KR102060253B1

KR102060253B1 - L-소르보스의 생산용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102060253B1
Application number: KR1020180099019A
Authority: KR
Inventors: 이정걸; 김태수; 고휘; 이정임
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2018-08-24
Filing date: 2018-08-24
Publication date: 2019-12-27

Abstract

본 발명은 L-소르보스의 생산용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 L-소르보스 생산용 조성물은 D-소르비톨을 L-소르보스로 전환시키는 D-소르비톨 탈수소화효소와, NADPH를 NADP⁺로 산화시켜 재생산성을 유도하는 NAD(P)H 산화효소를 커플링하여, D-소르비톨에서 L-소르보스로의 생산성을 증대시키는 효과가 있다. 따라서, L-소르보스와 관련된 식품, 약학 및 의약 산업에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

L-소르보스의 생산용 조성물 및 이의 용도{A composition for producing L-sorbose and uses thereof}

본 발명은 L-소르보스의 생산용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

희소 당(Rare sugars)은 항암 및 항바이러스제와 관련된 식품 및 약학 산업에서 널리 사용되고 있는 화학 물질이다(Gumina, G., FEMS microbiology letters 202, 9-15 (2001)). 또한 인간 면역 시스템을 자극하고 당뇨병을 제어하는데 사용한다[(Hossain, M. A. et al. Biochemical and biophysical research communications 405, 7-12 (2011)), (Lu, Y., Diabetes, obesity & metabolism 10, 109-134 (2008))]. 가장 중요한 희귀 당은 L-소르보스(L-sorbose)이며, 이는 L-ascorbic acid 생합성 출발 물질로서 주로 사용되고 있다[(Gao, L., Biotechnology progress 29, 1398-1404 (2013)), (Gao, L. et al. Metabolic engineering 24, 30-37 (2014)). 또한, 글리코시다아제 억제제 1-deoxygalactonojirim과, L-tagatose 및 L-iditol과 같은 희귀 당을 합성하는데도 이용되고 있다[(Huwig, A., Carbohydrate Research 305, 337-339 (1997)), (Leang, K. et al. Journal of bioscience and bioengineering 97, 383-388 (2004)), (Vongsuvanlert, V. & Tani, Journal of Fermentation Technology 66, 517-523 (1988))]. 희귀 당은 NAD(P)^+-의존적 폴리올 탈수소효소(NAD(P)^+-dependent polyol dehydrogenases)를 이용하여 생산될 수 있다. NAD(P)H의 해리와 관련된 폴리올 탈수소 효소의 정상-상태의 역동적 분석은 기질-포화 반응 조건 하에서 주된 비율-제한 단계이다.[Nidetzky, B., Chemico-biological interactions 143-144, 533-542 (2003)].

그러나, D-소르비톨 탈수소 효소(D-sorbitol dehydrogenase), L-글루타메이트 탈수소 효소(L-glutamate dehydrogenase) 및 mannitol dehydrogenase과 같은 폴리올 탈수소 효소는 NAD(P)H와 결합 후 비율-제한적 단계를 나타내는 경쟁적 방식으로 NAD(P)H에 의한 생산물 억제가 나타난다[(Lunzer, R., The Biochemical journal 336 (Pt 1), 91-99 (1998)), (Yang, X. P., Archives of biochemistry and biophysics 477, 206-210 (2008)), (Odman, P., Asymmetry 15, 2933-2937 (2004)), (Schwartz, D., Journal of Biotechnology 33, 95-101 (1994)), (Slatner, M., Biochemistry 38, 10489-10498 (1999))]. NAD(P)H 생산물 억제는 폴리올 탈수소 효소를 이용한 희소 당 생산을 위해 반드시 극복해야 할 문제점이다.

L-소르보스를 생산하기 위하여 가장 널리 사용되는 방법은 Gluconobacter 또는 Acetobacter 종을 이용하여 D-소르비톨을 L-소르보스로 생체 전환(biotransformation)하는 것이다[(Macauley-Patrick, S., Process Biochemistry 40, 2113-2122 (2005)), (Zebiri, I., European Journal of Organic Chemistry 2011, 2905-2910 (2011))].

종래 연구에서는, GoSLDH는 다른 폴리올 탈수소 효소와 비교하여 D-소르비톨에 대해 더 높은 활성을 보였다[Kim, T. S. et al. Scientific reports 6, 33438, doi:10.1038/srep33438 (2016)]. GoSLDH에 의한 촉매 활동이 진행되는 동안, NADP⁺가 NADPH로의 환원 반응과 관련하여 D-소르비톨이 L-소로보스로의 산화가 진행된다. 따라서, 생물 전환 동안, NADP⁺는 고갈되고 NADPH 및 L-소르보스는 축적된다.

NADPH 축적은 GoSLDH 활성을 억제 할 가능성이 있다. 따라서, NADP⁺ 저농도의 존재 하에서 보체 인자 NADPH 억제를 방출하고 높은 L- 소르보스 생산성을 얻으려면 보조 인자 NADP⁺ 재생 시스템을 통합하는 것이 필요하다. 또한, 고비용의 피리딘 보조 인자 때문에 효율적인 보조 인자 재생 시스템이 필요하다[(Schmid, A. et al. Nature 409, 258-268 (2001)), (Chenault, H. K., Applied biochemistry and biotechnology 14, 147-197 (1987)), (Han, Q. Enzyme and microbial technology 106, 106-113, doi:10.1016/j.enzmictec.2017.07.010 (2017))]. 전체 세포에는 보조 인자의 지속적인 공급원을 제공하는 NAD⁺ 및 NADP⁺를 포함하며[Wichmann, R. Advances in biochemical engineering/biotechnology 92, 225-260, (2005)] 전체 세포는 탈수소 효소를 포함한 많은 산업에 응용되고 있다. 타겟 효소와 보조 인자 재생 생 촉매의 동시 과발현은 많은 비대칭 감축 시스템에서 구현되어왔다[(Endo, T. Advanced Synthesis & Catalysis 343, 521-526 (2001)), (Galkin, A., Applied and environmental microbiology 63, 4651-4656 (1997))].

이에 본 발명자는 전체 세포 생 촉매제로서 GoSLDH 탈수소화효소 및 LreNOX 산화효소를 생성하는 E. coli _{gosldh-lrenox} 세포를 구성하였다. 상기 GoSLDH 탈수소화효소는 D-소르비톨을 L-소르보스로 효율적으로 전환시키고, LreNOX 산화효소는 GoSLDH에 의해 생성된 NADPH를 산화시켜 NADP⁺재생산성을 유도한다. 따라서, GoSLDH 탈수소화효소 작용을 증대시키면서 D-소르비톨을 L-소르보스로의 전환 효율성을 더욱 증대시키는 것으로, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 L-소르보스 생산용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산을 코딩하는 핵산 분자를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 목적은 서열번호 2로 표시되는 아미노산을 코딩하는 핵산 분자를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 목적은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 세포를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 목적은 L-소르보스 생산용 조성물 제조 방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 목적은 D-소르비톨에서 L-소르보스로의 생산 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 목적은 L-소르보스 생산용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 L-소르보스 생산용 조성물 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 D-소르비톨에서 L-소르보스로의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 L-소르보스 생산용 조성물은 D-소르비톨을 L-소르보스로 전환시키는 D-소르비톨 탈수소화효소와, NADPH를 NADP⁺로 산화시켜 재생산성을 유도하는 NAD(P)H 산화효소를 커플링되어, D-소르비톨에서 L-소르보스로의 생산성을 증대시키는 효과가 있다. 따라서, L-소르보스와 관련된 식품, 약학 및 의약 산업에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 NADPH에 의한 GoSLDH 억제와, GoSLDH 단독 조건 및 GoSLDH + LreNOX 조건에 따른 (a) NADPH 축적 (b) L-소르보스의 전환율(%)를 확인한 도이다(●는 GoSLDH만을 발현하는 Escherichia coli_gosldh 세포를, ○는 GoSLDH 및 LreNOX를 발현하는 Escherichia coli_{gosldh-lrenox} 세포를 나타낸다).
도 2는 NADPH에 의한 GoSLDH 억제와, GoSLDH 단독 조건 및 GoSLDH + LreNOX 조건에 따른 (a)NADPH에 의한 GoSLDH의 억제의 그래픽 분석, (b) 조효소로서 0.5 mM NADP⁺의 존재 하에 GoSLDH 반응 사이의 NADPH 축적을 확인한 도이다((b)에서 ●는 GoSLDH만을 발현하는 Escherichia coli_gosldh 세포를, ○는 GoSLDH 및 LreNOX를 발현하는 Escherichia coli_{gosldh-lrenox} 세포를 나타낸다).
도 3은 NADP⁺의 결합 열역학을 특성과, GoSLDH 단독 조건 및 GoSLDH + LreNOX 조건에 따른 (a) GoSLDH(100μM)에 대한 NADP⁺ 결합, (b) NADP⁺의 부재하에 GoSLDH (100μM)에 결합하는 NADPH, (c) NADP⁺(100 μM)의 존재하에 GoSLDH(100 μM)에 결합하는 NADPH를 확인한 도이다.
도 4는 SDS-PAGE에 의한 본 발명의 LreNOX 단백질 발현 및 정제를 확인한 도이다(레인 M, 분자량 표준 마커; 레인 P, pET28a-LreNOX를 보유하는 대장균 BL21 (DE3)의 무 세포 조 추출물의 펠렛; 레인 S, pET28a-LreNOX를 함유하는 대장균 BL21 (DE3)의 무 세포 조 추출물의 상등액; 레인 Lr, 정제 된 LreNOX. 빨간색 점선은 전체 길이 SDS-PAGE 젤의 자른 영역을 표시함).
도 5는 본 발명의 LreNOX의 활성에 NADPH 농도의 영향을 확인한 도이다.
도 6은 생체 촉매 조건이 전환율에 미치는 영향을 확인하기 위하여, (a) pH; (b) 건조한 세포 펠렛의 양 (mg); (c) D-소르비톨 농도 (mM); (d) 반응 시간 (분)을 확인한 도이다(●는 GoSLDH 및 LreNOX를 발현하는 Escherichia coli_{gosldh-lrenox} 세포를, ○는 GoSLDH만을 발현하는 Escherichia coli_gosldh 세포를 나타낸다).
도 7은 본 발명의 LreNOX와 결합된 GoSLDH를 생산하는 대장균 전체 세포를 이용한 생 촉매 L-소르보스 생산의 개략도를 나타낸 도이다.

본 발명은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 L-소르보스(L-sorbose) 생산용 조성물을 제공한다.

상기 서열번호 1은 D-소르비톨(D-sorbitol)을 L-소르보스로 전환시키는 D-소르비톨 탈수소화효소이고, 상기 D-소르비톨 탈수소화효소는 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans)에서 유래할 수 있다. 또한, NADP⁺ 존재 시 효소 활성이 나타날 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 서열번호 2는 NADPH를 NADP⁺로 산화시키는 NAD(P)H 산화효소(oxidase)이고, 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)에서 유래하였으며, NADP⁺로의 재생산성을 유도하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 서열번호 1 또는 서열번호 2는 커플링된 것이나, 이에 제한되지 않는다. 상기 커플링은 당업계에 일반적으로 알려진 방법， 예를 들어 HOBt-DCC(N-hydr oxybenzo triazole-dieye 1 ohexy lcarodiimide) 방법 또는 HOBt-DIC(N-hydroxybenzot riazole- diisopropylcarbodi imide) 방법 등에 따라 수행할 수 있다 (Wang C. Chan, Perter D. white, "Fmoc solid phase peptide synthesis", Oxford). 이 외에도 커플링 시약들인 N,N'-디시클로핵실카르보디이미드(DCC), N,N'-디이소프로필카르보디이미드(DIC), 0-벤조트리아졸-1-일-N,N,N', N'-테트라메틸우로늄핵사플로로포스페이트 (HBT U), 벤조-트리아졸-1-일옥시트리스 (디메틸아미노)포스포늄 핵사플로로포스페이트 (PyBOP), 벤조-트리아졸 -1-일옥시트리스(디메틸아미노)포스포늄 핵사플로로포스페이트 (B0P), [0_(7-아자벤조트리-아졸-1-일)-N,N,N', N'-테트라메틸우로늄핵사플로로-포스페이트](HATU), 1H-하이드록시-벤조트리아졸(HOBt), 1H-하이드록시 -7-아자벤조트리아졸(HOAt) 등을 이용하여 합성을 진행할 수 있으며, 커플링 시약에 따라 트리플루오로아세트산(TFA), 디이소프로필에틸아민(DIPEA), N-메틸모르폴린 (NMM) 등과 같은 유기 염기를 첨가하여 반응을 진행할 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 L-소르보스는 pH 7-10, 5-100 mM의 D-소르비톨의 농도, 반응시간 1-60분 및 세포 밀도 0.01-10 mg mL^-1의 조건에서 생산이 증대될 수 있으나, 바람직하게는, pH 7-9, 반응시간 1-40분 및 세포 밀도 0.1-7 mg mL-1일수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 아미노산은 첨부한 서열 목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.

상기 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

상기 핵산 분자의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 유전자로서 사용될 수 있는 핵산분자는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 유전자는 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 파지미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.

본 발명에 있어서, 용어 "작동적으로 결합된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절 인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al.(2001), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli(예컨대, HB101, BL21, DH5α 등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C.(1984), J. Bacteriol., 158:1018-1024) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D.(1980), Ann. Rev. Genet., 14:399-445)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파아지미드(예: pComb3X), 파아지 (예: M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 유전체로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 사 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 필요에 따라 다른 서열과 융합될 수도 있으며, 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주 세포를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 숙주세포는 바람직하게는 E. coli이고 보다 바람직하게는 E.coli ER2537, E. coli ER2738, E. coli XL-1 Blue, E. coli BL21(DE3), E. coli JM109, E. coli DH 시리즈, E. coli TOP10, E. coli TG1 및 E. coli HB101이다. 본 발명에서는 E. coli 을 이용하여 목적하는 단백질을 과발현 시켜 적은 비용으로 대량 생산이 가능하다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al.(1973), Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al.(1973), Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114; 및 Hanahan, D.(1983), J. Mol. Biol., 166:557-580) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al.(1988), Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145) 등에 의해 실시될 수 있다.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 본 발명의 단일 gosldh 또는 lrenox, gosldh-lrenox 결합 단백질을 생산할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하여 형질전환 세포로 형질전환 하는 단계; 및 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계;를 포함하는 L-소르보스 생산용 조성물 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다.

상기 형질전환 세포는 통상의 배지에서 생육 가능하며, 일 예로 뉴트리엔트 브로스(Nutrient broth) 배지에서 배양할 수 있다. 상기 배지는 특정 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열을 처리하는 단계를 포함하는, D-소르비톨에서 L-소르보스로의 생산 방법을 제공한다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

[준비예]

<준비예 1> 플라스미드 및 시약

Ex-Taq DNA 중합 효소, 게놈 DNA 추출 키트, pGEM-T 쉬운 벡터 및 중합 효소 연쇄 반응을위한 시약은 Promega (Madison, WI, USA)에서 구입 하였다. T4 DNA 리가 제 및 제한 효소는 New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)로부터 구입 하였다. His-tag 단백질 정제를 위한 pET28a 발현 벡터, plasmid isolation kit, nickel-nitrilotriacetic acid superflow 컬럼을 Qiagen (Hilden, Germany) 20에서 구입하였다. 올리고 뉴클레오타이드 프라이머는 Bioneer (대한민국, 대전)로부터 입수하였다. Bio-Rad (Hercules, CA, USA)에서 전기 영동 시약을 제공했으며, 분석에 사용 된 모든 화학 물질은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

<준비예 2> 등온 적정 열량계(Isothermal titration calorimetry, ITC) 조건

한국 기초 과학 연구소 (한국 오창)에서 NADP⁺및 NADPH (MicroCal iTC 200 시스템, GE Healthcare, 영국, Little Chalfont)를 사용하여 ITC 측정을 수행하였다. ITC 측정은 Korea Basic Science Institute에서 Auto-iTC200 Micro-Calorimeter를 사용하여, 100 mM glycine-NaOH 완충액(pH 10)이 들어있는 완충액에서 25도에서 수행하였다. 134 μM GoSLDH의 ITC 측정을 위해 2.6 mM NADP와 NADPH가 함유된 칼로리 미터 셀에 2 mL로 주입하였다. MicroCal OriginTM 소프트웨어를 사용하여 ITC 데이터를 분석하였다.

<준비예 3> Escherichia coli _gosldh 및 Escherichia coli _{gosldh-lrenox} 의 구조

합성된 sldh 서열은 G. oxydans G624 (GenBank 수탁 번호 AB028937.1)의 폴리올(Polyol) 특이적 장쇄 탈수소 효소의 DNA 서열을 기초로 하였다. 종래 보고된 방법으로 코돈 최적화를 수행하였다[Kim, T. S. et al., Scientific reports 6, 33438, doi:10.1038/srep33438 (2016)]. 최적화된 sldh 서열을 Gosldh로 명명하였다. 5' 및 3' 말단의 NdeI 및 XhoI 제한 효소 부위가 각각 있는 Gosldh 단편을 GeneScript (Piscataway, NJ, USA)에 의해 합성하고 pUC57 벡터에 클로닝하였다. 코돈 최적화된 Gosldh를 NdeI-XhoI로 소화시킨(digested) 후 Novagen (Madison, WI, USA)의 발현 벡터 pETDuet-1에 연결하여 Gosldh를 발현시켰다. 또한, lrenox 단편은 프라이머 Nox1 및 Nox2를 사용하여 Lactobacillus reuteri의 게놈으로부터 수득 하였다(표 1). Gosldh와 Lrenox가 있는 동시 발현 시스템을 구축하기 위해, pEasy-Blunt-nox를 BamHI과 NotI로 분해하고, 동일한 제한 효소로 절단된 pETDuet-gosldh에 겔 정제 된 nox 단편을 연결 하였다. 대장균 DH5α 세포를 일반적인 클로닝에 사용하고, 대장균 BL21-Codon Plus (DE3)-RIL 세포를 단백질 발현에 사용 하였다. Luria-Bertani 배지는 상기 대장균 배양에 사용하였다.

Strain, plasmids, or primers	Genotype, properties, or sequence	Source	서열번호
Bacteria
E. coli DH5α	F^-, 80d/lacZ M15, (lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rk^-mk⁺), phoA, supE44, λ^-, thi^-1, gyrA96, relA1	Clontech
E. coli BL21-Codon Plus (DE3)-RIL	B F ompT hsdS(r_B m_B ^-) dcm ⁺ Tc^r gal (DE3) endA The [argU ileY leuW Cam^r]	Stratagene
E. coli _pET28- _gosldh	Km^r, Gosldh in pET28a in E. coli BL21-Codon Plus (DE3)-RIL	참고문헌
E. coli _pET28- _lrenox	Km^r, Lrenox in pET28a in E. coli BL21-Codon Plus (DE3)-RIL	본 발명
E. coli _{gosldh-lrenox}	Gosldh and Lrenox in pETDuet-1 vector in E. coli BL21-Codon Plus (DE3)-RIL	본 발명
E. coli _gosldh	Gosldh in pETDuet-1 vector in E. coli BL21-Codon Plus (DE3)-RIL	본 발명
plasmids
pET28a	Km^r, overexpression vector	Novagen
pETDuet-1	Amp^r, overexpression vector	Novagen
pGEM	Amp^r, cloning vector	Promega
pGEM-T-nox	Amp^r, Lrenox in T-vector	본 발명
pETDuet-gosldh	Ampr, Gosldh in pETDuet	본 발명
primers
Nox1	AAA GGA TCC AAT GAA GGT TAT TAT TGT T	BamHI	3
Nox2	GTG GCG GCC GCT TAT TTT TCT AAT TCA GC	NotI	4
참고문헌 ; Han, Q. & Eiteman, M. A. Enzyme and microbial technology 106, 106-113, doi:10.1016/j.enzmictec.2017.07.010 (2017).

<준비예 4> 재조합 대장균에 의한 D-소르비톨(D-sorbitol)에서 L- 소르보스(L-sorbose)의 생산

재조합 대장균 세포를 ampicillin(100 μg mL^-1)및 chloramphenicol(50 μg mL^-1)을 포함한 Luria-Bertani 배지에서 회전 진탕기(200 rpm)로 37도에서 생장시켰다. 재조합 유전자 발현은 비활성 봉입체의 형성을 피하기 위해 16 도에서 0.2 mM IPTG를 첨가함으로써 유도하였다. 유도 후 세포를 4,000 rpm에서 12 분 동안 4도에서 원심 분리하고 증류수로 두 번 세척하였다. 세포 펠릿을 100 mM Tris-HCl (pH 7-8) 또는 Glycine-NaOH 완충액 (pH 9-10)에 재현탁하고 4도에 저장하였다. E. coli _gosldh 로부터 L-소르보스를 생산하기 위한 pH 및 세포 밀도의 파라미터를 최적화하기 위해, 상기 기재된 세포 펠렛을 100 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7-8) 또는 다양한 pH의 글리신-NaOH 완충액 (pH 9-10), 1.5-18 mg DCW mL-1의 세포 밀도의 조건으로 실험을 수행하였다.

E. coli _gosldh 로부터의 L- 소르보스 생산 속도에 대한 D-소르비톨 및 NADP⁺농도의 영향을 확인하기 위하여, 초기 D-소르비톨 농도를 10 내지 90 mM로 하고, NADP⁺ 농도를 0.1 내지 0.8 mM로 변화시켜 확인하였다. 결합된 시스템에 대한 반응 조건은 전체 세포 E. coli _gosldh 만으로 L- 소르보스를 생산하는 반응 조건과 동일하다. gosldh 유전자를 갖는 발현 플라스미드 pACYCDuet-1을 발현하는 대장균(Escherichia coli)을 대조 균주로서 사용 하였다. pH, NADP⁺ 농도, 세포 밀도 및 기질 농도의 모든 조합에 대해 D- 소르비톨에서 L- 소르보스로의 생체 전환을 30도에서 150rpm으로 흔들어 수행하였다. 세포 현탁액의 샘플(1 mL)을 주기적으로 수득하고 13,000 rpm에서 5 분간 원심 분리하였고, 상등액을 사용하여 L- 소르보스 농도를 분석 하였다.

<준비예 5> 분석 방법

일정 시간 간격으로 시료를 채취하고, 종래의 방법을 이용하여 시스테인 카바졸 유황법(cysteine carbazole sulfuric method)으로 분석하고 560 nm에서 흡광도를 측정하였다[Dische, The Journal of biological chemistry 192, 583-587 (1951),34]. 그 결과는 Shodex sugar sp0810 컬럼 (Showa Denko, KK, Kawasaki, Japan)을 포함하는 Ultimate 3000 고압 액체 크로마토그래피 시스템(Dionex, Sunnyvale, CA, USA)과 evaporation light scattering detector(ESA6700, Chromachem, Chromaflo Technologies, Ashtabula, OH, USA)을 이용하여 고성능 액체 크로마토그래피로 확인하였다. 샘플을 80도(컬럼 온도)에서 1 mL min^-1의 속도로 물로 용해시켰다. D- 소르비톨 및 L- 소르보스의 머무른 시간(retention times)은 작동 조건 하에서 각각 21 및 9.6 분으로 수행하였다.

[실시예]

<실시예 1> NADPH에 의한 GoSLDH 억제

촉매 과정에서 NADP⁺는 NADPH로 환원되고 D-소르비톨은 L-소르보스로 산화된다. 따라서, NADP⁺ 농도 조건(0.1 내지 0.7 mM)에 따라, 상기 준비예 4의 방법에 따라서, GoSLDH만을 발현하는 Escherichia coli _gosldh 처리군(Gluconobacter oxydans G624로부터 SLDH를 암호화)과 GoSLDH 및 lrenox를 모두 발현하는 Escherichia coli _{gosldh-lrenox} 처리군을 두었다. 이를 전체 세포 생체 촉매 반응(whole cell biocatalysis)을 이용하였다. 이에 따라, NADPH 축적(μM) 및 L-소르보스의 전환율(%)을 확인하였다. 100 mM glycine-NaOH buffer, pH 10, 50 mM D-sorbitol의 처리 조건을 두었다. 또한, NADPH에 의한 GoSLDH 억제 정도를 분석하기 위하여, 100 mM glycine-NaOH buffer, pH 10, 200 mM D-소르비톨의 처리 조건을 두었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, E. coli _{gosldh-lrenox} 에 의한 전체 세포 생촉매 작용 동안(●), 0.5 mM NADP⁺의 존재 하에서 NADPH의 농도는 40 μM 이하임을 확인하였고, L-소르보스의 전환율(%)은 45% 이상임을 확인하였다.

반면, 0.5 mM NADP⁺의 존재 하에서 E. coli _gosldh 에 의한 전체 세포 생촉매 작용 동안(○), NADPH 농도는 147 μM에 이르렀음을 확인하였고, L-소르보스의 전환율(%)은 2.6%에 불과함을 확인하였다. 이는, E. coli _gosldh 전체 세포 생 촉매 반응 20초 후에 최대 160 μM의 NADPH가 축적되어 GoSLDH 활성이 80 % 억제됨을 확인하였다.

또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, NADPH에 의한 GoSLDH 억제의 그래픽 분석한 결과, 이중-역전도에 의한 상기 데이터의 분석은 NADPH가 GoSLDH를 경쟁적으로 저해함을 확인하였다. 또한, GoSLDH에 대한 NADPH의 억제 상수 (Ki)는 100μM임을 확인하였다(도 2a). 또한, 0-170 μM 범위의 NADPH 농도로 수행된 억제 운동 분석은 NADPH 농도가 증가함에 따라 Km이 증가 함을 보여 주었다. Km은 NADPH 농도가 70에서 150 μM로 증가함에 따라 보조 NADPH가없는 수치에 비해 3.9- 8.9 배 증가함을 확인하였다(도 2b).

따라서, NADPH 형성의 감소는 GoSLDH 억제를 감소시킴으로써 L-소르보스 생산을 증가시키는 것으로 확인되었다. 또한, E. coli _gosldh 에 의한 전체 세포 생촉매 작용보다, E. coli _{gosldh-lrenox} 에 의한 전체 세포 생촉매 작용으로 인하여 GoSLDH 및 lrenox 단백질 모두 발현되는 조건이 NADPH 농도를 낮추고 D-소르비톨에서 L-소르보스의 전환율이 더 높음을 확인하였다.

상기 결과에 따라, NADP⁺의 낮은 초기 농도 (0.5 mM)를 사용하여 보조 인자 재생 시스템을 확립했다.

<실시예 2> NADP ⁺ 의 결합 열역학 특성 확인

NADP⁺의 결합 열역학 특성을 확인하기 위하여, 등온 적정 열량계 (ITC) 실험을 수행하였다. GoSLDH (100μM)에 결합하는 NADP⁺ 처리군; NADP⁺ 부재 상태에서 GoSLDH (100μM)에 결합하는 NADPH 처리군; NADP⁺ 존재 상태에서 GoSLDH (100μM)에 결합하는 NADPH 처리군을 두었다. 25도, 100 mM 글리신-NaOH 완충액 (pH 10) 조건에서 GoSLDH (100 μM)에 대한 NADP⁺의 결합 열역학을 특성을 확인하기 위한 ITC 실험을 수행하였고 피팅 곡선을 확인하였다.

도 3a에 나타낸 바와 같이, D-소르비톨의 부재 하에 GoSLDH에 대한 NADP⁺의 결합은 Ka 값 1.12 × 10⁴ M^-1 또는 Kd (해리 상수) 값을 갖는 발열성(ΔH = -754 cal mol^-1) 89.3 μM임을 확인하였다. 이는 -5.5 kJ mol^-1의 ΔG 값과 동일하며, 결합은 대부분 entropy-driven (ΔS가 16.0 cal mol-1 deg^-1로 계산 됨)임을 확인하였다.

도 3b에 나타낸 바와 같이, GoSLDH (100μM)에 대한 NADPH의 결합은 Ka(친 화성 상수) 값 1.49 × 10⁴M^-1또는 Kd 값 67.1μM을 갖는 발열성(ΔH = -578 cal mol^-1) NADP⁺에 대한 GoSLDH의 더 높은 결합 친화력(22 μM보다 낮은 Kd)을 나타낸다. 이는 -5.6 kJ mol^-1의 ΔG 값과 동일하며, 결합은 대부분 entropy-driven(ΔS는 17.1 cal mol^-1deg^-1로 계산 됨)됨을 확인하였다. NADP⁺ 또한 NADPH(300 μM)의 존재 하에 GoSLDH (100 μM)로 적정(titrated)됨을 확인하였다.

또한, 도 3c에 나타낸 바와 같이, 단백질에 대한 NADP⁺의 결합은 검출되지 않았으며, 이는 NADPH 및 NADP⁺가 GoSLDH에서 동일한 부위에 결합하기 때문에, NADPH 및 NADP⁺가 서로 경쟁함을 시사한다. GoSLDH는 200 mM L-소르보스와 0.5 mM NADPH의 존재 하에 25도에서 반응 활성을 감소시키지 않으므로 NADPH는 GoSLDH의 산화 반응을 단독으로 억제함을 확인하였다.

<실시예 3> 본 발명의 LreNOX 산화효소(oxidase)에 대한 NADH 산화 효소로서의 특성 확인

NOX는 분자 O₂를 물 또는 과산화수소로 동시에 환원시킴으로써 NAD(P)H의 산화를 촉매한다. NOX는 수많은 효소 반응에 필요한 산화 된 보조 인자를 재생시키는 데 중요한 역할을 한다. 거의 모든 단백질이 H₂O₂에 노출되면 비활성화되기 때문에, H₂O 형성 NOX는 NAD(P)⁺ 재활성화에 대해 H₂O₂ 형성 NOX보다 더 효과적이라고 확인된다. 대부분의 NOX는 NADPH 산화 활성보다는 NADH 산화 활성을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)(LreNOX)의 새로운 NOX를 특성을 확인하기 위하여 NADPH와 NADH를 효율적으로 산화시켰다. L. reuteri의 NOX 유전자는 코딩 서열로부터 유래 된 특이적인 프라이머를 사용하여 게놈 DNA로부터 분리하였다(표 1). 이 유전자를 T7 프로모터 기반 플라스미드 pET28a에 클로닝하여 pET28a-LreNox를 생성시킨 다음, 콜라이 BL21 (DE3) 세포에서 발현시켰다. 효소는 니켈-니트릴 로트리 아세트산 친화성 크로마토그래피(nickel-nitrilotriacetic acid affinity chromatography)로 정제 하였다. 순도는 sodium dodecyl sulphate의 존재 하에 polyacrylamide gel 전기 영동으로 평가하였다. 또한, 최적의 분석 조건 하에서 정제된 산화효소 LreNOX를 사용하여 기질로서의 NADPH로 동역학 파라미터를 조사하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 정제된 LreNOX에 의한 NADPH의 산화를 위한 최적 pH 및 온도는 각각 6.0 및 60도임을 확인하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 LreNOX 산화효소가 높은 비활성(Vmax = 161Umg^-1)과 결합 친화성(Km = 35μM)으로 NADPH를 산화시킴을 확인하였다. 또한, 종래 L.san-Nox2와 비교하여, 본 발명의 LreNOX 산화효소는 NADPH에 대해 14.6배 더 높은 활성이 나타남을 확인하였다.

이는 본 발명의 LreNOX가 산화된 보조 인자 NADP⁺의 효소 재활성화 함을 시사한다.

<실시예 4> L- 소르보스 생산에 미치는 영향 확인

D-소르비톨로부터 L-소르보스 수율에 대하여, pH, 펠렛양(세포 밀도), 기질인 D-소르비톨의 농도 및 반응 시간에 따른 효과를 확인하였다.

구체적으로, 반응은 초기 기질로서 50 mM의 D-소르비톨을 농도별(10, 30, 50, 70, 90 mM)로 사용하였고, 상이한 pH(7, 8, 9, 10) 조건 하에서 생 촉매로서 E. coli _gosldh 또는 E. coli _{gosldh-lrenox} 의 각 중량(3, 6, 9, 12, 16 mg) 건조 셀 중량(DCW) mL^-1을 사용 하였다. 또한, E. coli _gosldh 또는 E. coli _{gosldh-lrenox} 와의 각 반응 조건(20, 40, 60, 80, 100, 120, 140 분) 반응 후, 전환율은 생성물 농도를 모니터링함으로써 측정하였다.

그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, D-소르비톨로부터 L-소르보스의 전환율(%)은 E. coli _{gosldh-lrenox} (32.4%)에서 pH 8.0에서 가장 높았고, E. coli _gosldh 는 pH 9.0 (5.8 %)에서 가장 높았다.

또한, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 생 촉매로서 E. coli _gosldh 또는 E. coli _{gosldh-lrenox} 의 펠렛양(세포 밀도)에 따른 L-소르보스의 전환율(%)을 확인한 결과, E. coli _{gosldh-lrenox} 의 펠렛양(세포 밀도)은 1.5-3 mg DCW mL-1 범위에서 전환율이 증가하였다. 최적 펠렛양(세포 밀도)는 3.0 mg mL-1일 때, 47.4 %의 전환율이 나타남을 확인하였다. E. coli _gosldh 에서도 1.5-3 mg DCW mL-1 범위에서 전환율이 증가하고, 2-5.6 %의 전환율이 나타남을 확인하였다.

또한, 도 6c에 나타낸 바와 같이, 10 mM D-소르비톨이 전체 세포 생 촉매제 인 E. coli _{gosldh-lrenox} 와 E. coli _gosldh 와 함께 사용되었을 때 최대 전환율은 92.0 %와 23.7 %였다. 전체 세포 생체 촉매 E. coli _{gosldh-lrenox} 와 E. coli _gosldh 가 50 mM D-소르비톨의 존재 하에 사용되었을 때 최대 L- 소르보스 농도는 각각 4.1과 0.23 g/L임을 확인하였다. 따라서, 최적 D-소르비톨 농도는 10 mM임을 확인하였다.

또한, 도 6d에 나타낸 바와 같이, 반응 시간은 20분에 가장 낮았고, 40분 이후부터 L-소르보스의 수율이 증가되어, 최적 반응시간은 40분 이상임을 확인하였다.

상기 일련의 결과에 따라, 도 7에 나타낸 바와 같이, GoSLDH는 D-소르비톨에서 L-소르보스로의 NADP⁺ 의존성 전환을 촉매하고 NADPH 생성물 억제를 나타낸다. 따라서 L-소르보스 생산을 증가시키기 위해서는 NADPH 축적을 줄이는 것이 중요하며, 반응을 보다 효율적이고 경제적으로 수행하기 위해서는 NADPH로부터 보조 인자 NADP⁺를 재활성화하는 것이 필요하다. 따라서, 본 발명에서는 NADP⁺를 재활성화하기 위하여, LreNOX 산화효소를 사용하였다. GoSLDH와 LreNOX의 결합 시스템에서, LreNOX는 반응 혼합물 중의 환원된 보조 인자 NADPH를 산화된 보조 인자 NADP⁺로 재순환시킨다.

따라서, 본 발명은 전체 세포 생 촉매제로서 E. coli _{gosldh-lrenox} 세포를 구성하였으며, 이는 GoSLDH 탈수소화효소 및 LreNOX 산화효소를 생성한다. 상기 GoSLDH 탈수소화효소는 D-소르비톨을 L-소르보스로 효율적으로 전환시킨다. 다만, NADP⁺가 NADPH로 환원되면서 NADPH가 상기 GoSLDH를 억제시키는 작용을 한다. 따라서, 본 발명의 LreNOX 산화효소는 GoSLDH에 의해 생성된 NADPH를 산화시켜 NADP⁺재생산성을 유도하여, GoSLDH 탈수소화효소 작용을 증대시키면서 D-소르비톨을 L-소르보스로의 전환 효율성을 더욱 증대시킴을 확인하였다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> A composition for producing L-sorbose and uses thereof <130> PN1808-284 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 485 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid of gosldh <400> 1 Met Ile Thr Arg Glu Thr Leu Lys Ser Leu Pro Ala Asn Val Gln Ala 1 5 10 15 Pro Pro Tyr Asp Ile Asp Gly Ile Lys Pro Gly Ile Val His Phe Gly 20 25 30 Val Gly Asn Phe Phe Arg Ala His Glu Ala Phe Tyr Val Glu Gln Ile 35 40 45 Leu Glu His Ala Pro Asp Trp Ala Ile Val Gly Val Gly Leu Thr Gly 50 55 60 Ser Asp Arg Ser Lys Lys Lys Ala Glu Glu Phe Lys Ala Gln Asp Cys 65 70 75 80 Leu Tyr Ser Leu Thr Glu Thr Ala Pro Ser Gly Lys Ser Thr Val Arg 85 90 95 Val Met Gly Ala Leu Arg Asp Tyr Leu Leu Ala Pro Ala Asp Pro Glu 100 105 110 Ala Val Leu Lys His Leu Val Asp Pro Ala Ile Arg Ile Val Ser Met 115 120 125 Thr Ile Thr Glu Gly Gly Tyr Asn Ile Asn Glu Thr Thr Gly Ala Phe 130 135 140 Asp Leu Glu Asn Ala Ala Val Lys Ala Asp Leu Lys Asn Pro Glu Lys 145 150 155 160 Pro Ser Thr Val Phe Gly Tyr Val Val Glu Ala Leu Arg Arg Arg Trp 165 170 175 Asp Ala Gly Gly Lys Ala Phe Thr Val Met Ser Cys Asp Asn Leu Arg 180 185 190 His Asn Gly Asn Val Ala Arg Lys Ala Phe Leu Gly Tyr Ala Lys Ala 195 200 205 Arg Asp Pro Glu Leu Ala Lys Trp Ile Glu Glu Asn Ala Thr Phe Pro 210 215 220 Asn Gly Met Val Asp Arg Ile Thr Pro Thr Val Ser Ala Glu Ile Ala 225 230 235 240 Lys Lys Leu Asn Ala Ala Ser Gly Leu Asp Asp Asp Leu Pro Leu Val 245 250 255 Ala Glu Asp Phe His Gln Trp Val Leu Glu Asp Gln Phe Ala Asp Gly 260 265 270 Arg Pro Pro Leu Glu Lys Ala Gly Val Gln Met Val Gly Asp Val Thr 275 280 285 Asp Trp Glu Tyr Val Lys Ile Arg Met Leu Asn Ala Gly His Val Met 290 295 300 Leu Cys Phe Pro Gly Ile Leu Val Gly Tyr Glu Asn Val Asp Asp Ala 305 310 315 320 Ile Glu Asp Ser Glu Leu Leu Gly Asn Leu Lys Asn Tyr Leu Asn Lys 325 330 335 Asp Val Ile Pro Thr Leu Lys Ala Pro Ser Gly Met Thr Leu Glu Gly 340 345 350 Tyr Arg Asp Ser Val Ile Ser Arg Phe Ser Asn Lys Ala Met Ser Asp 355 360 365 Gln Thr Leu Arg Ile Ala Ser Asp Gly Cys Ser Lys Val Gln Val Phe 370 375 380 Trp Thr Glu Thr Val Arg Arg Ala Ile Glu Asp Lys Arg Asp Leu Ser 385 390 395 400 Arg Ile Ala Phe Gly Ile Ala Ser Tyr Leu Glu Met Leu Arg Gly Arg 405 410 415 Asp Glu Lys Gly Gly Thr Tyr Glu Ser Ser Glu Pro Thr Tyr Gly Asp 420 425 430 Ala Glu Trp Lys Leu Ala Lys Ala Asp Asp Phe Glu Ser Ser Leu Lys 435 440 445 Leu Pro Ala Phe Asp Gly Trp Arg Asp Leu Asp Thr Ser Glu Leu Asp 450 455 460 Gln Lys Val Ile Val Leu Arg Lys Ile Ile Arg Glu Lys Gly Val Lys 465 470 475 480 Ala Ala Ile Pro Ala 485 <210> 2 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid of LreNox <400> 2 Met Lys Val Ile Ile Val Gly Cys Thr His Ala Gly Thr Ile Thr Ala 1 5 10 15 Thr Gln Ile Leu Gln Asn His Pro Glu Thr Glu Val Thr Ile Tyr Glu 20 25 30 Arg Asn Asp Asn Val Ser Phe Leu Ser Cys Gly Ile Ala Val Tyr Leu 35 40 45 Ser Gly Asp Val Gly Asn Pro Asp Ala Met Phe Tyr Ser Ser Pro Glu 50 55 60 Gln Leu Ala Ala Met Gly Ala Thr Val His Met Gln His Asn Val Thr 65 70 75 80 Asp Ile Asp Pro Lys Thr Lys Thr Val Thr Val Thr Asp Leu Val Thr 85 90 95 Gly Glu Thr Lys Thr Asp His Tyr Asp Lys Leu Val Asp Thr Thr Gly 100 105 110 Ser Trp Pro Val Ile Pro Pro Ile Glu Gly Val Asp Gly Pro His Val 115 120 125 Tyr Leu Cys Lys Asn Tyr His His Ala Lys Glu Leu Phe Asn Val Ala 130 135 140 Lys Asp Ala Gln Arg Ile Val Val Ile Gly Gly Gly Tyr Ile Gly Val 145 150 155 160 Glu Leu Val Glu Ala Tyr Thr Arg Gln Asn Lys Asp Val Thr Leu Ile 165 170 175 Asp Gly Ser Pro Arg Met Leu His Lys Tyr Phe Asp Arg Glu Tyr Thr 180 185 190 Asp Arg Ile Gln Gln Glu Phe Val Asp His Gly Ala His Phe Ala Phe 195 200 205 Asp Gln Arg Val Thr Gly Phe Glu Asn His Glu Asn Gly Val Thr Val 210 215 220 Lys Thr Asp Lys Gly Asn Tyr Glu Ala Asp Ile Ala Ile Leu Cys Val 225 230 235 240 Gly Phe Arg Pro Asn Thr Asp Leu Leu Lys Gly Lys Val Lys Met His 245 250 255 Asp Asn Gly Ala Ile Ile Thr Asn Glu Tyr Met Gln Ser Ser Asp Pro 260 265 270 Asp Ile Tyr Ala Ala Gly Asp Ser Thr Ala Val His Tyr Asn Pro Thr 275 280 285 Gly Lys Asp Ala Tyr Ile Pro Leu Ala Thr Asn Ala Ile Arg Gln Gly 290 295 300 Thr Ile Val Gly Thr Asn Leu Phe Gly Asn Thr Met Arg Asp Met Gly 305 310 315 320 Thr Gln Ser Ser Ser Gly Leu Asn Leu Tyr Gly Thr Thr Met Val Ser 325 330 335 Ser Gly Leu Thr Leu Glu Asn Ala Lys Glu Ala Gly Phe Asp Ala Ala 340 345 350 Ala Val Thr Val Glu Asp Asn Tyr Arg Pro Glu Phe Met Pro Thr Thr 355 360 365 Thr Pro Val Leu Met Thr Leu Val Trp Asp Lys Lys Thr Arg Gln Ile 370 375 380 Leu Gly Gly Gln Phe Met Ser Lys His Asp Val Ser Gln Ser Ala Asn 385 390 395 400 Ile Ile Ser Leu Cys Ile Gln Asp Lys His Thr Ile Asp Tyr Leu Ala 405 410 415 Phe Val Asp Met Leu Phe Gln Pro His Phe Asp Arg Pro Phe Asn Tyr 420 425 430 Val Asn Ile Leu Gly Gln Ala Ala Val Lys Lys Gln Ala Glu Leu Glu 435 440 445 Lys <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nox1 primers <400> 3 aaaggatcca atgaaggtta ttattgtt 28 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nox2 primers <400> 4 gtggcggccg cttatttttc taattcagc 29

Claims

글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans) 유래의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 D-소르비톨 탈수소화효소를 코딩하는 핵산 분자; 및 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 유래의 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 NAD(P)H 산화효소를 코딩하는 핵산 분자가 포함된 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포를 포함하는 L-소르보스(L-sorbose) 생산용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 D-소르비톨 탈수소화효소는 D-소르비톨(D-sorbitol)을 L-소르보스로 전환시키는 것인 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 D-소르비톨 탈수소화효소는 NADP⁺ 존재 시 효소 활성이 나타나는 것인 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 NAD(P)H 산화효소(oxidase)는 NADPH를 NADP⁺로 산화시키는 것인 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 NAD(P)H 산화효소는 NADP⁺로의 재생산성을 유도하는 것인 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 D-소르비톨 탈수소화효소 및 NAD(P)H 산화효소는 커플링된 것인 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 세포는 pH 7-10, 5-100 mM의 D-소르비톨의 농도, 반응시간 1-60분 및 세포 밀도 0.01-10 mg mL^-1의 조건에서 배양되는 것인 조성물.
삭제
삭제
글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans) 유래의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 D-소르비톨 탈수소화효소를 코딩하는 핵산 분자; 및 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 유래의 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 NAD(P)H 산화효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제 12 항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포.
삭제
제 13 항의 형질전환된 세포를 D-소르비톨이 포함된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 L-소르보스의 생산 방법.
제 15 항에 있어서,
상기 세포는 pH 7-10, 5-100 mM의 D-소르비톨의 농도, 반응시간 1-60분 및 세포 밀도 0.01-10 mg mL^-1의 조건에서 배양되는 것인 방법.