다.
도 6은 공지된 양의 에틸렌 글리콜에 대한 교정 데이타의 예시적인 표를 나타낸다. 교정 데이타는 소화된 PEG를 지닌 개체로부터 수득된 샘플 중에서 에틸렌 글리콜의 양을 정량화하기 위해 적어도 부분적으로 사용된다. 본원에 기술된 검정의 민감성은 약 100 내지 10,000ng/ml의 에틸렌 글리콜의 범위내에서 에틸렌 글리콜의 양을 정량화하는데 가장 최적이다.
도 7은 공지된 양의 디에틸렌 글리콜에 대한 교정 데이타의 예시적인 표를 나타낸다. 교정 데이타는 소화된 PEG를 지닌 개체로부터 수득된 샘플 내의 디에틸렌 글리콜의 양을 정량화하기 위해 적어도 부분적으로 사용된다. 본원에 기술된 검정의 민감성은 전형적으로 약 20 내지 2,000ng/ml의 디에틸렌 글리콜의 범위내에서 에틸렌 글리콜의 양을 정량화하는데 가장 최적이다.
추가의 세부사항은 다음의 비-제한적인 실시예 단락에 의해 나열된다.
실시예
이의 목적이 시판되는 참고 생성물과 비교하여 시험 제형 중에서 PEG 대사산물의 정량화와 함께 PEG 3350의 흡수율 및 경구 생이용율을 비교하기 위한 연구를 완료하였다. 본원에 기술된 바와 같은 조성물 및 방법을 사용하여 연구에서 PEG 대사산물 디에틸렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜을 검정하였다.
총 14명의 대상체를 본 연구에 포함시켰으며, 이들 대상체중 12명(85.7%)이 연구를 완료하였다. 이는 개방-표지되고, 무작위처리되며, 서열분석된, 2-기간, 2-처리 교차 연구였으며, 여기서 12명의 건강한 대상체에게 1 주기에서 시험 제형을 및 다른 주기에서 시판되는 생성물의 별개의 투여량을 제공하였다.
대상체에게 1 주기 동안 14시간에 걸쳐 5개 투여량의 처리 A, 시험 제형을 투여하고 1주기에서 3시간에 걸쳐 단일 투여량의 치료 B, 시판되는 생성물을 투여하였다. 처리 둘 다는 무작위적이었고, 순차적인 양식으로 투여하였다.
혈액 샘플을 시험 대상체로부터 수득하고 평가하여 각각의 처리: 에틸렌 글리콜(EG) 및 디에틸렌 글리콜(DEG) 후 PEG 3350 및 다음의 가능한 PEG 3350 대사산물의 약동학적 프로파일 및 노출을 측정하였다.
디에틸렌 글리콜( DEG )
대부분의 샘플에서, DEG의 혈장 농도는 정량 한계 이하(BLQ, <40.0 ng/mL)였다. DEG의 정량화가능한 농도는 시험 제형의 투여 후 3명의 대상체에 대해서만 관찰되었다: 대상체 1903(2개의 샘플), 대상체 1905(3개의 샘플), 및 대상체 1916(3개의 샘플); 이들의 농도는 정량화 하한치(LLOQ)보다 약간 높고 40.9 내지 47.5ng/mL의 범위였다. ECP를 투여받은 다른 9명의 대상체 및 시판되는 생성물을 투여받은 12명의 대상체에 대한 DEG의 모든 다른 혈장 농도는 BLQ이었다. 이들의 제한된 정량화가능한 데이타로 인하여, DEG는 약동학적 분석에 포함되지 않았다. 따라서, 이들 데이타는, 시판되는 생성물 또는 ECP 속의 PEG 3350이 DEG로 유의적으로 대사된다는 증거를 제공하지 않는다.
에틸렌 글리콜(EG)
에틸렌 글리콜의 평균 기본선 농도는 ECP 결장 제조 키트(ECP Colon Prep Kit) 및 시판되는 생성물에 대해 각각 602ng/mL 및 615ng/mL이었다. 정량화가능한 농도 EG는 처리 A, 시험 제형, 및 처리 B, 시판되는 생성물 둘 다의 투여 전 및 후에 모든 혈장 샘플에서 발견되었다. 연구 대상체에서 관찰된 EG 수준은 전체 샘플링 스케줄에 걸쳐 기본선(제로-시간) 값 이상으로 변하지 않았다.
본 연구의 12명의 대상체에서 관찰된 평균 EG 농도는 표 1에 나타낸다.
처리 A: 처리 B:
시험 제형 참고 생성물

시간(h)
n		 평균(ng/mL) SD(ng/mL)
CV%
n		 평균(ng/mL) SD(ng/mL)
CV%
0.00 12 602 60.7 10.08 12 615 54.7 8.90
0.50 12 600 39.1 6.52 - - - -
1.00 12 616 32.0 5.20 12 618 44.2 7.15
2.00 12 627 55.9 8.92 12 631 63.1 10.00
3.00 12 603 50.5 8.37 12 607 47.1 7.77
3.50 12 631 52.0 8.24 - - - -
4.00 - - - - 12 616 38.2 6.20
4.50 12 609 42.1 6.91 - - - -
5.00 12 620 44.8 7.23 12 612 54.2 8.86
5.50 12 668 75.6 11.32 - - - -
6.00 12 624 45.0 7.20 - - - -
7.00 - - - - 12 571 54.4 9.54
8.00 12 617 47.9 7.76 - - - -
9.00 - - - - 12 601 39.9 6.64
11.00 12 613 37.8 6.17 12 596 36.8 6.17
11.50 12 636 52.3 8.22 - - - -
12.50 12 623 40.1 6.43 - - - -
13.50 12 586 60.5 10.32 - - - -
15.00 - - - - 12 594 30.3 5.10
15.50 12 582 48.1 8.25 - - - -
17.50 12 594 43.7 7.37 - - - -
19.50 12 603 57.3 9.50 - - - -
21.00 - - - - 12 626 116 18.56
23.50 12 589 61.5 10.44 - - - -
27.00 - - - - 12 596 24.2 4.05
29.50 12 587 49.6 8.45 - - - -
35.50 12 584 39.4 6.74 - - - -
39.00 - - - - 12 594 28.2 4.74
47.50 12 590 32.7 5.54 - - - -
51.00 - - - - 12 583 39.6 6.78
59.50 12 583 39.9 6.84 - - - -
본 개개 문제의 바람직한 구현예를 본원에 나타내고 기술하였지만, 당해 분야의 숙련가에게는 이러한 구현예가 단지 예로만 제공됨이 명백할 것이다. 다수의 변형, 변화, 및 치환이 개개의 문제로부터 벗어나지 않고 당해 분야의 숙련가에게 이제 일어날 것이다. 본원에 기술된 개개의 문제의 구현예에 대한 다양한 대안이 본원에 기술된 개개 문제를 실시하는데 있어 사용될 수 있음이 이해되어야 한다. 다음의 청구범위는 본원에 기술된 개개 문제의 영역을 정의하며 이들 청구범위의 영역내 방법 및 구조 및 이들의 등가물은 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (29)

  1. PEG 3350을 함유하는 샘플을 수득하는 단계;
    상기 샘플, 수성 수산화물 함유 염, 및 유기 용매 중에 용해된 펜타플루오로벤조일 클로라이드를 합하여, 펜타플루오로벤조에이트 에스테르 유도체를 포함하는 이상(biphasic) 액체 시스템을 생산하는 단계;
    상기 이상 액체 시스템으로부터 액체상 상층액을 분리하는 단계; 및
    상기 상층액을 액체 크로마토그래피 및 질량 분광분석법(LC/MS)으로 분석하여 상기 펜타플루오로벤조에이트 에스테르 유도체의 보유 시간(retention time)을 검출하는 단계를 포함하며,
    상기 샘플 중의 에틸렌 글리콜이 샘플당 100 ng/ml 내지 500 ng/ml의 에틸렌 글리콜의 농도에서 상기 펜타플루오로벤조에이트 에스테르 유도체의 상기 보유 시간을 기준으로 정량화되며,
    디에틸렌 글리콜이 샘플당 20 ng/ml 내지 500 ng/ml의 디에틸렌 글리콜의 농도에서 상기 펜타플루오로벤조에이트 에스테르 유도체의 상기 보유 시간을 기준으로 정량화되는 것인,
    화합물을 검출하고 정량화하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 샘플이 소화된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 지닌 개체로부터 취한 표본을 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 표본이 혈액 표본을 포함하는, 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 표본이 소변 표본을 포함하는, 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 표본이 담즙 표본을 포함하는, 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 표본이 기관 표본을 포함하는, 방법.
  7. 제2항에 있어서, 상기 표본이 뇌척수액 표본을 포함하는, 방법.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 PEG 3350이 다른 화합물과 혼합된 것인, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 펜타플루오로벤조일 클로라이드가 헥산 중에 용해되는, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 수산화물 함유 염이 수산화나트륨을 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 수산화나트륨이 5M 수산화나트륨 용액을 포함하는, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 수산화물 함유 염이 수산화칼륨을 포함하는, 방법.
  14. 삭제
  15. 제1항에 있어서, 상기 펜타플루오로벤조에이트 에스테르 유도체를 정량화함을 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 에틸렌 글리콜이 샘플당 100 ng/ml의 에틸렌 글리콜의 농도에서 상기 펜타플루오로벤조에이트 에스테르 유도체를 기준으로 정량화되는, 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 디에틸렌 글리콜이 샘플당 20 ng/ml의 디에틸렌 글리콜의 농도에서 상기 펜타플루오로벤조에이트 에스테르 유도체를 기준으로 정량화되는, 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 이상 액체 시스템이 20 내지 2,000 ng/ml의 디에틸렌 글리콜을 포함하는, 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 분리 단계가 상기 이상 액체 시스템을 원심분리함을 포함하는, 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 이상 액체 시스템을 스냅 동결(snap freezing)시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 LC/MS가 음성의 화학 이온화 방식을 포함하는, 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 펜타플루오로벤조에이트 에스테르 유도체가 에탄-1,2-디일 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 에탄-1,2-디일 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)가 에틸렌 글리콜의 보유 시간보다 더 긴 보유 시간을 갖는, 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 펜타플루오로벤조에이트 에스테르 유도체가 2,2'-옥시비스(에탄-2,1-디일) 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)를 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 2,2'-옥시비스(에탄-2,1-디일) 비스(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤조에이트)가 디에틸렌 글리콜의 보유 시간보다 더 긴 보유 시간을 갖는, 방법.
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
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