KR101545504B1

KR101545504B1 - 지방배출 효능의 천연 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101545504B1
Application number: KR1020150015819A
Authority: KR
Inventors: 김철중; 김기중
Original assignee: (주) 다정
Priority date: 2015-02-02
Filing date: 2015-02-02
Publication date: 2015-08-19
Also published as: WO2016126008A1

Abstract

중성지질 및 콜레스테롤 성분 배출을 통한 항비만 효능을 구비한 어린귤 추출 조성물 및 그 제조방법이 개시된다. 본 발명은 외형상 푸른색을 띄며, 크기가 직경 4㎝ 이하인 완품 상태의 어린귤로부터 추출된 조성물로서, 항비만 효능을 구비한 어린귤 추출 조성물 및 그 제조방법을 제공한다.

Description

지방배출 효능의 천연 조성물 및 그 제조방법{NATURAL COMPOSITION HAVING EFFICACY OF TRIGLYCERIDE EXCRETION AND PREPARING METHOD SAME}

본 발명은 지방배출 효능의 천연 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 중성지질 및 콜레스테롤 성분 배출을 통한 항비만 효능을 구비한 어린귤 추출 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

경제발전과 더불어 우리나라 생활방식은 서구 선진국 형태로 발전함에 따라 식생활의 변화 및 육체적인 활동이 감소되면서, 신체 내의 체지방이 증가되고 대사의 불균형으로 비만 인구가 증가하고 있으며, 이로 인해 당뇨병, 고지혈증, 혈전장애 등 심혈관계 질환이 복합적으로 나타나는 이른바 대사증후군의 발생빈도가 지속적으로 높아지고 있다(Lee SJ, Park JY, Nam CM, Jee SH. 2008. The prevalence estimation of metabolic syndrome and it's related factors based on data from general health medical examination: a multi-center study. J Korean Soc Health Information Health Statistics 33: 119-133; Frohlich J, Lear SA. 2002. Old and new risk factors for atherosclerosis and development of treatment recommendations. Clin Exp Pharmacol Physiol 29: 838-842).

비만은 한 가지 원인으로 발생하는 질병이 아니라, 유전적, 환경적, 사회적 요인들에 의해 복합적으로 나타나는 증후군으로, 에너지의 과다 섭취 후 체내 대사활동에서 소비되지 못하고 지방조직에 중성지질으로 축적되어 발생된다(Chua, S.C.Jr. Monogenic models of obesity. Behav Genet. 27: 277-284, 1997). 또한, 비만에서 보이는 혈중 지방산(fatty acid) 농도와 복부 비만의 증가는 고지혈증과 제 2형 당뇨병의 흔한 증상으로, 자유지방산의 증가는 심실 비대를 야기하고(DeFronzo, R.A, Ferrannini, E. Insulin resistance. A multifaceted syndrome responsible for NIDDM, obesity, hypertension, dyslipidemia, and atherosclerotic cardiovascular disease. Diabetes Care. 14(3): 173-194, 1991), 복부 지방 축적은 인슐린 저항성의 유발에 밀접한 연관성이 있음이 보고되었고(Tamori, Y., Kasuga, M. Obesity and insulin resistance. Nippon Rinsho. 67(2):236-244, 2009), 이로 인하여 고혈압, 동맥경화증, 당뇨병, 고지혈증 등의 생활습관병을 야기하는 원인이 되거나 건강을 악화시키는 요인이 되고 있다.

비만에 의한 건강상의 문제는 미리 예방하는 것이 중요하지만 환자의 경우 장기적이고 효과적인 비만 관리와 치료가 필요하다. 현재 비만을 치료하기 위한 방법은 식사요법, 운동요법, 행동요법 등의 생활 습관 교정법과 약물치료 및 수술적 치료 등이 있다(Mason EE. 1992. Methods for voluntary weight loss and control. Obes Surg 2: 275-276). 일반적으로 생활습관 교정법만으로 비만치료에는 한계가 있기 때문에 많은 경우에 생활습관 교정과 함께 약물치료가 필요하다. 비만 치료를 위한 약물 사용은 오래전부터 시도되어 왔지만 여러 가지 심각한 부작용들로 인해 현재 미국 식품의약국(FDA)이 장기사용을 승인한 비만치료 약물은 노르에피네프린(norepinephrine) 및 세로토닌(serotonin)의 재흡수를 억제하는 작용을 갖는 시부트라민(sibutramine)과, 췌장 및 소화기계에서 분비되는 리파제(lipase)를 억제하여 효과를 나타내는 오르리스타트(orlistat)가 있다(King DJ, Devaney N. 1988. Clinical pharmacology of sibutramine hydrochloride (BTS 54524), a new antidepressant, in healthy volunteers. Br J Pharmacol 26: 607-611; Yanovski SZ, Yanovski JA: Obesity. N Engl J Med 346:591-602, 2002). 하지만, 이들 약물 모두 부작용 때문에 몇 가지 제한적 허용으로 인해 널리 사용되지는 못하고 있다(Padwal R, Li SK, Lau DC: Long-term pharmacotherapy for overweight and obesity: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Int J Obes Relat Metab Disord 27: 1437-1446, 2003; Thearle M, Aronne LJ: Obesity and pharmacologic therapy: Endocrin Metab Clin North Am 32: 1005-24, 2003).

이러한 문제를 해결하기 위하여 비만치료제의 개발과 연구는 계속되고 있지만, 합성된 항비만 약물들에서는 아직까지 부작용이 없는 완전한 치료제는 개발되지 않고 있다. 따라서, 최근 체중조절에 효과적이면서 부작용이 적은 기능성 소재들을 천연물에서 탐색하여, 이들의 항비만 작용기전에 따라 의약품 또는 건강기능성 식품으로 개발하려는 연구들이 활발하게 진행되고 있다(George AB, Louis AT. 2000. Medicinal strategies in the treatment of obesity. Nature 404: 672-677).

한편, 공개특허공보 제10-2009-0114093호에서는 청피를 포함하는 복합 추출물의 비만 및 대사증후군 예방에 대한 효능에 대해 개시하고 있다.

일반 성숙귤의 껍질을 진피라 하고, 어린귤의 껍질을 청피라 한다. 성숙귤은 일반적으로 즐겨 먹는 외관상 노란색을 띄는 과일이다. 귤의 기원 식물은 귤나무(Citrus unshiu Marko)이다. 성숙귤은 보통 11월에 출하되고, 어린귤은 보통 7~8월에 솎아 버리기도 하고 태풍이나 자연적으로 낙과되는 것이 일반적이다. 이러한 어린귤을 비만 예방용으로 활용하기 위해서는 그 열매는 제외하고 껍질(청피)만을 취하여 이를 추출하여 사용하고 있는 것이다.

다른 한편, 성숙한 탱자의 껍질은 지각이라 하고, 어린 탱자의 전체는 지실이라 한다. 탱자(Poncirus trifoliata Rafin)는 보통 소화불량에 많이 쓰이는 약제인데 지실은 지각보다 행기작용이 강하여 더 효과적인 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 지실이 소화기 계통에 더욱 유의적인 효과가 있는 점에 직시하여, 종래 비만 예방을 위해 청피나 진피만을 이용한 것과 달리 어린귤 전체로부터 추출된 추출물이 비만 예방에 더욱 효과적일 것이라 기대하고, 청피나 진피 추출물 대비 어린귤 추출 성분의 차이와, 이들 추출물에 대한 비만 예방 관련 비교 실증 실험을 통해 어린귤 추출물의 항비만 효능에 대해 명확히 밝히고자 한다.

전술한 기술적 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서 본 발명은, 외형상 푸른색을 띄며, 크기가 직경 4㎝ 이하인 완품 상태의 어린귤로부터 추출된 조성물로서, 항비만 효능을 구비한 어린귤 추출 조성물을 제공한다.

또한 상기 어린귤 추출 조성물은 성숙귤, 청피 및 진피로부터 추출된 각 추출 조성물 대비 기준 중량 당 마그네슘 함량 및 아연 함량이 더 높은 것을 특징으로 하는 항비만 효능을 구비한 어린귤 추출 조성물을 제공한다.

또한 상기 항비만 효능은 대변을 통한 중성지질 및 콜레스테롤 성분 배출량 증대로 발현되는 것을 특징으로 하는 항비만 효능을 구비한 어린귤 추출 조성물을 제공한다.

전술한 기술적 과제를 해결하기 위한 다른 양태로서 본 발명은, 상기 어린귤 추출 조성물을 유효성분으로 함유하는 식품 조성물을 제공한다.

전술한 기술적 과제를 해결하기 위한 또 다른 양태로서 본 발명은, (a) 외형상 푸른색을 띄며, 크기가 직경 4㎝ 이하인 어린귤을 세절, 건조 및 분쇄하는 단계; (b) 상기 분쇄된 어린귤을 용매 추출하는 단계; (c) 상기 추출된 추출액을 여과 및 감압농축하는 단계; 및 (d) 상기 감압농축된 농축물을 동결건조하는 단계;를 포함하는 항비만 효능을 구비한 어린귤 추출 조성물 제조방법을 제공한다.

또한 상기 세절은 적어도 4절 이상으로 수행되고, 상기 건조는 30~70℃에서 12~36시간 동안 열풍 건조로 수행되어, 상기 건조된 어린귤 중량이 건조 전 대비 20% 미만이 되도록 하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

또한 상기 분쇄된 어린귤은 10㎜ 이하의 망을 통과한 크기인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

또한 상기 용매로 상기 분쇄된 어린귤 중량의 5~20배의 알코올 또는 물이 사용되고, 상기 추출은 80~100℃에서 냉각환류 추출법이 이용되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

또한 상기 감압농축은 진공도 100㎜Hg 이하 및 75~85℃ 조건으로 수행되어, 농축물이 5~15bx의 농도를 갖도록 하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

또한 상기 동결건조는 -50~-40℃ 온도로 동결건조 후 -50~-40℃에서 25~35℃까지 0.5~1℃/hr의 승온속도로 상승시키면서 진공동결건조로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명은 완품 상태의 어린귤로부터 추출된 조성물이 청피나 진피 추출물에 비해 대변을 통한 중성지질 및 콜레스테롤 성분 배출량 증대를 통해 월등히 우수한 항비만 효능을 구비한 것을 밝혀, 비만 예방 관련 기능성 식품 분야에서 어린귤의 활용 가치를 극대화할 수 있는 방안을 제시하는 효과가 있다.

또한 완품 상태의 어린귤로부터 청피나 진피 추출물보다 더욱 우수한 항비만 효능을 가질 수 있는 최적의 추출, 농축 및 동결건조 조건 등을 구체적으로 제시하여 통상의 기술자가 어려움 없이 항비만 효능을 갖는 어린귤 추출 조성물을 제조할 수 있도록 하는 기초자료를 제공하는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 사용된 어린귤을 나타낸 사진,
도 2는 본 발명의 실시예에서 어린귤의 세절 과정을 나타낸 사진,
도 3은 본 발명의 실시예에서 어린귤을 4절(a) 및 8절(b) 후 건조 테스트를 수행한 결과를 비교하여 나타낸 사진,
도 4는 본 발명의 실시예에서 분쇄된 어린귤을 나타낸 사진,
도 5는 본 발명의 실시예에서 필터링 과정을 나타낸 사진,
도 6은 본 발명의 실시예에서 재탕 과정을 나타낸 사진,
도 7은 본 발명의 실험예에 따른 동물실험 디자인을 설명하는 흐름도,
도 8은 본 발명의 실험예에서 마우스의 시기별 체중 측정 결과를 나타낸 그래프,
도 9 및 도 10은 각각 본 발명의 실험예에 따른 정상군, 고지방식이군 및 실험군에 대해 주기적으로 분변을 채취하고, 분변 내 콜레스테롤 및 중성지질 함량 분석 결과를 나타낸 그래프,
도 11은 본 실험예에 따른 정상군, 고지방식이군 및 어린귤 추출물 식이 실험군의 췌장 리파아제 활성을 측정 분석한 결과를 나타낸 그래프.

이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참고하여 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략하기로 한다.

본 발명은 외형상 푸른색을 띄며, 크기가 직경 4㎝ 이하인 완품 상태의 어린귤로부터 추출된 조성물로서, 항비만 효능을 구비한 어린귤 추출 조성물 및 그 제조방법을 개시한다. 이하, 본 발명에 따른 어린귤 추출 조성물, 비교군인 성숙귤, 청피 및 진피 추출 조성물의 제조과정과, 추출 조성물의 성분 비교 및 항비만 효능 관련 실증 실험을 통하여 상세히 설명한다.

재료

어린귤은 7월에서 8월초에 제주도에서 수확된 외관상 푸른색을 띄고 직경 4㎝ 이하(90% 이상이 2~4㎝ 크기)의 크기이며, 쓰고 신맛이 나는 것으로 50~60㎏ 준비하였고(도 1 참조), 성숙귤은 9월경에 제주도에서 수확된 외관상 노랗고 단맛이 나는 것(하우스귤)을 50~60㎏ 준비하였다. 또한 청피(영천산)와 진피(제주도산)는 약업사(나눔제약)에서 각각 5~10㎏ 구입하여 준비하였다.

세절 및 건조

어린귤과 성숙귤에 대해서는 추출에 앞서 수분을 증발시키기 위해 세절(도 2 참조) 후 건조 과정을 거친다. 적정 세절 수준을 확인하기 위해 어린귤 1㎏을 각각 4절 및 8절 후 50℃에서 24시간 동안 열풍 건조 테스트를 실시하고 그 결과를 하기 표 1 및 도 3에 나타내었다.

표 1에서와 같이 4절의 경우 세절된 귤의 안쪽 부분이 완전히 건조되지 않는 등, 8절의 경우가 상대적으로 건조 상태가 양호한 것으로 나타나 세절은 8절로 실시하였다.

건조는 세절된 귤의 손상 없이 중량 기준 80% 이상의 수분이 빠져 나가도록, 즉 건조 전 중량 대비 20% 미만이 되도록 수행되는 것이 바람직하다. 이를 위해 열풍 건조를 수행하는 것이 바람직하며, 30~70℃에서 12~36시간 동안, 더욱 바람직하게는 40~60℃에서 18~30시간 동안 수행할 수 있다. 본 실시예에서는 50℃에서 24시간 동안 열풍 건조를 수행하였다. 한편 청피 및 진피는 건조 상태로 구입하여 별도 세절 및 건조 작업을 수행하지 않았다.

분쇄

상기 건조된 재료에 대하여 후속 추출 공정에서 고수율의 균질한 추출물 수득을 위해 분쇄 과정을 거친다. 분쇄물의 입자 크기가 과도할 경우, 특히 어린귤의 경우에는 추출 효율이 좋지 않을 수 있어, 후속 추출 공정에 사용될 분쇄물은 최대 10㎜(가로 및 세로) 크기의 망을 통과한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 본 실시예에서는 각 건조된 재료 약 3㎏을 분쇄기(속도 4rpm)로 조분쇄하여 5㎜ 크기의 망을 통과시켜 분쇄 전 중량 대비 95~98% 가량의 분쇄물을 수득하였다(도 4 참조).

추출

상기 각 분쇄물에 대한 추출 공정에 사용되는 추출 용매로는 에탄올 등의 알코올이나 물이 사용될 수 있다. 추출 효율을 고려한 적정 용매 함량은 상기 분쇄물 중량에 대하여 5~20배가 바람직하고, 8~12배가 더욱 바람직하다. 본 실시예에서는 추출 용매로 분쇄물 각각 약 2.85㎏에 대하여 10배인 28.5㎏의 주정을 사용하였다.

한편 추출은 냉각환류 추출법으로 시행될 수 있다. 이때 추출 온도는 80~100℃ 조건으로 수행될 수 있으며, 알코올이 90중량% 이상 함유된 용매의 경우에는 80~85℃, 알코올이 50~90중량% 가량 함유된 용매의 경우에는 88~92℃, 물이 90중량% 이상 함유된 용매의 경우에는 95~100℃ 조건으로 수행되는 것이 바람직하다. 본 실시예에서는 70중량%의 알코올 성분을 함유한 주정을 이용하여 90℃에서 9시간 동안 냉각환류 추출을 시행하여 각 추출액을 수득하였다.

여과 및 농축

상기 추출된 각 추출액에 대하여 불순물 제거를 위한 여과 및 용매 제거를 위한 감압농축 과정이 수행된다.

여과는 부크너깔때기에 와트만 2번 시험지(ADVENTEC No.2, 150㎜)를 깔고, 감압 필터링하여 수행되었다(도 5 참조). 이때 필터링되지 않은 부분에 대해서는 수시로 원심분리(7,000rpm) 후 필터링하였다.

감압농축은 각 여과액을 진공도 100㎜Hg 이하 및 75~85℃ 조건으로 수행되어, 농축물이 5~15bx의 농도를 갖도록 할 수 있고, 바람직하게는 진공도 60㎜Hg 이하 및 78~82℃ 조건으로 수행되어, 농축물이 8~12bx의 농도를 갖도록 할 수 있다. 본 실시예에서는 상기 각 여과액에 대하여 진공도 48㎜Hg 및 80℃ 조건에서 감압농축하여 24㎏ 정도의 알코올 성분을 회수하였다. 이때 농축 과정에서 물을 2㎏ 가량 가수하였다. 이후, 최종 진공도 60㎜Hg에서 시료 농도가 10bx 정도 될 때까지 최대한 농축한 후 종료하여 약 1.6㎏의 농축물을 수득하였다.

한편 상기 여과 후 잔존물에 대해서는 상기 추출, 여과 및 농축 과정을 반복하여 재탕하였다(도 6 참조).

동결건조

상기 농축 및 여과하여 수득된 생성물에 대하여 초저온 냉동고(deep freezer)를 이용하여 동결건조 과정을 수행하였다. 동결건조는 본 발명에 따른 어린귤 추출 조성물에서 마그네슘 및 아연 성분 등 특정 성분의 소실 방지를 위해 2차에 걸쳐 수행될 수 있다. 즉, -50~-40℃, 바람직하게는 -47~-43℃ 온도로 동결 후 25~35℃, 바람직하게는 28~32℃까지 0.5~1℃/hr의 승온속도로 상승시키면서 진공동결건조로 수행될 수 있다. 본 실시예에서는 약 1.5㎏의 여과 생성물을 2㎏ 정도의 물로 희석하여 -45℃ 동결 후 선반 온도 -45℃에서 30℃까지 90시간(0.8℃/hr) 정도 상승시키면서 진공동결건조하여 분말 상태의 최종 조성물을 제조하였다. 추출에서 사용되어진 원료 중량 대비 얻어진 동결건조물 중량으로 수율을 계산하였으며, 수율은 어린귤 추출물이 21.4%, 성숙귤 추출물이 38.9%, 청피 추출물이 16.1% 및 진피 추출물이 24.8%였다.

성분 분석

상기 제조된 각 최종 조성물에 대하여 아래와 같이 9대 영양소, 마그네슘 및 아연에 대한 성분 분석을 수행하고 그 결과를 하기 표 2 내지 4에 각각 나타내었다. 성분 분석은 식약처의 식품공전에 따라 수행되었다. 이하에서 약어 'IMF', 'MF', 'CP' 및 'JP'는 각각 '어린귤', '성숙귤', '청피' 및 '진피'를 의미한다.

먼저 표 2를 참조하면, 어린귤, 성숙귤, 청피 및 진피의 추출 조성물에 대하여 9대 영양소를 분석한 결과, 근소한 성분 함량 차이는 있으나 유의적인 차이를 보이지는 않는 것으로 확인되었다.

다음으로 표 3을 참조하면, 다른 추출 조성물에 비해 어린귤 추출 조성물에서 마그네슘 성분 함량이 현저히 높은 것을 알 수 있다. 마그네슘은 잡곡류 진녹색의 채소, 견과류, 어류 등에 많이 포함되어 있으며, 포화지방, 설탕, 카페인, 알코올 등을 많이 섭취하는 경우 마그네슘의 필요량이 증가할 수 있다. 인체내에는 총 20~28g의 마그네슘이 존재하고, 이 중 60%는 뼈에, 27%는 근육에, 1%는 세포외액에 존재하며, 나머지는 연부조직과 기타 체액에 존재한다.

식습관과 연관된 대표적 현대 질환인 비만은 지방의 과다한 축적을 의미한다. 에너지 섭취와 에너지 소비의 불균형으로 양성 에너지 환경 상태가 되면 여분의 에너지가 지방으로 축적되어 비만을 초래하게 되며, 비만과 영양소의 관계는 대부분 거대 영양소에 대한 연구에 그치고 있고, 현재까지 거대 영양소의 이상적인 비율에 대한 논쟁이 지속되고 있다. 이에 반해 미량 영양소에 대한 연구는 상대적으로 미비하며, 특히 혈액이 아닌 세포나 조직 수준에서의 연구는 더욱 드물다.

비만을 지방 축적 측면으로 볼 때 인슐린 저항성은 에너지 대사 측면에서 상당히 연관성이 있으며, 또한 이와 연관된 대표적인 미네랄 성분인 마그네슘은 연구 가치가 있다고 할 것이다. 세포내에서 두 번째로 많은 양이온인 마그네슘은 300개 이상의 효소반응에서 조효소로 작용한다. 생체 연구에서도 인슐린은 세포외에 있는 마그네슘을 세포내로 운반하며 세포내로 들어온 마그네슘은 포도당 산화에 있어 인슐린의 작용을 조절하는 것으로 알려져 있다. 세포내에서 마그네슘은 리포산(lipoic acid), 코엔자임 큐10(coenzyme Q10), 글루타치온(glutathion) 등이 담당하는 미토콘드리아 산화스트레스 방지에 있어 항산화제 및 조효소로 작용한다. 이와 같이 지방을 이용하여 에너지를 생성하는 미토콘드리아의 기능과 지방 축적을 유발하는 인슐린 저항성과의 관계에서 미토콘드리아의 항산화 작용을 담당하는 마그네슘의 역할을 볼 때 비만과 마그네슘의 연관성은 깊은 것으로 볼 수 있다.

다음으로 표 4를 참조하면, 어린귤 추출 조성물은 성숙귤 및 진피의 추출 조성물에 비해 아연 성분 함량이 현저히 높고, 청피에 비해서도 11% 가량 높은 함량을 보이는 것을 알 수 있다.

아연은 지속적으로 섭취해야 하는 필수 영양소로 대개 2가 이온으로 존재하며, 아미노산, 펩타이드, 단백질 및 뉴클레오타이드와 쉽게 복합체를 형성한다. 또한 아연은 효소의 구성요소로 핵산과 아미노산 대사에 관여하고, 성장과 조직골격 형성, 생식 및 면역기능을 원활하게 해 주는 역할을 한다. 또한 아연은 세포생장, 생식기능 성숙, 면역 등 체내의 여러 가지 작용에 필수적인 미량의 무기질로 우리 몸에 약 1.5~2.5g 함유되어 있으며, 그 중 60%는 근육에, 나머지는 골격 등에 분포되어 있다.

이러한 아연은 단백질, 탄수화물, 지질, 핵산의 합성과 분해에 관여하고, 특히 항산화 효소의 안정화에 중요한 역할을 하며, 지방세포로 포도당이 유입되는 것을 조절하는 인슐린 작용에 영향을 미쳐 당대사에 관여한다. 따라서 아연의 보충은 제1형 당뇨병에서 아연 결핍을 호전시켜 LDL 콜레스테롤 산화를 감소시킨다고 보고되어 있는 것으로 볼 때, 역시 비만과 아연의 연관성은 크다고 할 수 있다.

실험예 : 어린귤 추출 조성물의 항비만 효능 확인

본 발명에 따른 어린귤 추출 조성물의 항비만 효능을 확인하기 위해 동물실험을 시행하였다.

본 실험은 정상식이(AIN-76 semisynthetic diet, 10% fat wt/wt)를 급여한 정상군(normal diet(ND); n=11), 비만 유도를 위한 고지방식이(총 지방 함량 24% wt/wt, 총 칼로리 지방 함량 45% wt/wt)를 급여한 고지방식이군(high fat diet(HFD); n=11)군과 고지방식이에 의한 지질대사 개선 효과를 검증하기 위하여 고지방식이에 각각 어린귤, 성숙귤, 청피 및 진피 추출물 5중량%를 첨가한 실험군으로 배분하여 지질대사 관련 생물학적 지표(biomarker)들을 측정하였다. 실험동물은 ICR 마우스(C57BL/6J-ob/ob 수컷 5주령, Orient bio Inc, Seoul, Korea)를 사용하였으며, 1주간 펠렛(pellet) 형태의 식이(lab. chow 식이)를 제공하여 사육환경에 적응시킨 후, 난괴법(randomized complete block design)에 의해 각 그룹으로 나누어 실험하였다(도 7 참조). 동물 사육실의 환경은 항온(25±2℃), 항습(50±5%), 그리고 6시부터 18시까지의 명암 주기(dark-light cycle)로 일정한 조건을 유지하였고, 개개의 케이지(cage) 안에서 사육하였으며, 실험식이와 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였고(ad libitum), 식이는 4℃에 냉장 보관하였다. 식이 섭취량은 매일 기록하고 체중은 1주일 간격으로 측정하였다.

자료분석 및 통계처리에 있어, 모든 실험 결과는 컴퓨터 통계 프로그램 중의 하나인 SPSS package program(Statistical Package for the Social Sciences, SPSS Inc., Chicago)을 사용하여 산출되었다. 각 군 간의 평균 차이에 대한 유의성 검정을 위해 일원분산분석(one-way analysis of variance(ANOVA))을 실시하였고 다군 간의 차이는 던칸의 다중범위검정(Duncan's multiple range test)에 의해 p<0.05 이상의 수준에서 사후검정을 실시하였다. 모든 결과는 평균±표준오차(mean±S.E.(standard error))로 표시하였다(Steel & Torrie, 1960).

하기 표 5 및 도 8에서는 각 군의 마우스에 대해 시기별로 체중(단위: g)을 측정(2회씩 측정)한 결과를 나타내고 있다. 체중 측정 전 18시간 공복을 유지하였고, 음수는 자유로이 제공하였다.

표 5 및 도 8을 참조하면, 실험 시작 후 3주까지는 청피나 진피 추출 조성물 대비 체중 감소 효과가 나타나지 않았으나, 4주째 이후부터는 체중 감소 효과가 나타났으며, 청피나 진피 추출 조성물을 처치한 실험군 사이에서 통계적 유의성을 볼 수 있었다(p<0.05). 이로부터 어린귤 추출 조성물 식이가 체중 감량에 유효하다는 것을 알 수 있다.

도 9 및 도 10은 각각 실험예에 따른 정상군, 고지방식이군 및 실험군에 대해 주기적으로 분변을 채취하고, 분변 내 콜레스테롤(Fecal cholesterol) 및 중성지질(Fecal Triglyceride) 함량 분석 결과를 나타낸 그래프이고, 도 11은 실험예에 따른 정상군, 고지방식이군 및 어린귤 추출물 식이 실험군의 췌장 리파아제 활성을 측정 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. 분변 내 콜레스테롤 및 중성지질 함량 분석과, 리파아제 활성 측정 분석은 다음과 같이 수행되었다.

[분변 내 콜레스테롤 및 중성지질 함량 분석 방법]

분변 내 콜레스테롤 및 중성지질 함량 측정을 위해 Folch 등(1957)의 방법을 수정, 보완하여 추출하였다. 즉, 건조된 분변을 막자사발에 갈아 0.5g을 취한 후 5㎖ chloroform:methanol(2:1 v/v) 용액을 첨가하여 4℃에서 24시간 추출하였다. 추출액을 900×g(4℃)에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 취해 50℃에서 질소가스로 건조시킨 후 동일 추출용매 1㎖에 다시 녹였다. 이 중 콜레스테롤 및 중성지질 측정용으로 각각 100㎕를 취하여 다시 질소가스로 건조시키고 5㎖의 에탄올로 용해시켰다.

콜레스테롤 정량은 Allain 등(1974)의 효소법을 응용한 측정용 시액(아산제약 kit, Korea)을 사용하여 수행되었다. 상기 에탄올 용해물 10㎕에 효소시액 1.5㎖를 가하고 37℃에서 5분간 반응시킴으로써 에스테르(ester)형 콜레스테롤로부터 콜레스테롤 에스테라제(cholesterol esterase)에 의해 전환된 유리 콜레스테롤을 콜레스테롤 옥시다제(cholesterol oxidase)에 의해 H₂O₂ Δ⁴-cholestenon으로 전환시키고, 이 중 H₂O₂를 퍼옥시다제(peroxidase), 페놀(phenol) 및 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrine)과 혼합하여 적색으로 발색시킨 후, 500nm(VERSAmax, Molecular devices Co, USA)에서 흡광도를 측정하여 콜레스테롤 표준용액(300mg/㎗)과 비교하여 정량하였다.

중성지질 정량은 McGowan 등(1983)의 효소법을 이용한 발색법 원리에 의한 중성지질 측정용 시액(Asan kit, Korea)을 사용하여 수행되었다. 상기 에탄올 용해물 10㎕에 효소시액 1.5㎖를 가하고 37℃에서 10분간 반응시킴으로써 리포프로틴 리파제(lipoprotein lipase)를 이용하여 중성지질을 글리세롤(glycerol)로 분해시킨 후 글리세롤 키나제(glycerol kinase)와 글리세로포스포옥시다제(glycerophosphooxidase) 첨가로 H₂O₂를 발색시켰다. 여기에 퍼옥시다제(peroxidase)와 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrin)을 첨가하여 적색으로 발색시킨 후 550nm(VERSAmax, Molecular devices Co, USA)에서 흡광도를 측정하여 글리세롤 표준용액(300mg/㎗)과 비교하여 정량하였다.

[췌장 리파아제 활성 측정 분석 방법]

실험동물을 희생시킨 후 췌장 조직을 PBS(phosphate buffered saline) 용액에 수 차례 헹군 후 표면의 수분을 제거하였고, 적출 즉시 액체질소에 급냉시켜 시료 분석시까지 -70℃에서 보관하였다. 보관된 췌장 조직 40mg에 4배의 완충액(assay buffer)을 첨가하여 균질화시킨 다음 13,000×g(4℃)에서 10분간 원심분리하여 상층액을 사용하였고, 이를 리파아제 활성 측정 키트(BioVison, USA)를 사용하여 분석하였다. 췌장 리파아제에 의해 중성지방이 가수분해되어 생성되는 글리세롤의 양을 효소적기법으로, 형광을 생성하는 OxiRed probe와의 반응 생성물에 의한 변화 정도를 37℃에서 60분간 반응시킨 후, 570nm에서 흡광도를 측정하고, 표준곡선은 글리세롤 용액의 농도별 흡광도 값과 비교하여 정량하였다.

먼저, 분변 내 콜레스테롤 함량을 분석한 결과, 실험군이 정상군 및 고지방식이군보다 높은 것으로 나타났고, 청피나 진피 추출 조성물 식이 실험군보다 어린귤 및 성숙귤 추출 조성물 식이 실험군에서 더욱 높은 분변 내 콜레스테롤 함량을 보인 것으로 나타났으며, 특히 어린귤 추출 조성물 식이 실험군에서 월등히 높은 함량을 보인 것으로 나타났다. 또한 분변 내 중성지질 함량을 분석한 결과에서도 콜레스테롤 함량 분석 결과와 유사한 양상을 보였고, 다만 어린귤과 성숙귤 추출 조성물 식이 실험군이 비슷한 수치를 보인 것으로 확인되었다. 이는 어린귤 추출 조성물이 장내에서 중성지질 및 콜레스테롤 흡수를 억제하기 때문인 것으로 판단된다.

다음으로, 췌장 리파아제 활성 측정 분석 결과, 어린귤 추출물 식이 실험군은 정상군 및 고지방식이군에 비해 췌장 리파아제 활성이 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있다. 음식물 중 중성지질(triglyceride)은 췌장 리파아제의 작용으로 지방산과 모노글리세라이드(monoglyceride)로 가수분해되고, 가수분해로 생성된 지방산은 콜레스테롤과 함께 마이셀(micelle)을 형성한다. 이에 따라 지방산은 마이셀의 형태로 체내에 흡수된다. 리파아제는 일종의 에스테르분해효소로서 섭취된 지질(lipid)을 지방산과 글리세롤로 분해시킨다. 인체 내에는 위 리파아제(gastric lipase)와 췌장 리파아제(pancreatic lipase)등이 있으나 지방의 소화는 상기 위 리파아제에 의해서는 거의 일어나지 않고, 대부분 췌장 리파아제에 의하여 장관에서 이루어진다(Goldstein J. L., Schrott H., Hazzard E., Bierman E., Motuski A., J. Clin. Invest., 52, 1544-1568 (1973); Rodwell V. W., McNamara D. J., Shapiro D. J., Adv. Enzymol., 38, 373-412 (1973); Carey M. C., Small D. M., Bliss C. M., Annu. Rev. Physiol., 45, 651-677 (1983)). 췌장 리파아제 활성이 저해되면 식이 지방을 흡수 가능한 모노글리세리드(monoglyceride)와 유리지방산으로 가수분해할 수 없게 되고, 분해되지 않는 중성지방은 체내로 흡수되지 않으므로 칼로리 감소를 유도하는 효과를 가진다. 따라서 이는 비만치료에 사용될 수 있으며, 저칼로리 식이와 함께 체중의 감량 및 유지에 이용될 수 있다.

한편, 어린귤 추출물 식이 실험군은 총 지방 함량 24% 및 총 칼로리 지방 함량 45%에 해당하는 고지방식이로 처리된 군으로서 췌장 리파아제 활성은 고지방사료 섭취에 의해 증가하지 않은 것으로 판단된다(Sabb JE, Godfrey PM, Brannon PM, The Journal of Nutrition, [1986, 116(5):892-899] 참조). 이로부터, 상기 리파아제 활성 분석 결과는 전술한 어린귤 추출 조성물이 장내에서 중성지질 흡수를 억제하여 이를 분변으로 배출시키는 효과가 탁월하다는 것을 뒷받침해 준다고 할 것이다.

이하에서는 본 발명에 따른 어린귤 추출 조성물을 함유하는 기능성 식품의 적용 제제예를 설명하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

제제예 1: 건강 식품 제조

하기 표 6에서는 상술한 본 발명에 따른 어린귤 추출 조성물을 유효성분으로 함유하는 기능성 건강식품 조성을 나타내고 있다. 하기 조성에서 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 제제예로 혼합 조성한 것을 나타내고 있으나, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 각 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 2: 건강 음료 제조

하기 표 7에서는 상술한 본 발명에 따른 어린귤 추출 조성물을 유효성분으로 함유하는 기능성 건강음료 조성을 나타내고 있다. 건강음료 제조는 통상의 건강음료 제조방법에 따라 예컨대, 하기 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 후 냉장 보관하여 사용할 수 있다. 하기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였으나, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

이상으로 본 발명의 바람직한 실시예를 도면을 참고하여 상세하게 설명하였다. 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미, 범위 및 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

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(a) 외형상 푸른색을 띄며, 크기가 직경 4㎝ 이하인 완품 상태의 어린귤을 세절, 건조 및 분쇄하는 단계;
(b) 상기 분쇄된 어린귤을 용매 추출하는 단계;
(c) 상기 추출된 추출액을 여과 및 감압농축하는 단계; 및
(d) 상기 감압농축된 농축물을 동결건조하는 단계;
를 포함하는 항비만 효능을 구비한 어린귤 추출 조성물 제조방법으로,
상기 건조는 30~70℃에서 12~36시간 동안 열풍 건조로 수행되어, 상기 건조된 어린귤 중량이 건조 전 대비 20% 미만이 되도록 하고,
상기 용매로 상기 분쇄된 어린귤 중량의 5~20배의 알코올 또는 물이 사용되고, 상기 추출은 80~100℃에서 냉각환류 추출법이 이용되고,
상기 감압농축은 진공도 100㎜Hg 이하 및 75~85℃ 조건으로 수행되어, 농축물이 5~15bx의 농도를 갖도록 하고,
상기 동결건조는 -50~-40℃ 온도로 동결건조 후 -50~-40℃에서 25~35℃까지 0.5~1℃/hr의 승온속도로 상승시키면서 진공동결건조로 수행되어,
상기 어린귤 추출 조성물이 성숙귤, 청피 및 진피로부터 추출된 각 추출 조성물 대비 기준 중량 당 마그네슘 함량 및 아연 함량이 더 높도록 하고,
상기 항비만 효능은 대변을 통한 중성지질 및 콜레스테롤 성분 배출량 증대로 발현되는 것을 특징으로 하는 항비만 효능을 구비한 어린귤 추출 조성물 제조방법.
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제5항에 있어서,
상기 분쇄된 어린귤은 10㎜ 이하의 망을 통과한 크기인 것을 특징으로 하는 방법.
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