KR102087786B1

KR102087786B1 - 항균 및 항암 기능을 가지는 물옥잠 분리 마이크로모노스포라 속 m2 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102087786B1
Application number: KR1020190101044A
Authority: KR
Inventors: 박상화; 정진우; 황용; 황병수; 남윤종; 장석원; 오영택
Original assignee: 국립낙동강생물자원관
Priority date: 2019-08-19
Filing date: 2019-08-19
Publication date: 2020-03-12

Abstract

물옥잠으로부터 분리된 균주로서 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) 또는 대장균(Escherichia coli)에 대한 항균 활성, 전립선암 또는 백혈병에 대한 항암 활성을 가지는 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) 균주와 이의 배양물, 이를 활용한 항균용 조성물 및 항암용 조성물이 개시된다. 본 발명은 수탁번호 KCTC 13851BP로 기탁된 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주와 이의 배양물, 이를 활용한 항균용 조성물 및 항암용 조성물를 제공한다.

Description

항균 및 항암 기능을 가지는 물옥잠 분리 마이크로모노스포라 속 M2 균주 및 이의 용도{Micromonospora sp. M2 isolated from Monochoria korsakowii in fresh water having antibacterial and anticancer activity and uses thereof}

본 발명은 항균 및 항암 기능을 가지는 미생물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항균 및 항암 기능을 가지는 물옥잠 분리 마이크로모노스포라 속 균주에 관한 것이다.

방선균의 한 속인 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) 미생물은 토양, 담수, 식물과 동물 공생 등 다양한 방식과 다양한 환경에 존재하는 하는 것으로 알려져 있다.

특히, 토양에서 분리된 마이크로모노스포라 속 미생물의 경우 유용 항균제를 생산하는 것으로 알려져 있어, 꾸준한 연구가 지속되어 왔다. 또한, 식물 근부에 공생하는 마이크로모노스포라 속 미생물의 경우에는 유용 효소의 보고이며, 공생체 내에서의 역할에 대한 연구가 진행중이다.

최근 산호, 해면 등 동물에 공생하고 있는 마이크로모노스포라 속 미생물들이 발견되었고, 이들이 항균, 항암 등의 신약개발 후보 물질을 생산하는 것으로 알려지기 시작하여, 해양 동물 공생 마이크로모노스포라 속 미생물의 연구가 활발히 지속되고 있다.

한편, 물옥잠은 외떡잎식물로 물옥잠과의 한해살이풀로 알려져 있으며, 한국, 일본, 중국, 러시아 등에 분포하며, 논이나 고인 얕은 물에서 자란다. 물옥잠은 민간요법에 의해 약초로 사용되고 있으며, 청열작용이 있어 해수, 천식이 있는 데 쓰이는 것으로 알려져 있다.

한국등록특허 제0163660호는 마이크로모노스포라 속 SA-246 균주를 이용한 항균-항암활성을 갖는 SAPH 유도체의 제조방법에 관해 개시하고 있으나, 물옥잠으로부터 분리된 마이크로모노스포라 속 균주가 특정 병원균에 대한 항균 활성을 가지거나, 특정 암종에 대한 항암 활성을 가지는 사실에 관해서는 언급하지 않고 있다.

이에 본 발명은 물옥잠으로부터 분리된 균주로서 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) 또는 대장균(Escherichia coli)에 대한 항균 활성, 전립선암 또는 백혈병에 대한 항암 활성을 가지는 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) 균주와 이의 배양물, 이를 활용한 항균용 조성물 및 항암용 조성물을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 수탁번호 KCTC 13851BP로 기탁된 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주를 제공한다.

또한, 상기 균주는 항균 또는 항암 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주를 제공한다.

또한, 상기 항균 활성은 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) 또는 대장균(Escherichia coli)에 대한 항균 활성인 것을 특징으로 하는 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주를 제공한다.

또한, 상기 항암 활성은 전립선암 또는 백혈병에 대한 항암 활성인 것을 특징으로 하는 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주를 제공한다.

또한, 상기 균주는 물옥잠으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주를 제공한다.

상기 다른 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 상기 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주의 배양물을 제공한다.

상기 또 다른 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 상기 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

상기 또 다른 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 상기 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따라 물옥잠에서 분리한 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주는 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) 또는 대장균(Escherichia coli)에 대한 항균 활성, 전립선암 또는 백혈병에 대한 항암 활성을 가지기 때문에, 향후 약학적 소재로 개발 가치가 높아 의약 관련 산업에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주(KCTC 13851BP)를 R2A 평판배지에 계대배양하여 순수배양 균주임을 확인한 결과를 나타낸 사진,
도 2는 본 발명에 따른 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주(KCTC 13851BP)의 16S rRNA 염기서열을 나타낸 도면,
도 3은 16S rRNA 염기서열에 기초한 본 발명에 따른 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주(KCTC 13851BP)의 분자생물학적 동정을 위한 계통도를 분석한 결과를 나타낸 도면,
도 4는 본 발명의 실시예에서 사용된 균주의 항균 활성 측정 결과를 나타낸 그래프,
도 5 내지 도 7은 각각 본 발명의 실시예에서 B16-F10 세포(흑색종 세포주), U937 세포(백혈병 세포주) 및 LNCaP 세포(전립선암 세포주)에 대한 MTT assay 결과를 나타낸 그래프,
도 8 내지 도 10은 각각 본 발명의 실시예에서 전립선암을 대상으로 항암억제 기능의 사멸양상을 관찰하기 위해 수행한 DAPI 염색, FACS 및 DNA fragmentation 분석 결과를 나타낸 사진 및 그래프.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

본 발명자들은 물옥잠으로부터 M2 균주를 확보하였고, 순수 분리된 균주의 분자생물학적, 생리·생화학적 동정을 실시하고자 16S rRNA 염기서열을 분석한 결과, 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.)의 새로운 종으로 동정되었고, 상기 균주가 특정 병원균에 대한 항균 활성 및 특정 암종에 대한 항암 활성을 나타내는 것을 확인하고, 본 발명에 이르게 되었다.

따라서, 본 발명은 수탁번호 KCTC 13851BP로 기탁된 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주를 개시한다.

본 발명에 따른 균주는 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) 또는 대장균(Escherichia coli)에 대한 항균 활성을 가지고, 전립선암 또는 백혈병에 대한 항암 활성을 가지는 것으로 확인되었다.

본 발명의 적용예에 따르면, 상기 균주의 배양물이 제공된다.

본 발명에서 상기 균주 또는 이의 대사물질은 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양액(배양물), 상기 균주의 배양여액, 상기 배양물의 추출물 등의 상태로 이용될 수 있다. 여기서, 상기 균주의 균체는 균 자체를 모두 포함하는 의미이며, 상기 배양액은 균체가 포함된 배양액을 의미하며, 상기 배양여액은 균체 비포함 배양액을 의미하고, 상기 배양물의 추출물은 유기용매를 사용하여 농축 또는 건조된 것을 의미한다.

상기 '배양물'은 구체적으로 본 발명의 상기 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻어지는 배양된 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미하며, 균주 배양 후 균주를 제거한 배양여액도 포함한다. 또한, 상기 균주의 배양에 의해 수득된 배양액을 초음파 처리하거나 상기 배양액에 용해효소(lysozyme)을 처리하여 수득된 세포 파쇄액, 상기 배양액을 틴달화(tyndalization)한 틴달화물도 및 상기 정의한 배양물들의 건조분말 또한 본 발명의 배양물에 포함될 수 있다.

본 발명의 적용예에 따르면, 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물과 항암용 조성물이 제공된다.

본 발명에서 항균 활성은 유해 세균의 생육을 저해 또는 억제하는 활성을 의미한다. 바람직하게는, 생체 내 소화기관에 존재하면서 소화기관과 관련된 여러 질환을 유발하는 유해 세균의 생육을 저해 또는 억제하는 활성을 의미하거나, 피부 표면의 세균 및 항생제 내성균에 대해 항균 활성을 가짐으로써 각종 피부 질환의 예방, 개선 또는 치료 용도 및 항생제 내성 완화 용도로 사용될 수 있는 것을 의미하거나 또는 동식물을 포함한 생명체의 외부에 일상적으로 노출이 되는 균의 활성, 성장 또는 생육을 저해하는 활성을 의미한다.

본 발명에 따른 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주 또는 이의 배양물은 그람 음성균 또는 그람 양성균을 구분하지 않고 광범위한 항균 활성 또는 항암 활성을 나타낼 수 있으나, 바람직하게는 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) 또는 대장균(Escherichia coli)에 대하여 항균 활성을 나타내거나, 전립선암 또는 백혈병에 대한 항암 활성을 나타낼 수 있다.

본 발명에서 상기 조성물은 바람직하게는 의약외품 또는 의약품의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 조성물이 의약품의 형태일 경우에는, 본 발명의 미생물 또는 이의 배양물 뿐만 아니라, 병원성 미생물 또는 내성균에 대한 항균 활성을 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명에서의 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 임의의 대상 조성물 또는 성분을 하나의 기관 또는 신체의 부분으로부터 다른 기관, 또는 신체의 부분으로의 운반 또는 수송하는 것에 관여하는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은 제약상 허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 지칭하며, 본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 스테아린산 마그네슘 및 광물유를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 상기 화학식 1 또는 2의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 병원성 세균 및 내성균에 대한 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 바람직하게 의약외품 조성물일 수 있다. 본 발명의 조성물이 의약외품의 형태일 경우에는, 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 상기 의약외품 조성물은 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

실시예 1 : M2 균주의 분리

균주의 분리는 경북 예천 낙동강에서 채집된 물옥잠을 부위별로 나누어, 에탄올 소독 후 NaClO(sodium hypochlorite) 1.5% 용액을 이용하여 표면의 미생물을 제거하고, 멸균된 막자사발에 물옥잠 각 부위와 멸균수(5ml)를 첨가한 후 갈아서 식물액을 얻고, 농도별(10^-1,10^-2 및 10^-3)로 희석(0.8% NaCl in ddH₂0)하여 하기 표 1에 나타낸 조성의 R2A 배지에 도말하여 일주일 배양 후, 자란 콜로니를 대상으로 계대배양을 통해 순수 분리를 수행, 약 100 균주를 확보하였다.

실시예 2 : M2 균주의 동정

도 1은 본 발명에 따른 M2 균주를 R2A 평판배지에 계대배양하여 순수배양 균주임을 확인한 결과를 나타낸 사진이다. 상기 분리된 균주들의 배양액을 농축하여, 항균 효과가 가장 강하게 보이는 균주를 선별하고, 도 1과 같이 순수 분리된 담수원핵생물의 분자생물학적 동정을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하여 그 결과를 도 2(서열번호 1)에 나타내었다. 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하고, 근연종과 유사도를 비교한 결과(pairwise sequence) 마이크로모노스포라 웬챈젠시스(Micromonospora wenchangensis)와 99.5%, 마이크로모노스포라 리파미시니카(Micromonospora rifamycinica)와는 99.3%로 가장 높은 유사도를 보였다. 또한, 16S rRNA 유전자를 기반한 계통도(도 3) 분석에서 M. wenchangensis 및 M. rifamycinica와 클레이드를 구성하고 있어, 상기 두 균주와 생리·생화화학적 비교를 수행하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 생리학적 연구는 배양 가능 온도, pH, 염분 농도 R2A 배지를 대상으로 수행되었으며, 탄소 이용도 측정에는 Gen Ⅲ microplate가 사용되었다.

생리학적 특징을 분석한 결과, ⅰ) M. Wenchangensis 균주는 ISP2 배지가 최적 배지임에 비해 M2 균주의 최적배지는 R2A로 측정되었으며, ISP2에서는 약간 느리게 배양되었고, ⅱ) M2 균주는 45℃ 그리고 pH 5에서 배양이 불가하여 M. Wenchangensis와 구분되어질 수 있고, M. rifamycinica 균주와 pH 9에서 라피노스 이용능으로 구분되어질 수 있으며, ⅲ) 분리원에서 차이가 있다.

또한, M2 균주와 근연종 간의 지방산 분석을 수행하고 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 지방산 분석은 ISP2 배지에 4일간 28℃ 배양한 뒤 수행되었다. 지방산 분석에는 MIDI 방법이 사용되었고, GC로 추출물을 분석하여 Sherlock Software에서 제공하는 TSB 6.0 database를 이용하여 동정하였다.

표 3을 참조하면, M2 균주의 주요 지방산은 iso-C16:0, C17:1ω8c, C18:1ω9c 등으로 이루어져 있으나, M. Wenchangensis는 C18:1ω9c, iso-C15:0, 10-Methyl C18:0 (TBSA) 등으로, M. rifamycinica는 C18:1ω9c,iso-C16:0, iso-C15:0 등으로 구성되어 있어 확연한 차이가 있고, 특히 C17:1ω8c 지방산은 M2 균주의 특징 중에 하나로 확인되었다.

따라서, 본 발명에서 M2 균주는 상기 생리·생화학적, 분자생물학적 결과를 바탕으로 볼 때, 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.)의 새로운 종으로 볼 수 있으며, 이에 새롭게 분리 동정된 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) 미생물을 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주로 명명하고, 이를 생물자원센터(KCTC: Korean Collection for type Culture)에 2018년 06월 17일자로 수탁하여, 수탁번호 KCTC 13851BP를 부여받았다.

실시예 3 : 배양액 추출물 제조

분리된 M2 균주를 R2A broth 배지에 1/1000(v/v) 접종하여, 25℃에서 2주간 진탕배양(120RPM)하였다. 배양액은 Ethylacetate 용매를 이용하여 분획하고, 용매를 제거하여 추출물을 확보하였다. 이후 추출물을 DMSO에 녹여 배양액 추출물을 제조하였다.

실시예 4 : 항균 활성 확인

일반적인 항균 활성을 측정하는 방법으로 MIC(minimum inhibitory concentration)을 측정하나, 본 실험에서는 단일물질로 정제하지 않은 crude extraction 상태로 활성을 측정하여, 첫째 단일물질의 정확한 농도를 알 수 없었고, 둘째 추출물(crude extract)상태에서 MIC값(농도)을 얻을 수 없었다.

셋째 추출물을 용액화하기 위하여 가장 많은 양의 추출물을 녹이는 용매로 DMSO가 선정되었다.

그러나, DMSO는 미생물에 대한 독성이 있는 것으로 알려져 있어, 본 발명에서는 각 처리농도에 따른 생육의 저해 정도를 DMSO가 같은량 포함된 대조군과 비교하여 항균 활성을 비교하였다.

사용된 균주는 하기 표 4에 나타낸 5 균주이며, MH(Mueller-Hinton/difco) medium이 사용되었고, 37℃에서 24시간 배양하여, 균주의 생장은 OD 600nm의 수치로 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4를 참조하면, 실험결과 DMSO의 생육억제 효과가 있는 것으로 나타났으나, 배양액 추출물 처리군에서 DMSO의 생육저해능 보다 높은 억제 능력을 보여, 해당 균주의 생육을 억제 하는 효과를 확인할 수 있었다. 구체적으로, LG 6(Enterococcus faecalis) 및 LG 10(Escherichia coli) 균주에서는 모든 농도에서, LG 2(Staphylococcus aureus) 균주에서는 6mg/L 및 3mg/L 농도에서, LG 25(Bacillus therengenesis) 균주의 경우에는 3mg/L 농도의 경우에만 대조군에 비해 더 높은 균주 생육 억제, 즉 항균 활성을 나타내었고, LG 30(Bacillus cereus) 균주의 경우 거의 항균 활성을 보이지 않는 것으로 확인되었다.

실시예 5 : 항암 활성 확인

상기 제조된 추출물에 대하여 이하의 방법으로 흑색종, 백혈병 및 전립선암 세포를 대상으로 항암 활성을 측정하였다.

세포배양 및 MTT assay

B16-F10 세포(흑색종 세포주), U937 세포(백혈병 세포주) 및 LNCaP 세포(전립선암 세포주)를 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)로부터 분양받아, 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) 및 1% penicillin-streptomycin이 함유된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. M2 처리에 따른 세포 증식 억제 정도를 측정하기 위하여 6-well plate에 T24 세포를 well당 3×10⁵개를 분주하고 M2를 적정 농도로 처리하여 배양하였다. 그 후 MTT 시약을 0.5 ㎎/mL 농도가 되게 처리하여 2시간 동안 배양하고, 배지를 제거한 후 DMSO를 2 mL씩 분주하여 생성된 formazan을 모두 녹인 후 ELISA reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 세포의 생존율을 측정하기 위하여 위와 같은 조건으로 세포를 배양한 후 배지를 제거하고 phosphate-buffered saline(PBS)를 각 well 당 1 mL을 첨가하여 세포를 부유시킨 다음 0.5% trypan blue solution(Gibco-BRL)을 동량으로 첨가하여 2분간 처리하였다. 처리된 샘플을 hemocytometer에 적용한 후 도립 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 살아있는 세포의 수를 비교하였고, 그 결과를 도 5 내지 도 7에 나타내었다.

도 5 내지 도 7을 참조하면, 백혈병에서 200~400 ㎍/ml, 전립선암의 경우 100 ㎍/ml 농도에서 50% 이상의 암세포 사멸을 확인할 수 있었다. 또한, 최대 효과를 보인 전립선암을 대상으로 항암억제 기능의 사멸양상(apoptosis vs necrosis)을 관찰하기 위해 이하의 방법으로 DAPI 염색, FACS 및 DNA fragmentation 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 8 내지 도 10에 나타내었다. 실험결과 자가세포사멸(apoptosis)로 예상되었다.

DAPI staining에 의한 세포 핵의 형태 관찰

Apoptosis가 유발되었을 경우 특이적으로 나타나는 핵의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 M2 균주가 처리된 세포를 모은 다음 2,000 rpm으로 5분간 원심 분리하여 상층액을 제거하고 37% formaldehyde 용액과 PBS를 1:9 비율로 섞은 fixing solution을 모아진 세포에 500 ㎕ 첨가하여 충분히 섞은 후, 상온에서 10분 동안 고정하였다. 고정된 세포를 2,000 rpm으로 5분간 원심 분리하여 fixing solution을 제거하고 PBS 200 ㎕에 부유시킨 후 세포가 포함되어 있는 PBS 80 ㎕를 slide glass 위에 떨어뜨리고 1,000 rpm에서 5분간 cytospin하여 세포를 slide glass에 부착하였다. 세포가 부착된 slide glass를 PBS로 2~3회 정도 세척하고 PBS가 마르기 전에 0.2%의 Triton X-100(Sigma-Aldrich Co.)을 첨가하여 상온에서 10분간 고정한 후 2.5 ㎍/mL 농도의 DAPI 용액을 처리하여 상온에서 15분간 염색하였다. 염색이 끝난 후 DAPI 용액을 충분하게 세척하고 mounting solution을 처리한 후 형광 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용하여 ×400배의 배율로 각 농도에 따른 암세포 핵의 형태 변화를 관찰하였다.

DNA fragmentation 분석

Apoptosis 유발의 또 다른 증거를 제시하기 위하여 DNA 단편화 현상의 분석을 실시하였다. 상기와 동일한 방법으로 처리된 세포들을 모은 다음 lysis buffer(5 mM Tris-HCl(pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.5% Triton X-100)를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 처리한 다음 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액에 proteinase K solution(Sigma-Aldrich)을 처리하여 50℃에서 3시간 동안 반응시킨 후 phenol : chloroform : isoamyl alcohol 혼합 용액(25:24:1, Sigma-Aldrich)을 첨가하고 30분간 회전교반 시킨 다음 원심분리하여 다시 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액에 isopropanol(Sigma-Aldrich)과 5 M NaCl를 첨가하여 4℃에서 24시간 동안 반응시킨 후 원심분리시켜 DNA pellet을 추출하였다. 추출된 DNA pellet에 RNase A가 포함된 TE buffer 및 6X gel loading dye(Bioneer, Daejeon, Korea)를 첨가하고 1.6% agarose gel을 이용하여 50 V 전기영동 시킨 후 ethidium bromide(EtBr, Sigma-Aldrich)로 염색하여 DNA 단편화 현상을 확인하였다.

Annexin V-FITC/Propidium Iodide (PI) staining에 의한 apoptosis 분석

M2 균주가 유발하는 apoptosis 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 정상 및 M2 균주가 24시간 동안 처리된 세포들을 모은 다음 원심분리하여 상층액을 제거한 후 PBS를 이용하여 세척하였다. 준비된 세포를 10 mM HEPES/NaOH, pH 7.4, 140 mM NaCl 및 2.5 mM CaCl₂가 포함된 annexin V binding buffer(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에 부유시킨 다음 annexin V-FITC 및 propidium iodide(PI, Becton Dickinson)를 처리하여 암실에서 20분 동안 반응시켰다. 반응시킨 세포를 35-mm mesh를 이용하여 단일세포로 분리한 후 DNA flow cytometer(FACSCalibur, Becton Dickinson)에 적용시켜 apoptosis가 유발된 세포(V⁺/PI^-)를 형광반응에 따라 측정한 후 CellQuest software 및 ModiFit LT 프로그램을 이용하여 분석하였다.

이상의 실험결과로부터 본 발명에 따른 물옥잠에서 분리된 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주는 항균 활성(Enterococcus faecalis 및 Escherichia coli)과 항암 활성(전립선암 및 백혈병)을 가진 물질을 생산하여 향후 약학적 소재로 개발 가치가 높은 것을 확인할 수 있다.

이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC13851BP

20180617

<110> Nakdonggang National Institute of Biological Resources <120> Micromonospora sp M2 isolated from Monochoria korsakowii in fresh water having antibacterial and anticancer activity and uses thereof <130> NP19-07076 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1448 <212> DNA <213> Micromonospora sp. <400> 1 ctcaggacga acgctggcgg cgtgcttaac acatgcaagt cgagcggaaa ggcccttcgg 60 ggtactcgag cggcgaacgg gtgagtaaca cgtgagtaac ctgccctagg ctttgggata 120 accctcggaa acgggggcta ataccggata tgaccttgcc ctgcatgggg tttggtggaa 180 agtttttcgg cctgggatgg gctcgcggcc tatcagcttg ttggtggggt gatggcctac 240 caaggcgacg acgggtagcc ggcctgagag ggcgaccggc cacactggga ctgagacacg 300 gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcgg aagcctgatg 360 cagcgacgcc gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa acctctttca gcagggacga 420 agcgcaagtg acggtacctg cagaagaagc accggccaac tacgtgccag cagccgcggt 480 aagacgtagg gtgcgagcgt tgtccggatt tattgggcgt aaagagctcg taggcggctt 540 gtcgcgtcga ccgtgaaaac ttggggctca accccaagcc tgcggtcgat acgggcaggc 600 tagagttcgg taggggagac tggaattcct ggtgtagcgg tgaaatgcgc agatatcagg 660 aggaacaccg gtggcgaagg cgggtctctg ggccgatact gacgctgagg agcgaaagcg 720 tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgct gtaaacgttg ggcgctaggt 780 gtggggggcc tctccggttc cctgtgccgc agctaacgca ttaagcgccc cgcctgggga 840 gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggcggagca 900 tgcggattaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctggg tttgacatgg ccgcaaaact 960 tccagagatg ggaggtcctt cgggggcggt cacaggtggt gcatggctgt cgtcagctcg 1020 tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgttcga tgttgccagc 1080 gcgttatggc ggggactcat cgaagactgc cggggtcaac tcggaggaag gtggggatga 1140 cgtcaagtca tcatgcccct tatgtccagg gcttcacgca tgctacaatg gccggtacaa 1200 tgggttgcga tgccgtgagg tggagcgaat cccaaaaagc cggtctcagt tcggatcggg 1260 gtctgcaact cgaccccgtg aagtcggagt cgctagtaat cgcagatcag caacgctgcg 1320 gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcacg tcacgaaagt cggcaacacc 1380 cgaagccggt ggcccaaccc ttgtggaggg agccgtcgaa ggtggggctg gcgattggga 1440 cgaatcta 1448

Claims

수탁번호 KCTC 13851BP로 기탁된 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주로서,
상기 균주는 물옥잠으로부터 분리되고, 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 16S rRNA를 포함하고, 불포화 지방산 C17:1ω8c를 함유하고, 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) 및 대장균(Escherichia coli)에 대한 항균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주.
삭제
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수탁번호 KCTC 13851BP로 기탁된 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주로서,
상기 균주는 물옥잠으로부터 분리되고, 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 16S rRNA를 포함하고, 불포화 지방산 C17:1ω8c를 함유하고, 전립선암 및 백혈병에 대한 항암 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주.
삭제
제1항 또는 제4항의 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주의 배양액.
제1항의 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물.
제4항의 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) M2 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물.