KR102052610B1 - 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법 - Google Patents
떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
췌장 리파아제의 활성을 감소시킴으로써, 지방의 흡수를 줄일 수 있으며, 이에 따라 체중감소, TC, TG 및 LDL콜레스테롤 감소, 내장지방 감소등의 효과를 보이는 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법이 개시된다. 본 발명은, (a) 떫은감과 귤껍질에 용매를 첨가한 다음 가열하는 단계; (b) 상기 추출된 용액을 효소를 이용하여 분해하는 단계; 및 (c) 상기 효소 분해된 용액을 여과한 다음 농축하는 단계를 포함하는 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법을 제공한다.
Description
본 발명은 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 췌장 리파아제의 활성을 감소시킴으로써, 지방의 흡수를 줄일 수 있으며, 이에 따라 체중감소, TC, TG 및 LDL콜레스테롤 감소, 내장지방 감소등의 효과를 보이는 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
에너지 불균형에 의한 비만은 WHO에 의하여 심각한 세계적인 건강 위험인자로 간주된다. 이는 고지혈증, 고혈압, 지방간, 당뇨병, 암, 관절염, 천식 등의 건강 문제와도 관련있다. 2014년 WHO에서는 18세 이상 성인중 31%에 달하는 19억명이 비만이라고 보고 했다. 또한, 이 숫자가 2,030년까지 약 33억명(약 1.7배)으로 상승할 것으로 전망했다. 이 현재의 추세에 따르면 비만의 경제적 부담(상태 모니터링, 영양 보충제, 수술 관리를 포함한 직접 및 간접 의료 비용)은 매년 증가할 것으로 기대된다.
췌장 리파제는 식이 지방 소화 및 흡수를 담당하는 효소이다. 이 효소의 억제를 통한 식이 지방에서 에너지 섭취의 감소는 비만을 방지하고 치료하는 훌륭한 전략일 수 있다. FDA에서 승인된 Orlistat (상품명, Xenical)은 비만의 장기적인 치료에 효과적인 약물이다. 이 Orlistat는 췌장 리파제 효소의 억제를 통해 약물 효능을 발휘하며, 30% 정도의 식이지방을 흡수 방지할 수 있는 약물이다. 하지만, 심한 위장 부작용 때문에 그 사용이 제한되고 있다. 따라서 최근의 비만치료의 대상은 무해한 천연 치료제품에 초점을 맞추고 있다.
대한민국 공개특허 2016-0082824호에서는 복분자와 홍삼 발효 추출물의 혼합액을 유효성분으로 하는 지질대사 개선 및 항비만용 조성물에 관하여 개시하고 있다. 이 발명에서는 복분자 추출물과 홍삼추출물을 분리한 다음 유산균으로 발효시킨 조성물을 이용하여 지질대사의 개선을 통한 항비만 효과를 기재하고 잇지만, 지질대사의 개선을 통한 항비만 효과만 가지고 있어 비만의 원인인 지질의 흡수를 차단하지 못하고 있으며, 홍삼과 복분자의 가격이 상대적으로 높아 장기간 복용을 지속하기 어렵다는 단점을 가진다.
대한민국 등록특허 제1632580호에서는 비만 억제 효과를 갖는 건강기능식품 및 이의 제조방법에 관하여 개시하고 있다. 이 발명에서는 생강, 마카, 옥수수, 마테잎 및 녹차잎을 각각 법제한 다음, 가열하여 추출하는 건강기능 식품에 관하여 기재하고 있지만, 지질대사의 개선을 통한 항비만 효과만 가지고 있어 비만의 원인인 지질의 흡수를 차단하지 못하고 있으며, 각각 따로 법제하고 추출하는 방법이 복잡하여 제품화가 어려운 단점을 가진다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하고자 안출된 것으로, 췌장 리파아제의 활성을 낮춰 췌장 리파아제에 의한 식이 지방분해를 방지하여 지방의 소화 및 흡수를 방해하며, 이에 따라 체중감소, TC, TG 및 LDL콜레스테롤 감소, 내장지방 감소등의 효과를 보일 수 있는 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, (a) 떫은감과 귤껍질에 용매를 첨가한 다음 가열하는 단계; (b) 상기 추출된 용액을 효소를 이용하여 분해하는 단계; 및 (c) 상기 효소 분해된 용액을 여과한 다음 농축하는 단계를 포함하는 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한 상기 (a) 단계는 80~120℃의 온도에서 1~3시간 동안 추출하는 것을 특징으로 하는 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한 상기 용매는 물, 알코올, 벤젠, 톨루엔 및 사염화탄소에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한 상기 (a) 단계는 2회 반복하여 수행하는 것으로 특징으로 하는 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한 상기 (b) 단계의 효소는 아라바나제(arabanase), 셀룰라제(cellulase), 베타-글루카나제(beta-glucanase), 헤미셀룰라제(hemicellulase) 및 자일레나제(xylanase)를 포함하는 군에서 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한 상기 (b)단계는 5~25시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한, 상기 (c) 단계의 여과는 규조토, 활성탄, 제올라이트 또는 중공사막 필터를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한, 상기 (c)단계의 농축은 추출물의 농도가 10BX 이하가 될 때까지 수행하는 것을 특징으로 하는 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한, 상기 (c) 단계 이후 멸균된 덱스트린(dextrin)을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한, 상기 (c) 단계 이후 추출물을 동결 건조하여 분쇄하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한, 상기 제조방법을 이용하여 제조되는 항 비만 조성물을 제공한다.
이러한 본 발명에 따르면, 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물 제조방법은 떫은감과 귤껍질에 함유된 췌장 리파아제 비활성화 성분을 효과적으로 추출할 수 있으며, 상기 제조방법에 의하여 제조된 조성물은 췌장 리파아제의 활성을 감소시켜 식이 지방의 분해 및 흡수를 저해하므로 효과적인 체중관리에 유용하다.
도 1은 본 발명에 의한 PCM 및 아스코빅산을 이용한 DPPH 및 ABTS억제능 실험결과로 A, B는 DPPH 실험결과 그래프, C, D는 ABTS 실험결과 그래프,
도 2는 본 발명에 의한 췌장 리파아제 억제능 그래프,
도 3은 본 발명에 의한 6주간의 실험 이후 각 실험군 쥐의 TG, TC, HDL콜레스테롤, LDL콜레스테롤 수치를 각각 나타낸 그래프.
도 2는 본 발명에 의한 췌장 리파아제 억제능 그래프,
도 3은 본 발명에 의한 6주간의 실험 이후 각 실험군 쥐의 TG, TC, HDL콜레스테롤, LDL콜레스테롤 수치를 각각 나타낸 그래프.
이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
본 발명자들은 기존의 화학적 합성품에 의한 지방 췌장 리파아제의 활성 감소 및 이에 의한 지방 흡수저해 방법이 심각한 위장관 질환 및 과다한 비용소모의 문제가 있음에 주목하고, 이는 해결하기 위하여 예의 노력을 한 결과, 주변에서 쉽게 구할 수 있는 천연물인 떫은감과 귤껍질에서 췌장리파아제 비활성화 성분을 추출 가능한 것을 확인하고 본 발명에 이르게 되었다.
따라서 본 발명은 (a) 떫은감과 귤껍질에 용매를 첨가한 다음 가열하는 단계; (b) 상기 추출된 용액을 효소를 이용하여 분해하는 단계; 및 (c) 상기 효소 분해된 용액을 여과한 다음 농축하는 단계를 포함하는 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
상기 (a)단계는 떫은감과 귤껍질의 유효성분을 추출하기 위하여 떫은감과 귤껍질을 열에 의하여 연화하는 단계로, 유효성분을 추출할 수 있는 용매는 제한없이 사용 가능하지만, 바람직하게는 물, 알코올, 벤젠, 톨루엔 및 사염화탄소에서 선택되는 1종이상을 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 인체 또는 동물에 투여되는 것이며, 유효성분은 수용성일 것으로 예측되므로, 더욱 바람직하게는 물을 이용할 수 있다.
또한 상기 (a)단계는 유효성분이 최대한 용출되며, 떫은감과 귤껍질이 연화될 수 있도록 80~120℃의 온도에서 1~3시간 동안 가열하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 100℃의 온도에서 2시간 동안 가열할 수 있다. 아울러 상기(a)단계를 한번 만 수행하는 경우 아직 충분히 연화되지 못하여 다음 단계의 효소분해가 완전히 일어나지 않으므로 (a)단계를 수회 반복하는 것이 바람직하며, 시간 및 사용되는 연료에 의한 비용소모를 줄이기 위하여 2회 반복하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에서 떫은감은 예컨대, 재배 후 대략 6~9개월에 수확한 떫은감으로, 외형상 녹색을 띄고 크기는 직경 3~10㎝ 정도의 미성숙한 떫은맛의 감일 수 있다. 본 발명은 감 및 귤껍질에서 항 비만 성분을 가지는 폴리페놀등의 유효성분을 추출하여 사용하므로 이러한 폴리페놀의 함량이 높을 것으로 예상되는 떫은 감을 사용하는 것이 바람직하다. 아울러 감이 완전히 성숙하게 되면, 당분이 많아져 농축 과정에서 당도를 낮추기 어려우며, 당에 의한 체중증가가 있을 수 있으므로, 미성숙된 떫은 감을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 (b)단계는 연화된 떫은감과 귤껍질 용액에 효소를 첨가하여 분해하는 단계로 사용되는 효소는 아라바나제(arabanase), 셀룰라제(cellulase), 베타-글루카나제(beta-glucanase), 헤미셀룰라제(hemicellulase) 및 자일레나제(xylanase)를 포함하는 군에서 1종 이상을 포함하는 것이 바람직하며, 다양한 성분으로 구성되는 떫은감과 귤껍질을 효과적으로 분해하기 위하여 노보자임(Novozymes, Denmark)사의 Viscozyme을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 또한 연화된 떫은감 및 귤껍질이 충분히 분해될 수 있도록 5~25시간 동안 효소에 의한 분해를 하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 10~20시간, 가장 바람직하게는 15시간 동안 수행할 수 있다. 아울러 상기 효소에 의한 분해가 완결된 이후에는 효소에 의한 당질 생성이나, 유효성분의 분해와 같은 부반응을 방지하기 위하여 80~100℃로 가열하여 효소를 비활성화 하는 것이 바람직하다.
상기 (c)단계는 유효성분이 용출된 이후 유효성분을 제외한 식이섬유, 세포벽등을 제거하는 단계로 규조토, 활성탄, 제올라이트 또는 중공사막 필터를 이용하여 여과하는 것이 바람직하며, 식용품에 사용 가능한 필터인 규조토를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
또한 상기 여과된 용액을 10BX 이하까지 농축하는 것이 바람직하다. 본 발명의 조성물은 비만을 개선하기 위하여 사용되는 것이므로 당에 의한 체중 증가를 막기 위하여 10BX 이하까지 농축하는 것이 바람직하다.
본 발명의 단위 "BX"는 당도를 측정하는 단위로 흔히 브릭스(Brix)로 표현된다. 이는 100g의 물에 녹아있는 사탕수수 설탕의 농도를 기준으로 하여 당도를 표현한 것으로 수치가 높아질수록 당분이 많이 함유된 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 (c)단계 이후 멸균된 덱스트린(dextrin)을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 덱스트린은 생성된 조성물의 점도를 높이기 위하여 첨가되는 것으로 생성물의 이동과 보관의 편의를 위하여 첨가할 수 있다. 또한 상기 덱스트린은 추출물의 변질을 방지하기 위하여 95℃에서 30분간 멸균한 것을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계 이후 추출물을 동결 건조하여 분쇄하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 생성된 조성물은 액상이므로, 쉽게 변질될 수 있으며, 무게가 무거워 이동과 보관이 용이하지 않을 수 있다. 따라서, 이를 동결건조한 다음 분쇄하여 분말형태로 제조하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 상기의 방법으로 제조되는 항 비만 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명에 따른 구체적인 실시예를 들어 설명한다.
실시예
사용 원료
돼지 췌장 리파아제(Type 2), Orlistat, morpholinepropanesulphonicacid (MOPS), Tris-HC1, and p-nitrophenyl butyrate (p-NPB), 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 및 2,2′′-Azino-bis diammonium salt (ABTS)는 시그마알드리치(St Louis, MO, USA)에서 구매하였다.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka, Japan)에서 구매하였다.
Viscozyme은 Novozymes(Denmark)에서 구매하였다.
다른 모든 시약은 생화학 등급을 사용하였다.
실험 동물의 취급
생후 4주의 건강한 숫 ICR 쥐(약 30~32g)를 Orient(한국 경기도)에서 구매하였다. 각 쥐는 실온(22±3℃)과 습도(55±5%)에서 12시간씩 낮과 밤을 변경하여 보관하였다. 실험은 대구 한의대의 동물 실험의 윤리위원회에 의해 승인되었다. 쥐는 실험용 먹이 펠릿 및 임의 량의 물에 자유롭게 접근 할 수 있게 하였다.
적응기간(1주)이후 정상 쥐(n=8)을 제외한 모든 실험용 쥐는 60%의 고지방식(HFD; Diet 12492, Research Diets, Inc., 105 New Brunswick, NJ, USA)이 5일간 공급되었다. 이후 HDF 60%가 공급된 ICR쥐(n=32)는 임의의 네개의 그룹(HDF 대조군, orlistat 군, 두개의 PCM처리 군(50 및 200mg/kg/day))으로 분리되었다(각 그룹당 n=8). 정상 그룹은 정상적인 먹이가 공급되었으며, 나머지 그룹은 시험종료까지 60% HDF가 공급되었다.
6주 동안 정상 그룹과 HDF대조군은 위 튜브를 통하여 물을 공급하였으며, 약물 처리군은 위 튜브를 통하여 Orlistat 또는 PCM을 공급하였다. 6주의 실험 이후, 각 쥐는 12시간 동안 금식 이후 에테르로 마취되었다. 채취된 혈액은 4℃에서 10분간 즉각적으로 원심 분리되었다.
혈청 트리글리세라이드 및 총 촐레스테롤은 시판중인 키트(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan)를 이용하여 분광실험을 수행하였다. HDL콜레스테롤은 Asan Pharm. Co., Ltd.,(한국 화성시, Cat AM203)의 시판중인 킷으로 측정되었다. LDL콜레스테롤 레벨은 TG, TC 및 HDL레벨 및 하기의 식을 이용하여 계산되었다.
LDL-cholesterol level (mg/dL) = [TC-(HDL-cholesterol)-TG]/5
통계처리
모든 결과는 평균±표준오차(mean±S.E)로 나타내었다. 유의성 검정을 위해 Dunnett의 다중 비교 테스트(Dunnett's multiple comparison test, SPSS 18.0 for Windows, SPSS Inc., U.S.A.)에 따르는 일원분산분석(one-way analysis of variance(ANOVA))을 실시하였다. P<0.05인 경우 통계적인 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
실시예
1
떫은감(Diospyros kaki Thunb)은 경상북도 농업기술원(한국 상주)에서 수확(재배 후 6~8개월에 수확한 것으로, 녹색을 띈 직경 3~10㎝ 크기의 떫은감)되었으며, 마른 귤껍질(Citrus unshi. S.Marcov)은 MSC Co.,Ltd.(한국 양산)로부터 구매하였다. 각 500kg을 선별하여 100℃로 가열된 물에서 2시간 동안 2회 추출하였다. 이후 15시간 동안 효소(Viscozyme)분해를 실시하였다. 이후, 90℃에서 30분간 효소가 비활성화되었다. 규조토를 이용하여 여과 한 후, 추출물을 감압농축기(rotary vacuum evaporator N-N series, Eyela, Tokyo, Japan)를 이용하여 10BX 이하로 농축하였다. 농축된 추출물에 95℃에서 30분간 멸균한 덱스트린을 추가하였다. 멸균된 추출물은 동결 건조된 다음, 분쇄기로 분쇄하였다(결과물을 PCM으로 명명하였다).
비교예
1
효소에 의한 분해과정을 실시하지 않는 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하였다.
비교예
2
효소에 의한 분해과정을 5시간 실시하는 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하였다.
비교예
3
효소에 의한 분해과정을 25시간 실시하는 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하였다.
실험예
1
PCM의 항산화 활성의 판정은 Park et al.의 방법에 따라, DPPH라디칼에 의하여 억제되는 것에 의하여 수행된다. 실시예 1에서 제조된 100㎕의 PCM 에탄올 용액(blank: 100㎕ of ethanol)은 96-웰 플레이트를 이용하여 100㎕의 DPPH 에탄올 용액(60μM)에 첨가된다. 아스코빅산(표준시료)을 여덟가지 농도(0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 50 및 200㎍/mL)로 준비하였다. 반응용액은 25℃에서 30분간 어둠속에서 보관되었다. 흡광도는 마이크로 플레이트 판독기(M200 PRO, Tecan, Austria)를 이용하여 측정하였다. 상기 혼합물은 540nm을 이용하여 분광 측정되었다. 각 시료의 항산화 활성은 IC50(로그 투여 억제 곡선으로부터 계산된, 50 % DPPH 라디칼 형성을 억제하는 데 필요한 마이크로 몰 농도)을 이용하여 표현되었다. 항산화 활성은 IC50으로 표현되며, 낮은 IC50 값은 큰 억제능에 대응된다.상기 라디칼 저해 활성은 하기의 식을 이용하여 계산되었다.
DPPH radical scavenging activity (%) = [1 (Asample/Ablank)] × 100
도1(A, B)에 나타난 바와 같이, PCM의 DPPH억제능에 의한 IC50은 117.46 ± 4.89 μg/mL이며, 아스코빅산(양의 대조군)의 IC50수치는 1.26 ± 0.02 μg/mL이다.
실험예
2
각 추출물의 ABTS억제능은 Park et al.의 방법을 개선하여 측정되었다. ABTS 스톡 용액은 7.4mM의 농도로 물에 용해되었다. 상기 ABTS 라디칼 양이온은 ABTS 스톡 용액과 2.45mM의 과황산칼륨을 혼합하였으며, 실온에서 14시간동안 어둠속에 보관하여 제조된다. 상기 ABTS용액은 750 nm에서 0.70 ± 0.02의 흡광도를 얻기 위해 에탄올로 희석하였다. 실시예 1에서 제조된 PCM용액에 희석된 ABTS를 혼합한 다음, 실온의 어둠속에서 15분간 방치하였다. 아스코빅산(표준시료)을 여덟가지 농도(0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 50 및 200㎍/mL)로 준비하였다. 75nm의 흡광도는 마이크로 플레이트 판독기(M200 PRO, Tecan, Austria)를 이용하여 측정하였다. 블랭크는 샘플을 증류수를 이용한 것을 제외하고 동일한 방법으로 준비되었다. 상기 라디칼 저해 활성은 하기의 식을 이용하여 계산되었다
ABTS radical scavenging activity (%) = [1 (Asample/Ablank)] × 100
ABTS에 대한 PCM의 IC50 수치는 120.04 ±1.67 μg/mL 이며, 양의 대조군으로 아스코빅산의 수치는 2.27 ± 0.19 μg/mL이다(도 1(C, D))
실험예
3
췌장 리파아제의 활성은 Kim et al.에 의하여 이전에 보고된 방법으로 수정되었다. 간략하게 효소 완충액은 10mM의 MOPS(morpholinepropanesulphonicacid)와 1mM의 EDTA 를 포함하는 pH 6.8의 169㎕의 트리스 완충액(100mM Tris-HC1 147 and 5mM CaCl2, pH 7.0)을 돼지 췌장 리파아제 용액 6㎕에 첨가하여 준비되었다. 이후 시험농도(100, 250, 500, 및 1000㎍/mL)의 각 20㎕의 실시예 1의 PCM 또는 Orlistat(0.1, 0.25, 0.5 및 1㎍/mL)가 175㎕의 효소 완충액에 혼합되었으며, 기질용액(10mM 10mM p-NPB (p-nitrophenyl butyrate) in dimethylformamide)과 함께 37℃에서 15분간 방치되었다. 효소 반응은 37℃에서 35분간 수행되었다. 리파아제 활동은 p-니트로페놀로 p-NPB가 가수분해되는 것을 측정하여 결정되었다. 405nm의 흡광도 증가는 마이크로 플레이트 판독기(M200 PRO, Tecan, Austria)를 이용하여 측정하였다. 리파아제 활성 억제는 돼지 췌장 리파아제가 시험화합물과 같이 방치될 때 OD에서 비율의 감소로 표시되었다. 리파아제 저해능은 하기의 식을 이용하여 계산되었다.
Inhibition (%) = 100-[(B-b)/(A-a)*100]
A는 저해제 없이 측정된 활동성, a는 저해제 없는 음의 대조군, B는 저해재를 포함하는 활동성, b는 저해제를 포함하는 음의 대조군, 그 결과를 평균으로 표시하였다(n=4)
도 2에 나타난 바와 같이 Orlistat의 경우 일정 농도 이상에서는 리파아제 저해능이 더 이상 상승하지 않고 있었지만, PCM의 경우 많은 양을 투여할수록 리파아제 저해능이 상승하는 것을 알 수 있다.
실험예
4
PCM의 총 페놀 함량은 Folin-Ciocaleu의 방법을 약간 변경하여 정량하였다. 10㎕의 실시예 1의 PCM과 790㎕의 증류수를 웰에 혼합하여 투입한 다음, 50㎕의 Folin-Ciocaleu 시약을 1분간 혼합하였다. 150Folin-Ciocaleu의 20% 탄산나트륨 용액을 더한 다음, 20℃에서 2시간 동안 혼합하였다. 마지막으로 765nm에서 결과물의 흡광도가 측정되었다. 총 페놀 함량은 추출물 g 당 밀리그램 갈산 당량으로 표시 하였다. 제시된 값은 세 가지 측정의 평균이다. 추출된 플라보노이드는 Lister et al.의 방법을 적용하여 정량화하였다. PCM 50㎕와 500㎕의 디에틸렌글리콜은 웰에서 혼합되었다. 이후, 1N의 NaOH 5㎕이 혼합되었으며, 37℃에서 1시간 동안 방치되었다. 최종적으로 결과물의 흡광도가 420nm에서 측정되었다. 플라보노이드의 함량은 추출물 g당 mg 나린진 당량으로 표시하였다. 제시된 값은 세 가지 측정의 평균이다.
총 페놀 함량은 표준곡선(y = 0.023x+0.30 and R2 = 0.997)을 이용하여 갈산의 당량(GAE)으로 측정되었으며, PCM 추출물의 29.90 ±0.14 mg GAE/g 였다. 플라보노이드의 함량은 표준곡선(y = 0.0195x + 196 0.04 and R2 = 0.9999)을 참조할 때 PCM 추출물의 18.33 ± 0.08 mg나린진당량/g이였다.
실험예
5
HDF유도 비만에 대한 PCM의 효과를 분석하기 위하여 6주간 실시예 1에서 제조된 PCM공급을 하거나 또는 하지 않으면서 쥐에서 HDF유도비만 현상을 연구하였으며, 실험 이후에 TG, TC, HDL콜레스테롤 및 LDL콜레스테롤과 같은 혈청 리파아제에 대한 PCM의 효과를 측정하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 6주간의 HDF공급 이후 쥐(Con)의 TG, TC, LDL콜레스테롤은 일반 먹이를 공급한 쥐(Nor)보다 그 수치가 상당히 높아진 것을 볼 수 있다. Orlistat를 공급한 쥐(O) 또는 PCM을 200mg 공급한 쥐(PCM200)의 경우 일반 적인 먹이를 공급한 쥐와 동일한 수준의 수치를 가지고 있었으며, 이는 Orlistat와 PCM모두 TG, TC, LDL콜레스테롤수치를 낮추는 것에 도움을 줄 수 있다는 것을 보여준다. 또한 PCM을 50mg공급한 쥐(PCM50)역시 Orlistat나 PCM200만큼은 아니였지만 일정 부분의 수치감소를 나타내는 것을 알 수 있다. 아울러 혈관 건강에 도움이 되는 것으로 알려진 HDL콜레스테롤은 모든 쥐에서 많은 변화가 없는 것으로 나타났다.
실험예
6
HDF유도 비만에 대한 PCM의 효과를 분석하기 위하여 6주간 실시예 1에서 제조된 PCM공급을 하거나 또는 하지 않으면서 쥐에서 HDF유도비만 현상을 연구하였으며, 실험 이후 쥐의 몸무게 변화와 내장지방의 변화를 측정하였다.
그룹 | 체중 | 내장지방량(g) | |||
초기(g) | 최종(g) | 변화량(g/6주) | |||
일반먹이 | 36.06±0.96 | 47.92±1.46 | 11.86±1.00 | 24.1±1.0 | |
HDF 먹이 | CON | 37.67±0.51 | 55.15±1.78 | 17.48±1.95 | 57.5±1.5 |
O | 36.71±0.96 | 44.92±1.62 | 8.21±1.82 | 42.5±2.8 | |
PCM50 | 37.18±0.44 | 48.06±0.17 | 10.88±0.52 | 50.6±3.2 | |
PCM200 | 36.93±0.38 | 45.98±0.94 | 9.05±0.90 | 50.3±2.3 |
표1에 나타난 바와 같이, HDF 제어 쥐(CON)는 정상 쥐(일반먹이)에 비하여 상당히 최종 체중이 증가하였다(55.15±1.78g, 47.92±1.46g). 또한, HFD 제어 쥐의 내장 지방의 중량은 정상 쥐에 비해 대폭(정상쥐의 238%) 증가하였지만, Orlistat 및 PCM200 처리 된 마우스(O, PCM200)는 HFD 제어 쥐의 것과 비교하여 현저하게 감소하였다. PCM50 처리는 그 차이가 크지는 않았지만 감소하는 경향을 보였다. 무엇보다도, 체중 변화는 모든 약물처리 된 실험군에서 크게 감소했다. 전반적으로, PCM은 HFD 유도 된 비만의 질환을 개선하는 데 도움이 될 수 있다.
실험예
7
제조방법에 따른 PCM의 효과를 확인하기 위하여 실시예 1, 비교예1, 비교예2 및 비교예3의 방법으로 각각 제조된 PCM을 이용하여 실험예 6과 동일한 방법으로 실험을 실시하였다. 실험 쥐에는 각각의 방법으로 제조된 PCM을 200mg씩 공급하여 제조방법에 따른 체중변화와 내장지방의 변화를 측정하였다.
그룹 | Viscozyme 분해 시간 |
체중 | 내장지방량(g) | |||
초기(g) | 최종(g) | 변화량(g/6주) | ||||
일반먹이 | - | 36.06±0.96 | 47.92±1.46 | 11.86±1.00 | 24.1±1.0 | |
HDF 먹이 | CON | - | 37.67±0.51 | 55.15±1.78 | 17.48±1.95 | 57.5±1.5 |
실시예1 | 15시간 | 36.93±0.38 | 45.98±0.94 | 9.05±0.90 | 50.3±2.3 | |
비교예1 | 0시간 | 36.51±0.36 | 53.36±1.42 | 16.85±1.65 | 54.8±1.8 | |
비교예2 | 5시간 | 38.38±0.54 | 49.16±0.52 | 10.78±1.02 | 52.1±3.2 | |
비교예3 | 25시간 | 36.03±0.48 | 51.02±1.02 | 14.99±1.32 | 55.2±2.1 |
표2에 나타난 바와 같이, 비교예 1의 경우 Viscozyme에 의한 분해를 실시 하지 않음에 따라 효과가 가장 떨어지는 것으로 나타났으며, 비교예2의 경우 Viscozyme에 의한 분해시간이 짧아 충분히 유효성분을 용출하지 못했음을 알 수 있다. 또한 비교예3의 경우 Viscozyme에 의한 용출시간은 충분하였지만, 용출된 유효성분이 효소에 의하여 분해되거나 효소와 결합하여 비활성화 되어 효과가 떨어진 것으로 판단된다.
이상으로 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명하였다. 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미, 범위 및 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (11)
- (a) 떫은감과 귤껍질에 용매를 첨가한 다음 가열하는 단계;
(b) 상기 추출된 용액을 효소를 이용하여 분해하는 단계; 및
(c) 상기 효소 분해된 용액을 여과한 다음 농축하는 단계;
를 포함하는 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법으로서,
상기 (b) 단계의 효소는 아라바나제(arabanase), 셀룰라제(cellulase), 베타-글루카나제(beta-glucanase), 헤미셀룰라제(hemicellulase) 및 자일레나제(xylanase)로 이루어진 비스코자임(Viscozyme)이고,
상기 (b) 단계는 10~20시간 동안 수행되고,
상기 (c) 단계의 농축은 여과된 추출물의 당도가 10BX 이하가 될 때까지 수행되는 것을 특징으로 하는 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 (a) 단계는 80~120℃의 온도에서 1~3시간 동안 추출하는 것을 특징으로 하는 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 용매는 물, 알코올, 벤젠, 톨루엔 및 사염화탄소에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 (a) 단계는 2회 반복하여 수행하는 것으로 특징으로 하는 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 (c) 단계의 여과는 규조토, 활성탄, 제올라이트 또는 중공사막 필터를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 (c) 단계 이후 멸균된 덱스트린(dextrin)을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 (c) 단계 이후 추출물을 동결 건조하여 분쇄하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 떫은감과 귤껍질을 이용한 항 비만 조성물의 제조방법. - 제1항 내지 제4항, 제7항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조되는 항 비만 조성물.
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