KR102073349B1 - 한약재 추출물을 포함하는 피부 주름 개선, 피부 미백 및 항염증용 조성물 - Google Patents
한약재 추출물을 포함하는 피부 주름 개선, 피부 미백 및 항염증용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 홍삼, 당귀, 황기, 천궁 및 작약을 포함하는 한약재 추출물을 이용한 염증 및 산화 억제에 관한 발명으로, 특별한 약재 조합을 통해 항염증 및 항산화 효과가 우수한 다양한 조성물을 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 피부 주름을 개선할 수 있고, 염증을 효과적으로 억제 및 조절할 수 있는 한약재 추출물에 관한 것이다.
몸을 보호하는 기관인 피부는 다양한 요인에 의해 변화가 일어나고, 외부로 노출된 기관으로서 그 변화를 쉽게 인지할 수 있다. 피부의 변화의 대표적인 요인인 노화의 진행에 따라 피부는 탄력이 감소하고, 주름이 형성되며 전체적으로 혹은 부분적으로 색상의 변화가 나타난다. 노화 외에도 스트레스, 자외선, 물리적 손상, 스트레스 등 다양한 요인에 의해 피부의 변화가 발생한다.
피부의 주름 개선과 미백은 화장품 등 피부 미용과 관련된 분야에서 중요한 연구 목적으로, 특히 피부 노화의 억제와 외적인 아름다움을 유지하기 위한 최우선 과제로 여겨지고 있다. 피부 주름 개선을 위한 다양한 화장품, 의약품, 의약외품, 식품 등이 지속적으로 개발되고 있고, 한국 공개특허 제10-2015-0143375호와 같이 한약재를 이용한 피부 주름 개선 조성물에 대한 연구도 활발하다.
염증은 생체 내 주요 조직이나 세포에 발생하는 손상을 회복하기 위한 면역작용으로 생체를 보호하기 위해 발생하는 자연스러운 방어 기재이나 과도하거나 비이상적인 염증 반응은 생체에 예상할 수 없는 피해를 발생시킬 수 있다. 염증도 한약재를 이용하여 조절, 억제, 예방 혹은 치료가 가능한 현상으로 한국 공개특허 제10-2015-0019337호에서 인삼 또는 홍삼을 활용한 항염 조성물을 개시하고 있다.
본 발명자들은 한약재를 이용한 연구를 지속한 결과, 피부 미백과 피부 주름개선에 효과적이고, 염증의 조절과 억제 효과를 가지는 조성물 개발하여 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명은 피부 미백, 피부 주름 개선 및 염증 발생의 조절과 억제에 우수한 효과를 가지는 한약재 추출물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 침향, 녹용, 당귀 및 산수유를 포함하는 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 침향, 녹용, 당귀 및 산수유를 포함하는 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명은 침향, 녹용, 당귀 및 산수유를 포함하는 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 침향, 녹용, 당귀 및 산수유를 포함하는 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 침향, 녹용, 당귀 및 산수유를 포함하는 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명은 침향, 녹용, 당귀 및 산수유를 포함하는 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 침향, 녹용, 당귀 및 산수유를 포함하는 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 건강기능식품 제공한다.
본 발명은 침향, 녹용, 당귀 및 산수유를 혼합한 한약재를 이용하여 피부 미백, 피부 주름 개선 및 염증의 조절과 억제에 현저히 우수한 다양한 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 한약재 추출물을 처리한 세포에서 한약재 추출물의 농도별세포생존율을 보여준다((A)B16F10, (B)RAW264.7, (C)CCD-986Sk).
도 2는 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 멜라닌 생성 억제 정도를 보여준다.
도 3은 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 티로시나아제(tyrosinase) 발현 정도를 보여준다.
도 4는 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 일산화질소(NO) 생성 억제 정도를 보여준다.
도 5는 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 IL-1β 생성 억제 정도를 보여준다.
도 6은 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 IL-6 생성 억제 정도를 보여준다.
도 7은 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 TNF-α생성 억제 정도를 보여준다.
도 8은 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 발현 정도를 보여준다.
도 9는 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 MMP-1 생성 억제 정도를 보여준다.
도 10은 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 MMP-3 생성 억제 정도를 보여준다.
도 11은 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 MMP-9 생성 억제 정도를 보여준다.
도 12는 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 TIMP-1 생성 억제 정도를 보여준다.
도 13은 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 Type-1 프로콜라겐(procollagen) 생성 증가 정도를 보여준다.
도 2는 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 멜라닌 생성 억제 정도를 보여준다.
도 3은 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 티로시나아제(tyrosinase) 발현 정도를 보여준다.
도 4는 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 일산화질소(NO) 생성 억제 정도를 보여준다.
도 5는 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 IL-1β 생성 억제 정도를 보여준다.
도 6은 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 IL-6 생성 억제 정도를 보여준다.
도 7은 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 TNF-α생성 억제 정도를 보여준다.
도 8은 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 발현 정도를 보여준다.
도 9는 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 MMP-1 생성 억제 정도를 보여준다.
도 10은 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 MMP-3 생성 억제 정도를 보여준다.
도 11은 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 MMP-9 생성 억제 정도를 보여준다.
도 12는 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 TIMP-1 생성 억제 정도를 보여준다.
도 13은 본 발명의 한약재 추출물의 농도별 Type-1 프로콜라겐(procollagen) 생성 증가 정도를 보여준다.
이하에서 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 따로 정의하지 않는 경우 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 내용으로 해석되어야 할 것이다. 본 명세서의 도면 및 실시예는 통상의 기술자가 본 발명을 쉽게 이해하고 실시하기 위한 것으로 도면 및 실시예에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 내용은 생략될 수 있으며, 본 발명이 도면 및 실시예로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 피부 미백, 피부 주름 개선 및 항염증에 탁월한 효과를 가지는 한약재 추출물을 이용한 다양한 조성물 및 이를 활용한 제품에 관한 것이다.
본 발명에서 한약재는 한의학에서 사용할 수 있는 둘 이상의 약재가 조합된 약제(藥劑)를 의미한다.
본 발명의 한약재 추출물은 침향(Aquilaria agallocha Roxburgh), 녹용(Cervus elaphus sibericus), 당귀(Angelica gigas) 및 산수유(Cornus officinalis)를 포함하는 한약재의 추출물이다.
한약 재료로 사용되는 다양한 약재들은 약재마다 서로 다른 약리 효과를 가지며, 대부분 생체 내에서 이로운 효과를 발생시킨다. 그러나, 둘 이상의 약재를 조합하는 경우 각각의 단일 약재가 가지는 약리 효과가 모두 발생되지 않을 수 있고, 오히려 각각의 약재가 가지는 효과가 약재의 조합에 의해 저해될 수도 있다. 이러한 현상은 약재에 포함된 약리 활성을 나타내는 성분들의 상호작용이나, 생체 내에서 서로 상반된 약리 기전을 유발한 결과에 의한 것일 수 있다. 즉, 한약재의 제조에 사용되는 약재의 종류와 그 조합 방법이 매우 다양하여, 단순히 여러 약재를 조합함으로써 조합에 사용된 각각의 약재가 가지는 약리 성분이 모두 나타나거나 그 효과가 증진된다고 볼 수 없는 경우가 많다.
본 발명은 한약재로 사용할 수 있는 다양한 약재 중 침향, 녹용, 당귀 및 산수유의 특수한 조합에 의해 나타나는 피부 미백, 피부 주름 개선 및 항염증 효과를 이용한 것으로서, 침향, 녹용, 당귀 및 산수유 각각의 단일 성분이나 이들 중 일부 조합에 의한 효과에 비해 현저히 우수하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 본 발명의 한약재 추출물은 멜라닌 생성을 억제할 수 있어, 피부의 색소 침작이나 피부의 색깔 변화 등을 예방하거나 치료할 수 있다. 이러한 효과를 가지는 본 발명의 한약재 추출물은 피부를 밝게 만들고 유지하기 위한 피부 미백 용도로 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면 본 발명의 한약재 추출물은 콜라겐 분해하는 주요 효소인 MMPs(Matrix Metalloproteinases)의 생성을 효과적으로 억제할 수 있어 콜라겐의 감소에 의한 피부 노화 현상의 예방 및 개선할 수 있다. 보다 구체적으로 콜라겐 분해 효소인 MMP-1, MMP-3 및 MMP-9의 생성을 효과적으로 억제할 수 있다. 그리고, MMPs의 활성을 비가역적으로 조절할 수 있는 억제제인 TIMP(tissue inhibitor of metalloprotease)의 생성도 증가시킬 수 있다. 또한, 콜라겐의 전구물질인 프로콜라겐(procollagen)의 생성을 증가시킬 수 있다. 이러한 효과를 가지는 본 발명의 한약재 추출물은 피부 탄력을 유지 및 증가시킬 수 있어 피부 주름을 예방하거나 개선하기 위한 용도로 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면 본 발명의 한약재 추출물은 세포에서 생성되는 일산화질소(nitric oxide, NO)와 염증 유발 사이토카인인 IL-1β, TNF-α, IL-6 등의 생성을 효과적으로 억제할 수 있다. 이러한 효과를 가지는 본 발명의 한약재 추출물은 염증을 억제하거나 조절하기 위한 용도로 사용할 수 있다.
본 발명의 한약재는 침향, 녹용, 당귀 및 산수유를 포함하는 경우 본 발명의 목적 및 효과를 달성할 수 있다. 바람직하게는 침향 2 내지 5 중량%, 녹용 25 내지 35 중량%, 당귀 25 내지 35 중량% 및 산수유 25 내지 35 중량%을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아닌바. 보다 바람직하게는 침향 1 중량부 대비 녹용 8 내지 10 중량부, 당귀 8 내지 10 중량부 및 산수유 8 내지 10 중량부이다. 가장 바람직하게는 침향, 녹용, 당귀 및 산수유를 침향 : 녹용 : 당귀 : 산수유 = 1 : 8.5 : 8.5 : 8.5 중량비로 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 한약재 추출물은 물 또는 알코올을 추출 용매로 하여 추출한 열수 추출물이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 한약재 추출물을 포함한 조성물은 의약 분야, 식품 분야 및 미용 분야를 비롯한 다양한 분야에서 여러 제품으로 활용될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 한약재 추출물을 유효성분으로 하는 항염증용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 한약재 추출물을 유효성분으로 하는 항염증용 건강기능식품을 제공할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 한약재 추출물을 유효성분으로 하는 항염증용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 한약재 추출물을 유효성분으로 하는 피부 미백용 건강기능식품을 제공할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 한약재 추출물을 유효성분으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 한약재 추출물을 유효성분으로 하는 피부 미백용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 한약재 추출물을 유효성분으로 하는 피부 주름 개선용 건강기능식품을 제공할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 한약재 추출물을 유효성분으로 하는 피부 주름 개선용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 한약재 추출물을 유효성분으로 하는 피부 주름 개선용화장료 조성물을 제공할 수 있다.
이외에도 본 발명의 한약재 추출물은 피부 보습 개선, 피부 탄력 개선, 기미나 주근깨의 제거 용도 등 다양한 피부 개선 용도로 사용할 수 있다. 그리고, 화장료, 의약품, 건강 식품 외에도 일반 가정이나 의료 분야에서 사용하는 다양한 의약외품의 주요 성분으로도 제공될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 한약재 추출물을 유효성분으로 하는 염증질환 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공할 수 있다. 염증질환은 급성 염증, 만성 염증 또는 과도한 염증이 발생하거나, 이로 인해 발병하는 질환을 포함할 수 있다. 염증성 질환은 아토피, 비염, 중이염, 폐렴, 위염, 결막염, 치주염, 인후염, 위궤양, 치질, 통풍, 관절염, 건염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 질환일 수 있다. 또한, 세포 내 활성산소 증가로 인해 발생하는 염증과 관계된, 심근경색, 고지혈증, 치매, 파킨슨 병, 간질, 뇌졸중, 당뇨병 및 당뇨병에 의한 합병증으로 이루어진 군에서 선택되는 질환일 수 있다.
본 발명에서 항염증용 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 담체로는 에탄올, 식염수, 완충액 및 글리세롤 등 해당 분야에서 일반적으로 사용되는 담체라면 제한되지 않고 사용할 수 있다. 그리고, 투여 방식에 따라 희석제나 부형제를 사용하여 특정 형태로 제제화 할 수 있고, 제제 형태는 편의에 따라 분말이나 환(丸)과 같은 고체나 액체 등 자유롭게 선택할 수 있다.
본 발명에서 건강기능식품은 인간, 인간외 동물, 식물 등 생물에 대한 영양공급이나 생체기능 향상에 효과적인 식품으로, 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 제조할 수 있다. 건강기능식품에는 감미료, 항료, 유화제, 조미료, 비타민, 미네랄, 아미노산, 방부제, 산화방지제, 착색제 등 다양한 식품 첨가물을 포함할 수 있다. 건강기능식품의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 음료이나 환(丸), 과자, 껌, 빵, 동물 사료, 식물 영양제 등 다양한 형태를 자유롭게 선택할 수 있다.
본 발명에서 화장료 조성물은 로션, 스킨, 크림, 화장수, 에센스, 샴푸, 린스나 마스크팩 등 미용 제품 전반의 유효성분으로 사용할 수 있는 조성물로, 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 물, 알코올, 에스테르, 글리콜, 보습제, 왁스제, 안료 등 다양한 첨가물을 포함할 수 있다. 화장료 조성물은 목적하는 제품의 형태에 제한되지 않고 사용될 수 있고, 스킨, 크림, 겔, 팩, 스프레이, 파우더 등 제품 형태에 따라 여러 담체를 이용할 수 있다.
본 발명에서 의약외품은 인간, 인간외 동물의 상처나 질병을 치료하거나 예방하기 위해 사용되는 제품으로 기구나 기계 등이 아닌 제품을 포함할 수 있다. 피부 외용제(연고)나 위생용품 등이 대표적이며 구체적인 예로, 비누와 같은 세정제, 청결제, 소독제, 드레싱 제제, 물티슈, 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 의약외품 조성물은 의약외품에 첨가될 수 있는 물질로서, 의약외품에 사용 가능한 다양한 첨가제나 담체와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 한약재의 추출물은 정제된 물이나 알코올에 한약재를 이루는 침향,녹용, 당귀 및 산수유를 투입하고 가열하는 일반적인 열수 추출방법으로 추출하여 사용하여도 본 발명의 목적 및 효과를 달성할 수 있다. 열수 추출후 여과 과정을 거쳐 불순물을 제거하는 과정을 더 거칠 수 있고, 여과 후 추가 농축과정을 더 수행할 수 있다. 열수 추출과정은 농축기, 달임기, 탕약기, 여과기(필터) 등 본 발명이 속하는 분야에서 일반적으로 사용되는 다양한 기기를 이용할 수 있으며 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 한약재 추출물에 의한 효과를 보다 상승시키기 위하여 다음과 같은 추출 방법을 통해 한약재 추출물을 얻을 수도 있다.
본 발명의 한약재 추출물은 선별 및 칭량된 약재를 법제화하는 법제화 단계, 법제된 약재를 경도가 높은 순서 또는 유효성분 추출률이 낮은 순서로 추출 보자기에 투입 및 적층하는 약재 적층단계, 적층된 약재와 용매를 1: 3 내지 6 중량비로 혼합하여 약재 추출물을 제조하는 추출단계를 포함하는 제조방법으로 제조할 수 있다. 추가로 약재 추출물을 70 내지 85℃에서 50 내지 70시간, 35 내지 65 brix% 로 농축시켜 농축물을 제조하는 농축단계와 농축물을 당류와 혼합하여 혼합 농축물을 형성하는 혼합단계를 더 포함하는 제조방법으로 제조할 수도 있다. 또한, 법제화 단계에 앞서, 약재를 선별, 칭량 및 세척하는 전처리 단계를 더 포함할 수 있다. 나아가 한약재 추출물이나 한약재 추출물의 농축액을 80 내지 110℃서 30분 내지 3시간 정도 멸균하는 멸균단계를 더 거쳐 산화 및 변성을 방지할 수 있다.
전처리 단계는 약재의 효능을 향상시키기 위해 품질이 좋은 약재를 선별하고, 약재에 존재하는 이물질을 제거하며, 일정한 비율로 칭량하는 방법으로 수행할 수 있다.
법제화 단계는 한약재 추출물에 의한 효과를 증가시키기 위해 한약재 추출물에 포함된 약재를 법제화 하는 것을 의미한다. 한약재 추출물에 포함된 침향, 녹용, 당귀 및 산수유는 본 발명이 속하는 분야에서 이용되는 방법으로 법제화 할 수 있고, 다음과 같은 방법으로 법제화하여 한약재 추출물의 효과를 보다 향상시킬 수도 있다. 녹용의 법제화의 경우 녹용을 우유 또는 산양유에 5 내지 15℃에서 36 내지 48시간 침지 및 숙성시킨 후 건조하고 10 내지 20분간 약 80 내지 95℃의 중불에서 볶아 녹용 특유의 누린내를 제거하고 소화 흡수력을 향상시킬 수 있다. 산수유 법제화의 경우 산수유 꼭지, 씨앗 등의 잡질을 제거하고 에탄올 수용액에 1 내지 2시간 90 내지 110 ℃에서 증숙하여 산수유가 갖는 특유의 신맛이 일부 제거할 수 있고, 소화력 및 보신삽정(補腎澁精) 효능을 향상시킬 수 있다. 당귀 법제화의 경우 에탄올 수용액에 침지 및 세척하여 당귀가 갖는 유효성분인 데쿠신 용출성을 향상시킬 수 있다.
침향의 법제화의 경우 500 내지 1000 메쉬(mesh) 단위로 분쇄하여 침향의 정유 성분들의 용출성을 향상시킬 수 있고, 에탄올 수용액을 이용한 고온고압 증숙공정과 휴지(休止)공정을 3회 내지 5회 반복 수행하여 정유 성분의 열변성을 방지하고 추출률을 향상시킬 수 있다. 구체적으로는 침향을 증숙기에 넣어 5 내지 15기압 하, 90 내지 150℃에서 30분 내지 3시간 동안 증숙한 다음, 1시간 내지 2시간 동안 추가적인 열과 압력을 공급하지 않고, 증숙기 내부의 열기로 서서히 정유성분이 배출되도록 하는 공정을 3회 내지 5회 반복 수행하여 침향의 정유성분이 서서히 배출되도록 함과 동시에 정유성분의 열변성을 방지할 수 있다.
약재들의 법제화 후, 약재의 혼합 및 추출을 수행하기 전 약재에 포함된 수분을 제거하는 건조단계를 거쳐 약재에 포함된 유효성분의 보유성과 농축성을 향상시킬 수 있다. 약재의 건조는 50 내지 70℃에서 3 내지 5시간 건조하여 건조효율을 높이고 탄화와 산화를 방지하는 것이 바람직하다.
약재의 적층단계에서는 약재가 가지는 물리적 특성과 약재별 추출률을 고려할 때, 약재의 경도가 높은 순서나 추출률이 낮은 순서로 추출 보자기에 투입 및 혼합하는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 경도가 가장 높은 침향을 투입하고 이어서 녹용, 당귀 및 산수유를 순차적으로 투입하여 추출시 추출률을 극대화 할 수 있다.
한약재 추출물 제조시 추가적으로 침향, 녹용, 당귀 및 산수유 외에 다른 부첨가 약재를 더 첨가할 수 있다. 부첨가 약재의 첨가시 침향, 녹용, 당귀 및 산수유는 주 약재가 된다. 부첨가 약재는 주 약재를 순서대로 추출 보자기에 투입 후 가장 나중에 투입하는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 부첨가 약재는 황기, 복령, 숙지황, 토사자, 홍삼, 복분자, 대추, 오미자, 마카, 목향, 소엽, 진피, 백출, 연잎, 후박, 시호, 맥문동, 구기자, 산약, 산양산삼, 박하, 인삼, 녹각, 용뇌 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 부첨가 약재 추가시 주 약재 100 중량% 대비 부첨가 약재를 5 내지 40중량% 첨가하여 주 약재에 의한 효과가 뚜렷하게 나타나도록 하는 것이 바람직하다.
추출단계에서는 적층한 약재를 용매와 혼합하여 추출기에서 한약재 추출물을 추출하는 단계이다. 용매는 에탄올이나 정제수를 사용할 수 있고, 길초근이나 천마를 정제수 또는 에탄올 수용액으로 추출한 추출 수용액을 사용할 수도 있다. 길초근이나 천마 추출 수용액의 용매로 사용하는 경우 한약재 추출물에 포함된 다양한 유효성분의 체내 흡수률을 높힐 수 있다. 추출단계는 30 내지 40℃에서 2시간 내지 6시간 추출하는 1차 추출단계와 90 내지 100℃에서 8시간 내지 20시간 추출하는 2차 추출단계로 구분할 수도 있다. 추출단계를 1차와 2차로 구분하는 경우 저온에서 수행되는 1차 추출단계를 통해 고온 추출(2차 추출단계)에 의한 유효성분의 파괴와 변성을 최소화할 수 있는 등 약재의 유효성분이 원활하게 추출될 수 있는 환경을 조성할 수 있다. 1차와 2차 추출 단계의 사이에 초음파 추출을 추가로 수행할 수 있다. 초음파 추출은 50 내지 70 ℃ 에서 20 내지 120kHz의 초음파를 가하여 10 내지 30분간 추출을 수행하여 추출 효율을 극대화 할 수 있다. 초음파 추출 과정에서 초음파 에너지에 의한 높은 압력으로 약재 내부 조직이 파괴되고 지방질의 이동거리가 짧아져 확산이 용이하게 되기 때문에, 약재와 약재에 포함된 다양한 성분의 혼합 효과를 상승시킬 수 있다.
혼합단계에서는 한약재 추출물이나 한약재 추출물의 농축물에 꿀, 당밀, 설탕, 전화당, 과당, 당알코올, 올리고당, 물엿 등과 같은 당류를 혼합하여 식감이나 맛을 향상시킬 수 있다.
이하에서 본 발명을 실시하기 위한 실시예에 대하여 설명한다. 실시예는 본 발명을 실시하기 위한 하나의 예시에 해당하는 것으로서 본 발명이 실시예에 의해 한정 해석되어서는 안된다.
이하 본 발명을 실시하기 위한 실시예에서 사용한 약재, 시약, 기기, 세포(세포배양 방법 포함) 및 한약재 추출물(한약재 제조방법 포함)은 다음과 같다.
1. 약재
침향, 녹용, 당귀 및 산수유를 준비하여 사용하였다.
2. 시약
에탄올(Duksan, Korea), DMEM(dulbecco'sModified Eagle's Medium)(Gibco BRL, U.S.A.), FBS(fetal bovine serum)(Gibco BRL, U.S.A.), 페니실린/스트렙토마잇니(penicillin/streptomycin)(Sigma, U.S.A.), 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)(Thermofisher, U.S.A.), 트리판블루(trypan blue)(Sigma, U.S.A.), EZ-Cytox(Daeilab, Korea), D-PBS(dulbecco'sphosphate bufferedsaline)(Welgene, Korea), IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)(Sigma, U.S.A.), NaOH(sodium hydroxide)(Sigma, U.S.A.), LPS(lipopolysaccharide)(Sigma, U.S.A.), Mouse IL-1 beta ELISA Kit(komabiotech, Korea), Mouse IL-6 ELISA Kit(komabiotech, Korea), Mouse TNF-alpha ELISA Kit(komabiotech, Korea), HumanMatrix Metalloproteinase 1 ELISA Kit(Elabscience, China), HumanMatrix Metalloproteinase 3 ELISA Kit (Elabscience, China), Human Matrix Metalloproteinase 9 ELISA Kit (Elabscience, China), HumanTissue Inhibitors of Metalloproteinase 1 ELISA Kit (Elabscience, China). HumanProcollagen Ⅰ ELISA Kit(Elabscience, China), HumanHyaluronic Acid ELISA Kit(Mybiosource, U.S.A.), HumanFilaggrin ELISA Kit(Mybiosource, U.S.A.), HumanHyaluronan Synthase 1 ELISA Kit(Mybiosource, U.S.A.), Human Hyaluronan Synthase 2 ELISA Kit(Mybiosource, U.S.A.), HumanHyaluronan Synthase 3 ELISA Kit(Mybiosource, U.S.A.)를 사용하였다.
3. 기기
클린벤치(clean bench)(Vision scientific, Korea), 오토크래이브(autoclave)(Sanyo, Japan), 볼텍스믹서(vortex mixer)(Vision scientific, Korea), 원심분리기(centrifuge)(Hanil, Korea), 딥-프리저(deep-freezer)(Sanyo, Japan), 워터배스(water bath)(Vision scientific, Korea), 아이스-메이커(ice-maker) (Vision scientific, Korea), 플레이트 셰이커(plate shaker)(Lab-Line, U.S.A.), 마이크로 플레이트 리더(micro plate reader)(Molecular Devices, U.S.A.)를 사용하였다.
4. 세포
ATCC(American Type CultureCollection)에서 분양받은 B16F10, RAW264.7, CCD-986Sk 세포를 실험에 사용하였다. 세포는 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건이 유지되는 세포배양기에서 배양하였고, 2-3일 주기로 계대 배양 후 실험에 사용하였다.
5. 한약재 추출물
한약재 추출물은 다음과 같은 제조방법으로 제조하여 사용하였다.
법제화한 침향 10g, 녹용 85g, 당귀 85g 및 산수유 85g을 준비하였다. 약재각각의 법제화는 공지의 법제화 방법을 사용하거나 적절하게 변경하여 이용할 할 수 있다. 침향은 500~1000mesh 크기로 분쇄하여 에탄올 수용액에 침지 처리하여 법제화할 수 있고, 녹용은 우유 또는 산양유에서 5 내지 15 ℃에서 36 내지 48시간 동안 침지 및 숙성 건조한 후 10분 내지 20분간 중불(약 80 내지 95℃)에서 볶아 법제화 할 수 있고, 당귀는 에탄올 수용에 침지 및 세척하여 법제화 할 수 있고, 산수유는 꼭지, 씨앗 등의 잡질을 제거하고 에탄올 수용액에 1시간 내지 2시간 90 내지 110℃에서 증숙하여 법제화 할 수 있다. 각각의 약재 법제화에서는 약재에 흡수된 수분을 증발시키기 위해 50 내지 70℃에서 3 내지 5시간 정도 건조 단계를 거칠 수 있다.
법제화한 약재는 침향, 녹용, 당귀, 산수유 순서대로 추출 보자기에 투입 및 적층하고, 800ml의 정제수와 혼합하였다. 이 후, 탕약기에서 30 내지 40℃로 온도를 유지하면서 4시간 동안 1차 추출하고, 90 내지 100℃로 온도를 유지하면서 14시간 동안 2차 추출하는 추출 단계를 수행하여 한약재 추출물을 얻었다. 필요에 따라 1차 추출과 2차 추출 사이에 약 60℃에서 70 kHz의 초음파를 가하여 20분간 초음파 추출을 수행하였다.
한약재 추출물은 동결건조 과정을 통해 분말화하여 냉동 보관(-80℃)하여 사용하였고, 각각의 실시예에서 필요한 농도로 희석하여 사용하였다.
세포생존율 측정
B16F10, CCD-986Sk 세포는 96-웰 플레이트(96-well plate)에 2×104 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양 하였다. 실험 전 새로운 배양액으로 교체하였고, 한약재 추출물을 20, 50, 100, 150, 200㎍/㎖ 농도로 처리하여 다시 48시간 동안 배양하였다. RAW264.7 세포는 1×105 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양 하였다. 실험을 하기 전에 새로운 배양액으로 교체하였고, 20, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 10㎕의 EZ-Cytox 용액을 첨가하여 세포배양기에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 450㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군(한약재 추출물을 처리하지 않은 세포군)에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다([표 1], 도 1(A), 도 1(B), 도 1(C)).
[표 1] B16F10, RAW264.7, CCD-986Sk 세포에 한약재 추출물 처리시 세포 생존율
세포 생존율 측정 결과, 한약재 추출물에서 세포 독성은 거의 나타나지 않았다.
한약재 추출물의 미백 효과 확인
6-웰 플레이트(well plate)에 B16F10 세포를 2×104 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하여 안정화 시켰다. 안정화 후 100μM IBMX와 한약재 추출물을 20, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 다시 48시간 동안배양하였다. 이후, 세포를 이용하여 각 측정 방법에 따라 진행하였다.
멜라닌 생성을 위해 IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)와 한약재 추출물을 처리하여 배양한 세포를 PBS로 세척하고, 1N NaOH 120㎕를 첨가하여 95℃에서 15분 동안 멜라닌을 용해시킨 후 450㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 멜라닌 생성량을 백분율로 표시하였다.
세포 내 유전자 발현량 측정은 다음과 같이 진행하였다. IBMX와 한약재 추출물을 처리하여 배양한 세포에 이지블루(easy blue)를 1㎖씩 넣어 혼합 후 클로로포름(chloroform)을 200㎕씩 첨가하여 다시 혼합하였다. 이를 13,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 400㎕의 상층액을 회수하여 바인딩 버퍼(binding buffer)를 400㎕씩 넣어 혼합하여 컬럼(column)에 주입하고 원심분리 하였다. 컬럼(column)에 세척 버퍼 A(washing bufferA)를 700㎕씩 넣어 원심분리 하고 세척 버퍼 B(washing bufferB)를 700㎕씩 넣어 원심분리 후 용출 버퍼(elution buffer) 50㎕을 넣고 원심분리 하여 RNA를 추출하였다. 역전사(reverse transcription) 반응은 RT premix (reverse transcriptase, reaction buffer,dNTPs, dT20 primer, stabilizer)에 total RNA를 1㎍ 첨가하고 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 최종부피가 20㎕가 되도록 하여 첨가하였다. 이 혼합액을 섞은 후 2,000rpm에서 5초간 원심 침강하고 45℃ 히팅 블록(heating block)에서 60분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성하였다. 이를 다시 95℃에서 5분 동안 반응시켜 M-MLV RT를 불활성화 시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 PCR(polymerase chain reaction)에 사용하였다. 합성이 완료된 cDNA를 증폭시키기 위하여 PCR을 진행하였다. PCR은 PCR premix (DNA polymerase, 250 mM dNTPs mix, PCR buffer)에 cDNA 1㎕와 각 프라이머(primer) 2㎕를 넣고 증류수를 최종 부피가 20㎕가 되도록 하여 첨가하여 다음과 같이 진행하였다. 94℃에서 5분 동안 1 cycle을 진행한 다음 94℃에서 15초, 각 프라이머의 어닐링(annealing) 온도에서 15초, 72℃에서 30초를 30~40 cycle 진행하였고 마지막으로 72℃에서 5분 후 서서히 온도가 내려가 4℃가 되었을 때 증폭이 완료된 DNA 샘플을 얻었다. 증폭된 DNA는 1% 아가로즈 겔(agarose gel)에 전기영동 하여 유전자 발현의 여부를 측정하였다. UV로 촬영하여 각 그룹별로 밴드(band)를 확인하였고 사용한 프라이머(primer)의 서열과 어닐링 온도는 [표 2]와 같다.
[표 2] 미백 효과 확인 실험의
PCR에
사용된
프라이머
서열 및
어닐링
온도
멜라닌 생성량을 측정한 결과, 정상군은 34.7±2.1%, 대조군은 100.0±3.1%로 나타낸 반면, 한약재 추출물은 20, 50, 100, 150, 200㎍/㎖ 농도에서 각각 99.1±4.5%, 98.7±2.9%, 98.4±5.7%, 95.9±1.5%, 87.7±4.4%로 나타나 200㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 (* : p<0.05) 감소가 나타났다(도 2).
유전자 발현량을 측정한 결과, 한약재 추출물 처리 군의 경우 멜라닌 합성에 특이적인 효소인 티로시나아제(tyrosinase) 유전자 발현량이 대조군에 비해 차이를 나타내지 않았다(도 3).
- 정상군 : IBMX를 처리하지 않은 세포군
- 대조군 : IBMX를 처리한 세포군
- 실험군 : IMBX 및 한약재 추출물을 농도별(20, 50, 100, 150, 200㎍/㎖)로 처리한 세포군
한약재 추출물의 항염증 효과 확인
6-웰 플레이트에 B16F10 세포를 2×104 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하여 안정화 시켰다. 안정화 후 LPS 100㎍/㎖와 한약재 추출물을 20, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 다시 48시간 동안 배양하였다. 이후, 세포를 이용하여 NO(Nitric oxide) 생성량과, IL-1β, IL-6, TNF-α 생성량을 측정하였다.
NO 생성량을 측정하기 위해, 96-웰 플레이트에 LPS와 한약재 추출물을 처리한 배양액과 표준용액(standard)을 100 ㎕씩 넣고 1 버퍼(buffer) 50㎕를 각 웰에 처리하여 10분간 상온에서 반응 한 후, N2 버퍼(buffer) 50㎕를 각 웰에 처리하고 10분간 반응시켰다. 반응 후 540㎚에서 흡광도를 측정하였으며 표준곡선(standard curve)를 기준으로 대조군(LPS를 처리한 세포군)에 대한 NO 생성량을 백분율로 표시하였다.
IL-1β, IL-6, TNF-α 생성량을 측정하기 위해 96 에 LPS와 한약재 추출물을 처리한 배양액과 표준용액(standard)를 100㎕씩 넣고 상온에서 120분간 반응시켰다. 웰에 있는 용액을 제거하고 세척 버퍼(washing buffer)를 이용하여 세척한 후 100 ㎕의 검출 항체(detection antibody)를 넣어 다시 상온에서 120분간 반응시켰다. 다시 세척 버퍼로 세척하고 발색효소(color development enzyme)을 100㎕씩 넣어 상온에서 30분간 반응시키고 세척 버퍼로 세척하였다. 이 후 발색용액(color development solution)을 100㎕씩 넣고 상온에서 10분간 반응시키고 100㎕의 스탑 솔루션(stop solution)을 추가하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였으며 표준곡선(standard curve)을 기준으로한 절대값으로 표시하였다.
세포 내 유전자 발현량 측정은 다음과 같이 진행하였다. LPS와 한약재 추출물을 처리하여 배양한 세포에 이지블루(easy blue)를 1㎖씩 넣어 혼합 후 클로로포름(chloroform)을 200㎕씩 첨가하여 다시 혼합하였다. 이를 13,000rpm에서 10분간 원심분리 후 400㎕의 상층액을 회수하여 바인딩 버퍼(binding buffer)를 400㎕씩 넣어 혼합하여 컬럼(column)에 주입하고 원심분리 하였다. 컬럼(column)에 세척 버퍼 A(washing bufferA)를 700㎕씩 넣어 원심분리 하고 세척 버퍼 B(washing bufferB)를 700㎕씩 넣어 원심분리 후 용출 버퍼(elution buffer) 50㎕을 넣고 원심분리 하여 RNA를 추출하였다. 역전사(reverse transcription) 반응은 RT premix (reverse transcriptase, reaction buffer,dNTPs, dT20 primer, stabilizer)에 total RNA를 1㎍ 첨가하고 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 최종부피가 20㎕가 되도록 하여 첨가하였다. 이 혼합액을 섞은 후 2,000rpm에서 5초간 원심 침강하고 45℃ 히팅 블록(heating block)에서 60분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성하였다. 이를 다시 95℃에서 5분 동안 반응시켜 M-MLV RT를 불활성화 시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 PCR(polymerase chain reaction)에 사용하였다. 합성이 완료된 cDNA를 증폭시키기 위하여 PCR을 진행하였다. PCR은 PCR premix (DNA polymerase, 250 mM dNTPs mix, PCR buffer)에 cDNA 1㎕와 각 프라이머(primer) 2㎕를 넣고 증류수를 최종 부피가 20㎕가 되도록 하여 첨가하여 다음과 같이 진행하였다. 94℃에서 5분 동안 1 cycle을 진행한 다음 94℃에서 15초, 각 프라이머의 어닐링(annealing) 온도에서 15초, 72℃에서 30초를 30~40 cycle 진행하였고 마지막으로 72℃에서 5분 후 서서히 온도가 내려가 4℃가 되었을 때 증폭이 완료된 DNA 샘플을 얻었다. 증폭된 DNA는 1% 아가로즈 겔(agarose gel)에 전기영동 하여 유전자 발현의 여부를 측정하였다. UV로 촬영하여 각 그룹별로 밴드(band)를 확인하였고 사용한 프라이머(primer)의 서열과 어닐링 온도는 [표 3]과 같다.
[표 3] 항염증 효과 확인 실험의
PCR에서
사용된
프라이머
서열
NO 생성량을 측정한 결과, 정상군은 36.8±7.8%, 대조군은 100.0±6.3%로 나타낸 반면, 한약재 추출물 20, 50, 100, 150, 200㎍/㎖ 농도에서 각각 95.2±5.5%, 86.9±5.4%, 76.7±2.8%, 71.2±7.3%, 61.2±5.2%로 나타나 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 (** : p<0.01, *** : p<0.001) 감소가 나타났다(도 4).
세포 내 IL-1β 생성량을 측정한 결과, 정상군은 9.2±1.7 pg/㎖, 대조군은 153.9±3.5 pg/㎖로 나타낸반면, 한약재 추출물 20, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖ 농도에서 각각 155.2±3.8 pg/㎖, 146.9±4.0 pg/㎖, 136.7±2.6 pg/㎖, 131.2±9.7 pg/㎖, 121.2±1.9 pg/㎖로 나타나 100, 150, 200 ㎍/㎖ 대조군에 비해 유의성 있는 (* : p<0.05, ** : p<0.01) 감소가 나타났다(도 5).
세포 내 IL-6 생성량을 측정한 결과, 정상군은 36.2±22.2 pg/㎖, 대조군은 1594.6±27.4 pg/㎖로 나타낸 반면, 한약재 추출물 20, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖ 농도에서 각각 1523.2±11.0 pg/㎖, 1390.4±33.3 pg/㎖, 1227.2±19.9 pg/㎖, 1139.2±21.7 pg/㎖, 919.2±18.5 pg/㎖로 나타나 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 (* : p<0.05, ** : p<0.01, *** : p<0.001) 감소가 나타났다(도 6).
세포 내 TNF-α 생성량을 측정한 결과, 정상군은 155.4±57.3 ng/㎖, 대조군은 2156.2±83.3 ng/㎖로 나타낸 반면, 한약재 추출물 20, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖ 농도에서 각각 2189.6±67.9 ng/㎖, 1998.7±55.1 ng/㎖, 1764.1±91.6 ng/㎖, 1637.6±70.1 ng/㎖, 1407.6±94.0 ng/㎖로 나타나 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 (* : p<0.05) 감소가 나타났다(도 7).
유전자 발현량을 측정한 결과, 한약재 추출물은 IL-1β, IL-6 유전자 발현량이 대조군에 비해 차이를 나타내지 않았으나, TNF-α 유전자 발현량은 대조군에 비해 감소가 나타났다(도 8).
- 정상군 : LPS를 처리하지 않은 세포군
- 대조군 : LPS를 처리한 세포군
- 실험군 : LPS 및 한약재 추출물을 농도별(20, 50, 100, 150, 200㎍/㎖)로 처리한 세포군
한약재 추출물의 주름개선 효과 확인
6-웰 플레이트(6-well plate)에 CCD-986Sk 세포를 2×104 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하여 안정화시켰다. 안정화 후 배지를 제거하고 PBS로 교체하여 UV-B(20 mJ/㎠)를 60초간 조사하였다. 이 후 한약재 추출물을 20, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 다시 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 배양액을 이용하여 세포 내 MMPs(matrix metalloproteinases), TIMP-1(tissue inhibitor of matrix metalloprotease-1), Type Ⅰ프로콜라겐(procollagen) 생성량을 측정하였다. 구체적으로, 96-웰 플레이트(96-well plate)에 UV-B 조사 및 한약재 추출물을 처리한 배양액과 표준용액(standard)을 100㎕씩 넣고 37℃에서 90분간 반응시킨다. 웰에 있는 용액을 제거한 후 100㎕의 검출 항체(detection antibody)를 넣어 다시 37℃에서 60분간 반응시키고 세척 버퍼(washing buffer)를 이용하여 3회 세척하였다. 세척 후 HRP conjugated 이차 항체를 100㎕씩 넣어 37℃에서 30분간 반응시키고 세척 버퍼를 이용하여 5회 세척하였다. 이 후 기질 시약(substratereagent)을 90㎕씩 넣어 37℃에서 15분간 반응시키고 50㎕의 반응 정지액(stop solution)을 추가하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였으며 표준곡선(standard curve)를 기준으로 절대 값으로 표시하였다. 실험 결과는 SPSS 18.0의 unpaired student's T-test와 ANOVA를 사용하여 통계처리 하였고 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001 수준에서 그 유의성을 검정하였다.
세포 내 MMP-1 생성량을 측정한 결과, 정상군은 14.1±3.8 pg/㎖, 대조군은 67.4±4.8 pg/㎖로 나타났다. 반면, 한약재 추출물 20, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖ 농도에서 각각 55.6±4.1 pg/㎖, 55.9±2.7 pg/㎖, 55.8±1.5 pg/㎖, 50.9±6.1 pg/㎖, 45.6±1.2 pg/㎖로 나타났고 특히 200㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 (** : p<0.01) 감소가 나타났다(도 9).
세포 내 MMP-3 생성량을 측정한 결과, 정상군은 4.7±2.6 pg/㎖, 대조군은 48.2±3.9 pg/㎖로 나타났다. 반면, 한약재 추출물 20, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖ 농도에서 각각 48.2±2.8 pg/㎖, 46.8±3.0 pg/㎖, 46.2±1.5 pg/㎖, 42.2±3.8 pg/㎖, 29.3±1.2 pg/㎖로 나타났고 특히 200㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 (** : p<0.01) 감소가 나타났다(도 10).
세포 내 MMP-9 생성량을 측정한 결과, 정상군은 8.7±5.2 pg/㎖, 대조군은 49.6±5.3 pg/㎖로 나타났다. 반면, 한약재 추출물 20, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖ 농도에서 각각 49.4±5.1 pg/㎖, 50.0±4.8 pg/㎖, 48.4±4.8 pg/㎖, 45.3±3.3 pg/㎖, 37.8±2.0 pg/㎖로 나타났고 특히 200㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 (** : p<0.01) 감소가 나타났다(도 11).
세포 내 TIMP-1 생성량을 측정한 결과, 정상군은 15.3±1.5 ng/㎖, 대조군은 9.9±1.3 ng/㎖로 나타났다. 반면, 한약재 추출물 20, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖ 농도에서 각각 9.8±1.8 ng/㎖, 9.9±1.3 ng/㎖, 10.3±1.3 ng/㎖, 10.5±1.7 ng/㎖, 11.3±1.6 ng/㎖로 나타났고 100, 150, 200 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 12).
세포 내 type Ⅰ 프로콜라겐(procollagen) 생성량을 측정한 결과, 정상군은 15.5±1.7 pg/㎖, 대조군은 7.4±0.2 pg/㎖로 나타났다. 반면, 한약재 추출물 20, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖ 농도에서 각각 7.5±0.2 pg/㎖, 7.9±0.5 pg/㎖, 9.1±0.9 pg/㎖, 9.8±0.6 pg/㎖, 10.4±1.2 pg/㎖로 나타났고 특히 100, 150, 200 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 (* :p<0.05, ** : p<0.01) 증가가 나타났다(도 13).
- 정상군 : UV-B를 처리하지 않은 세포군
- 대조군 : UV-B를 처리한 세포군
- 실험군 : UV-B 및 한약재 추출물을 농도별(20, 50, 100, 150, 200㎍/㎖)로 처리한 세포군
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comprising medicinal herb extract
<130> P18020310133
<160> 12
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<210> 1
<211> 20
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<220>
<223> [Table2]beta-actin forward primer
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 2
tcagcaatgc ctgggtacat 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> [Table2]tyrosinase reverse primer
<400> 4
taggtgcatt ggcttctggg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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tcagcaatgc ctgggtacat 20
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<223> [Table3]IL-1beta forward primer
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<223> [Table3]IL-6 forward primer
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- 침향 1 중량부를 기준으로, 녹용 8 내지 10 중량부, 당귀 8 내지 10 중량부 및 산수유 8 내지 10 중량부를 포함하는 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
- 삭제
- 침향 1 중량부를 기준으로, 녹용 8 내지 10 중량부, 당귀 8 내지 10 중량부 및 산수유 8 내지 10 중량부를 포함하는 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 건강기능식품.
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