KR102083472B1

KR102083472B1 - 흑무(Raphanus sativus L. var niger) 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102083472B1
Application number: KR1020190082181A
Authority: KR
Inventors: 김기옥; 양다운; 홍승현; 오동관
Original assignee: 재단법인 제주테크노파크
Priority date: 2019-07-08
Filing date: 2019-07-08
Publication date: 2020-03-02
Also published as: KR20190084927A

Abstract

본 발명은 흑무(Raphanus sativus L. var niger) 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물이 AMPK(5' 아데노신 모노포스페이트-활성화 단백질 카이네이즈)를 활성화 시켜 전구지방세포에서 지방세포로의 분화에 관여하는 C/EBP-α, C/EBP-δ 및 PPAR-γ 전사인자를 억제하고, 지방 발생 관련 단백질의 발현을 감소시킴으로써 비만의 예방 또는 치료에 효과가 있음을 확인하였다.
또한, 상기 조성물이 간세포에서의 지질 합성을 억제하여 지방간의 예방 또는 치료에 효과가 있음을 확인하였다.

Description

흑무(Raphanus sativus L. var niger) 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating obesity or fatty liver comprising extract of Raphanus sativus L. var niger as an active ingredient}

본 발명은 흑무 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 상기 흑무 추출물이 AMPK(5' 아데노신 모노포스페이트-활성화 단백질 카이네이즈)의 활성화를 유도하여 비만 또는 지방간의 예방 또는 치료에 효과를 보이는 조성물에 관한 것이다.

비만은 에너지의 섭취와 소모의 불균형으로 인하여 체내에 에너지가 과잉으로 축적되어 지방조직이 비정상적으로 증가 된 상태로 정의되며, 세계보건기구(WHO)는 비만을 치료해야 하는 질병의 대상으로 보고 있다. 체내 에너지는 지방세포에 중성지방(triglyceride) 형태로 저장되었다가 체내 에너지원이 고갈되면 저장되었던 지방이 유리지방산과 글리세롤로 분해되어 에너지원으로 사용되게 되지만, 에너지의 과잉 섭취는 지방세포로의 분화를 촉진하고 체내 저장 지방량을 증가시켜 비만의 직접적인 원인이 된다.

상기와 같이 지방 세포는 에너지 균형에서 중요한 역할을 하기 때문에 지방 세포 분화의 분자 메커니즘을 이해하는 것이 비만 예방 전략의 개발을 위한 정보를 제공할 수 있다. 지방 세포 분화의 메커니즘은 전구지방세포 배양 시스템에서 광범위하게 연구되어왔다. 지방세포 특이적 유전자의 조절 영역의 특성 규명은 지방세포 분화 과정에서 발생하는 복잡한 전사 신호전달의 핵심 전사인자를 밝혀냈다. PPAR-γ, CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) 유전자 등이 그것이다. 지방 생성은 C/EBP 계열과 PPAR-γ의 구성원이 SREBP-1c, A-FABP, FAS, GLUT4, LPL 및 SCD-1c와 같은 지방 발생 관련 유전자의 발현에 중요한 역할을 하는 복잡한 전사 캐스케이드에 의해 조절된다.

지방간은 만성적인 음주, 과식에 의한 비만증과 당뇨병이 주요 원인으로 꼽히며, 그밖에 독성이 강한 약제의 복용, 임신 중에 항생제를 잘못 복용하였을 경우, 어린아이에게서의 발열성 감염질환이 있을 경우에 해열목적으로 아스피린을 함부로 남용하였을 경우에도　지방간이 생길 수 있다. 이러한　지방간은 면역상태 등의 신체적 여건이 좋으면 간세포의 재생으로 쉽게 회복되지만 그렇지 못할 경우에는 간세포 속의 지방 덩어리가 커지면서 핵을 포함한 세포의 중요한 구성성분이 한쪽으로 밀려 간세포의 기능이 저하되며, 세포 내에 축적된 지방으로 인하여 팽창된 간세포들이 간세포 사이에 있는 미세혈관과 임파선을 압박하여 간 내의 혈액과 임파액의 순환에 장애가 생기게 되고, 간세포는 산소와 영양공급을 적절히 받을 수 없어 간 기능이 저하되며, 간경변증까지 진행될 수가 있다.

비만 및 지방간의 유병률이 높아지면서 비만 및 지방간의 예방 및 치료에 대한 관심이 고조되고 있으며, 상기 질병에 효과를 나타낼 수 있는 천연물질 및 식품 소재에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

흑무(Raphanus sativus L. var niger)는 십자과(Brassicaceae family)에 속하는 식용작물로서 스페인, 중국, 터키, 러시아 등 전 세계적으로 분포되어 재배되고 있다. 일부 스페인이나 중국, 러시아에서는 전통약용 작물로 알려져있으며 민간요법으로도 많이 활용되어 왔다. 글루코시놀레이트(glucosinolate)는 십자과 작물의 2차 대사 산물로서 식물의 생육, 환경으로부터 보호작용, 식물 면역작용, 미생물로부터 방어, 기타 생리적 현상에 의해 다양하게 만들어진다. 대부분의 글루코시놀레이트는 미로시네이즈(myrosinase)에 의해 당(glucose), 황(sulfate), 아글루콘(aglucone)으로 분해되며, 화합물의 구조에 따라 이소티오시아네이트(isothiocyanate;ITC), 설포라판(surforaphenen), 티오시안산(thiocyanate), 옥사졸리딘-2-티온(oxazolindine-2-thione) 그리고 나이트릴(nitrile)로 분류된다. 그리고 이미 보고된 바에 의하면 글루코시놀레이트는 120 여종이 있다.

AMPK (5'AMP-활성화 단백질 카이네이즈; 5' 아데노신 모노포스페이트-활성화 단백질 카이네이즈)는 세포 에너지 항상성에 중요한 역할을 하는 효소이다. AMPK를 활성화 시킴으로써, 당뇨, 대사증후군, 비만, 암, 퇴행성질환(치매) 등의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다는 것이 알려져있어, AMPK 활성화제에 대한 연구가 지속되고 있다(AMPK and the biochemistry of exercise:Implications for human health and disease. Biochem J 418(2), 261-275 (2009), Mechanisms linking obesity, chronic kidney disease, and fatty liver disease: the roles of fetuin-A, adiponectin and AMPK. J Am Soc Nephrol 2010 Mar.;(21) 3: 406-12).

본 발명에서는 흑무 추출물이 AMPK에 대하여 우수한 활성화 효과를 나타내는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제1326271호

본 발명의 목적은 천연물 유래의 비만 또는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 흑무(Raphanus sativus L. var niger) 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 흑무 추출물은 AMPK(5' 아데노신 모노포스페이트-활성화 단백질 카이네이즈)를 활성화 시키는 것을 특징으로 한다.

상기 흑무 추출물은 C/EBP-α, C/EBP-β, C/EBP-δ, PPAR-γ, SREBP-1c, ACC, FAS, SCD-1, ADD1, ATGL, HSL, Adipsin, GLUT4, aP2, MGL로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.

상기 흑무 추출물은 에탄올 또는 에틸아세테이트 추출물인 것을 특징으로 한다.

상기 예방 또는 치료는 지질합성을 억제하거나 지방세포로의 분화를 억제하는 것을 특징으로 한다.

또한 (a) 상기 조성물의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 비만 또는 지방간의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한 (a) 상기 조성물의 식품학적 유효량; 및 (b) 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 비만 또는 지방간의 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 AMPK(5' 아데노신 모노포스페이트-활성화 단백질 카이네이즈)을 활성화 시켜, 지방세포로의 분화 억제, 지질합성의 억제를 유도하여 궁극적으로 비만의 예방 또는 치료 활성을 나타낸다.

또한, 상기 조성물은 지방간의 예방 또는 치료활성을 나타낸다.

도 1은 흑무추출물의 세포독성 테스트 결과이다.
도 2는 흑무추출물 분획물의 세포독성 테스트 결과이다.
도 3은 흑무추출물의 지질합성 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 4는 흑무잎추출물의 지질합성 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 5는 DMI의 지방세포 분화 촉진 효과를 나타낸 결과이다.
도 6는 AG490의 지방세포 분화 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 7은 흑무추출물(조추출물)의 지방세포 분화 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 8은 흑무추출물(분획물)의 지방세포 분화 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 9는 상기 도6 및 도7의 결과를 정량화한 것이다.
도 10은 흑무추출물의 지질합성 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 11은 흑무추출물의 PPAR-γ, C/EBP-α, aP2 발현 억제효과를 나타낸 결과이다.
도 12는 흑무추출물의 AMPK 활성화 효과를 나타낸 결과이다.
도 13은 흑무 추출물의 C/EBP-β 발현 촉진 효과를 나타낸 결과이다.
도 14a 내지 도 14e는 흑무 추출물의 지방분화 관련 유전자 발현 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 15는 흑무 추출물의 간세포에서 지질과산화물 합성 억제효과를 나타내는 결과이다.
도 16은 흑무 추출물의 간세포에서 지질 합성 억제효과를 나타내는 결과이다.

이하, 실시예 및 실험예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다.

< 실시예 > 흑무 추출물의 제조

흑무(black radish; Raphanus sativus L. var niger) 종자를 아시아 종묘사에서 구입 후 성산일출봉 농협에서 재배하였다. 파종 5개월 후 수확하여 흐르는 물에서 깨끗하게 씻어낸 후 뿌리를 5~10mm로 슬라이스 후 80℃ 물에서 10분간 담근 후 열풍건조 하였다. 상기 건조된 흑무 뿌리 300g에 80% 에탄올을 가하고 밤새 추출시켜 60g의 추출물을 얻었다. 상기 추출물에 300mL의 물을 첨가하고 이 혼합물을 HP-20 컬럼에 로딩(loading)하고 물 1L로 세척하였다. 그 후, 50% 에탄올 4L로 용리(elution)하고 감압농축기를 이용하여 농축하여 1.08g의 흑무추출물(BRE)을 얻었다.

또한, 흑무(black radish; Raphanus sativus L. var niger) 잎을 열풍건조하고, 건조된 흑무 잎 700g에 70% 에탄올 가하고 밤새 추출시켜 250g의 추출물(BRE 2)을 얻었다.

< 실험예 >

본 발명에서는 지방세포로의 분화 기작이 잘 알려진 3T3-L1 세포, 간세포인 HepG2 세포를 이용하여, 흑무 추출물에 의한

1) 지질합성 억제효과

2) 전구지방세포의 지방세포로의 분화 억제 효과

3) 간세포 보호효과

를 확인하였다.

세포배양

마우스 전구지방세포(preadipocyte)인 3T3-L1 세포와 인간 간세포인 HepG2 세포를 ATCC(American Type Culture Collection)으로부터 분양받아 사용하였다. 3T3-L1 세포는 100U/L 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신, 10% 우아혈청(Bovine calf serum; Gibco, USA)이 포함된 DMEM(Dulbecco's Minimal Essential Medium; Gibco, USA) 배양액을 사용하였고, HepG2 세포는 100U/L 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신, 10% 우태혈청(fetal bovine serum, Gibco, USA)이 포함된 MEM(Minimum Essential Medium ;Hyclone) 배양액을 사용하여 5% CO₂ 및 37℃가 유지되는 배양기에서 배양하였으며, 계대배양은 3~4일을 주기로 실행하였다.

세포 생존율 분석( MTT Assay)

3T3-L1 세포를 48웰 플레이트에 분주하고 24시간 배양 후 흑무추출물(BRE)을 농도별(12.5ug/mL, 25ug/mL, 50ug/mL, 100ug/mL, 200ug/mL)로 처리하고 24,48시간 동안 배양하였다. MTT（500㎍/ml) 용액을 처리하여 37℃에서 3시간 동안 반응시킨 후 ELISA(Bio-Tek, USA)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 처리군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포 생존율을 조사하였다.

지방세포로의 분화유도

3T3-L1 세포를 24웰 플레이트에 분주하여 4일 동안 배양하였다. 4일 후 post-confluence 상태에서 분화유도물질인 MDI (0.5mM 3-Isobutyl-1-methylxanthine(Sigma, USA), 1uM Dexamethasone(Sigma, USA), 10㎍/㎖ Insulin (Sigma, USA))가 함유된 DMEM/10% 우태혈청(fetal bovine serum, FBS) 배양액으로 교환하여 2일 동안 분화유도를 촉진시켰다. 2일 후 기존 배지를 제거하고 10㎍/㎖ 인슐린을 포함한 DMEM/10% FBS 배양액으로 교환하여 2일간 배양하였으며, 그 후 DMEM/10% FBS 배양액으로 배양하였다. 총 분화유도는 8일 동안 실시하였으며, 흑무추출물(BRE)은 분화유도물질과 함께 처리하였다.

Oil Red O 염색 및 중성지방( triglyceride ) 분석

지방세포로의 분화가 유도되면 중성지방이 축적된 정도를 Oil Red O 염색법으로 관찰할 수 있다. 분화된 3T3-L1 세포를 인산완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS)로 세척하고 10% 포르말린/PBS로 1시간 동안 고정시켰다. 그 후 증류수로 2회 세척하고 이소프로판올(isopropanol)에 녹인 0.6% Oil Red O(Sigma, USA) 염색약으로 1시간 동안 염색시킨 후 증류수로 세척하고 분화된 양상을 사진으로 남겨두었다. 염색된 지방소립(lipid droplet)은 4% Nonidet P-40(Amresco, USA)이 포함된 이소프로판올에 녹여 520nm에서 흡광도를 측정하였다.

총 중성지방 분석은 Triglyceride Quantification kit (abcam, ab65336)을 이용하여 분석하였다.

전기영동(electrophoresis) 및 웨스턴 블롯 (Western blot)

세포를 인산완충액(PBS)으로 2~3회 세척하여 RIPA 용해완충액(lysis buffer)에 처리하여 1시간 동안 균질화 시켰다. 균질화 된 세포를 원심분리하여 상층액을 얻었으며 단백질 농도는 소혈청알부민(Bovine Serum Albumin, BSA)을 표준화하여 Bio-Rad Protein Assay Kit를 사용하여 정량하였다. 30~50㎕의 용해물(lysate)을 10% SDS-PAGE로 총 단백질을 분리하였으며, 이를 폴리비닐리덴 다이플로라이드(polyvinylidene difluoride(PVDF); Millipore, USA) 막(membrane)으로 전이(transfer)하였다. PVDF membrane을 blocking buffer로 상온에서 1시간 동안 처리하였고 1차 항체는 anti-PPAR-γ와 anti-C/EBP-α, anti-aP2, anti-β-actin, anti-Erk를 처리하였다. 그 후 TTBS로 세척하였고 2차 항체는 HRP가 결합된 anti-mouse, anti-rabbit, anti-goat IgG(Immunoglobulin G)를 희석하여 상온에서 반응시켰으며, TTBS로 세척하여 WEST-ZOL(iNtRON, Korea)을 이용하여 반응 후 X-ray 필름에 감광하였다.

quantitative PCR

분화 또는 미분화된 3T3-L1 세포로부터 NucleoSpin RNA reagent kit(Macherey-Nagel)를 이용하여 total RNA를 분리한 후, cDNA 합성은 ReverTra Ace-a synthesis kit(Japan)를 이용하였다. quantitative PCR은 5x HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Supermix(Solis Biodyne, Estonia) 와 cDNA 그리고 프라이머를 혼합하여 40 사이클을 수행 하였다, 사용된 프라이머는 하기의 표 1과 같다.

번호	프라이머 이름	서열 (5'→3')
1	m-PPARγ-F	CAAGAATACCAAAGTGCGATCAA
2	m-PPARγ-R	GAGCTGGGTCTTTTCAGAATAATAAG
3	m-C/EBPα-F	CTGGAAAGAAGGCCACCTC
4	m-C/EBPα-R	AAGAGAAGGAAGCGGTCCA
5	m-C/EBPβ-F	TGATGCAATCCGGATCAA
6	m-C/EBPβ-R	CACGTGTGTTGCGTCAGTC
7	m-C/EBPδ-F	GGGCAGTGGAGTAAGGTACAGA
8	m-C/EBPδ-R	GCACTGTCACCCATACAATGTT
9	m-aP2-F	GCCAGACACCCCTGCTA
10	m-aP2-R	GTTCTGGGCGTCACTCC
11	m-GLUT4-F	GACGGACACTCCATCTGTTG
12	m-GLUT4-R	GCCACGATGGAGACATAGC
13	m-ACC-F	GCGTCGGGTAGATCCAGTT
14	m-ACC-R	CTCAGTGGGGCTTAGCTCTG
15	m-FAS-F	GTTGGGGGTGTCTTCAACC
16	m-FAS-R	GAAGAGCTCTGGGGTCTGG
17	m-SCD-1-F	TTCCCTCCTGCAAGCTCTAC
18	m-SCD-1-R	CAGAGCGCTGGTCATGTAGT
19	m-SREBP-1c-F	GGTTTTGAACGACATCGAAGA
20	m-SREBP-1c-R	CGGGAAGTCACTGTCTTGGT
21	m-ATGL-F	TGACCATCTGCCTTCCAGA
22	m-ATGL-R	TGTAGGTGGCGCAAGACA
23	m-HSL-F	GCACTGTGACCTGCTTGGT
24	m-HSL-R	CTGGCACCCTCACTCCATA
25	m-MGL-F	TCGGAACAAGTCGGAGGT
26	m-MGL-R	TCAGCAGCTGTATGCCAAAG
27	m-ADD1-F	AGGCACACTTCATCAAGGCAG
28	m-ADD1-R	GGTAGCGCTTCTCAATGGCAT
29	m-Adipsin-F	GCCTGATGTCCTGCATCAAC
30	m-Adipsin-R	TTTTCGATCCACATCCGGTA

< 실험예 1> 흑무 추출물의 세포독성 테스트

흑무추출물(BRE)이 세포에 독성효과가 있는지 여부를 확인하기 위해 흑무추출물을 세포에 처리 후 세포 생존율을 MTT Assay로 분석하고 그 결과를 도 1에 나타내었다.

3T3-L1 세포에 흑무추출물(BRE)을 200~12.5ug/ml로 처리하고 24~48시간 동안 배양하였다. 그 후, MTT 용액을 넣고 4시간 후 DMSO 용액에 녹이고 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 흑무추출물을 24시간 동안 처리한 군에서는 세포독성이나 세포증식 효과는 관찰되지 않았다. 그러나 흑무추출물을 200ug/ml로 48시간 동안 처리한 군에서는 처리하지 않은 대조군에 비해 세포증식 효과를 보였다.

< 실험예 2> 흑무 추출물 분획물의 세포독성 테스트

에탄올(EtOH)에 추출된 흑무추출물(BRE)을 헥산(hexane), 에틸아세테이트(EtOAc), 부탄올(BuOH), 물(H₂0) 용매를 이용하여 분획하였다. 그리고 에탄올(EtOH) 추출물과 각 분획물을 3T3-L1 세포에 48시간 동안 처리하고 세포 생존율을 MTT Assay로 분석하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.

에탄올(EtOH)에 추출된 흑무추출물(BRE)을 1500~187ug/ml로 처리한 결과 고농도에서 세포독성을 보였다. 헥산 분획물과 에틸아세테이트 분획물을 처리한 군에서는 처리 농도 의존적으로 세포 증식 효과를 보이고, 부탄올 분획물과 물 분획물을 처리한 군에서는 경미한 세포독성 효과를 보였다.

< 실험예 3> 흑무추출물의 지질합성 억제 효과

3T3-L1 세포에 MDI(0.5mM 3-Isobutyl-1-methylxanthine, 1uM Dexamethasone, 10㎍/㎖ Insulin) 처리하여 지방세포로 분화를 유도하였다. 그리고 흑무추출물(BRE)을 각각 200, 100, 50, 25㎍/㎖로 3회(0, 2일, 4일)처리 후 7일에 Oil Red O 염색을 진행하였다. 그 후, 현미경으로 관찰하고, 지질에 염색된 Oil Red O의 함량을 측정하여 각각 도 3(A), 도 3(B)에 나타내었다.

MDI 처리군에서는 비처리군에 비해 3.5배 높은 지질함량을 보였으며, 여기에 흑무추출물 처리시 처리 농도의존적으로 지질합성이 억제되는 것을 확인하였다.

또한, 3T3-L1 세포에 MDI를 처리하여 지방세포로 분화유도 하면서 흑무 잎 추출물(BRE 2)을 500~ 250㎍/㎖로 처리하고 Oil-Red-O 염색을 진행하였다. 그 후 세포를 현미경으로 관찰하고 지질에 염색된 Oil Red O의 함량을 측정하여 각각 도 4(A), 도 4(B)에 나타내었다.

그 결과 MDI만 처리한 군 보다 흑무 잎 추출물(BRE 2)을 500ug/ml 처리한 군에서는 77%의 지질합성 억제효과를 보였으며, 250ug/ml 처리한 군에서는 10%의 지질합성 억제 효과를 보였다.

< 실험예 4> DMI(Dimethyl-indole)의 지방세포 분화 촉진 효과

다이메틸인돌(dimethyl-indole, DMI)은 글루코시놀레이트(glucosinolate) 중 하나인 인돌-3-카비놀(indole-3-carbinol)이 이합체(dimer)를 형성한 화합물로서 십자과 채소를 섭취하면 위와 장에서 자연적으로 형성되는 화합물이다. DMI를 3T3-L1 세포에 처리하여 지방세포 분화에 미치는 영향을 확인하여 도 5에 나타내었다.

DMI를 12.5, 25, 50, 100uM로 처리시 이미 지방세포로 분화된 세포에 비해 1.8~2배 정도 높은 지질함량이 관찰되어, DMI는 지방세포로의 분화를 촉진함을 확인하였다. 따라서, 당뇨병 같은 대사 증후군에 사용할 수 있을 것으로 보인다.

< 실험예 5> AG490의 지방세포 분화 억제 효과

AG490은 JAK2의 활성억제제로 사용되는 약물이다. 이미 알려진 보고에 의하면 IL-6 활성화는 체세포에서 지방세포로의 분화 및 간세포에서 지방간 세포로 분화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져있다. 주요 경로는 IL-6/JAK2/STAT3 를 걸쳐 세포성장, 분화, 대사 등에 관여한다.

AG490을 전구지방세포인 3T3-L1에 MDI와 함께 처리하여 지방세포로의 분화를 억제하는지 여부를 분석하였다. 그 결과 AG490을 5, 10uM 로 처리한 군 모두에서 지방세포로의 분화가 억제된 것을 확인하고 이를 도 6에 나타내었다. 도 6 (A)는 세포를 현미경으로 관찰한 결과이고, 도 6 (B)는 축적된 지방량을 정량화한 것이다.

< 실험예 6> 흑무추출물(조추출물 및 분획물)의 지방세포로의 분화 억제 효과

주정으로 추출된 흑무 조추출물을 3T3-L1 세포에 MDI와 함께 처리하여 지방세포로의 분화 억제효과를 확인하였다. 그 결과 500 및 250ug/ml의 조추출물(BRE) 처리군에서 모두 지방세포로의 분화가 억제됨을 확인하여 도 7에 나타내었다.

상기 조추출물을 헥산(hexane), 에틸아세테이트(EtOAc), 부탄올(BuOH), 물(H₂0) 용매를 이용하여 분획하였다. 그리고 각 분획물을 3T3-L1 세포에 MDI와 함께 처리하여 지방세포로의 분화 억제효과를 확인하였다. 그 결과 에틸아세테이트 분획물 처리군에서 강력하게 지방세포 분화가 억제됨을 확인하였다(도 8).

상기의 3T3-L1 세포에 Oil Red O 염색을 수행하여 축적된 지방량을 정량하였다. 그 결과 MDI만 처리한 군에 비해 조추출물 처리군과 에틸아세테이트 분획물 처리군에서 지질 방울 및 지질 저장 수가 현저하게 감소 된 것을 확인하였다. (도 9)

< 실험예 7> 총 중성지방 분석을 통한 흑무추출물의 지질합성 억제 효과 확인

3T3-L1 세포에 MDI와 흑무추출물(BRE)을 처리하고 중성지방량을 측정한 결과를 도 10에 나타내었다. 아무것도 처리하지 않은 대조군의 중성지방 농도는 1.95 ± 0.26 nM 이고 MDI만 처리한 군에서의 농도는 11.80 ± 0.26 nM이다. 흑무추출물(BRE) 200, 100, 50, 25ug/ml과 MDI가 함께 처리된 군의 중성지방 농도는 각각 1.81 ± 0.13 nM, 1.84 ± 1.15 nM, 3.67 ± 0.13 nM, 10.67 ± 0.43 nM 이다(도 10). 따라서 흑무추출물이 지질합성을 농도의존적으로 억제하는 것을 확인하였다.

< 실험예 8> 흑무추출물의 PPAR -γ, C/ EBP -α, aP2 발현 억제효과

흑무추출물(BRE), AG490, PEITC, I3C 화합물을 처리한 후, 지방세포분화 억제에 직접적으로 관여하는 PPAR-γ, C/EBP-α, aP2 단백질 발현 양상을 웨스턴 블롯(Western blot)를 이용하여 분석하였다(도 11).

지방세포로 분화된 3T3-L1 세포에서 PPAR-γ, C/EBP-α, aP2 단백질 발현은 흑무추출물(BRE)과 AG490 처리군에서는 농도의존적으로 감소하였으나, PEITC, I3C 처리군에서는 발현양에 변화가 없었다(도 11). 이 결과는 분화과정 동안의 Oil-Red O 염색결과와 일치하였다(도 3 및 도 6).

< 실험예 9> 흑무추출물의 AMPK 활성화 효과

지방세포 미분화 단계와 분화단계에서 AMPK(5' 아데노신 모노포스페이트-활성화 단백질 카이네이즈) 및 PPAR-γ 분자의 발현을 비교하여 도 12에 나타내었다. 미분화세포에 MDI를 처리하여 분화하는 8일 동안 2일 간격으로 분석하였다.

AMPK 발현은 분화를 유도하지 않은 세포에서 증식이 될수록 점차 증가하였다. 그러나 이때 PPAR-γ은 발현되지 않았다.

MDI를 처리하여 지방세포로 분화를 유도한 세포에서는 AMPK, PPAR-γ 모두 점진적으로 발현양이 증가하였다. 따라서 AMPK, PPAR-γ의 발현은 지방세포로의 분화에 필수적으로 요구된다는 것을 알 수 있다.

또한 MDI처리를 통해 지방세포로의 분화를 유도하면서 흑무추출물(BRE)을 함께 처리한 군에서는 2일~8일 동안 흑무추출물을 처리한 군 모두에서 PPAR-γ의 발현이 감소하였다. 또한, 흑무추출물 처리군에서 AMPK가 많이 활성화되는 것을 확인하였다(p-AMPK).

따라서 AMPK 활성은 PPAR-γ 및 C/EBP 발현을 억제하여 지방구 합성을 억제하는 것으로 보인다.

< 실험예 10> 흑무 추출물의 C/ EBP -β 발현 촉진 효과

이미 알려진 연구 보고에 의하면 C/EBP-β의 발현은 초기의 지방세포분화에 매우 중요한 기능을 한다. MDI를 전구지방세포에 처리하면 C/EBP-β의 발현이 촉진되어 C/EBP-α와 PPAR-γ를 촉진하여 지방세포의 분화가 시작된다.

본 발명의 흑무추출물(BRE)을 처리하면 C/EBP-β 발현은 증가하지만 C/EBP-α와 PPAR-γ의 발현은 감소하는 것을 확인하였다 (도 13).

< 실험예 11> 흑무 추출물의 지방분화 관련 유전자 발현 억제 효과

흑무추출물(BRE) 처리에 의해 지방분화에 관련된 15개 유전자의 발현이 억제 되는 것을 확인하여 도 14a 내지 도 14e에 나타내었다.

3T3-L1 세포에 MDI와 흑무추출물(BRE)을 처리하고 분화관련 15개 유전자(C/EBP-α, C/EBP-β, C/EBP-δ, PPAR-γ, SREBP-1c, ACC, FAS, SCD-1, ADD1, ATGL, HSL, Adipsin, GLUT4, aP2, MGL)의 mRNA를 실시간유전자 증폭기를 이용하여 정량분석 하였다.

C/EBP-β 유전자는 전구지방세포에서의 분화시발 인자로 알려져있다. 분화 후 2일과 6일에서 mRNA 발현양상을 비교하였다. MDI만 처리한 군에서는 6일에서가 2일보다 약 3배 많이 발현되었다. 흑무추출물을 함께 처리한 군에서는 2일 및 6일 모두 발현이 감소하는 양상을 보였으나 2일에서는 200ug/ml 처리군에서 발현이 증가하는 특징을 보였다. 그리고 6일 처리군에서는 2일보다 C/EBP-β발현이 약 2배이상 많이 발현됨을 확인하였다(도 14a).

C/EBP-α 유전자는 C/EBP-β에 의해서 발현이 조절되는 것으로 알려져있다. MDI 처리군에서 2일, 6일 모두 발현양이 급상승하였으며 6일 처리군에서는 2일보다 25배 이상 많이 발현되었다. 따라서 C/EBP-α는 지방세포 분화 및 조절에 매우 중요한 유전자임을 확인하였다. 그리고 흑무추출물 처리군에서는 2일, 6일 모두 흑무추출물 농도의존적으로 C/EBP-α 발현양이 감소하였다(도 14a). 흑무추출물의 C/EBP-α 발현 억제효과는 2일에서는 90%(200ug/ml), 73%(100ug/ml), 24%(50ug/ml), -10%(25ug/ml)이고, 6일에서는 98.1%(200ug/ml), 89%(100ug/ml), 50%(50ug/ml), 15%(25ug/ml) 이다.

C/EBP-δ(CCAAT/enhancer binding protein-δ) 유전자는 전구지방세포에서 분화초기에 C/EBP-β와 함께 C/EBP-α 및 PPAR-γ를 조절하는 유전자이다. 분화된 세포에서의 C/EBP-δ 발현은 미분화 세포에서 보다 2일에서는 2.6배, 6일에서는 1.7배 이상 mRNA가 많이 발현되었다(도 14a). 흑무추출물의 C/EBP-δ 발현 억제효과는 2일에서는 82.4%(200ug/ml), 68.8%(100ug/ml), 34.1%(50ug/ml), 14%(25ug/ml)이고, 6일에서는 83.7%(200ug/ml), 44.8%(100ug/ml), 21%(50ug/ml), 21.5%(25ug/ml)이다. MDI처리 후 2일과 6일에서 C/EBP-δ mRNA 발현 비교에서는 6일에서가 2일에 비교해 약 1.15배 증가하였다. 흑무추출물은 2일 및 6일 모두 농도 의존적으로 C/EBP-δ mRNA 발현을 억제 하였다(도 14a).

PPAR-γ 유전자는 C/EBP-β, SREBP-1에 의해 발현이 조절된다. 이 유전자는 지질, 지방합성에 매우 중요한 역할을 한다. 분화된 세포에서 PPAR-γ 발현은 미분화 세포에서 보다 2일에서는 8배, 6일에서는 36배 이상 mRNA가 많이 발현되었다(도 14b). 흑무추출물의 PPAR-γ 발현 억제효과는 2일에서는 72%(200ug/ml), 57.5%(100ug/ml), 3%(50ug/ml), -18%(25ug/ml)로 나타났다. 6일에서는 95.5%(200ug/ml), 94.2%(100ug/ml), 55.3%(50ug/ml), 33.5%(25ug/ml)의 mRNA 발현 억제 효과를 보였다.

SREBP-1c 유전자는 지방대사 및 콜레스테롤 대사에 매우 중요한 기능을 한다. 분화된 세포에서의 SREBP-1c mRNA 발현은 미분화 세포에서 보다 2일에서는 2배, 6일에서는 8배 이상 많이 발현되었다(도 14b). 흑무추출물의 SREBP-1c 발현 억제효과는 2일에서는 25%(200ug/ml), 32.5%(100ug/ml), 32%(50ug/ml), 25%(25ug/ml)로 나타났다. 6일에서는 85.3%(200ug/ml), 76.2%(100ug/ml), 54%(50ug/ml), 42%(25ug/ml)의 mRNA 발현 억제 효과를 보였다. MDI 처리된 6일 처리군에서는 2일 처리군보다 SREBP-1c mRNA가 4배 많이 발현되었다(도 14b). 그러나 흑무처리군 2일에서는 25%로 억제하는 양상을 보였으며, 6일 처리군에서는 흑무 추출물 농도의존적으로 SREBP-1c mRNA 발현이 억제되었다.

ACC(Acetyll-CoA-carboxylase) 유전자는 지방산과 콜레스테롤 합성을 조절하는 유전자로서 SREBP-1,2에 의해 조절된다. 분화된 세포에서 ACC 발현은 미분화 세포에서 보다 2일에서는 1.5배, 6일에서는 19배 이상 mRNA가 많이 발현되었다(도 14b). 분화유도 후 2일에서는 흑무추출물은 ACC 발현을 유의적으로 억제하지는 못했다. 6일에서는 92.2%(200ug/ml), 84.5%(100ug/ml), 50%(50ug/ml), 22%(25ug/ml)의 mRNA 발현 억제 효과를 보였다. MDI 처리된 6일 처리군에서는 2일보다 12배 많이 발현되었다(도 14b).

FAS(fatty acid synthase)는 지방산 합성에 중요한 유전자로서 SREBP-1,2에 의해서 조절된다. 분화된 세포에서 FAS mRNA 발현은 미분화 세포에서 보다 2일에서는 3배, 6일에서는 13배 이상 mRNA가 많이 발현되었다(도 14c). 분화유도 후 2일 처리군에서는 흑무추출물은 FAS 발현을 유의적으로 억제하지는 못했다. 6일에서는 93.7%(200ug/ml), 84.8%(100ug/ml), 25.4%(50ug/ml), 11.8%(25ug/ml)의 mRNA 발현 억제 효과를 보였다. MDI 처리된 6일 처리군에서는 2일보다 7.8배 많이 발현되었다(도 14c).

SCD-1(stearoyl-CoA desaturase-1)은 SREBP-1c에 의해 조절되는 유전자로서 지질합성에 주요한 기능을 한다. 분화된 세포에서 SCD-1 발현은 미분화 세포에서 보다 2일에서는 8.3배, 6일에서는 670배 이상 mRNA가 많이 발현되었다(도 14c). 흑무추출물의 SCD-1 발현 억제효과는 2일에서는 49%(200ug/ml), 42%(100ug/ml), 24%(50ug/ml), 14.5%(25ug/ml), 6일에서는 99.6%(200ug/ml), 98.6%(100ug/ml), 83%(50ug/ml), 62%(25ug/ml) 이다. 흑무추출물은 2일, 6일 모두 농도 의존적으로 SCD-1 mRNA 발현을 억제 하였다(도 14c).

ADD1 (adipocyte differentiation and determination factor 1)은 SREBP-1과 함께 PPAR-γ, C/EBP-α를 조절하는 유전자로서 전구지방세포에서 지방세포로 분화하는데 매우 중요한 유전자이다. 2일 및 6일 모두에서 흑무처리군 농도 의존적으로 mRNA 발현이 억제 되었다(도 14c). 분화된 세포에서 ADD1 발현은 미분화 세포에서 보다 2일에서는 2.3배, 6일에서는 8.2배 이상 mRNA가 많이 발현되었다(도 14c). 흑무추출물의 ADD1 발현 억제효과는 2일에서는 40%(200ug/ml), 35%(100ug/ml), 17.4%(50ug/ml), 4.4%(25ug/ml) 이고, 6일에서는 81.4%(200ug/ml), 73.7%(100ug/ml), 60.5%(50ug/ml), 35.2%(25ug/ml) 이다. MDI 처리 후 2일과 6일에서 ADD1 mRNA 발현을 비교하면 6일에서가 2일에 비해 약 4배 많이 발현되었다. 흑무추출물은 2일, 6일 모두 농도 의존적으로 ADD1 mRNA 발현을 억제 하였다(도 14c).

ATGL(adipocyte triglyceride lipase) 유전자는 중성지방을 글리세롤과 지방산으로 전환시키는, 지방분해 역할을 한다. 분화된 세포에서 ATGL 발현은 미분화 세포에서 보다 2일에서는 13배, 6일에서는 600배 이상 mRNA가 많이 발현되었다(도 14d). 흑무추출물의 ATGL 발현 억제효과는 2일에서는 76.3%(200ug/ml), 64.7%(100ug/ml), 18.4%(50ug/ml), 18.1%(25ug/ml) 이고, 6일에서는 99.5%(200ug/ml), 90.1%(100ug/ml), 36.5%(50ug/ml), 15.3%(25ug/ml) 이다. MDI 처리 후 2일과 6일에서 ATGL mRNA발현을 비교하면, 6일에서가 2일에 비해 약 47배 많이 발현되었다. 흑무추출물은 2일, 6일 모두 농도 의존적으로 ATGL mRNA 발현을 억제 하였다(도 14d).

HSL(hormone sensitive lipase) 유전자 역시 지방을 분해하는 역할을 한다. 분화된 세포에서 HSL 발현은 미분화 세포에서 보다 2일에서는 31배, 6일에서는 671배 이상 mRNA가 많이 발현되었다(도 14d). 흑무추출물의 HSL발현 억제효과는 2일에서는 80%(200ug/ml), 77.6%(100ug/ml), 27%(50ug/ml), 21.3%(25ug/ml) 이고, 6일에서는 99.2%(200ug/ml), 91.1%(100ug/ml), 28.8%(50ug/ml), 34.3%(25ug/ml) 이다. MDI처리 후 2일과 6일에서 HSL mRNA발현을 비교하면 6일에서가 2일에 비해 약 25배 많이 발현되었다. 흑무추출물은 2일, 6일 모두 농도 의존적으로 HSL mRNA 발현을 억제 하였다(도 14d).

Adipsin은 분화된 지방세포에서 강하게 발현되는 유전자로서 지방세포 유전자 마커로 알려져있다. 분화된 세포에서 Adipsin 발현은 미분화 세포에서 보다 2일에서는 53배, 6일에서는 13259배 이상 mRNA가 많이 발현되었다(도 14d). 흑무추출물의 Adipsin 발현 억제효과는 2일에서는 99%(200ug/ml), 96.3%(100ug/ml), 62.3%(50ug/ml), 28%(25ug/ml) 이고, 6일에서는 99.6%(200ug/ml), 97.8%(100ug/ml), 56.2%(50ug/ml), 35.9%(25ug/ml) 이다. MDI처리 후 2일과 6일에서 Adipsin mRNA 발현을 비교하면 6일에서가 2일에 비교 약 1900배 많이 발현되었다. 흑무추출물은 2일, 6일 모두 농도 의존적으로 Adipsin mRNA 발현을 억제하였다(도 14d).

GLUT4 (glucose transporter 4) 유전자는 지방형성 유전자이다. 도 14e를 보면 2일과 6일에서 미분화 세포와 분화세포간의 GLUT4 mRNA 발현 차이는 각각 400배와 30,000배 차이를 보인다. 흑무추출물의 GLUT4 발현 억제효과는 2일에서는 97%(200ug/ml), 96.5%(100ug/ml), 62%(50ug/ml), 27%(25ug/ml) 이고, 6일에서는 99.7%(200ug/ml), 99.1%(100ug/ml), 78%(50ug/ml), 50%(25ug/ml) 이다(도 14e).

aP2(fatty acid-binding protein 4) 유전자는 지방형성 유전자로서 분화된 세포에서의 aP2 발현은 미분화 세포에서 보다 2일에서는 65배, 6일에서는 45배 이상 mRNA가 많이 발현되었다. 흑무추출물의 aP2 발현 억제효과는 2일에서는 90%(200ug/ml), 87%(100ug/ml), 73%(50ug/ml), 28%(25ug/ml) 이고, 6일에서는 94.3%(200ug/ml), 82%(100ug/ml), 52%(50ug/ml), 44%(25ug/ml) 이다.

MGL 유전자는 MGL(monoacylglyceride lipase)을 코딩하는 유전자로써, 지방분해 반응에 역할을 하는 유전자이다. 분화된 세포에서 MGL 발현은 미분화 세포에서 보다 2일에서는 유의적인 차이는 없었다. 그러나 6일에서는 280배 이상 mRNA가 많이 발현되었다(도 14e). 흑무추출물의 MGL 발현 억제효과는 2일에서는 55.3%(200ug/ml), -13%(100ug/ml), -11%(50ug/ml), -55.3%(25ug/ml) 이고, 6일에서는 99.6%(200ug/ml), 99.14%(100ug/ml), 87.2%(50ug/ml), 54.8%(25ug/ml) 이다. MDI처리 후 2일과 6일에서 MGL mRNA 발현을 비교하면 6일에서가 2일에 비해 약 164배 증가하였다. 흑무추출물은 2일 처리군에서는 고농도에서만 억제효과를 보였지만, 6일 처리군 에서는 농도 의존적으로 MGL mRNA 발현을 억제 하였다(도 14e).

이상의 결과를 보면 흑무추출물이 지질 축적을 감소시킨 것은 전사인자(transcription factor)인 C/EBP-α, C/EBP-δ와 PPAR-γ의 발현억제에서 기인 한 것이다. 전구지방세포에서 지방세포로의 분화는 C/EBP-α, C/EBP-δ 및 PPAR-γ를 비롯한 여러 전사 인자의 순차적 활성화에 의해 제어된다. 따라서 흑무추출물은 AMPK 활성화를 통해 전구지방세포에서 지방세포로의 분화에 관여하는 C/EBP-α, C/EBP-δ 및 PPAR-γ 전사인자를 억제하는 것이다. 또한, 흑무추출물은 상기 전사인자 외에도 지방 발생 관련 단백질의 발현을 감소시킴으로써 지방 생성을 억제하는 것이다.

따라서, 본 발명의 흑무추출물은 비만의 예방 또는 치료용 약학조성물 또는 식품조성물로 제조될 수 있다.

< 실험예 12> 흑무 추출물의 간세포에서 지질과산화물 합성 억제효과

지질과산화는 활성산소에 의해 매개되는 기작으로써 세포 및 간 손상을 일으킨다. MDA(Malondialhyde)는 지질과산화 과정 중에 생성되는 대표적인 활성 알데하이드로써, 산화적 스트레스, 알콜, 중성지방, 기타 화합물 등에 의해서 생성된다.

본 실험예에서는 1.5mM 올레산(OA;Oleic acid)을 흑무추출물(BRE)과 함께 HepG2 세포에 처리하여 흑무추출물의 MDA 합성억제 효과를 확인하여 도 15에 나타내었다. 올레산(OA) 처리군에서는 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 MDA가 1.7배 많이 생성되었다. 그리고 흑무추출물(BRE) 처리군에서는 37.5%(1000ug/ml), 33.4%(500ug/ml)의 MDA 합성 억제 효과를 보였다. 따라서 흑무추출물은 MDA를 유의하게 감소 시킴으로서 간세포를 보호하게 된다.

< 실험예 13> 흑무 추출물의 간세포에서 지질 합성 억제효과

HepG2 세포에 올레산(OA)과 흑무추출물(BRE)을 처리한 뒤 Oil-Red O 염색을 하고 중성지방량을 분석 하여 도 16 (A)에 나타내었다. Oil-Red O 염색 후 PBS로 3회 씻어낸 후 이소프로판올에 녹이고 520nm에서 OD 값을 측정하였다. 그 결과 올레산 처리군에서는 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 1.8배 중성지방이 증가한 것을 알 수 있다. 그리고 흑무추출물(BRE) 처리군에서는 30%(1000ug/ml), 21%(500ug/ml)의 지질합성 억제효과가 나타났다.

중성지방(triglyceride) 분석은 Quantification kit (abcam, ab65336)이용하였고 그 결과는 도 16 (B)에 나타내었다. 그 결과 올레산(OA) 처리군에서는 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 중성지방이 4.5배 증가한 것을 알 수 있다. 그리고 흑무추출물(BRE) 처리군에서는 38.3%(1000ug/ml), 25.8%(500ug/ml)의 지질합성 억제효과가 나타났다.

간세포에서의 상기 결과를 종합하면 흑무 추출물은 간세포를 보호할 뿐만 아니라 중성지방 합성을 억제하였다. 따라서 본 발명의 흑무 추출물은 간 보호 및 지방간 예방 또는 치료용 약학조성물 또는 식품조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 흑무 추출물이 약학 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 흑무 추출물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 흑무 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 다이사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분인 흑무 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

Claims

흑무(Raphanus sativus L. var niger) 추출물을 유효성분으로 포함하되,
상기 흑무 추출물은 파종 5개월 후 수확하여 얻어진 흑무의 뿌리를 물에 담근 후 열풍건조 한 다음, 주정으로 추출된 흑무조추출물을 에틸아세테이트 용매를 이용하여 분획하여 얻어진 것으로,
상기 흑무 추출물은 AMPK(5' 아데노신 모노포스페이트-활성화 단백질 카이네이즈)를 활성화 시키는 것을 특징으로 하는 비만 또는 지방간의 예방용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 흑무 추출물은 C/EBP-α, C/EBP-β, C/EBP-δ, PPAR-γ, SREBP-1c, ACC, FAS, SCD-1, ADD1, ATGL, HSL, Adipsin, GLUT4, aP2, MGL 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 예방은 지질합성을 억제하거나 지방세포로의 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
(a) 제 1항의 조성물의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 비만 또는 지방간의 예방 또는 치료용 약학조성물
(a) 제 1 항의 조성물의 식품학적 유효량; 및 (b) 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 비만 또는 지방간의 예방 또는 개선용 식품조성물