KR102087110B1 - 생체조직 내 항체 침투력 향상을 위한 면역조직화학법 인핸서 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생체조직 내 항체 침투력 향상을 위한 면역조직화학법 인핸서 키트에 관한 것으로, 본 발명에 따른 항체 침투력 향상을 위한 면역조직화학법 인핸서 키트를 사용하여 다양한 생체조직으로 면역조직화학법을 수행할 경우, 항체의 조직 내 침투력을 증가시켜 기존의 면역조직화학법을 이용하는 경우에 비해 두꺼운 두께의 조직 슬라이드에서도 관찰하기 어려운 타겟을 보다 쉽게 관찰하고 결과를 분석하는 것이 가능하다. 따라서, 슬라이드 제작에 대한 수고를 줄일 수 있을 뿐만 아니라 정확한 결과 해석이 가능한 바, 다양한 질병의 진단과 치료를 위한 생검 병리학적 검사에 적용하여 질병의 원인을 규명하고 치료법을 찾아내는 데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 생체조직 내 항체 침투력 향상을 위한 면역조직화학법 인핸서 키트 및 이를 이용하여 생체조직 내 항체 침투력을 향상시키는 방법 등에 관한 것이다.
질병의 정확한 진단과 치료를 위해서는 검체의 형태학적인 관찰이 중요하며, 이를 위해 종래에는 생검 조직으로 제작한 헤마톡실린-에오신 염색 표본을 이용하고 있으나, 각종 질환이 점차 세분화 되고 새로운 진단 기준이 제시되고 있어 통상적인 헤마톡실린-에오신을 이용한 염색 방법만으로는 이러한 종합적이고 정확한 정보를 얻기가 어려운 실정이다.
이를 위해 하는 검사법이 면역조직화학법이며, 이는 항체를 이용함으로써 민감성과 특이성이 매우 높은 검사법으로, 최근까지 병리 진단에서 형태학적 연구에 필수적인 검사법으로 이용되고 있다.
면역조직화학법은 항원항체반응에 있어서 정밀한 선택성, 특이성을 이용하여 조직 또는 세포에 있는 특정한 물질을 가시화하여 광학현미경, 또는 전자현미경으로 관찰할 수 있도록 고안한 기법을 말하는 것으로, 탈파라핀되고 적절하게 처리된 조직에 원하는 항원에 대한 일차항체를 반응시킨 다음 일차항체를 항원으로 해서 만든 이차항체를 반응시키는데, 이 이차항체에는 형광색소 등의 형광물질, 효소, 방사선동위체 등이 부착되어 있으며, 항체의 활성을 상실하지 않도록 하면서 발색, 발광, 방사하는 물질을 표지하는 기술이 꾸준히 개발되고 있다.
면역조직화학법의 종류에는 항체에 형광색소를 표지하는 형광항체법(A. H. Coons 등), 과산화효소 등의 효소를 표지하여 그 효소가 분해한 기질에서 발색물질을 얻어내는 효소표지항체법(P. N. Nakane 등), 방사선동위체로 표지한 방사선자동사진(autoradiography)을 이용하는 방사선동위체 표지항체법(D. Pressman 등) 등이 있는데, 형광항체법으로는 2종류 내지 3종류의 형광색소를 표지한 다른 항체를 사용하는 중복표지법 등도 개발하여 세포동정, 세포선별 등에 유효하게 이용하고 있으며, 효소항체법은 전자현미경에서도 응용하여 분자수준의 해석에서 이용하고 있다. 방사항체법은 방사능의 계수에 의한 정량과 방사선자동사진에 의한 국재가 같은 시료로 해석할 수 있다는 이점이 있다.
상기 면역조직화학법은 세포 또는 조직을 고정하여 관찰하기 때문에 통상 얻게 되는 정보는 정적인 것이지만 형광색이 다른 이차항체를 사용하면, 복수인 단백질의 공동국재도 연구할 수 있는 점에서 분자세포생물학에 있어서도 매우 중요한 기술로 인식되고 있다.
따라서, 상기와 같은 면역조직화학법에서는 항원에 대한 항체를 반응시켜 선명한 발색을 얻는 것이 중요하다.
이에, 본 발명자들은 면역조직화학법을 이용한 생검 조직의 병리 진단에서, 생검 조직의 전처리 과정을 통해 항체의 조직 내 침투력을 향상시켜 보다 쉽게 조직을 관찰하여 정확한 진단 결과를 얻을 수 있도록 하는 방법을 도모하고자 하였다.
본 발명자들은 면역조직화학법 수행 시 생검 조직의 전처리 과정에 사용하여, 두꺼운 두께의 조직 슬라이드에서도 항체의 침투력을 향상시켜 기존의 면역조직화학법에 비해 쉽게 정확한 검출 결과를 얻을 수 있도록 도움을 주는 면역조직화학법 인핸서 키트를 발명함으로써, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생체조직 시료를 고정시키는 고정 용액(fixing solution);
상기 고정된 시료를 세척시키는 세척 용액(washing solution); 및
상기 세척된 시료 내 항체 침투력을 향상시키는 면역조직화학법 인핸서(immunohistochemistry enhancer; IHC enhancer) 용액을 포함하는, 생체조직 내 항체 침투력 향상을 위한 면역조직화학법 인핸서 키트를 제공한다.
본 발명의 일구현예로서, 상기 생체조직은 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 또는 혈관일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 고정 용액(fixing solution)은 수크로오스(sucrose)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 수크로오스(sucrose)는 농도가 0.001 내지 50%(w/v)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 세척 용액(washing solution)은 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 면역조직화학법 인핸서(immunohistochemistry enhancer; IHC enhancer) 용액은 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), 우레아(urea), 트리톤(triton) X-100, 및 이메틸 일산화황(dimethyl sulfoxide; DMSO)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트)는 농도가 0.001 내지 50%(w/v)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 우레아(urea)는 농도가 0.001 내지 60%(w/v)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 트리톤(triton) X-100은 농도가 0.001 내지 10%(w/v)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 이메틸 일산화황(dimethyl sulfoxide; DMSO)은 농도가 0.001 내지 40%(w/v)일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 면역조직화학법 인핸서 키트를 이용하여 생체조직 내 항체 침투력을 향상시키는 방법을 제공한다:
(a) 고정 용액(fixing solution)으로 생체조직 시료를 고정시키는 단계;
(b) 세척 용액(washing solution)으로 상기 고정된 시료를 세척하는 단계; 및
(c) 면역조직화학법 인핸서(immunohistochemistry enhancer; IHC enhancer) 용액을 사용하여 상기 세척한 시료 내 항체 침투력을 향상시키는 단계.
본 발명에 따른 항체 침투력 향상을 위한 면역조직화학법 인핸서 키트를 사용하여 다양한 생체조직으로 면역조직화학법을 수행할 경우, 항체의 조직 내 침투력을 증가시켜 기존의 면역조직화학법을 이용하는 경우에 비해 두꺼운 두께의 조직 슬라이드에서도 관찰하기 어려운 타겟을 보다 쉽게 관찰하고 결과를 분석하는 것이 가능하다. 따라서, 슬라이드 제작에 대한 수고를 줄일 수 있을 뿐만 아니라 정확한 결과 해석이 가능한 바, 다양한 질병의 진단과 치료를 위한 생검 병리학적 검사에 적용하여 질병의 원인을 규명하고 치료법을 찾아내는 데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에 따른 면역조직화학법 인핸서 키트를 이용한 마우스 뇌 조직의 IHC assay 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명은 생체조직 시료를 고정시키는 고정 용액(fixing solution);
상기 고정된 시료를 세척시키는 세척 용액(washing solution); 및
상기 세척된 시료 내 항체 침투력을 향상시키는 면역조직화학법 인핸서(immunohistochemistry enhancer; IHC enhancer) 용액을 포함하는, 생체조직 내 항체 침투력 향상을 위한 면역조직화학법 인핸서 키트를 제공한다.
본 발명에서 상기 생체조직은 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 또는 혈관일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 고정 용액(fixing solution)은 수크로오스(sucrose)를 포함할 수 있으며, 상기 수크로오스(sucrose)는 농도가 0.001 내지 50%(w/v)일 수 있고, 10 내지 40%(w/v)일 때 시료의 고정 효과가 좋을 수 있으나, 상기 농도에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 세척 용액(washing solution)은 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS)를 포함할 수 있으며, 이 때 상기 PBS는 1X PBS를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 면역조직화학법 인핸서(immunohistochemistry enhancer; IHC enhancer) 용액은 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), 우레아(urea), 트리톤(triton) X-100, 및 이메틸 일산화황(dimethyl sulfoxide; DMSO)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트)는 농도가 0.001 내지 50%(w/v), 상기 우레아(urea)는 농도가 0.001 내지 60%(w/v), 상기 트리톤(triton) X-100은 농도가 0.001 내지 10%(w/v), 상기 이메틸 일산화황(dimethyl sulfoxide; DMSO)은 농도가 0.001 내지 40%(w/v)일 수 있고, 각각의 농도가 10 내지 40%(w/v), 10 내지 50%(w/v), 1 내지 5%(w/v), 10 내지 30%(w/v)일 때, 항체의 침투력 향상 효과가 좋을 수 있으나, 상기 농도에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 면역조직화학법 인핸서 키트를 이용하여 생체조직 내 항체 침투력을 향상시키는 방법을 제공한다:
(a) 고정 용액(fixing solution)으로 생체조직 시료를 고정시키는 단계;
(b) 세척 용액(washing solution)으로 상기 고정된 시료를 세척하는 단계; 및
(c) 면역조직화학법 인핸서(immunohistochemistry enhancer; IHC enhancer) 용액을 사용하여 상기 세척한 시료 내 항체 침투력을 향상시키는 단계.
본 발명에서 "포함하는"이라는 용어가 사용될 때, 이는 다른 요소 또는 단계를 배제시키지 않는다.
또한, 본 발명에서 "~으로 이루어진"이라는 용어는 "포함하는"이라는 용어의 바람직한 실시양태인 것으로 간주된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 항원에 특이적으로 결합하여 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 이의 단편에서 유래하는 프레임워크 영역을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론, 및 뮤 불변 영역 유전자를 비롯하여, 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류되며, 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되고, 결과적으로 각각 면역글로불린 부류 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 한정한다. 전형적으로, 항체의 항원-결합 영역은 결합 특이성 및 친화성에서 가장 핵심적이게 된다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항체의 단편은 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 낙타 등을 포함한, 상이한 유기체에서 유래될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항체 침투력"은 유의하거나 또는 효과적인 양으로 조직 또는 세포 외 환경으로부터 조직 또는 세포를 통과하는 항체의 능력을 의미한다.
이 때, 본 발명에서 상기 "유의하거나 또는 효과적인 양"은 원하는 생물학적 효과가 달성되기 위해 필요한 양 또는 충분한 양을 의미하는 것으로, 예컨대, 생체조직 시료로 면역조직화학법을 수행할 경우 항원에 대해 항체가 반응하여 발색을 나타내기에 충분한 양을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "인핸서(enhancer)"는 개선, 증강, 증진, 또는 증폭자의 의미를 가지며, 본 발명의 일실시예에 따르면, "면역조직화학법 인핸서"는 생체조직의 면역조직화학법에서 항체의 조직 내 침투력을 증강시킴으로써 개선된 면역조직화학법 검사 결과를 얻을 수 있도록 하는 물질을 의미한다.
본 발명의 일실시예에서는, 생체조직 내 항체 침투력 향상을 위한 면역조직화학법 인핸서 키트를 제조하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 면역조직화학법 인핸서 키트를 이용하여 마우스 뇌 조직의 면역조직화학법을 수행한 결과, 항체의 조직 내 침투력이 향상되어 기존의 면역조직화학법에 비해 더 명확한 검출 결과를 얻을 수 있었다(실시예 2 참조).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
면역조직화학법
인핸서
키트의
제조
농도가 10 내지 40%(w/v)인 수크로오스(sucrose)로 고정 용액(fixing solution)을 제조하였다.
또한, 1X 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS)를 세척 용액(washing solution)으로 사용하였으며, 농도 10 내지 40%(w/v)의 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), 10 내지 50%(w/v)의 우레아(urea), 1 내지 5%(w/v)의 트리톤(triton) X-100, 및 10 내지 30%(w/v)의 이메틸 일산화황(dimethyl sulfoxide; DMSO)으로 면역조직화학법 인핸서(immunohistochemistry enhancer; IHC enhancer) 용액을 제조하였다.
상기 제조한 본 발명의 면역조직화학법 인핸서 키트의 구성 및 구성 성분은 표 1에 나타내었다.
구성 | 구성 성분 | |
1 | Fixing solution | Sucrose(10-40%(w/v)) |
2 | Washing solution | PBS(1X) |
3 | IHC enhancer | CHAPS(10-40%(w/v)), Urea(10-50%(w/v)), Triton X100(1-5%(w/v)), DMSO(10-30%(w/v)) |
실시예
2.
면역조직화학법
인핸서
키트를
이용한 마우스 뇌 조직의 IHC assay 결과 확인
마우스의 뇌 조직을 5um, 10um, 및 20um 두께의 슬라이드로 제작하여 DAPI로 핵을 염색하고 미토콘드리아 마커인 SOD/MnSOD2 항체를 이용하여 IHC assay를 실시하였다.
구체적으로, 상기 마우스 뇌 조직 슬라이드를 4%의 formaldehyde로 15분간 고정시킨 후, 상기 실시예 1에서 제조한 고정 용액으로 상기 마우스 뇌 조직 슬라이드를 4℃에서 1시간 동안 고정시키고, 세척 용액으로 실온에서 3회 세척하였다.
상기 세척한 슬라이드에 상기 실시예 1에서 제조한 IHC enhancer 용액을 35℃에서 2시간 동안 처리하고, 다시 세척 용액으로 실온에서 3회 세척한 후 blocking buffer로 1시간 동안 blocking 하였다.
그런 다음, 1X PBS로 5분간 1회 세척하고 일차항체(SOD/MnSOD2)로 4℃에서 overnight 동안 반응시킨 후 다시 1X PBS로 5분간 3회 세척하고, 이차항체(GAR dylight647)로 실온에서 2시간 반응시킨 후 1X PBS로 5분간 3회 세척한 다음, mounting 후 관찰하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 핵이 파란색으로 염색되었고, 미토콘드리아는 붉은색으로 염색되었으며, 상기 실시예 1에서 제조한 면역조직화학법 인핸서(IHC enhancer) 키트를 사용하여 면역조직화학법을 실시한 경우(도 1의 우측), 기존의 면역조직화학법을 실시한 경우(도 1의 좌측)에 비해 미토콘드리아 마커인 SOD/MnSOD2의 발현이 훨씬 더 명확하게 검출되는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터, 상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 면역조직화학법 인핸서 키트를 사용하여 생체조직의 면역조직화학법을 실시할 경우, 기존의 면역조직화학법에 비해 항체의 침투력을 향상시켜 훨씬 더 명확한 검출 결과를 얻을 수 있으며, 이는 두께가 20um으로 두꺼운 생체조직 슬라이드에서도 가능한 것을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
Claims (11)
- 생체조직 시료를 고정시키는 고정 용액(fixing solution);
상기 고정된 시료를 세척시키는 세척 용액(washing solution); 및
면역조직화학법 인핸서(immunohistochemistry enhancer; IHC enhancer) 용액을 포함하는, 면역조직화학법 인핸서 키트로서,
상기 고정 용액은 수크로오스(sucrose)를 포함하고;
상기 세척 용액은 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS)를 포함하고;
상기 면역조직화학법 인핸서 용액은 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), 우레아(urea), 트리톤(triton) X-100, 및 이메틸 일산화황(dimethyl sulfoxide; DMSO)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 면역조직화학법 인핸서 키트.
- 제1항에 있어서,
상기 생체조직은 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 또는 혈관인 것을 특징으로 하는, 면역조직화학법 인핸서 키트.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 수크로오스(sucrose)는 농도가 0.001 내지 50%(w/v)인 것을 특징으로 하는, 면역조직화학법 인핸서 키트.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트)는 농도가 0.001 내지 50%(w/v)인 것을 특징으로 하는, 면역조직화학법 인핸서 키트.
- 제1항에 있어서,
상기 우레아(urea)는 농도가 0.001 내지 60%(w/v)인 것을 특징으로 하는, 면역조직화학법 인핸서 키트.
- 제1항에 있어서,
상기 트리톤(triton) X-100은 농도가 0.001 내지 10%(w/v)인 것을 특징으로 하는, 면역조직화학법 인핸서 키트.
- 제1항에 있어서,
상기 이메틸 일산화황(dimethyl sulfoxide; DMSO)은 농도가 0.001 내지 40%(w/v)인 것을 특징으로 하는, 면역조직화학법 인핸서 키트.
- 삭제
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