KR102041764B1 - Ｂａｍｂａｍ：고처리율 서열분석 데이터의 병렬 비교 분석 - Google Patents

Ｂａｍｂａｍ：고처리율 서열분석 데이터의 병렬 비교 분석 Download PDF

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Abstract

상이한 서열 대상 (differential sequence object) 은 참조 게놈 서열에 대한 서브스트링의 알려져 있는 위치를 사용하는 서열 스트링의 점증적 동기화를 통한 서브스트링의 정렬을 기준으로 구축된다. 이후, 참조 게놈에 대한 관련 있는 변화만을 포함하는 출력물 파일이 생성된다.

Description

ＢＡＭＢＡＭ：고처리율 서열분석 데이터의 병렬 비교 분석 {BAMBAM: PARALLEL COMPARATIVE ANALYSIS OF HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING DATA}
다른 출원과의 관계
본 출원은 그 전체가 본원에 참고문헌으로 인용되는 2011 년 11 월 18 일에 출원한 발명의 명칭 "Bambam: Parallel Comparative Analysis Of High-Throughput Sequencing Data" 인 미국 정규출원 일련 번호 13/373,550 과 관련되고 이에 대해 우선권을 주장한다.
본 발명은 하기 미국 연방 기관의 기금을 사용하여 일부 이루어졌다: 미국 국립 암 연구소 (National Cancer Institute) 번호 1U24CA143858-01. 미국 연방 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 데이터를 처리하고 개체 또는 대상에서 생물학적 경로의 성분을 확인하고 이로써 상기 개체 또는 대상이 장애 또는 질환에 걸릴 위험이 있는지를 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 SAM/BAM-포맷화 파일에 저장된 숏-리드 (short-read) 정렬을 사용하여 개체 또는 대상의 종양 및 생식세포 서열분석 데이터의 비교 분석을 수행하기 위한 도구로서 사용될 수 있다. 상기 데이터 처리 방법으로, 전체 및 대립형질-특이적 카피 수를 계산하고, 대립형질-불균형 부위에 걸쳐 생식세포 서열을 위상화 (phase) 시키고, 체세포 및 생식세포 서열 변이체를 발견하고, 체세포 및 생식세포 구조 변이 부위를 추론한다. 본 발명은 또한 대상이 암, 자가 면역 질환, 세포 주기 장애 또는 기타 장애에 걸리기 쉬운지 여부를 진단하는 방법을 사용하는 것에 관한 것이다.
현대 암치료에 있어 중심이 되는 전제는 환자 진단, 예후, 위험 평가, 및 치료 반응 예측이 진단시 수집되는 관련 임상 정보 (예를 들어, 환자 이력, 종양 조직학 및 단계) 뿐 아니라 후속적인 임상 추적 데이터 (예를 들어, 치료 요법 및 질환 재발 이벤트) 와 함께 종양의 게놈, 전사 및 에피게놈 특징에 기초한 암의 계층화에 의해 개선될 수 있다는 것이다.
서열분석에 있어서의 최근의 진전으로 인해 개별 유기체 및 유기체의 조직 뿐 아니라 별개의 인구 집단 및 심지어 종에 대한 게놈 및 하위-게놈 데이터가 풍부해졌다. 이는 다양한 질환의 진단 또는 게놈-기반 개인 맞춤 치료, 예후/위험 평가, 및 심지어 게놈, 전사 및/또는 후성적 정보를 사용하는 치료 반응 예측의 발전을 촉진시켰다.
게놈 데이터의 양이 상당한 수준에 도달하였으므로, 컴퓨터 요구사항 및 중요한 출력물 생성 방법에 변화가 필요해지고 있다. 예를 들어, 'The Cancer Genome Atlas' (TCGA) 와 같은 프로젝트로부터의 다수 종양 및 매치된 정상 전체 게놈 서열이 이제 이용가능하며 관련 정보 추출이 어렵다. 이는 통계적 관련 데이터를 수득하기 위한 높은 게놈 서열분석 커버리지 (coverage) (예를 들어, 30 배 초과) 의 필요성과 추가로 합해진다. 압축 형태로도 게놈 정보가 종종 수백 기가바이트에 도달할 수 있으며, 다수의 이러한 대규모 데이터세트를 비교하는 분석이 대부분의 경우 속도가 느리고 관리하기에 어려우나, 임의의 제공된 샘플에서 두 번째 샘플에 대해 발생한 많은 게놈 변화를 발견하기 위해서는 전적으로 필요하다.
유방암은 임상적 및 유전체적으로 불균질적이고, 여러 병리학적 및 분자적으로 다른 아류형으로 구성된다. 통상적이면서 표적화된 치료에 대한 환자 반응은 마커 유도된 치료 전략의 개발을 동기 유발하는 아류형에 따라 상이하다. 유방암 세포주의 수집은 종양에서 발견된 많은 분자 아류형 및 경로를 잘 보여주며, 후보 치료 화합물을 사용하는 세포주의 치료가 분자 아류형, 경로 및 약물 반응 간의 연관성의 확인을 유도할 수 있음을 제시한다. 77 개의 치료 화합물의 시험에서, 거의 모든 약물은 이들 세포주에 대해 차등적 반응을 보여주며, 대략 절반은 아류형-, 경로 및/또는 게놈 이상-특이적 반응을 보여준다. 이러한 관찰은 임상 약물 지정 뿐 아니라 약물을 효과적으로 병용하려는 노력을 알려줄 수 있는 반응 및 저항성의 메커니즘을 제시한다.
현재, 질환 및 장애의 분석, 진단, 치료, 및 결과 측정에 사용할 수 있는 방법을 제공할 필요가 있다.
발명의 개시
본 발명자는, 처리할 다수의 거대 파일을 필요로 하지 않는 방법 및 게놈 일탈에 대해 상대적으로 낮은 정보 밀도를 갖는 유사하게 거대한 출력물 파일의 생성을 방지하는 방법으로 중요한 출력물이 신속히 생성되게 하는 비교 게놈 분석의 다양한 시스템 및 방법을 발견하였다.
본 발명의 주제의 한 구현예에서, 상이한 유전자 서열 대상을 도출하는 방법은 (a) 제 1 조직을 나타내는 제 1 유전자 서열 스트링 (string) 및 (b) 제 2 조직을 나타내는 제 2 유전자 서열 스트링을 저장하는 유전자 데이터베이스에 대한 접근을 제공하는 단계를 포함한다 (이때 제 1 및 제 2 서열 스트링은 다수의 상응하는 서브스트링 (sub-string) 을 가짐). 또 다른 단계에서, 유전자 데이터베이스와 연결된 서열 분석 엔진에 대한 접근이 제공되고, 또 다른 단계에서는 서열 분석 엔진이, 다수의 상응하는 서브스트링 중 하나 이상의 알려져 있는 위치를 사용하여 제 1 및 제 2 서열 스트링을 점증적으로 동기화시켜 부분적인 정렬을 생성시킨다. 추가의 단계에서, 서열 분석 엔진은 부분적인 정렬을 사용하여 부분적인 정렬 내의 제 1 및 제 2 서열 스트링 사이의 부분적으로 상이한 스트링을 생성시키고; 서열 분석 엔진은 부분적으로 상이한 스트링을 사용하여 상이한 서열 데이터베이스에서의 상이한 유전자 서열 대상을 업데이트한다.
가장 바람직하게는, 제 1 및 제 2 유전자 서열 스트링은 각각 제 1 및 제 2 조직의 10% 이상, 보다 통상적으로는 50% 이상의 게놈, 전사체 또는 프로테옴을 나타내거나, 제 1 및 제 2 조직의 실질적 전체 게놈, 전사체 또는 프로테옴을 나타낸다. 제 1 및 제 2 조직이 동일한 생물학적 독립체 (예를 들어, 환자, 건강한 개체, 세포주, 줄기 세포, 실험 동물 모델, 재조합 박테리아 세포 또는 바이러스) 로부터 기원한다는 것이 추가로 이해되어야 한다. 한편, 제 1 조직은 건강한 조직일 수 있으나 제 2 조직은 병든 조직 (예를 들어, 종양 조직) 일 수 있다. 추가의 고려된 양태에서, 상응하는 서브스트링은 동형 또는 이형 대립형질을 포함한다.
동기화 단계가 다수의 서브스트링 중 하나 이상을 정렬하는 것을 포함하며, 이때 상기 정렬이 제 1 스트링 내의 선험적 (a priori) 으로 알려져 있는 위치를 기준으로 한다는 것이 또한 일반적으로 바람직하다.
대안적이거나 추가적으로, 동기화 단계는 다수의 서브스트링 중 하나 이상에 대한 알려져 있는 위치를 포함하는 알려져 있는 참조 스트링 (예를 들어 컨센서스 (consensus) 서열) 을 기준으로 다수의 서브스트링 중 하나 이상을 정렬하는 것을 포함하고/포함하거나, 동기화 단계는 다수의 서브스트링 중 하나 이상의 길이 미만의 길이를 갖는 윈도우 내 다수의 서브스트링 중 하나 이상을 정렬하는 것을 포함한다. 필요시, 고려된 방법은 제 1 서열 스트링의 전체 길이에 걸쳐 제 1 및 제 2 서열 스트링을 반복하여 점증적으로 동기화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
특히 바람직한 방법에서, 상이한 유전자 서열 대상은 하나 이상의 염색체에 대한 다수의 부분적으로 상이한 스트링을 나타내고, 제 1 조직의 실질적 전체 게놈에 대한 다수의 부분적으로 상이한 스트링을 나타내고/나타내거나, 상이한 유전자 서열 대상을 기술하는 메타데이터를 포함하는 속성을 포함한다. 특히 바람직한 속성은 제 1 및 제 2 조직 중 하나 이상의 상태이다. 예를 들어, 상기 상태는 제 1 및 제 2 조직 중 하나 이상의 생리학적 상태 (예를 들어 종양 성장, 세포자멸사, 분화 상태, 조직 연령 및 치료에 대한 반응), 또는 유전적 상황 (예를 들어 배수성, 유전자 카피 수, 반복 카피 수, 역위, 결실, 바이러스 유전자 삽입, 체세포 돌연변이, 생식세포 돌연변이, 구조적 재배열, 전위 및 이형성 손실) 을 포함할 수 있다. 적합한 상태는 또한 조직 내 신호전달 경로 (예를 들어 성장 인자 신호전달 경로, 전사 인자 신호전달 경로, 세포자멸사 경로, 세포 주기 경로 및 호르몬 반응 경로) 와 연관된 경로 모델 정보를 포함한다. 유전자 서열 대상이 파일을 포함하며, 상기 파일이 가장 바람직하게는 표준화 포맷 (예를 들어 SAM/BAM 포맷) 에 따른다는 것이 추가로 고려된다.
본 발명의 주제의 또 다른 양태에서, 본 발명자는 또한 건강 관리 서비스를 제공하는 방법을 고려한다. 이러한 방법에서, 의료 기록 저장 장치와 정보적으로 연결되는 분석 엔진에 대한 접근이 제공되며, 이때 상기 저장 장치는 환자에 대한 상이한 유전자 서열 대상을 저장한다. 또 다른 단계에서, 분석 엔진은 환자에 대한 상이한 유전자 서열 대상에서의 다수의 부분적으로 상이한 스트링의 성좌 (constellation) 또는 부분적으로 상이한 스트링의 존재를 사용하여 환자-특이적 데이터 세트를 생성시키며, 상기 분석 엔진은 또한 환자-특이적 데이터 세트를 기준으로 환자-특이적 지시사항을 생성시킨다.
특히 바람직한 방법에서 의료 기록 저장 장치는 스마트 카드로서 구성되며 환자에 의해 휴대되고/휴대되거나 건강관리 제공자에 의해 원격으로 접근가능하다.
가장 통상적으로는, 환자에 대한 상이한 유전자 서열 대상은 2 개 이상의 염색체, 또는 환자의 실질적 전체 게놈에 대한 다수의 부분적으로 상이한 스트링을 포함한다. 대안적이거나 추가적으로, 환자에 대한 상이한 유전자 서열 대상은 또한 2 개 이상의 조직 유형을 나타내는 다수의 부분적으로 상이한 스트링, 또는 동일 조직에 대한 2 개 이상의 시간적 간격 (temporally spaced) 결과를 포함할 수 있다 (예를 들어, 상기 동일 조직에 대한 시간적 간격 결과는 치료의 개시 전과 후에 수득됨). 또한, 환자-특이적 지시사항이 진단, 예후, 치료 결과 예측, 치료 전략에 대한 권고사항 및/또한 처방인 것이 일반적으로 바람직하다.
본 발명의 주제의 또 다른 양태에서, 본 발명자는 인구 집단의 의료 기록 데이터베이스에서 다수의 상이한 유전자 서열 대상을 수득하고 저장하는 단계를 포함하는 인구 집단 분석 방법을 고려하며, 이때 상기 기록 데이터베이스는 분석 엔진과 정보적으로 연결된다. 또 다른 단계에서, 분석 엔진은 다수의 상이한 유전자 서열 대상 내의 다수의 부분적으로 상이한 스트링 성좌를 확인하여 성좌 기록을 생성시키며, 상기 분석 엔진은 성좌 기록을 사용하여 인구 집단 분석 기록을 생성시킨다.
이러한 방법에서, 인구 집단이 하나 이상의 통상적 특징 (예를 들어 병원체에 대한 노출, 유해한 작용제에 대한 노출, 건강 이력, 치료 이력, 치료 성공, 성별, 인종 및/또는 연령) 을 공유하는 것을 특징으로 하는 다수의 일원 및/또는 다수의 혈족을 포함한다는 것이 일반적으로 고려된다. 적합한 인구 집단은 또한 지리학적 위치, 민족성 및/또는 직업을 공유하는 것을 특징으로 하는 다수의 일원을 포함할 수 있다. 따라서, 인구 집단 분석 기록이 부성 (paternity) 또는 모성 (maternity) 확인을 포함한다는 것을 인지해야 한다.
본원에 나타낸 방법이 개별적인 환자의 성좌 기록을 인구 집단 분석 기록과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다는 것이 또한 고려되는데, 따라서 이는 환자-특이적 기록 (예를 들어, 특정 인구 집단에 속하는 것으로서의 환자의 확인 또는 위험 평가를 나타냄) 을 생성시킬 수 있다. 환자-특이적 기록은 또한 진단, 예후, 치료 결과 예측, 처방 및/또는 치료 전략에 대한 권고사항을 포함할 수 있다.
결과적으로 본 발명자는 또한, 한 단계에서 분석 엔진과 정보적으로 연결되는 의료 기록 데이터베이스에서 참조 상이한 유전자 서열 대상을 저장하는, 개인의 상이한 유전자 서열 대상을 분석하는 방법을 고려한다. 분석 엔진은 개인의 상이한 유전자 서열 대상 내 다수의 부분적으로 상이한 스트링과 참조 상이한 유전자 서열 대상 내 다수의 부분적으로 상이한 스트링 사이의 편차를 계산하여 편차 기록을 생성시키며, 상기 분석 엔진은 편차 기록을 사용하여 개인-특이적 편차 프로파일을 생성시킨다.
이러한 방법에서, 참조 상이한 유전자 서열 대상이 개인의 다수의 부분적으로 상이한 스트링으로부터, 또는 개인의 다수의 부분적으로 상이한 스트링으로부터 계산되는 것이 바람직하다.
본원에 나타낸 방법에서 환자 또는 개인이 병상, 및 특히 질환 또는 장애로 진단된 환자 또는 개인일 수 있다는 것이 인지되어야 한다. 예를 들어, 고려된 병상은 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS), 에디슨병, 성인 호흡곤란 증후군, 알레르기, 강직성 척추염, 아밀로이드증, 빈혈, 천식, 죽상동맥경화증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 갑상선염, 전립성 비대증, 기관지염, 체디아크-히가시 증후군, 담낭염, 크론병, 아토피 피부염, 피부근염, 진성 당뇨병, 폐기종, 태아적아구증, 결절성 홍반, 위축성 위염, 사구체신염, 굿파스튜어 증후군, 통풍, 만성 육아종 질환, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 과호산구증가증, 과민성대장 증후군, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심근 또는 심막 염증, 골관절염, 골다공증, 췌장염, 다낭성 난소 증후군, 다발성근염, 건선, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 강피증, 중증복합면역결핍증 (SCID), 쇼그렌 증후군, 전신과민증, 전신성 홍반성 낭창, 전신 경화증, 혈소판감소성 자반병, 궤양성 대장염, 포도막염, 베르너 증후군, 암의 합병증, 혈액투석 및 체외순환, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 원충 및 연충 감염; 및 선암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 골수종, 육종, 기형암종, 및 특히, 부신, 방광, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 자궁경부, 담낭, 신경절, 위장관, 심장, 신장, 간, 폐, 근육, 난소, 췌장, 부갑상선, 음경, 전립선, 타액선, 피부, 지라, 고환, 흉선, 갑상선 및 자궁의 암, 정좌불능증, 알츠하이머병, 기억상실증, 루게릭병 (ALS), 운동 실조증, 조울증, 긴장증, 뇌성마비, 뇌혈관 질환, 크로이츠펠트-야콥병, 치매, 우울증, 다운 증후군, 지연성 운동장애, 긴장 이상, 뇌전증, 헌팅턴병, 다발성 경화증, 근이영양증, 신경통, 신경섬유종증, 신경병증, 파킨슨병, 피크병, 망막색소변성증, 정신분열증, 계절성 정서장애, 노인성 치매, 뇌졸중, 투렛 증후군 및 특히 뇌의 선암, 흑색종 및 기형암종을 포함하는 암을 포함한다.
추가로 고려된 병상은 또한 암 예컨대 선암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 골수종, 육종, 기형암종, 및 특히, 부신, 방광, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 자궁경부, 담낭, 신경절, 위장관, 심장, 신장, 간, 폐, 근육, 난소, 췌장, 부갑상선, 음경, 전립선, 타액선, 피부, 지라, 고환, 흉선, 갑상선 및 자궁의 암; 면역 장애 예컨대 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS), 에디슨병, 성인 호흡곤란 증후군, 알레르기, 강직성 척추염, 아밀로이드증, 빈혈, 천식, 죽상동맥경화증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 갑상선염, 기관지염, 담낭염, 접촉성 피부염, 크론병, 아토피 피부염, 피부근염, 진성 당뇨병, 폐기종, 림프구세포독소를 갖는 우발성 림프구감소증, 태아적아구증, 결절성 홍반, 위축성 위염, 사구체신염, 굿파스튜어 증후군, 통풍, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 과호산구증가증, 과민성대장 증후군, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심근 또는 심막 염증, 골관절염, 골다공증, 췌장염, 다발성근염, 건선, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 강피증, 쇼그렌 증후군, 전신과민증, 전신성 홍반성 낭창, 전신 경화증, 혈소판감소성 자반병, 궤양성 대장염, 포도막염, 베르너 증후군, 암의 합병증, 혈액투석 및 체외순환, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 원충 및 연충 감염, 외상, 브루톤의 X-상관관계 무감마글로불린혈증, 공통가변성 면역결핍증 (CVI), 디죠지 증후군 (흉선형성부전), 흉선 형성이상, 단독성 IgA 결핍, 중증복합면역결핍증 (SCID), 혈소판감소증 및 습진을 갖는 면역결핍 (비스코트-알드리히 증후군), 체디아크-히가시 증후군, 만성 육아종 질환, 유전성 결관신경 부종, 및 쿠싱병과 관련된 면역결핍; 및 발달 장애 예컨대 신세뇨관 산증, 빈혈, 쿠싱 증후군, 연골무형성 왜소증, 뒤시엔느 및 베커 근이영양증, 뇌전증, 생식샘 발생장애, WAGR 증후군 (빌름스 종양, 무홍채증, 비뇨 생식기 기형 및 정신 지체), 스미스-마제니스 증후군, 골수이형성 증후군, 유전성 점막표피 이형성, 유전성 각피증, 유전성 신경병증 예컨대 샤르코-마리-투스병 및 신경섬유종증, 갑상선 기능 저하증, 수두증, 발작 장애 예컨대 시드남 무도증 및 뇌성마비, 척추파열, 무뇌증, 두개척추파열, 선천성 녹내장, 백내장, 감음 신경성 청력 손실, 및 대상의 임의의 조직, 기관, 또는 계, 예를 들어, 뇌, 부신, 신장, 골격계 또는 생식계를 포함하는 세포 성장 및 분화, 배아발생, 및 형태발생과 관련된 임의의 장애를 포함한다.
또한 추가로 고려된 병상은 내분비 장애 예컨대 성선기능저하증, 시한 증후군, 요붕증, 칼라만병, 핸드-쉴러-크리스찬병, 렛테러-시웨병, 유육종증, 공터기안 증후군 및 왜소증을 포함하는 뇌하수체 기능저하증과 관련된 장애; 말단비대증, 거인증 및 부적합 항이뇨 호르몬 (ADH) 분비 증후군 (SIADH) 을 포함하는 뇌하수체기능항진증; 및 갑상선종, 점액수종, 박테리아 감염 관련 급성 갑상선염, 바이러스 감염 관련 아급성 갑상선염, 자가면역성 갑상선염 (하시모토병) 및 크레틴병을 포함하는 갑상선 기능 저하증과 관련된 장애; 갑상선 중독증 및 이의 다양한 형태, 그레이브스병, 전경골 점액수종, 중독성 다결절 갑상선종, 갑상선암 및 플러머병을 포함하는 갑상선 기능 항진증과 관련된 장애; 및 콘 질환 (만성 고칼륨혈증) 을 포함하는 부갑상선 기능항진증과 관련된 장애; 호흡기 장애 예컨대 알레르기, 천식, 급성 및 만성 염증성 폐 질환, ARDS, 폐기종, 폐울혈 및 부종, COPD, 간질성 폐질환 및 폐암; 암 예컨대 선암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 골수종, 육종, 기형암종, 및 특히, 부신, 방광, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 자궁경부, 담낭, 신경절, 위장관, 심장, 신장, 간, 폐, 근육, 난소, 췌장, 부갑상선, 음경, 전립선, 타액선, 피부, 지라, 고환, 흉선, 갑상선 및 자궁의 암; 및 면역 장애 예컨대 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS), 에디슨병, 성인 호흡곤란 증후군, 알레르기, 강직성 척추염, 아밀로이드증, 빈혈, 천식, 죽상동맥경화증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 갑상선염, 기관지염, 담낭염, 접촉성 피부염, 크론병, 아토피 피부염, 피부근염, 진성 당뇨병, 폐기종, 림프구세포독소를 갖는 우발성 림프구감소증, 태아적아구증, 결절성 홍반, 위축성 위염, 사구체신염, 굿파스튜어 증후군, 통풍, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 과호산구증가증, 과민성대장 증후군, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심근 또는 심막 염증, 골관절염, 골다공증, 췌장염, 다발성근염, 건선, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 강피증, 쇼그렌 증후군, 전신과민증, 전신성 홍반성 낭창, 전신 경화증, 혈소판감소성 자반병, 궤양성 대장염, 포도막염, 베르너 증후군, 암의 합병증, 혈액투석 및 체외순환, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 원충 및 연충 감염, 및 외상을 포함한다.
본 발명은 또한 개체의 위험성, 특히, 예를 들어 질환, 장애 또는 병상에 대한 개체의 성향에 대한 위험성; 개체의 작업장, 거주지, 학교 등에서의 위험성; 개체의 독소, 발암 물질, 돌연변이 유발원 등에 대한 노출의 위험성; 및 개체의 식습관의 위험성 (이에 제한되지는 않음) 을 결정하는데 사용될 수 있는 데이터베이스를 생성하는 방법을 제공한다. 추가적으로, 본 발명은 특정 개체, 동물, 식물 또는 미생물을 확인하는데 사용될 수 있는 방법을 제공한다.
한 구현예에서, 본 발명은 상이한 유전자 서열 대상을 도출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다: (a) 제 1 조직을 나타내는 제 1 유전자 서열 스트링 및 (b) 제 2 조직을 나타내는 제 2 유전자 서열 스트링을 저장하는 유전자 데이터베이스에 대한 접근을 제공하고 (이때 제 1 및 제 2 서열 스트링은 다수의 상응하는 서브스트링을 가짐); 유전자 데이터베이스와 연결된 서열 분석 엔진에 대한 접근을 제공하고; 서열 분석 엔진을 사용하여, 다수의 상응하는 서브스트링 중 하나 이상의 알려져 있는 위치를 사용하여 제 1 및 제 2 서열 스트링을 점증적으로 동기화시켜 부분적인 정렬을 생성시키고; 서열 분석 엔진에 의해, 부분적인 정렬을 사용하여 부분적인 정렬 내의 제 1 및 제 2 서열 스트링 사이의 부분적으로 상이한 스트링을 생성시키고; 서열 분석 엔진에 의해, 부분적으로 상이한 스트링을 사용하여 상이한 서열 데이터베이스에서의 상이한 유전자 서열 대상을 업데이트함. 바람직한 구현예에서, 제 1 및 제 2 유전자 서열 스트링은 각각 제 1 및 제 2 조직의 10% 이상의 게놈, 전사체 또는 프로테옴을 나타낸다. 대안적 바람직한 구현예에서, 제 1 및 제 2 유전자 서열 스트링은 각각 제 1 및 제 2 조직의 50% 이상의 게놈, 전사체 또는 프로테옴을 나타낸다. 또 다른 대안적으로 바람직한 구현예에서, 제 1 및 제 2 유전자 서열 스트링은 각각 제 1 및 제 2 조직의 실질적 전체 게놈, 전사체 또는 프로테옴을 나타낸다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상응하는 서브스트링은 동형 대립형질을 포함한다. 대안적 바람직한 구현예에서, 상응하는 서브스트링은 이형 대립형질을 포함한다. 또 다른 보다 바람직한 구현예에서, 유전자 서열 대상은 파일을 포함한다. 더욱 보다 바람직한 구현예에서, 상기 파일은 표준화 포맷에 따른다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 파일은 SAM/BAM 포맷에 따른다.
바람직한 구현예에서, 동기화 단계는 제 1 스트링 내의 선험적으로 알려져 있는 위치를 기준으로 다수의 서브스트링 중 하나 이상을 정렬하는 것을 포함한다. 대안적 바람직한 구현예에서 동기화 단계는 다수의 서브스트링 중 하나 이상에 대한 알려져 있는 위치를 포함하는 알려져 있는 참조 스트링을 기준으로 다수의 서브스트링 중 하나 이상을 정렬하는 것을 포함한다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 알려져 있는 참조 스트링은 컨센서스 서열이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 동기화 단계는 다수의 서브스트링 중 하나 이상의 길이 미만의 길이를 갖는 윈도우 내 다수의 서브스트링 중 하나 이상을 정렬하는 것을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상이한 유전자 서열 대상은 하나 이상의 염색체에 대한 다수의 부분적으로 상이한 스트링을 나타낸다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상이한 유전자 서열 대상은 제 1 조직의 실질적 전체 게놈에 대한 다수의 부분적으로 상이한 스트링을 나타낸다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상이한 유전자 서열 대상은 상이한 유전자 서열 대상을 기술하는 메타데이터를 포함하는 속성을 포함한다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 속성은 제 1 및 제 2 조직 중 하나 이상의 상태를 포함한다. 더욱 보다 바람직한 구현예에서, 상기 상태는 제 1 및 제 2 조직 중 하나 이상의 생리학적 상태를 포함한다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 생리학적 상태는 종양 성장, 세포자멸사, 분화 상태, 조직 연령 및 치료에 대한 반응으로 이루어지는 군에서 선택되는 상태를 포함한다.
대안적인 보다 바람직한 구현예에서, 상기 상태는 유전적 상황을 포함한다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 유전적 상황은 하나 이상의 배수성, 유전자 카피 수, 반복 카피 수, 역위, 결실, 바이러스 유전자 삽입, 체세포 돌연변이, 생식세포 돌연변이, 구조적 재배열, 전위 및 이형성 손실로 이루어지는 군에서 선택되는 상황을 포함한다.
대안적인 보다 바람직한 구현예에서, 상기 상태는 조직 내 신호전달 경로와 관련된 경로 모델 정보를 포함한다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 신호전달 경로는 성장 인자 신호전달 경로, 전사 인자 신호전달 경로, 세포자멸사 경로, 세포 주기 경로 및 호르몬 반응 경로로 이루어지는 군에서 선택된다.
대안적 구현예에서, 제 1 및 제 2 조직은 동일한 생물학적 독립체에서 기원하며, 생물학적 독립체는 환자, 건강한 개체, 세포주, 줄기 세포, 실험 동물 모델, 재조합 박테리아 세포 및 바이러스로 이루어지는 군에서 선택된다. 대안적 구현예에서, 제 1 조직은 건강한 조직이며 제 2 조직은 병든 조직이다. 보다 바람직한 구현예에서, 병든 조직은 종양 조직을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 바와 같은 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은 제 1 서열 스트링의 전체 길이에 걸쳐 제 1 및 제 2 서열 스트링을 반복하여 점증적으로 동기화시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 건강 관리 서비스를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다: 의료 기록 저장 장치와 정보적으로 연결되는 분석 엔진에 대한 접근을 제공하고 (이때 상기 저장 장치는 환자에 대한 상이한 유전자 서열 대상을 저장함); 분석 엔진에 의해, 환자에 대한 상이한 유전자 서열 대상에서의 다수의 부분적으로 상이한 스트링의 성좌 또는 부분적으로 상이한 스트링의 존재를 사용하여 환자-특이적 데이터를 생성시키고; 분석 엔진에 의해, 환자-특이적 데이터 세트를 기준으로 환자-특이적 지시사항을 생성시킴. 바람직한 구현예에서 의료 기록 저장 장치는 스마트 카드로서 구성되며 환자에 의해 휴대된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 의료 기록 저장 장치는 건강관리 제공자에 의해 원격으로 접근가능하다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 환자에 대한 상이한 유전자 서열 대상은 2 개 이상의 염색체에 대한 다수의 부분적으로 상이한 스트링을 포함한다. 추가로 바람직한 구현예에서, 환자에 대한 상이한 유전자 서열 대상은 환자의 실질적 전체 게놈에 대한 다수의 부분적으로 상이한 스트링을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 환자에 대한 상이한 유전자 서열 대상은 2 개 이상의 조직 유형을 나타내는 다수의 부분적으로 상이한 스트링, 또는 동일 조직에 대한 2 개 이상의 시간적 간격 결과를 포함한다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 동일 조직에 대한 2 개 이상의 시간적 간격 결과는 치료의 개시 전과 후에 수득된다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 동일 조직에 대한 2 개 이상의 시간적 간격 결과는 치료 개시 전과 후에 수득된다.
또 다른 대안적 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 환자-특이적 지시사항은 진단, 예후, 치료 결과 예측, 치료 전략에 대한 권고사항 및 처방으로 이루어지는 군에서 선택된다.
본 발명은 또한 인구 집단을 분석하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다: 인구 집단의 의료 기록 데이터베이스에서 다수의 상이한 유전자 서열 대상을 수득하고 저장하고 (이때 기록 데이터베이스는 분석 엔진과 정보적으로 연결됨); 분석 엔진에 의해, 다수의 상이한 유전자 서열 대상 내의 다수의 부분적으로 상이한 스트링 성좌를 확인하여 성좌 기록을 생성시키고; 분석 엔진에 의해, 성좌 기록을 사용하여 인구 집단 분석 기록을 생성시킴. 바람직한 구현예에서, 상기 인구 집단은 다수의 혈족을 포함한다. 대안적 바람직한 구현예에서, 상기 인구 집단은 병원체에 대한 노출, 유해한 작용제에 대한 노출, 건강 이력, 치료 이력, 치료 성공, 성별, 인종 및 연령으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 통상적 특징을 공유하는 것을 특징으로 하는 다수의 일원을 포함한다. 또 다른 대안적으로 바람직한 구현예에서, 상기 인구 집단은 지리학적 위치, 민족성 및 직업으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 통상적 특징을 공유하는 것을 특징으로 하는 다수의 일원을 포함한다. 추가의 대안적으로 바람직한 구현예에서, 상기 인구 집단 분석 기록은 부성 또는 모성 확인을 포함한다.
대안적 구현예에서 본원에 개시된 방법은 개별적인 환자의 성좌 기록을 인구 집단 분석 기록과 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 구현예에서, 개별적인 환자의 성좌 기록을 인구 집단 분석 기록과 비교하는 단계로, 환자-특이적 기록이 생성된다. 보다 바람직한 구현예에서, 환자-특이적 기록은 특정 인구 집단에 속하는 것으로서의 환자의 확인 또는 위험 평가를 포함한다. 대안적인 보다 바람직한 구현예에서, 환자-특이적 기록은 진단, 예후, 치료 결과 예측, 치료 전략에 대한 권고사항 및 처방을 포함한다.
본 발명은 개인의 상이한 유전자 서열 대상을 분석하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다: 분석 엔진과 정보적으로 연결되는 의료 기록 데이터베이스에서 참조 상이한 유전자 서열 대상을 저장하고; 분석 엔진에 의해, 개인의 상이한 유전자 서열 대상 내 다수의 부분적으로 상이한 스트링과 참조 상이한 유전자 서열 대상 내 다수의 부분적으로 상이한 스트링 사이의 편차를 계산하여 편차 기록을 생성시키고; 분석 엔진에 의해, 편차 기록을 사용하여 개인-특이적 편차 프로파일을 생성시킴. 바람직한 구현예에서, 상기 참조 상이한 유전자 서열 대상은 개인의 다수의 부분적으로 상이한 스트링으로부터 계산된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 참조 상이한 유전자 서열 대상은 개인의 다수의 부분적으로 상이한 스트링으로부터 계산된다.
본원에 개시된 다양한 방법에 관해, 바람직한 구현예에서 환자 또는 개인은 병상으로 진단된 환자 또는 개인으로 이루어지는 군에서 선택되며, 상기 병상은 질환 및 장애로 이루어지는 군에서 선택된다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 병상은 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS), 에디슨병, 성인 호흡곤란 증후군, 알레르기, 강직성 척추염, 아밀로이드증, 빈혈, 천식, 죽상동맥경화증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 갑상선염, 전립성 비대증, 기관지염, 체디아크-히가시 증후군, 담낭염, 크론병, 아토피 피부염, 피부근염, 진성 당뇨병, 폐기종, 태아적아구증, 결절성 홍반, 위축성 위염, 사구체신염, 굿파스튜어 증후군, 통풍, 만성 육아종 질환, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 과호산구증가증, 과민성대장 증후군, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심근 또는 심막 염증, 골관절염, 골다공증, 췌장염, 다낭성 난소 증후군, 다발성근염, 건선, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 강피증, 중증복합면역결핍증 (SCID), 쇼그렌 증후군, 전신과민증, 전신성 홍반성 낭창, 전신 경화증, 혈소판감소성 자반병, 궤양성 대장염, 포도막염, 베르너 증후군, 암의 합병증, 혈액투석 및 체외순환, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 원충 및 연충 감염; 및 선암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 골수종, 육종, 기형암종, 및 특히, 부신, 방광, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 자궁경부, 담낭, 신경절, 위장관, 심장, 신장, 간, 폐, 근육, 난소, 췌장, 부갑상선, 음경, 전립선, 타액선, 피부, 지라, 고환, 흉선, 갑상선 및 자궁의 암, 정좌불능증, 알츠하이머병, 기억상실증, 루게릭병 (ALS), 운동 실조증, 조울증, 긴장증, 뇌성마비, 뇌혈관 질환, 크로이츠펠트-야콥병, 치매, 우울증, 다운 증후군, 지연성 운동장애, 긴장 이상, 뇌전증, 헌팅턴병, 다발성 경화증, 근이영양증, 신경통, 신경섬유종증, 신경병증, 파킨슨병, 피크병, 망막색소변성증, 정신분열증, 계절성 정서장애, 노인성 치매, 뇌졸중, 투렛 증후군 및 특히 뇌의 선암, 흑색종 및 기형암종을 포함하는 암으로 이루어지는 군에서 선택된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 병상은 암 예컨대 선암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 골수종, 육종, 기형암종, 및 특히, 부신, 방광, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 자궁경부, 담낭, 신경절, 위장관, 심장, 신장, 간, 폐, 근육, 난소, 췌장, 부갑상선, 음경, 전립선, 타액선, 피부, 지라, 고환, 흉선, 갑상선 및 자궁의 암; 면역 장애 예컨대 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS), 에디슨병, 성인 호흡곤란 증후군, 알레르기, 강직성 척추염, 아밀로이드증, 빈혈, 천식, 죽상동맥경화증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 갑상선염, 기관지염, 담낭염, 접촉성 피부염, 크론병, 아토피 피부염, 피부근염, 진성 당뇨병, 폐기종, 림프구세포독소를 갖는 우발성 림프구감소증, 태아적아구증, 결절성 홍반, 위축성 위염, 사구체신염, 굿파스튜어 증후군, 통풍, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 과호산구증가증, 과민성대장 증후군, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심근 또는 심막 염증, 골관절염, 골다공증, 췌장염, 다발성근염, 건선, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 강피증, 쇼그렌 증후군, 전신과민증, 전신성 홍반성 낭창, 전신 경화증, 혈소판감소성 자반병, 궤양성 대장염, 포도막염, 베르너 증후군, 암의 합병증, 혈액투석 및 체외순환, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 원충 및 연충 감염, 외상, 브루톤의 X-상관관계 무감마글로불린혈증, 공통가변성 면역결핍증 (CVI), 디죠지 증후군 (흉선형성부전), 흉선 형성이상, 단독성 IgA 결핍, 중증복합면역결핍증 (SCID), 혈소판감소증 및 습진을 갖는 면역결핍 (비스코트-알드리히 증후군), 체디아크-히가시 증후군, 만성 육아종 질환, 유전성 결관신경 부종, 및 쿠싱병과 관련된 면역결핍; 및 발달 장애 예컨대 신세뇨관 산증, 빈혈, 쿠싱 증후군, 연골무형성 왜소증, 뒤시엔느 및 베커 근이영양증, 뇌전증, 생식샘 발생장애, WAGR 증후군 (빌름스 종양, 무홍채증, 비뇨 생식기 기형 및 정신 지체), 스미스-마제니스 증후군, 골수이형성 증후군, 유전성 점막표피 이형성, 유전성 각피증, 유전성 신경병증 예컨대 샤르코-마리-투스병 및 신경섬유종증, 갑상선 기능 저하증, 수두증, 발작 장애 예컨대 시드남 무도증 및 뇌성마비, 척추파열, 무뇌증, 두개척추파열, 선천성 녹내장, 백내장, 감음 신경성 청력 손실, 및 대상의 임의의 조직, 기관, 또는 계, 예를 들어, 뇌, 부신, 신장, 골격계 또는 생식계를 포함하는 세포 성장 및 분화, 배아발생, 및 형태발생과 관련된 임의의 장애로 이루어지는 군에서 선택된다.
추가의 대안적 바람직한 구현예에서, 병상은 내분비 장애, 예컨대 성선기능저하증, 시한 증후군, 요붕증, 칼라만병, 핸드-쉴러-크리스찬병, 렛테러-시웨병, 유육종증, 공터기안 증후군 및 왜소증을 포함하는 뇌하수체 기능저하증과 관련된 장애; 말단비대증, 거인증 및 부적합 항이뇨 호르몬 (ADH) 분비 증후군 (SIADH) 을 포함하는 뇌하수체기능항진증; 및 갑상선종, 점액수종, 박테리아 감염 관련 급성 갑상선염, 바이러스 감염 관련 아급성 갑상선염, 자가면역성 갑상선염 (하시모토병) 및 크레틴병을 포함하는 갑상선 기능 저하증과 관련된 장애; 갑상선 중독증 및 이의 다양한 형태, 그레이브스병, 전경골 점액수종, 중독성 다결절 갑상선종, 갑상선암 및 플러머병을 포함하는 갑상선 기능 항진증과 관련된 장애; 및 콘 질환 (만성 고칼륨혈증) 을 포함하는 부갑상선 기능항진증과 관련된 장애; 호흡기 장애, 예컨대 알레르기, 천식, 급성 및 만성 염증성 폐질환, ARDS, 폐기종, 폐울혈 및 부종, COPD, 간질성 폐질환 및 폐암; 암 예컨대 선암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 골수종, 육종, 기형암종, 및 특히, 부신, 방광, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 자궁경부, 담낭, 신경절, 위장관, 심장, 신장, 간, 폐, 근육, 난소, 췌장, 부갑상선, 음경, 전립선, 타액선, 피부, 지라, 고환, 흉선, 갑상선 및 자궁의 암; 및 면역 장애 예컨대 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS), 에디슨병, 성인 호흡곤란 증후군, 알레르기, 강직성 척추염, 아밀로이드증, 빈혈, 천식, 죽상동맥경화증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 갑상선염, 기관지염, 담낭염, 접촉성 피부염, 크론병, 아토피 피부염, 피부근염, 진성 당뇨병, 폐기종, 림프구세포독소를 갖는 우발성 림프구감소증, 태아적아구증, 결절성 홍반, 위축성 위염, 사구체신염, 굿파스튜어 증후군, 통풍, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 과호산구증가증, 과민성대장 증후군, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심근 또는 심막 염증, 골관절염, 골다공증, 췌장염, 다발성근염, 건선, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 강피증, 쇼그렌 증후군, 전신과민증, 전신성 홍반성 낭창, 전신 경화증, 혈소판감소성 자반병, 궤양성 대장염, 포도막염, 베르너 증후군, 암의 합병증, 혈액투석 및 체외순환, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 원충 및 연충 감염, 및 외상으로 이루어지는 군에서 선택된다.
본 발명은 상이한 유전자 서열 대상을 도출하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다: (a) 제 1 조직을 나타내는 제 1 유전자 서열 스트링 및 (b) 제 2 조직을 나타내는 제 2 유전자 서열 스트링을 저장하는 유전자 데이터베이스에 대한 접근을 제공하고 (이때 제 1 및 제 2 서열 스트링은 다수의 상응하는 서브스트링을 가짐); 유전자 데이터베이스와 연결된 서열 분석 엔진에 대한 접근을 제공하고; 서열 분석 엔진을 사용하여, 다수의 상응하는 서브스트링 중 하나 이상의 알려져 있는 위치를 사용하여 제 1 및 제 2 서열 스트링을 점증적으로 동기화시켜 부분적인 정렬을 생성시키고; 서열 분석 엔진에 의해, 부분적인 정렬을 사용하여 부분적인 정렬 내의 제 1 및 제 2 서열 스트링 사이의 부분적으로 상이한 스트링을 생성시키고; 서열 분석 엔진에 의해, 부분적으로 상이한 스트링을 사용하여 상이한 서열 데이터베이스에서 상이한 유전자 서열 대상을 생성시킴으로써, 상이한 서열 대상을 유도함.
본 발명은 상이한 유전자 서열 대상을 생성시키기 위한 형질전환 방법을 추가로 제공하며, 상기 상이한 유전자 서열 대상은 제 1 유전자 서열과 제 2 유전자 서열 사이의 임상적 관련 차등을 나타내고 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (i) (a) 제 1 조직을 나타내는 제 1 유전자 서열 스트링 및 (b) 제 2 조직을 나타내는 제 2 유전자 서열 스트링을 저장하는 유전자 데이터베이스에 대한 접근을 제공하는 단계 (이때 제 1 및 제 2 서열 스트링은 다수의 상응하는 서브스트링을 가짐); (ii) 유전자 데이터베이스와 연결된 서열 분석 엔진에 대한 접근을 제공하는 단계; (iii) 서열 분석 엔진을 사용하여, 다수의 상응하는 서브스트링 중 하나 이상의 알려져 있는 위치를 사용하여 제 1 및 제 2 서열 스트링을 점증적으로 동기화시켜 부분적인 정렬을 생성시키는 단계; (iv) 서열 분석 엔진에 의해, 부분적인 정렬을 사용하여 부분적인 정렬 내의 제 1 및 제 2 서열 스트링 사이의 부분적으로 상이한 스트링을 생성시키는 단계; 및 (v) 서열 분석 엔진에 의해, 부분적으로 상이한 스트링을 사용하여 상이한 서열 데이터베이스에서 상이한 유전자 서열 대상을 생성시킴으로써, 상이한 서열 대상을 도출하는 단계 (이때, 상이한 서열 대상은 사용자에게 객관적 정보를 제공함).
바람직한 구현예에서, 객관적 정보는 유전적 관련 정보, 대사 관련 정보, 독성학적 관련 정보, 임상적 관련 정보, 일시적 관련 정보, 지리적 관련 정보, 직업 위험 관련 정보, 생활사 관련 정보 등으로 이루어지는 군에서 선택된다.
본 발명의 주제의 다양한 대상, 특성, 양태 및 이점은, 유사 숫자가 유사 성분을 나타내는 동반 도면과 함께, 하기의 바람직한 구현예의 상세한 설명으로부터 보다 명백해질 것이다.
도 1 은 "BamBam" 데이터 흐름의 모식도를 설명한다.
도 2 는 대립형질-특이적 카피 수 계산의 개관을 설명한다.
도 3 은 구조 변이 추출 (calling) 의 개관을 설명한다.
도 4 는 구조적 재배열이 발생한 게놈 내 위치를 확인하기 위한 예시적 방법을 설명한다.
도 5 는 예시적 종양-특이적 게놈 브라우저를 설명한다.
도 6 은 본 발명의 주제에 따른 상이한 유전자 서열 대상을 생성시키기 위한 예시적 컴퓨터 시스템의 모식도이다.
도 7 은 상이한 유전자 서열 대상을 도출하는 방법의 모식도이다.
도 8 은 환자 특이적 지시사항의 형태로 건강 관리 서비스를 제공하는 방법의 모식도이다.
도 9 는 유전학에 있어서의 차이에 대한 인구 집단 분석 방법의 모식도이다.
도 10 은 개인의 상이한 유전자 서열 대상 분석 방법의 모식도이다.
발명의 상세한 설명
본 문헌에 개시된 구현예는 실례적이고 예시적이며 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 다른 구현예를 이용할 수 있으며, 본 발명의 청구항의 범주를 벗어나지 않고 구조적 변화가 이루어질 수 있다.
본원 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같이, 문맥상 명확히 다르게 나타내지 않는 한, 단수 형태는 복수 형태를 포함한다. 따라서, 예를 들어 "대립형질" 에 대한 언급은 이러한 대립형질 다수를 포함하고, "클러스터" 에 대한 언급은 하나 이상의 클러스터 또는 이의 등가물 등에 대한 언급이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "큐레이트된 (curated)" 은 당업계에 잘 알려져 있는 방법, 예컨대 분자 생물학적, 생화학적, 생리학적, 해부학적, 게놈, 전사체학적, 프로테오믹스, 대사체학적, ADME 및 생물정보학적 기술 등을 사용하여 과학적 및/또는 임상적 원리에 따라 시험되고, 분석되고 확인된 한 세트의 생물학적 분자 및/또는 비 (non)-생물학적 분자간의 관계를 의미한다. 상기 관계는 생화학적, 예컨대 생화학 경로, 유전 경로, 대사 경로, 유전자 조절 경로, 유전자 전사 경로, 유전자 번역 경로, miRNA-조절 경로, 위유전자-조절 경로 등일 수 있다. 본 발명자들은 제 1 및 제 2 조직 샘플 (예를 들어 건강한 조직 및 병든 조직) 로부터 각각의 더 큰 유전자 서열 스트링의 다수의 상대적으로 작은 게놈 서열 서브스트링 (예를 들어 서열분석 실행으로부터의 숏-리드) 을 수득하는 시스템 및 방법을 개발하였다. 상응하는 서브스트링 중 하나 이상의 하나 이상의 알려져 있는 위치를 사용하여 유전자 서열 스트링을 점증적으로 동기화시켜, 부분적인 정렬을 생성시킨다. 이렇게 생성된 부분적인 정렬을 분석하여 (통상 참조 게놈 서열을 사용) 부분적인 정렬 내 제 1 및 제 2 서열 스트링 사이의 부분적으로 상이한 스트링을 생성시켜, 이는 그에 따라 유의한 차등 정보 (통상 참조 게놈 서열에 대한) 를 포함한다. 부분적으로 상이한 스트링, 가장 통상적으로는 다수의 부분적으로 상이한 스트링을 사용하여 일부 또는 전체 게놈에 대한 상이한 유전자 서열 대상을 생성시킨다.
그러므로, 2 개의 매우 큰 파일을 처리하여 또 다른 매우 큰 중간체 (또는 출력물) 파일을 생성시키는 것 대신, 다수의 유의하게 더 작은 부분에서 전체 게놈 분석을 달성할 수 있으며 이때 상기 더 작은 부분이 하나 이상의 서브스트링의 게놈 내의 알려져 있는 위치를 사용하여 참조 게놈에 대해 정렬된다는 것을 인지해야 한다. 또 다른 관점에서 보면, 서브스트링 및 참조 게놈 서열의 알려져 있는 위치를 사용하여 서열 스트링의 점증적 동기화에 의해 정렬이 수행되며, 참조 게놈에 대한 관련 있는 변화만을 포함하는 출력물 파일이 생성될 수 있다. 따라서, 처리 속도는 상당히 개선되며 중요한 출력물 생성에 필요한 데이터량이 극적으로 감소된다. 또한, 고려된 시스템 및 방법은, 그 중에서도, 일배체형 추론 (haplotyping)/체세포 및 생식세포 변이 추출 (variant calling), 및 대립형질-특이적 카피 수의 결정을 가능하게 한다. 더욱이, 본원에 나타낸 상기 시스템 및 방법은 SAM/BAM-포맷으로의 서열 정보와 함께 사용하기에 적합하다.
예를 들어, 다수의 서열분석 단편 (예를 들어, 공여자의 종양 샘플 및 상응하는 동일 공여자의 비-종양 샘플로부터의 숏-리드) 을, 샘플로부터의 서열분석 단편을 조직화하는데 이용하는 동일 참조 게놈에 대해 정렬한다. 이후 BAMBAM 은 동일 환자 및 참조 게놈으로부터의 2 개 서열분석 단편 데이터세트 (1 개는 종양으로부터의 것이며 다른 1 개는 상응하는 정상 "생식세포" 조직으로부터의 것임) 를 사용하고, (서브스트링에서의 참조 게놈 및 주석을 기준으로) 동일한 게놈 위치가 중첩되는 데이터세트 둘 모두에서의 모든 서열이 동시에 처리되도록 데이터세트를 판독한다. 이는 이러한 데이터를 처리하기 위한 가장 효율적 방법인 한편, 또한 어렵거나 불가능할 수 있는 복잡한 분석이 직렬화 방법으로 성취될 수 있게 하는데, 이때 각각의 데이터세트가 저절로 처리되고, 결과는 그 후 단지 병합된다.
결과적으로 BAMBAM 이, 끊임없이 각각의 BAM 파일을 서로 동시에 유지하고 2 개 파일 사이의 모든 공통 게놈 위치가 중첩되는 게놈 리드를 적체하면서 2 개의 파일로부터 동시에 점증적으로 판독한다는 것을 인지해야 한다. 적체물 (pileup) 각 쌍에 대해서, BAMBAM 은 적체물을 폐기하고 다음의 공통 게놈 위치로 이동하기 전에 일련의 분석을 실행한다. 이러한 방법으로 틴 (tin) 을 처리함으로써, 컴퓨터의 RAM 사용량이 극적으로 감소되고 처리 속도는 파일 시스템이 2 개 파일을 판독할 수 있는 속도에 의해 주로 제한된다. 이로 인해 BAMBAM 이 대량의 데이터를 신속히 처리할 수 있는 한편, 단일 컴퓨터에서 또는 컴퓨터 클러스터에 걸쳐 실행하기에 충분히 융통성이 있다. 이들 파일을 BAMBAM 으로 처리하기 위한 또 다른 중요한 이점은, 이의 출력물이 상당히 최소라는 것이다 (통상 각각의 파일에서 발견된 중요한 차이점만을 포함함). 이는 환자의 종양과 생식세포 게놈 사이의 본질적 전체-게놈 차등 분석을 생성시켜, 모든 게놈 정보를 각각의 파일에 대해 개별적으로 저장한 경우보다 디스크 저장을 훨씬 덜 필요로 한다.
하기의 설명이 컴퓨터/서버 기반 경로 분석 시스템에 대해 유도되지만, 다양한 대안적 구성이 또한 적합한 것으로 여겨지며, 서버, 인터페이스, 시스템, 데이터베이스, 에이전트, 동등 (peer), 엔진, 컨트롤러, 또는 개별적 또는 집합적으로 작동하는 기타 유형의 컴퓨팅 장치를 포함하는 다양한 컴퓨팅 장치를 이용할 수 있다는 것에 유의해야 한다. 상기 컴퓨팅 장치가 유형, 비-일시적 컴퓨터 판독가능 저장 매체 (예를 들어 하드 드라이브, 솔리드 스테이트 드라이브 (solid state drive), RAM, 플래시, ROM 등) 상에 저장된 소프트웨어 지시사항을 실행하도록 구성된 프로세서를 포함한다는 것을 이해해야 한다. 상기 소프트웨어 지시사항은 바람직하게는, 컴퓨팅 장치가 개시된 장치에 대해 하기 토의한 바와 같은 역할, 책무 또는 기타 기능을 제공하도록 구성된다. 특히 바람직한 구현예에서, 다양한 서버, 시스템, 데이터베이스 또는 인터페이스는, 가능하게는 HTTP, HTTPS, AES, 퍼블릭-프라이빗 (public-private) 키 교환, 웹 서비스 API, 알려져 있는 금융 거래 프로토콜, 또는 기타 전자 정보 교환 방법 기반의 표준화 프로토콜 또는 알고리즘을 사용하여 데이터를 교환한다. 데이터 교환은 바람직하게는 패킷-교환 네트워크, 인터넷, LAN, WAN, VPN, 또는 기타 유형의 패킷 교환 네트워크를 통해 수행된다.
또한, 하기의 토의는 본 발명의 주제의 많은 예시적 구현예를 제공한다. 각각의 구현예가 본 발명의 요소의 단일 조합을 나타내지만, 본 발명의 주제는 개시된 요소의 모든 가능한 조합을 포함하는 것으로 여겨진다. 따라서 제 1 구현예가 요소 A, B 및 C 를 포함하고 제 2 구현예가 요소 B 및 D 를 포함하는 경우, 본 발명의 주제는 또한, 명백하게 개시되지 않는 경우에도 A, B, C 또는 D 의 다른 남아 있는 조합을 포함하는 것으로 여겨진다.
본원에서 사용하는 바와 같이, 그리고 문맥상 다르게 나타내지 않는 한, 용어 "~에 연결되는" 은 직접 연결 (서로 연결되는 2 개 요소가 서로 접촉함) 및 간접 연결 (하나 이상의 추가적 요소가 2 개 요소 사이에 위치함) 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 용어 "~에 연결되는" 및 "~와 연결되는" 은 동의어로 사용된다. 현 문헌 내에서 "~와 연결되는" 은 또한 "~와 통신적으로 연결되는" 을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
고처리율 데이터는 암 조직에서의 분자 변화의 포괄적인 관점을 제공한다. 신기술은 게놈 카피 수 변이, 유전자 발현, DNA 메틸화, 및 종양 샘플 및 암 세포주의 후성 상태의 동시적인 전체 게놈 (genome-wide) 어세이를 가능하게 한다.
The Cancer Genome Atlas (TCGA), Stand Up To Cancer (SU2C) 등과 같은 연구가 광범위하게 다양한 종양에 대해 가까운 미래에 계획된다. 현재 데이터 세트의 분석은, 환자들 간의 유전자 변화가 상이하지만 종종 공통의 경로를 포함할 수 있음을 밝혀내었다. 그러므로 암 진행에 포함된 관련 경로를 확인하고 상이한 환자에서 어떻게 변화되는지를 검출하는 것이 중요하다.
The Cancer Genome Atlas (TCGA) 와 같은 프로젝트로부터의 다수의 완전히 서열분석된 종양 및 매치된 정상 게놈의 배포로, 이들 막대한 데이터세트를 효과적으로 분석할 수 있는 도구에 대한 큰 필요성이 존재한다.
이를 위해, 본 발명자는 SAM/BAM-포맷화 파일에 포함된 정렬된 숏-리드 데이터를 사용하여 환자의 종양 및 생식세포 게놈으로부터 각각의 게놈 위치를 동시에 분석하는 도구인 BamBam 을 개발하였다 (SAMtools library; Li H, Handsaker B, Wysoker A, Fennell T, Ruan J, Homer N, Marth G, Abecasis G, Durbin R; 1000 Genome Project Data Processing Subgroup. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 2009 Aug 15;25(16):2078-9. Epub 2009 Jun 8). BamBam 은 SAMtools library 와 인터페이스로 접속하여, SAM/BAM-포맷화 파일로부터 숏-리드 정렬을 사용하여 환자의 종양 및 생식세포 게놈을 동시에 분석한다. 본 개시물에서 BamBam 도구는 정보 스트링을 포함하는 서열을 비교하는데 사용되는 서열 분석 엔진일 수 있다. 한 구현예에서, 정보 스트링은 생물학적 정보, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 생물학적 정보는 발현 데이터, 예를 들어 mRNA 전사체 또는 rRNA 또는 tRNA 또는 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 단백질의 상대 농도 수준을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 생물학적 정보는 예를 들어 비제한적으로, 인산화, 황산화, 아세틸화, 메틸화, 글리코실화, 시알산화 (sialation), 글리코실포스파티딜이노시톨로의 개질, 또는 프로테오글리칸으로의 개질과 같은 상대량의 단백질 개질일 수 있다.
이러한 처리 방법은 BamBam 이 종양 및 생식세포 게놈 모두에서의 전체 카피 수를 효과적으로 계산하고 구조 변이 부위 (예를 들어, 염색체 전좌) 를 추론할 수 있게 하고; 전체 및 대립형질-특이적 카피 수를 효과적으로 계산할 수 있게 하고; 이형성 손실 (LOH) 을 나타내는 부위를 추론할 수 있게 하고; 체세포 및 생식세포 서열 변이체 (예를 들어, 점 돌연변이) 및 구조적 재배열 (예를 들어, 염색체 융합) 모두를 발견할 수 있게 한다. 또한, 2 개의 게놈 서열을 동시에 비교함으로써, BamBam 은 또한 생식세포 서열 변이체로부터 체세포 서열 변이체를 즉각 구분할 수 있고, 종양 게놈 내 대립형질-특이적 카피 수 변화를 계산할 수 있고, 대립형질 비율이 종양 게놈 내에서 바뀐 염색체 부위에 걸쳐 생식세포 반수체형을 위상화시킬 수 있다. 이들 분석 모두를 단일한 도구로 종합하여, 연구자들은, 종종, 종양 형성의 잠재적 요인을 확인하는데 도움이 되는 특이적인 유전자 대립형질에 대해 BamBam 을 사용하여 환자의 종양 게놈 내에 발생한 많은 유형의 게놈 변화를 발견할 수 있다.
발견된 변이체가 체세포 (즉, 종양에서만 발견된 변이체 서열) 변이체인지 생식세포 (즉, 유전되거나 유전가능한 변이체 서열) 변이체인지를 결정하기 위해서는, 종양 및 매치된 정상 게놈을 어떤 식으로든 비교하는 것이 필요하다. 이는 종양 및 생식세포 모두에 대한 모든 게놈 위치에서의 데이터를 요약한 후 분석을 위해 결과를 조합함으로써, 순차적으로 수행될 수 있다. 불행히도, 전체-게놈 BAM 파일이 압축 형태로 수백 기가바이트이기 때문에 (압축되지 않은 경우 1-2 테라바이트), 이후 분석을 위해 저장할 필요가 있는 중간 결과는 크기가 매우 크고 통합 및 분석하기에 속도가 느릴 것이다.
이러한 논쟁을 피하기 위해서 BamBam 은, 끊임없이 각각의 BAM 파일을 서로 동기화시키고 2 개 파일 간의 모든 공통 게놈 위치가 중첩되는 게놈 리드를 적체시켜, 2 개 파일을 동시에 판독한다. 적체물 (pileup) 각 쌍에 대해서, BamBam 은 적체물을 폐기하고 다음의 공통 게놈 위치로 이동하기 전에 상기 열거된 일련의 분석을 수행한다. 상기 방법으로 이들 대규모 BAM 파일을 처리하여, 컴퓨터의 RAM 사용도가 최소가 되며, 처리 속도는 파일 시스템이 2 개 파일을 판독할 수 있는 속도에 의해 주로 제한된다. 이로 인해 BamBam 이 대량의 데이터를 신속히 처리할 수 있는 한편, 단일 컴퓨터에서 또는 컴퓨터 클러스터에 걸쳐 실행하기에 충분히 융통성이 있다. 이들 파일을 BamBam 으로 처리하기 위한 또 다른 중요한 이점은 이의 출력물이 상당히 최소라는 것이다 (각각의 파일에서 발견된 중요한 차이점으로만 이루어짐). 이는 환자의 종양과 생식세포 게놈 사이의 본질적 전체-게놈 차등을 생성시켜, 모든 게놈 정보를 각각의 파일에 대해 개별적으로 저장한 경우보다 디스크 저장을 훨씬 덜 필요로 한다.
BamBam 은 대규모 서열분석 데이터세트를 조사하여 이의 생식세포에 관한 각각의 종양 내에서 발생한 고품질 게놈 이벤트의 한 세트를 생성시키는 계산적으로 효율적인 방법이다. 이들 결과는 종양의 염색체 역학 관계에 대한 일견을 제공하여, 종양의 최종 상태 및 이를 유도하는 이벤트의 이해를 향상시킨다. BamBam 데이터 흐름의 예시적 모식도를 도 1 에 나타낸다.
본 발명의 한 특정한 예시적 구현예는 상이한 유전자 서열 대상의 생성 및 사용이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 대상은 BamBam 기술에서 예시된 디지털 대상을 나타내며, 참조 서열 (예를 들어, 제 1 서열) 과 분석 서열 (예를 들어, 제 2 서열) 사이의 차이를 반영한다. 대상은 많은 상이한 소비 시장에서 요충점으로 고려될 수 있다. 소비 시장 관점으로부터 이러한 대상의 사용 및 관리에 관련된 하기의 요인을 고려할 수 있다:
o 대상은 매개변수 (예를 들어, 시간, 지리적 위치, 유전적 트리 (genetic tree), 종 등) 의 벡터에 대한 변화물 및 역학물일 수 있다.
o 대상은 각각의 다른 대상 또는 참조 서열에 대한 "거리" 를 갖는 것으로 고려될 수 있다. 거리는 관련성의 규모에 따라 측정될 수 있다. 예를 들어, 거리는 시간에 관한 가상 정상 또는 이동값으로부터의 편차일 수 있다.
o 대상은 다음의 위험성: 질환 발전 위험성, 노출에 대한 감수성, 작업 장소에 대한 위험성 등을 나타낼 수 있다.
o 대상은 다음의 이해관계자: 건강관리 제공자, 보험 사업자, 환자 등에게 제출하기 위해 관리될 수 있으며,
■ 그래픽 대상으로서 제출될 수 있고,
■ 통계적 포맷: 개인, 인구 집단, 표준 인간 등으로 제출될 수 있다.
o 참조 서열이 대상으로부터 생성되어 정규화 서열을 형성할 수 있다. 정규화 서열은 측정된 대상에서 유래한 컨센서스를 기준으로 구축될 수 있다.
o 대상은 단일 유전자 정렬보다는 대규모 하위 (sub)-게놈 또는 게놈 정보를 대표하며, 주석화되고/표준 소프트웨어에 의해 판독가능한 메타 데이터를 포함한다.
o 대상은 검출될 수 있는 내부 패턴 또는 구조를 가질 수 있다: 1 개 스팟 (spot) 내의 돌연변이 한 세트는 병상과 상호연관되는 또 다른 스팟 내의 돌연변이 제 2 세트와 상호연관될 수 있으며; 차등 패턴의 성좌는 핫 스팟 (hot spot) 일 수 있고; 다변량 분포 분석 또는 다른 AI 기술을 사용하여 상관관계를 확인하고; 핫 스팟의 중요성을 검출한다 (예를 들어, 존재, 부재 등).
o 개인과 관련된 대상을 보안 키 (security key) 로서 사용할 수 있다.
상이한 서열 대상의 업데이트: 업데이트는 생성시키고, 변형시키고, 변화시키고, 삭제하는 것 등을 포함하고;
o 주형을 기준으로 할 수 있고,
o 드 노보 (de novo) 대상일 수 있고,
o 존재하는 대상일 수 있다.
대안적인 예시적 구현예에서 상기 방법은 치료에 대한 환자의 반응성: 예상값, 추정값, 예측값, 실제값 등을 확인하고 예측하는데 사용될 수 있다.
대안적인 예시적 구현예에서 상기 방법은 환자-특이적 지시사항: 처방, 권고사항, 진단 등을 제공하는데 사용될 수 있다.
한 구현예에서, 상기 방법은 다양한 진단 및 치료적 적용, 예컨대 암 조직의 검출, 암 조직의 병기 결정 (staging), 전이성 조직의 검출 등; 신경 장애, 예컨대 비제한적으로, 알츠하이머병, 루게릭병 (ALS), 파킨슨병, 정신분열증, 뇌전증 및 이의 합병증과 같은 장애; 발달 장애 예컨대 디조지 증후군, 자폐증, 자가면역성 장애 예컨대 다발성 경화증, 당뇨병 등의 검출; 감염, 예컨대 비제한적으로, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염, 리슈마니아증 (leishmania), 주혈흡충증, 말라리아, 촌충, 상피병, 선충, 네마틴 (nematine) 등에 의한 감염의 치료에서 사용될 수 있는 임상 정보를 제공하는데 사용될 수 있다.
한 구현예에서, 상기 방법은 유전자 또는 단백질의 변경된 발현과 관련된 병상에 대한 변경된 유전자 구조, 유전자 돌연변이, 유전자 생화학적 변형 (메신저 RNA (mRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 트랜스퍼 RNA (tRNA), 마이크로RNA (miRNA), 안티센스 RNA (asRNA) 등에 대한 변경 및/또는 변형을 포함) 을 검출하고 정량하기 위해 임상 정보를 제공하는데 사용될 수 있다. 변경된 발현과 관련된 병상, 질환 또는 장애는 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS), 에디슨병, 성인 호흡곤란 증후군, 알레르기, 강직성 척추염, 아밀로이드증, 빈혈, 천식, 죽상동맥경화증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 갑상선염, 전립성 비대증, 기관지염, 체디아크-히가시 증후군, 담낭염, 크론병, 아토피 피부염, 피부근염, 진성 당뇨병, 폐기종, 태아적아구증, 결절성 홍반, 위축성 위염, 사구체신염, 굿파스튜어 증후군, 통풍, 만성 육아종 질환, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 과호산구증가증, 과민성대장 증후군, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심근 또는 심막 염증, 골관절염, 골다공증, 췌장염, 다낭성 난소 증후군, 다발성근염, 건선, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 강피증, 중증복합면역결핍증 (SCID), 쇼그렌 증후군, 전신과민증, 전신성 홍반성 낭창, 전신 경화증, 혈소판감소성 자반병, 궤양성 대장염, 포도막염, 베르너 증후군, 암의 합병증, 혈액투석 및 체외순환, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 원충 및 연충 감염; 및 선암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 골수종, 육종, 기형암종, 및 특히, 부신, 방광, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 자궁경부, 담낭, 신경절, 위장관, 심장, 신장, 간, 폐, 근육, 난소, 췌장, 부갑상선, 음경, 전립선, 타액선, 피부, 지라, 고환, 흉선, 갑상선 및 자궁의 암을 포함한다. 진단 검정은 변경된 유전자 발현을 검출하기 위해서 하이브리드화 또는 증폭 기술을 사용하여 환자의 생물학적 샘플에서의 유전자 발현을 표준 샘플에 대해 비교할 수 있다. 상기 비교를 위한 정성적 또는 정량적 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 방법은 유전자 또는 단백질의 변경된 발현과 관련된 장애에 대한 변경된 유전자 구조, 유전자 돌연변이, 유전자 생화학적 변형 (메신저 RNA (mRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 트랜스퍼 RNA (tRNA), 마이크로RNA (miRNA), 안티센스 RNA (asRNA) 등에 대한 변경 및/또는 변형 포함) 을 검출하고 정량하기 위해 임상 정보를 제공하는데 사용될 수 있다. 변경된 발현과 관련된 장애는 정좌불능증, 알츠하이머병, 기억상실증, 루게릭병 (ALS), 운동 실조증, 조울증, 긴장증, 뇌성마비, 뇌혈관 질환, 크로이츠펠트-야콥병, 치매, 우울증, 다운 증후군, 지연성 운동장애, 긴장 이상, 뇌전증, 헌팅턴병, 다발성 경화증, 근이영양증, 신경통, 신경섬유종증, 신경병증, 파킨슨병, 피크병, 망막색소변성증, 정신분열증, 계절성 정서장애, 노인성 치매, 뇌졸중, 투렛 증후군 및 특히 뇌의 선암, 흑색종 및 기형암종을 포함하는 암을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 방법은 포유동물 단백질의 변경된 발현 또는 활성과 관련된 병상에 대한 임상 정보를 제공하는데 사용될 수 있다. 이러한 병상의 예는 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS), 에디슨병, 성인 호흡곤란 증후군, 알레르기, 강직성 척추염, 아밀로이드증, 빈혈, 천식, 죽상동맥경화증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 갑상선염, 전립성 비대증, 기관지염, 체디아크-히가시 증후군, 담낭염, 크론병, 아토피 피부염, 피부근염, 진성 당뇨병, 폐기종, 태아적아구증, 결절성 홍반, 위축성 위염, 사구체신염, 굿파스튜어 증후군, 통풍, 만성 육아종 질환, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 과호산구증가증, 과민성대장 증후군, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심근 또는 심막 염증, 골관절염, 골다공증, 췌장염, 다낭성 난소 증후군, 다발성근염, 건선, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 강피증, 중증복합면역결핍증 (SCID), 쇼그렌 증후군, 전신과민증, 전신성 홍반성 낭창, 전신 경화증, 혈소판감소성 자반병, 궤양성 대장염, 포도막염, 베르너 증후군, 암의 합병증, 혈액투석 및 체외순환, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 원충 및 연충 감염; 및 선암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 골수종, 육종, 기형암종, 및 특히, 부신, 방광, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 자궁경부, 담낭, 신경절, 위장관, 심장, 신장, 간, 폐, 근육, 난소, 췌장, 부갑상선, 음경, 전립선, 타액선, 피부, 지라, 고환, 흉선, 갑상선 및 자궁의 암, 정좌불능증, 알츠하이머병, 기억상실증, 루게릭병, 운동 실조증, 조울증, 긴장증, 뇌성마비, 뇌혈관 질환, 크로이츠펠트-야콥병, 치매, 우울증, 다운 증후군, 지연성 운동장애, 긴장 이상, 뇌전증, 헌팅턴병, 다발성 경화증, 근이영양증, 신경통, 신경섬유종증, 신경병증, 파킨슨병, 피크병, 망막색소변성증, 정신분열증, 계절성 정서장애, 노인성 치매, 뇌졸중, 투렛 증후군 및 특히 뇌의 선암, 흑색종 및 기형암종을 포함하는 암을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 구현예에서, 상기 방법은 유전자 또는 단백질의 변경된 발현에 관련된 장애에 대한 변경된 유전자 구조, 유전자 돌연변이, 유전자 생화학적 변형 (메신저 RNA (mRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 트랜스퍼 RNA (tRNA), 마이크로RNA (miRNA), 안티센스 RNA (asRNA) 등에 대한 변경 및/또는 변형 포함) 을 검출하고 정량하기 위해 임상 정보를 제공하는데 사용될 수 있다. 이러한 장애의 예는 암 예컨대 선암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 골수종, 육종, 기형암종, 및 특히, 부신, 방광, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 자궁경부, 담낭, 신경절, 위장관, 심장, 신장, 간, 폐, 근육, 난소, 췌장, 부갑상선, 음경, 전립선, 타액선, 피부, 지라, 고환, 흉선, 갑상선 및 자궁의 암; 면역 장애 예컨대 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS), 에디슨병, 성인 호흡곤란 증후군, 알레르기, 강직성 척추염, 아밀로이드증, 빈혈, 천식, 죽상동맥경화증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 갑상선염, 기관지염, 담낭염, 접촉성 피부염, 크론병, 아토피 피부염, 피부근염, 진성 당뇨병, 폐기종, 림프구세포독소를 갖는 우발성 림프구감소증, 태아적아구증, 결절성 홍반, 위축성 위염, 사구체신염, 굿파스튜어 증후군, 통풍, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 과호산구증가증, 과민성대장 증후군, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심근 또는 심막 염증, 골관절염, 골다공증, 췌장염, 다발성근염, 건선, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 강피증, 쇼그렌 증후군, 전신과민증, 전신성 홍반성 낭창, 전신 경화증, 혈소판감소성 자반병, 궤양성 대장염, 포도막염, 베르너 증후군, 암의 합병증, 혈액투석 및 체외순환, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 원충 및 연충 감염, 외상, 브루톤의 X-상관관계 무감마글로불린혈증, 공통가변성 면역결핍증 (CVI), 디죠지 증후군 (흉선형성부전), 흉선 형성이상, 단독성 IgA 결핍, 중증복합면역결핍증 (SCID), 혈소판감소증 및 습진을 갖는 면역결핍 (비스코트-알드리히 증후군), 체디아크-히가시 증후군, 만성 육아종 질환, 유전성 결관신경 부종, 및 쿠싱병과 관련된 면역결핍; 및 발달 장애 예컨대 신세뇨관 산증, 빈혈, 쿠싱 증후군, 연골무형성 왜소증, 뒤시엔느 및 베커 근이영양증, 뇌전증, 생식샘 발생장애, WAGR 증후군 (빌름스 종양, 무홍채증, 비뇨 생식기 기형 및 정신 지체), 스미스-마제니스 증후군, 골수이형성 증후군, 유전성 점막표피 이형성, 유전성 각피증, 유전성 신경병증 예컨대 샤르코-마리-투스병 및 신경섬유종증, 갑상선 기능 저하증, 수두증, 발작 장애 예컨대 시드남 무도증 및 뇌성마비, 척추파열, 무뇌증, 두개척추파열, 선천성 녹내장, 백내장, 감음 신경성 청력 손실, 및 대상의 임의의 조직, 기관 또는 계, 예를 들어, 뇌, 부신, 신장, 골격계 또는 생식계에 포함되는 세포 성장 및 분화, 배아발생, 및 형태발생과 관련된 임의의 장애를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 구현예에서, 상기 방법은 유전자 또는 단백질의 변경된 발현과 관련된 장애에 대한 변경된 유전자 구조, 유전자 돌연변이, 유전자 생화학적 변형 (메신저 RNA (mRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 트랜스퍼 RNA (tRNA), 마이크로RNA (miRNA), 안티센스 RNA (asRNA) 등에 대한 변경 및/또는 변형 포함) 을 검출하고 정량하기 위해 임상 정보를 제공하는데 사용될 수 있다. 이러한 장애의 예는 내분비 장애 예컨대 성선기능저하증, 시한 증후군, 요붕증, 칼라만병, 핸드-쉴러-크리스찬병, 렛테러-시웨병, 유육종증, 공터기안 증후군 및 왜소증을 포함하는 뇌하수체 기능저하증과 관련된 장애; 말단비대증, 거인증 및 부적합 항이뇨 호르몬 (ADH) 분비 증후군 (SIADH) 을 포함하는 뇌하수체기능항진증; 및 갑상선종, 점액수종, 박테리아 감염 관련 급성 갑상선염, 바이러스 감염 관련 아급성 갑상선염, 자가면역성 갑상선염 (하시모토병) 및 크레틴병을 포함하는 갑상선 기능 저하증과 관련된 장애; 갑상선 중독증 및 이의 다양한 형태, 그레이브스병, 전경골 점액수종, 중독성 다결절 갑상선종, 갑상선암 및 플러머병을 포함하는 갑상선 기능 항진증과 관련된 장애; 및 콘 질환 (만성 고칼륨혈증) 을 포함하는 부갑상선 기능항진증과 관련된 장애; 호흡기 장애 예컨대 알레르기, 천식, 급성 및 만성 염증성 폐질환, ARDS, 폐기종, 폐울혈 및 부종, COPD, 간질성 폐질환 및 폐암; 암 예컨대 선암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 골수종, 육종, 기형암종, 및 특히, 부신, 방광, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 자궁경부, 담낭, 신경절, 위장관, 심장, 신장, 간, 폐, 근육, 난소, 췌장, 부갑상선, 음경, 전립선, 타액선, 피부, 지라, 고환, 흉선, 갑상선 및 자궁의 암; 면역 장애 예컨대 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS), 에디슨병, 성인 호흡곤란 증후군, 알레르기, 강직성 척추염, 아밀로이드증, 빈혈, 천식, 죽상동맥경화증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 갑상선염, 기관지염, 담낭염, 접촉성 피부염, 크론병, 아토피 피부염, 피부근염, 진성 당뇨병, 폐기종, 림프구세포독소를 갖는 우발성 림프구감소증, 태아적아구증, 결절성 홍반, 위축성 위염, 사구체신염, 굿파스튜어 증후군, 통풍, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 과호산구증가증, 과민성대장 증후군, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심근 또는 심막 염증, 골관절염, 골다공증, 췌장염, 다발성근염, 건선, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 강피증, 쇼그렌 증후군, 전신과민증, 전신성 홍반성 낭창, 전신 경화증, 혈소판감소성 자반병, 궤양성 대장염, 포도막염, 베르너 증후군, 암의 합병증, 혈액투석 및 체외순환, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 원충 및 연충 감염, 및 외상을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 변경된 핵산 서열 발현을 검출하기 위해 환자로부터의 체액 또는 조직을 이용하여 서던 또는 노던 분석, 도트 블롯, 또는 기타 멤브레인-기반 기술에서; PCR 기술에서; 딥 스틱 (dipstick), 핀, 및 ELISA 검정에서; 및 마이크로어레이에서 사용될 수 있다. 이러한 정성적 또는 정량적 방법은 당업계에 널리 알려져 있다.
발명의 분석 및 최적의 양태
"BamBam" 은 대규모 서열분석 데이터세트를 조사하여 이의 생식세포에 관한 각각의 종양 내에서 발생한 고품질 게놈 이벤트의 한 세트를 생성시키는 계산적으로 효율적인 방법이다. 이들 결과는 종양의 염색체 역학 관계에 대한 일견을 제공하여, 종양의 최종 상태 및 이를 유도하는 이벤트의 이해를 향상시킨다.
진단법
본원에 기재된 방법은 유전자 또는 단백질의 변경된 발현과 관련된 병상, 질환 또는 장애에 대한 변경된 유전자 구조, 유전자 돌연변이, 유전자 생화학적 변형 (메신저 RNA (mRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 트랜스퍼 RNA (tRNA), 마이크로RNA (miRNA), 안티센스 RNA (asRNA) 등에 대한 변경 및/또는 변형 포함) 을 검출하고 정량하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 방법은 또한 치료적 개입 동안 mRNA 수준을 모니터링하거나, mRNA 의 발현, 부재/존재 대 과다, 변경된 유전자 발현을 검출하고 정량하는데 사용될 수 있다. 변경된 발현과 관련된 병상, 질환 또는 장애는 특발성 폐동맥 고혈압, 이차성 폐 고혈압, 세포 증식성 장애, 특히 미분화성 회돌기교종, 성상세포종, 희돌기성상세포종, 교모세포종, 뇌수막종, 신경절세포종, 뉴런 신생물, 다발성 경화증, 헌팅턴병, 유방 선암, 전립선 선암, 위 선암, 전이성 신경내분비 암종, 비증식성 섬유낭성 및 증식성 섬유낭성 유방 질환, 쓸개 담낭염 및 담석증, 골관절염, 및 류마티스 관절염; 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS), 에디슨병, 성인 호흡곤란 증후군, 알레르기, 강직성 척추염, 아밀로이드증, 빈혈, 천식, 죽상동맥경화증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 갑상선염, 전립성 비대증, 기관지염, 체디아크-히가시 증후군, 담낭염, 크론병, 아토피 피부염, 피부근염, 진성 당뇨병, 폐기종, 태아적아구증, 결절성 홍반, 위축성 위염, 사구체신염, 굿파스튜어 증후군, 통풍, 만성 육아종 질환, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 과호산구증가증, 과민성대장 증후군, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심근 또는 심막 염증, 골관절염, 골다공증, 췌장염, 다낭성 난소 증후군, 다발성근염, 건선, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 강피증, 중증복합면역결핍증 (SCID), 쇼그렌 증후군, 전신과민증, 전신성 홍반성 낭창, 전신 경화증, 혈소판감소성 자반병, 궤양성 대장염, 포도막염, 베르너 증후군, 혈액투석, 체외순환, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 원충 및 연충 감염; 프로락틴 생성 장애, 난관 질환, 배란 결함 및 자궁내막증을 포함하는 불임, 발정 주기 파괴, 월경 주기 파괴, 다낭성 난소 증후군, 난소과잉자극 증후군, 자궁 내막 또는 난소 종양, 자궁섬유종, 자가면역 장애, 자궁외 임신, 및 기형발생; 유방의 암, 섬유낭성 유방 질환 및 유즙 분비증; 정자형성의 중단, 이상정자 생리학, 전립성 비대증, 전립선염, 페이로니병, 발기불능, 여성형 유방; 광선 각화증, 동맥경화증, 점액낭염, 간경변, 간염, 혼합 결합 조직병 (MCTD), 골수섬유증, 발작성 야간혈색소 요증, 진성 다혈증, 1 차 혈소판혈증, 암의 합병증, 선암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 골수종, 육종, 기형암종을 포함하는 암, 및 특히, 부신, 방광, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 자궁경부, 담낭, 신경절, 위장관, 심장, 신장, 간, 폐, 근육, 난소, 췌장, 부갑상선, 음경, 전립선, 타액선, 피부, 지라, 고환, 흉선, 갑상선 및 자궁의 암을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 핵산.
본원에 기재된 방법은 유전자 또는 단백질의 변경된 발현과 관련된 장애에 대한 변경된 유전자 구조, 유전자 돌연변이, 유전자 생화학적 변형 (메신저 RNA (mRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 트랜스퍼 RNA (tRNA), 마이크로RNA (miRNA), 안티센스 RNA (asRNA) 등에 대한 변경 및/또는 변형 포함) 을 검출하고 정량하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 방법은 또한 치료적 개입 동안 mRNA 수준을 모니터링하거나; mRNA 의 부재, 존재 또는 과다; 변경된 유전자 발현을 검출하고 정량하는데 사용될 수 있다. 변경된 발현과 관련된 장애는 정좌불능증, 알츠하이머병, 기억상실증, 루게릭병, 운동 실조증, 조울증, 긴장증, 뇌성마비, 뇌혈관 질환, 크로이츠펠트-야콥병, 치매, 우울증, 다운 증후군, 지연성 운동장애, 긴장 이상, 뇌전증, 헌팅턴병, 다발성 경화증, 근이영양증, 신경통, 신경섬유종증, 신경병증, 파킨슨병, 피크병, 망막색소변성증, 정신분열증, 계절성 정서장애, 노인성 치매, 뇌졸중, 투렛 증후군 및 특히 뇌의 선암, 흑색종 및 기형암종을 포함하는 암을 포함한다.
유전자 발현과 관련된 병상, 질환 또는 장애의 진단을 위한 기초를 제공하기 위해서, 정상 또는 표준 발현 프로파일이 구축된다. 이는, 하이브리드화 또는 증폭을 위한 조건 하에 정상 대상 (동물 또는 인간) 에서 채취한 생물학적 샘플을 프로브와 조합하여 이루어질 수 있다. 표준 하이브리드화는 정상 대상을 사용하여 수득한 값을 실질적으로 정제된 표적 서열의 공지된 양이 사용된 실험에서 수득한 값과 비교하여 정량될 수 있다. 이러한 방식으로 수득한 표준 값은 특정 병상, 질환 또는 장애에 대한 증상을 나타내는 환자로부터의 샘플에서 수득한 값과 비교될 수 있다. 특정 병상과 관련된 값에 대한 표준 값으로부터의 편차는 상기 병상을 진단하는데 사용된다.
이러한 검정은 또한 동물 연구 및 임상 시험에서 특정 치료적 처리 계획의 효능을 평가하거나 개별 환자의 치료를 모니터링하는데 사용될 수 있다. 병상의 존재가 확고히 되고 치료 프로토콜이 개시되고 나면, 환자에서의 발현 수준이 정상 대상에서 관찰되는 수준에 비슷해지기 시작하는지를 측정하기 위해 진단 검정을 규칙적으로 반복할 수 있다. 상기 검정은 또한, 임상 치료 또는 치료요법을 거치는 개인의 종양의 존재, 종양의 부재, 또는 소강 단계 (remission status) 를 표시하고/하거나 확인시키는 유전자 구조, 유전자 돌연변이, 유전자 생화학적 변형 (메신저 RNA (mRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 트랜스퍼 RNA (tRNA), 마이크로RNA (miRNA), 안티센스 RNA (asRNA) 등에 대한 변경 및/또는 변형 포함) 을 검출하고, 정량하거나 측정하는데 사용될 수 있다. 연속 검정에서 수득한 결과를 사용하여, 수 일 내지 수 개월 범위의 기간에 걸친 치료 효능을 나타낼 수 있다.
본원에 개시된 방법은 또한, 특정 임상 질환, 장애 또는 병상과 관련되거나 이전에 확인되지 않은 유전자 구조, 유전자 돌연변이, 유전자 생화학적 변형 (메신저 RNA (mRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 트랜스퍼 RNA (tRNA), 마이크로RNA (miRNA), 안티센스 RNA (asRNA) 등에 대한 변경 및/또는 변형 포함) 에서의 변화를 검출하고, 정량하고, 상호연관시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로는, 본원에 개시된 방법은 신규한 임상 질환, 장애 또는 병상을 확인하는데 사용될 수 있다. 유전자 구조, 유전자 돌연변이 및 유전자 생화학적 변형에서의 신규한 변화는, 핵산 서열 또는 단백질 서열의 알려져 있는 화학적 및 생화학적 특성과 비교될 수 있으며, 임상 질환, 장애 또는 병상과 상호연관되어 임상적 사용을 위해 세포 대사에 대한 새로운 데이터베이스 및 지식을 생성시키는데 사용될 수 있다.
모델 시스템
동물 모델을 생물검정으로서 사용할 수 있는데, 상기 동물 모델은 인간과 유사한 독성 반응을 나타내며 노출 조건은 인간 노출에 관련된다. 포유동물이 가장 통상적인 모델이며, 저비용, 활용가능성 및 풍부한 참조 독성학으로 인해 대부분의 독성 연구는 랫트 또는 마우스와 같은 설치류에서 수행된다. 근친 교배한 설치류 품종은 관심 유전자의 과소발현 또는 과발현의 생리학적 결과의 조사 및 질환의 진단 및 치료용 방법의 개발을 위한 편리한 모델을 제공한다. 특정 유전자 (예를 들어, 우유에서 분비되는) 를 과발현시키기 위해 근친 교배된 포유동물이 또한 상기 유전자에 의해 발현된 단백질의 편리한 공급원으로서 역할할 수 있다.
독성학
독성학은 생명체에 대한 작용제의 효과를 연구한다. 다수의 독성 연구가 랫트 또는 마우스에 대해 수행되어 이들 작용제의 인간 건강에 대한 효과를 예측하는 것을 돕는다. 생리학, 거동, 항상성 과정 및 치사율에서의 정량적 및 정성적 변화의 관찰은 독성 프로파일을 생성시키고 작용제에 노출된 후 인간 건강의 결과를 평가하는데 사용된다.
유전 독성학은 작용제가 유전적 돌연변이를 생성시키는 능력을 확인하고 분석한다. 유전독성 물질 (Genotoxic agent) 은 통상 핵산과의 상호작용을 촉진시키는 공통의 화학적 또는 물리적 특성을 가지며, 염색체 이상이 자손에게 전달되는 경우 가장 유해하다. 독성학적 연구로, 수정 전에 부모 중 한 명에게, 임신 중 모체에게, 또는 발생 유기체에 투여되는 경우 자손에서 구조적 또는 기능적 이상의 빈도를 증가시키는 작용제를 확인할 수 있다. 마우스 및 랫트는 이들 시험에서 가장 빈번히 사용되는데, 이는 통계적 요건을 충족시키기에 필요한 유기체 수를 생성시키는 생식 주기가 짧기 때문이다.
급성 독성 시험은 작용제의 징후학 또는 치사율을 측정하기 위해 대상에게 작용제를 단일 투여하는 것을 기준으로 한다. 다음과 같은 세 가지 실험을 수행한다: (a) 초기 용량 결정 (dose-range-finding) 실험, (b) 유효 용량의 범위를 좁히기 위한 실험, 및 (c) 용량-반응 곡선을 구축하기 위한 최종 시험.
지속 독성 시험은 작용제의 반복 투여를 기준으로 한다. 랫트 및 개가 이들 시험에서 흔히 사용되어, 상이한 패밀리의 종으로부터 데이터를 제공한다. 발암을 제외하고, 3 내지 4 개월의 기간 동안 고용량 농도에서 작용제를 매일 투여하는 것이 성체 동물에서 대부분 형태의 독성을 밝혀낼 것이라는 상당한 증거가 존재한다.
1 년 이상 지속되는 만성 독성 시험은 작용제의 발암 가능성 또는 독성의 부재를 입증하는데 사용된다. 연구가 랫트에 대해 수행되는 경우, 최소 3 개 시험군 + 1 개 대조군을 사용하고, 실험 전체에 걸쳐 착수시 및 간격을 두고 동물을 검사하고 모니터링한다.
트랜스제닉 동물 모델
관심 유전자를 과발현하거나 과소발현하는 트랜스제닉 설치류를 근친 교배할 수 있으며, 인간 질환을 모델화하거나 치료제 또는 독성제를 시험하는데 사용할 수 있다 (미국 특허 제 4,736,866; 5,175,383; 및 5,767,337 호 참조; 본원에 참고문헌으로 포함됨). 일부 경우, 도입된 유전자는 태아 발생 동안 또는 출산 후에 특정 조직 유형에서 특정 시간에 활성화될 수 있다. 트랜스유전자 (transgene) 의 발현은 실험 약물 치료요법으로의 챌린지 전, 챌린지하는 동안, 그리고 챌린지 후에 트랜스제닉 동물에서 표현형 또는 조직-특이적 mRNA 발현을 분석함으로써 모니터링된다.
배아 줄기 세포
설치류 배아로부터 단리된 배아 줄기 세포 (ES) 는 배아 형성 가능성을 보유한다. ES 세포가 운반체 배아 (carrier embryo) 내부에 위치하는 경우, 이는 정상 발생을 재개하며 정상 출산된 동물의 모든 조직에 기여한다. ES 세포는 실험용 녹아웃 (knockout) 및 녹인 (knockin) 설치류 종의 생성에 사용되는 바람직한 세포이다. 마우스 ES 세포, 예컨대 마우스 129/SvJ 세포주는 초기 마우스 배아에서 유래되며 당업계에 잘 알려져 있는 배양 조건 하에 생장한다. 녹아웃 종에 대한 벡터는 전사 및/또는 번역을 생체내 방해하는 마커 유전자를 포함하도록 변형된 질환 유전자 후보물을 함유한다. 상기 벡터는 당업계에 잘 알려져 있는 전기천공, 리포솜 전달, 미세주입 등과 같은 형질전환 방법에 의해 ES 세포 내로 도입된다. 내생성 설치류 유전자는 세포 분열 동안 상동 재조합 및 통합을 통해, 분쇄된 (disrupted) 질환 유전자에 의해 대체된다. 형질전환된 ES 세포가 확인되고, 바람직하게는 C57BL/6 마우스 종으로부터의 것과 같은 마우스 세포 배반포 내로 미세주입된다. 배반포는 가임신한 어미 동물 (dam) 에 수술적으로 이식되고, 생성된 키메라 자손은 유전자형 분석되고 교배되어 이형 또는 동형 종이 생성된다.
ES 세포는 또한 신경 세포, 조혈 계통 및 심근세포와 같은 다양한 세포 유형 및 조직의 시험관내 분화를 연구하는데 사용된다 (Bain et al. (1995) Dev. Biol. 168: 342-357; Wiles and Keller (1991) Development 111:259-267; 및 Klug et al. (1996) J. Clin. Invest. 98: 216-224). 최근의 발전은 인간 배반포에서 유래한 ES 세포가 또한, 내배엽, 중배엽 및 외배엽 세포 유형을 포함하는 8 개의 별개 세포 계통으로 분화되도록 시험관내 조작될 수 있다는 것을 입증한다 (Thomson (1998) Science 282: 1145-1147).
녹아웃 (Knockout) 분석
유전자 녹아웃 분석에서, 인간 질환 유전자 후보물 부위는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자 (neo; 예를 들어, Capecchi (1989) Science 244: 1288-1292 참조) 와 같은 비-포유동물 유전자를 포함하도록 효소적으로 변형된다. 삽입된 코딩 서열은 표적화된 유전자의 전사 및 번역을 방해하며, 질환 후보물 단백질의 생화학적 합성을 막는다. 변형된 유전자는 배양된 배아 줄기 세포 (상기 기재됨) 내로 형질전환되고, 형질전환된 세포는 설치류 포배에 주입되고, 상기 포배는 가임신한 어미 동물에게 이식된다. 트랜스제닉 자손을 교잡하여 동형의 근친 교배주를 수득한다.
녹인 (Knockin) 분석
배 발생의 초기 단계에 존재하는 전능 (Totipotent) ES 세포는 인간 질환의 녹인 인간화 동물 (돼지) 또는 트랜스제닉 동물 모델 (마우스 또는 랫트) 을 생성시키는데 사용될 수 있다. 녹인 기술로, 인간 유전자 부위를 동물 ES 세포에 주입하고, 인간 서열을 재조합에 의해 동물 세포 게놈 내로 통합한다. 통합된 인간 유전자를 포함하는 전능 ES 세포를 상기 기재된 바와 같이 취급한다. 근친 교배한 동물을 연구하고 처리하여, 유사한 인간 병상에 대한 정보를 수득한다. 이들 방법을 사용하여 여러 인간 질환을 모델화하였다 (예를 들어, Lee et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 11371-11376; Baudoin et al. (1998) Genes Dev. 12: 1202-1216; 및 Zhuang et al. (1998) Mol. Cell Biol. 18: 3340-3349 참조).
비-인간 영장류 모델
동물 시험 분야는 생리학, 유전학, 화학, 약리학 및 통계학과 같은 기초 과학으로부터의 데이터 및 방법론을 다룬다. 이들 데이터는, 인간 건강과 관련될 수 있기 때문에, 비-인간 영장류에 대한 치료제의 효과를 평가하는데 있어서 가장 중요하다. 원숭이는 백신 및 약물 평가에 있어서 인간 대리물로서 사용되며, 그의 반응은 유사한 조건 하의 인간 노출에 관련된다. 필리핀 원숭이 (Cynomolgus monkeys) (Macaca fascicularis, Macaca mulata) 및 보통의 마모셋 (Callithrix jacchus) 은 이러한 조사에 사용되는 가장 통상적인 비-인간 영장류 (NHP) 이다. NHP 의 콜로니를 성장시키고 유지하는데 큰 비용이 관련되기 때문에, 초기 조사 및 독성학 연구는 통상 설치류 모델에서 실행된다. 약물 중독과 같은 행동 측정을 사용하는 연구에서, NHP 는 최초 선택된 시험 동물이다. 또한, NHP 및 개별 인간은 많은 약물 및 독소에 대해 차등적 민감도를 나타내며, 이들 작용제의 "강대사능력자 (extensive metabolizer)" 및 "약대사능력자 (poor metabolizers)" 로서 분류될 수 있다.
본 발명의 예시적 사용
개인 맞춤형 의약은 가장 이득을 얻을 것으로 보이는 환자에게 특이적인 치료(들) 를 전달하는 것을 기약한다. 본 발명자는 임상적으로 관련된 전사 또는 게놈 유방암 아형 중 하나 이상에서 대략 절반의 치료 화합물이 우선적으로 효과적이라는 것을 보여주었다. 이러한 발견은 유방암 치료에 있어서 반응-관련 분자 아형 정의의 중요성을 지지한다. 본 발명자는 또한 세포주에서의 전사 및 게놈 데이터의 경로 통합이, 관찰된 아형 특이적 반응에 대한 기계론적 설명을 제공하는 서브네트워크를 밝혀낸다는 것을 보여준다. 세포주와 종양 사이의 서브넷 활성의 비교 분석은 다수의 아형-특이적 서브네트워크가 세포주와 종양 사이에 보존된다는 것을 보여준다. 이들 분석은 잘 분석된 세포주 패널에서의 실험 화합물의 전임상 스크리닝으로 초기 임상 시험에서의 민감도 강화를 위해 사용될 수 있는 후보물 반응-연관 분자 시그너쳐 (molecular signature) 를 확인할 수 있다는 발상을 지지한다. 본 발명자는 이러한 시험관내 평가 접근방식이, 반응성 종양 아형이 화합물의 임상 개발이 시작하기 전에 확인될 가능성을 증가시켜, 비용을 감소시키고, 궁극적인 FDA 승인 가능성을 증가시키고, 가능하게는 반응 가능성이 낮은 환자의 치료와 관련된 독성을 방지한다는 것을 제시한다. 이러한 연구에서 본 발명자는 전사 아형 및 선택된 재발성 게놈 카피 수 이상 (CNA) 을 정의하는 분자 시그너쳐만을 평가하였다. 본 발명자는, 유전적 돌연변이, 메틸화 및 대안적 스플라이싱과 같은 추가적인 분자 특성이 분석에 포함됨에 따라 이러한 접근방식의 영향력 및 정확도가 증가할 것이라는 것을 예상한다. 마찬가지로, 세포주 패널의 크기를 증가시키는 것은 패널 내 덜 통상적인 분자 패턴에 접근할 영향력을 증가시키며 인간 유방암에 존재하는 보다 완전한 범위의 다양성 제시 가능성을 증가시킬 것이다.
여기서, 본 발명자는 BamBam 이라고 칭하는 신규한 소프트웨어 도구를 개시하며, 이는 종양 (체세포) 및 생식세포 매치된 서열분석 데이터세트의 신속한 비교를 가능하게 한다. BamBam 에 의한 결과 출력물은 가변적이며, 각 환자의 샘플에 의해 포함된 체세포 및 생식세포 변이체의 자세한 목록을 생성시킨다. 이러한 목록은 조사자에게 종양 발생 동안 일어난 중요한 변화를 신속히 발견하는 능력을 제공할 뿐 아니라, 질환에 대한 성향을 표시할 수 있는 환자의 생식세포에 존재하는 고품질 변이체를 제공한다. BamBam 의 추가적인 향상은, 종양형성의 요인을 암시할 수 있는 동일한 게놈 부위에 발생하는 여러 유형의 변이체 (예를 들어, 삭제된 유전자 중 하나의 대립형질, 중단점에 의한 절단형 돌연변이를 포함하는 다른 대립형질) 를 특이적으로 찾아내는 방법으로 이루어질 것이다. 본 발명자는 또한 여러 쌍 초과의 게놈을 처리하는 BamBam 의 능력을 확장시킬 뿐 아니라 조사자에게 그의 고유 분석 방법을 BamBam 의 파이프라인에 연결시키는 능력을 제공하는 것을 계획하고 있다.
추가적인 구현예에서, 새로운 기술이 현재 알려져 있는 핵산 분자의 특성 (예컨대 트리플렛 (triplet) 유전 암호 및 특정 염기쌍 상호작용과 같은 특성을 포함하나 이에 제한되지는 않음) 을 필요로 한다면, 폴리뉴클레오티드 핵산을 아직 개발되지 않은 임의의 분자 생물학 기술에서 사용할 수 있다.
도 6 은 가능하게는 네트워크 115 (예를 들어 LAN, WAN, VPN, 인터넷 등) 를 통해, 하나 이상의 데이터베이스와 연결되는 서열 분석 엔진 140 을 포함하는 유전자 서열 분석 에코시스템 100 을 설명한다. 바람직한 데이터베이스는 하나 이상의 조직에 대한 유전자 서열 스트링을 저장하는 유전자 데이터베이스 110, 부분적으로 상이한 스트링을 나타내는 상이한 유전자 서열 대상을 저장하는 상이한 서열 데이터베이스 120, 및 환자, 개인, 인구 집단, 또는 기타 유형의 독립체와 연관된 하나 이상의 의료 기록을 저장하는 의료 기록 데이터베이스 130 을 포함한다. 의료 기록 데이터베이스 130 은 또한, 가능하게는 환자, 개인, 인구 집단 또는 기타 군과 연관된 하나 이상의 상이한 유전자 서열 대상을 저장할 수 있다.
본 발명의 주제의 한 양태는 상이한 유전자 서열 대상의 관리를 포함하는 것으로 고려된다. 유전자 서열 스트링의 분석을 통해, 분석 엔진 140 은 상이한 스트링 145 의 성좌 또는 상이한 스트링을 생성시킬 수 있다. 상이한 스트링 145 는 상이한 유전자 서열 대상으로 변환될 수 있으며, 그 다음 상이한 서열 데이터베이스 120 또는 의료 기록 데이터베이스 130 에 저장될 수 있다. 서열 대상은 대상의 성질을 기술하는 하나 이상의 속성으로 태그 붙여질 수 있다. 예시적인 속성은 대상 생성의 타임 스탬프, 샘플이 환자로부터 채취되었을 때의 타임 스탬프, 환자명, 인구통계학적 정보, 조직 유형 (예를 들어, 건강한, 병든, 종양, 기관 조직 등), 또는 기타 특성을 포함할 수 있다. 속성은 분석 엔진 140 에 의해 영향력을 행사하여, 의료 기록 데이터베이스 130 에서의 의료 기록과 연관된 특징들 사이에 하나 이상의 상관관계를 확립시킬 수 있다.
상이한 유전자 서열 대상의 관리는 넓은 스펙트럼의 역할 또는 책무를 포함한다. 상기 토의한 바와 같이, 한 양태는 이러한 대상의 생성을 포함한다. 분석 엔진 140 은 또한 바람직하게는 필요에 따라 서열 대상을 업데이트하고, 분석하고, 변형시키고, 시간에 따라 추적하고, 삭제하고, 복사하고, 분할시키고, 첨부하고, 또는 다르게는 조작하도록 구성된다. 또한, 분석 엔진 140 은 가능하게는 출력 장치 190 상에서, 상이한 유전자 서열 대상 관리 인터페이스를 제공할 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, 에코시스템 100 은 인터넷을 통해 이용가능한 하나 이상의 웹 서버를 포함하는 서비스당 이용료 시스템 (for-fee service) 으로서 작동한다. 이러한 구현예에서, 브라우저를 갖는 컴퓨터는 분석 엔진 140 과 인터페이스로 접속하여 상이한 유전자 서열 대상을 관리하거나 이와 상호작용할 수 있다.
일부 구현예에서, 하기 추가로 토의한 바와 같이, 분석 엔진 140 은 유전자 데이터베이스 110 으로부터 수득한 유전자 서열 스트링을 분석하도록 구성된다. 바람직하게는 유전자 서열 스트링은 둘 이상의 상이한 조직 샘플 내에서 연관된다. 분석 엔진 140 은 서열 스트링에서의 상응하는 서브스트링의 하나 이상의 알려져 있는 위치를 사용하여 2 개 이상의 서열을 점증적으로 동기화시킴으로써 하나 이상의 부분적인 정렬 143 을 생성시킨다. 또한, 분석 엔진 140 은 부분적인 정렬을 사용하여, 유전자 서열 스트링 사이에 하나 이상의 부분적으로 상이한 스트링 145 또는 상이한 스트링 145 의 성좌를 생성시킨다. 분석 엔진 140 은 상이한 스트링 145 를 사용하여 상이한 서열 데이터베이스 120 또는 의료 기록 데이터베이스 130 에서의 상이한 유전자 서열 대상을 업데이트할 수 있다. 상이한 서열 대상이 추가 분석을 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 분석 엔진 140 은 특정 환자, 개인, 개체, 가계, 인구 집단, 또는 기타 군에 대한 상이한 유전자 서열 대상을 저장하는 의료 기록 데이터베이스 130 과 통신적으로 연결된다. 분석 엔진 140 은 환자에 대한 상이한 서열 대상을 수득하며 환자의 서열 대상과 연관된 상이한 스트링의 성좌 또는 부분적으로 상이한 스트링의 존재를 기준으로 환자 특이적 데이터 세트를 생성시킨다. 그런 다음, 분석 엔진 140 은 환자-특이적 데이터 세트에 영향력을 행사하여 하나 이상의 환자 특이적 지시사항 151 을 발생시키거나 다르게는 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 환자 특이적 부분적으로 상이한 스트링의 분석을 통해, 분석 엔진 140 은 환자 특이적 상이한 스트링과 알려져 있는 조건 사이에 상관관계가 있는지 여부를 결정할 수 있으며, 이는 그 다음 지시사항에 대해 맵핑될 수 있다. 고려된 지시사항은 진단, 예후, 권고된 치료, 예측, 처방, 또는 기타 유형의 지시사항을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 분석 엔진 140 은 서열 대상이 개체의 인구 집단과 연관되는 의료 기록 데이터베이스 130 에서 저장된 상이한 유전자 서열 대상을 수득한다. 분석 엔진 140 은 다수의 서열 대상으로부터 부분적으로 상이한 스트링의 성좌를 확인하며 성좌로부터 성좌 기록 152 를 생성시킨다. 성좌 기록 152 는 인구 집단과 연관된 부분적으로 상이한 스트링에 관한 정보의 표시 (예를 들어 속성, 특성, 메타데이터, 특징 등) 를 포함한다. 분석 엔진 140 은 성좌 기록 152 를 사용하여 인구 집단 분석 기록 153 을 생성시킨다. 따라서, 상이한 유전자 서열 대상은 인구 집단 조각에 대해 맵핑될 수 있다.
또 다른 구현예는 개인의 유전자 서열이 참조 샘플에서 벗어나는 정도를 측정하기 위해 상이한 유전자 서열 대상을 사용하는 분석 엔진 140 을 포함한다. 가능하게는 실제 개인 또는 표준 개인을 나타내는 참조 상이한 유전자 서열 대상은 의료 기록 데이터베이스 130 에서 의료 기록으로서 저장될 수 있다. 분석 엔진 140 은 개인과 연관된 상이한 서열 대상으로부터의 개인의 부분적으로 상이한 스트링과 참조 상이한 유전자 서열 대상으로부터의 부분적으로 상이한 스트링 사이의 편차를 계산한다. 편차를 계산하고 나면, 분석 엔진 140 은 편차 또는 일탈을 나타내는 편차 기록 154 를 생성시킨다. 시스템 내 다른 기록과 유사하게, 편차 기록 154 는 또한 기록 내 정보의 특징 (예를 들어 개인명, 타임 스탬프, 샘플 유형 등) 을 반영하는 속성을 포함할 수 있다. 분석 엔진 140 은 편차 기록 154 에 영향력을 행사하여, 개인 유전자 서열이 참조 상이한 스트링에서 어떻게, 또는 어느 정도로 벗어나는지를 나타내는 개인-특이적 편차 프로파일 155 를 생성시킬 수 있다.
분석 유형 또는 생성된 결과 (예를 들어 환자 지시사항 151, 인구 집단 분석 153, 개인-특이적 프로파일 155 등) 에 관계없이, 분석 엔진 140 은 추가의 구성 출력 장치 190 이 결과를 나타내도록 할 수 있다. 출력 장치 190 은 바람직하게는, 가능하게는 네트워크 115 를 통해, 분석 엔진 140 과 연결된 컴퓨팅 장치를 포함한다. 출력 장치 190 의 예는 휴대폰, 무인안내시스템 (information kiosk), 관리 시점에서의 컴퓨터 단말기, 보험 회사 컴퓨터, 프린터, 영상화 장치, 게놈 브라우저, 또는 기타 유형의 장치를 포함한다.
따라서, 본 발명의 주제에 따른 시스템을 사용하는 것은 통상적으로 유전자 데이터베이스를 포함할 것이다. 상기 이미 나타낸 바와 같이, 유전자 데이터베이스가 단일 컴퓨터 상에 물리적으로 위치할 수 있으나, 분산된 데이터베이스가 또한 본원에서 사용하기에 적합한 것으로 간주된다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 이러한 데이터베이스가 각각의 제 1 및 제 2 조직을 나타내는 제 1 및 제 2 유전자 서열 스트링 (상기 제 1 및 제 2 서열 스트링은 다수의 상응하는 서브스트링을 가짐) 을 저장하고 검색 (retrieval) 할 수 있기만 하면, 특정 포맷의 데이터베이스가 본 발명의 주제를 제한하지 않는다는 것도 이해되어야 한다.
마찬가지로, 제 1 및 제 2 유전자 서열 스트링이 게놈에서의 위치가 알려져 있는 하나 이상의 상응하는 서브스트링을 포함하는 것이면, 특정 포맷의 제 1 및 제 2 유전자 서열 스트링이 본 발명의 주제를 제한하지 않는다는 것에 유의해야 한다. 그러므로, 적합한 데이터 포맷은 단순한 ASCII 또는 2 진법 코드를 포함할 것이며, 서열 스트링은 현재 알려져 있는 서열 분석 도구에서 흔히 이용하는 사양에 따라 포맷화될 수 있다. 따라서, 특히 바람직한 포맷은 EMBL, GCG, fasta, SwissProt, GenBank, PIR, ABI 및 SAM/BAM 포맷을 포함한다.
분석
분석 및 샘플의 특정 성질에 따라, 유전자 서열 스트링의 유형은 상당히 가변적일 수 있으며, 서열이 핵산 서열 (DNA 또는 RNA) 뿐 아니라 단백질 서열일 수 있다는 것이 언급되어야 한다. 그러나 가장 통상적으로는, 유전자 서열 스트링은 분석 하에 제 1 및 제 2 조직의 게놈, 전사체 및/또는 프로테옴의 유의한 일부를 나타낼 핵산 스트링일 것이다. 예를 들어, 제 1 및 제 2 유전자 서열 스트링이 제 1 및 제 2 조직의 10% 이상, 보다 통상적으로는 25% 이상, 보다 통상적으로는 50% 이상, 보다 더 통상적으로는 70% 이상, 가장 통상적으로는 90% 이상 또는 실질적 전체 (98% 이상) 의 게놈, 전사체 또는 프로테옴을 나타낸다는 것이 고려된다. 따라서, 본원에 나타낸 시스템 및 방법이 제 1 및 제 2 조직 사이 유의한 차이의 신속하고 매우 포괄적인 개관을 가능하게 하면서 압축적이고 유익한 출력물 파일을 생성시킬 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
조사 중인 조직의 유형에 따라서, 여러 유형의 분석이 수행될 수 있다는 것에 유의해야 한다. 예를 들어, 제 1 및 제 2 조직이 동일한 생물학적 독립체에서 기원하는 경우, 건강한 조직이 상이한 건강한 조직에 대해 비교될 수 있거나, 건강한 조직이 상응하는 병든 조직 (예를 들어 종양 조직) 에 대해 비교될 수 있다. 따라서, 상기 생물학적 독립체는 건강한 개체 또는 질환 또는 장애로 진단받은 개체일 수 있다. 한편, 제 1 및 제 2 조직이 세포주 (불멸화 또는 1 차) 에서 유래한 경우, 약물의 유전적 효과 또는 후성적 효과가 신속하게 확인될 수 있다. 유사하게, 제 1 및 제 2 조직이 줄기 세포에서 유래한 경우, 발생 배아의 유전적 조성 또는 유전적 가소성에 있어서의 변화가 분석될 수 있다. 추가 고려된 예에서, 제 1 및 제 2 조직은 질환의 진행 또는 치료의 효과를 조사하기 위한 실험 동물 모델의 조직일 수 있다. 대안적으로는, 제 1 및 제 2 조직은 효모, 재조합 박테리아 세포 및/또는 바이러스로부터의 것일 수 있다.
결과적으로, 상응하는 서브스트링의 성질은 상당히 가변적이며 샘플 채취한 조직의 유형 및 게놈 커버리지 양에 따라 적어도 일부 좌우된다는 것을 인식해야 한다. 그러나, 게놈 커버리지가 상대적으로 높으며 대부분의 경우 전체 게놈을 분석하는 것이 통상 바람직하다. 따라서, 상응하는 서브스트링은 통상 동형 및 이형 대립형질을 포함할 것이다.
서브스트링의 유형에 관계없이, 동기화가 제 1 스트링 내 선험적으로 알려져 있는 위치를 기준으로 다수의 서브스트링 중 하나 이상을 정렬하는 단계를 포함하는 것이 일반적으로 바람직하다. 다양한 유기체 (및 특히 인간) 에 대한 수많은 게놈이 이미 실질적으로 완전히 주석화되고, 심지어 알려져 있지 않은 서열이 종종 하나 이상의 추정상 기능으로 주석화되고, 실질적으로 (선형) 서열 전체 게놈이 알려져 있기 때문에, 참조 게놈에 대한 선험적으로 알려져 있는 위치의 수가 크다. 따라서, 참조 게놈 내 주석의 지식은 효과적이고 정확한 동기화에 대한 로드맵으로서 역할할 것이다. 물론, 참조 게놈의 성질이 단일의 건강한 조직의 게놈에 반드시 제한되지는 않으나, 상기 참조 게놈이 임의의 규정된 (실제 또는 계산된) 게놈 구조일 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 참조 게놈은 컨센서스 참조 서열이 생성되도록 다수의 건강한 개체 (의 통상 단일 조직) 로부터 구축될 수 있다. 대안적으로는, 참조 스트링은 동일한 (또는 상이한) 개체의 다수 조직의 컨센서스, 또는 병든 조직 샘플 (동일한 또는 여러 환자로부터의) 의 컨센서스를 기준으로 할 수 있다.
결과적으로, 상이한 유전자 서열 대상이 참조 조직에 대한 하나 이상의 샘플 조직(들) 의 정보를 제공할 것이라는 점을 인식해야 한다. 그에 따라, 그리고 참조 스트링의 선택에 따라, 상이한 유전자 서열 대상에 대한 정보 내용은 상당히 가변적일 수 있다. 예를 들어, 상이한 유전자 서열 대상은, 샘플이 특정 하위-인구 집단 (참조 스트링에 의해 규정된 바와 같은) 에 대한 매치이거나 상기 샘플이 질환 또는 병상과 연관될 수 있거나 연관되지 않을 수 있는 다수의 미스매치를 갖는다는 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 주제의 추가 바람직한 양태에서, 동기화는 또한 다수의 서브스트링 중 하나 이상의 길이 미만의 길이를 갖는 윈도우 내 서브스트링(들) 을 정렬함으로써 수행될 수 있다. 가장 바람직하게는, 동기화는 제 1 서열 스트링의 전체 길이에 걸쳐 제 1 및 제 2 서열 스트링을 반복하여 점증적으로 동기화시킴으로써 수행된다. 상이한 관점에서, 동기화는 따라서 2 개의 절반이 점증적으로 매치되어 정렬을 생성시키는 지퍼의 방식과 유사한 방식으로 수행될 것이다. 동일한 영상을 사용하여, 닫힌 지퍼의 미스매치 부분만이 상이한 유전자 서열 대상에서 반영된다.
따라서 결과적으로 상이한 유전자 서열 대상이, 통상적으로는 제 1 또는 제 2 조직의 게놈의 규정된 일부 이상 (예를 들어, 하나 이상의 염색체), 보다 통상적으로는 제 1 또는 제 2 조직의 실질적 전체 게놈에 대한 하나 이상의 부분적으로 상이한 스트링을 나타낼 것이라는 것을 인식해야 한다. 물론, 참조 스트링으로부터의 측정된 편차 및/또는 이미 알려져 있는 부위를 기준으로, 상이한 유전자 서열 대상이 통상 상이한 유전자 서열 대상을 기술하는 메타데이터를 갖는 하나 이상의 속성을 포함할 것이라는 것에 유의해야 한다. 예를 들어, 상기 속성은 제 1 및/또는 제 2 조직의 상태를 기술할 수 있다. 상태가 생리학적 상태인 경우, 메타데이터는 종양 성장, 세포자멸사, 분화 상태, 조직 연령 및/또는 조직 치료에 대한 반응을 반영할 수 있다. 한편, 상태가 유전적 상태인 경우, 메타데이터는 배수성, 유전자 카피 수, 반복 카피 수, 역위, 결실, 바이러스 유전자 삽입, 체세포 돌연변이, 생식세포 돌연변이, 구조적 재배열, 전위 및/또는 이형성 손실을 반영할 수 있다. 유사하게, 상기 상태는 조직 내 신호전달 경로 (예를 들어 약물에 대한 예상된 반응, 수용체에 있어서의 결함 등) 와 연관된 경로 모델 정보를 포함할 수 있으며, 특히 고려되는 경로는 신호전달 경로 (예를 들어 성장 인자 신호전달 경로, 전사 인자 신호전달 경로, 세포자멸사 경로, 세포 주기 경로, 호르몬 반응 경로 등) 를 포함한다.
본원에 나타낸 시스템 및 방법에 의해 제공되는 출력물 정보는 참조 스트링으로부터의 다수 편차를 나타내는 단일한 상이한 유전자 서열 대상, 또는 참조 스트링으로부터의 개별 편차를 나타내는 하나 초과의 상이한 유전자 서열 대상, 또는 이의 임의의 타당한 조합의 형태일 수 있다. 가장 통상적으로는, 상이한 유전자 서열 대상은 전자 포맷일 것이며, 따라서 컴퓨터 판독가능 파일로서 검색되고/되거나 이동될 것이다. 쉽게 인식되기 때문에, 상기 파일은 가장 바람직하게는 표준화되고, 포맷이 SAM/BAM 포맷에 따르는 것이 특히 바람직하다.
따라서 상기를 고려하여, 상이한 유전자 서열 대상이 다양한 방식으로 사용될 수 있으며, 상이한 유전자 서열 대상이 건강관리, 인구 집단 분석 및 개인 맞춤형 의약에 있어서의 수많은 적용물에 대해 특히 적합하다는 것이 이해되어야 한다.
예를 들어, 하나 이상의 상이한 유전자 서열 대상이 개체에 대해 알려져 있는 경우, 환자-특이적 데이터 세트는 환자에 대한 상이한 유전자 서열 대상에서의 다수의 부분적으로 상이한 스트링의 성좌 또는 부분적으로 상이한 스트링을 기준으로 생성될 수 있으며, 상기 환자-특이적 데이터 세트를 사용하여 환자-특이적 지시사항을 생성시킨다. 통상적 예에서, 본 발명자는 분석 엔진이 환자에 대한 상이한 유전자 서열 대상을 저장하는 의료 기록 저장 장치에 연결되는 건강 관리 서비스를 제공하는 방법을 고려한다. 분석 엔진은 환자에 대한 상이한 유전자 서열 대상에서의 다수의 부분적으로 상이한 스트링의 성좌 또는 하나 이상의 부분적으로 상이한 스트링을 사용하여 환자-특이적 데이터를 발생시키며, 상기 환자-특이적 데이터 세트를 기준으로 환자-특이적 지시사항을 생성시킨다.
의료 기록 저장 장치가 수많은 방식으로 구성될 수 있으며, 환자에 의해 휴대가능하고 (예를 들어 환자에 의해 휴대되는 스마트 카드), 환자에 의해 접근가능하거나 (예를 들어 스마트폰을 통해), 환자 또는 환자의 의료 전문가에 의해 접근가능한 서버 상에 원격으로 저장될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 상기 토의에서 얻을 수 있는 바와 같이, 환자에 대한 상이한 유전자 서열 대상은 여러 부분적으로 상이한 스트링 (즉, 참조 게놈에 대한 게놈 내 특정 위치에서의 서열 편차) 을 포함할 수 있으며, 부분적으로 상이한 스트링은 게놈의 규정된 영역, 하나 이상의 염색체, 또는 전체 게놈에 걸쳐 위치할 수 있다. 유사하게는, 상이한 유전자 서열 대상은 2 개 이상의 조직 유형 (예를 들어 건강한 조직 대 병든 조직) 을 나타내는 다수의 부분적으로 상이한 스트링, 또는 동일 조직에 대한 2 개 이상의 시간적 간격 결과 (예를 들어, 특정 양생법에서의 특정 약물로의 치료 전 및 치료 개시 후) 를 포함할 수 있다.
그에 따라, 그리고 상이한 관점에서, 전체 게놈 (또는 이의 분획물 [예를 들어 염색체 또는 인접 서열 스트레치]) 에 대한 의학적 관련 정보가 하나 이상의 부분적으로 상이한 스트링을 갖는 편차 기록으로서 표시될 수 있으며, 상기 정보를 사용하여 부분적으로 상이한 스트링과 연관되거나 이에 대한 치료 옵션, 진단 및/또는 예측을 포함하는 데이터베이스에 대해 비교할 수 있다는 것에 유의해야 한다. 다수의 부분적으로 상이한 스트링이 존재하는 경우, 선택된 부분적으로 상이한 스트링의 조합이 병상, 소인 또는 질환을 나타낼 수 있으며, 이러한 다수의 특정 부분적으로 상이한 스트링의 성좌를 사용하여 환자-특이적 데이터를 생성시킬 수 있고, 이를 사용하여 환자-특이적 지시사항을 생성시킨다는 것에 유의한다. 따라서, 환자-특이적 지시사항의 성질은 상당히 가변적이며, 진단, 예후, 치료 결과의 예측, 치료 전략에 대한 권고사항 및/또는 처방일 수 있다.
고려된 상이한 유전자 서열 대상의 또 다른 바람직한 사용에 있어서, 본 발명자는 유전자 분석이 개체에 대해서 가능할 뿐 아니라, 본원에 나타낸 시스템 및 방법을 사용하여 인구 집단 전반적 분석이 신속하고 효과적 방식으로 수행될 수 있다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 인구 집단 분석 방법에 있어서, 다수의 상이한 유전자 서열 대상 (예를 들어 다수의 개체에 대한) 이 인구 집단의 의료 기록 데이터베이스에 저장되고, 분석 엔진이 다수의 상이한 유전자 서열 대상 내 다수의 부분적으로 상이한 스트링의 성좌를 확인 (예를 들어 다형성, 후성적 변화 등을 기준으로) 하여 성좌 기록을 생성시키고, 이를 사용하여 인구 집단 분석 기록을 생성시킬 것이다.
예를 들어, 혈족, 동일 민족 또는 인종의 일원, 동일 직업에 종사하는 인구 집단, 선택된 지리학적 장소에서 거주하는 인구 집단에 대해 성좌 기록을 준비할 수 있다. 대안적으로는, 인구 집단은 또한 병원체 또는 유해한 작용제에 대한 노출, 건강 이력, 치료 이력, 치료 성공, 성별, 인종 및/또는 연령을 공유하는 일원에 의해 규정될 수 있다. 따라서 성좌 기록이, 개체가 상기 성과 기록에 의해 규정되는 바와 같은 하나 이상의 특정 군에 속하는 것으로서 확인될 수 있게 하는 게놈-전반 분석 도구라는 것을 인식해야 한다. 따라서 성좌 기록 및 관련 방법은 부성 또는 모성을 결정하는데 유용할 수 있거나, 성좌 기록을 고려하여 환자-특이적 기록을 생성시키는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 환자-특이적 기록은 질환 또는 병상에 대한 소인, 또는 특정 약물 또는 기타 작용제에 대한 민감도를 밝혀낼 수 있다. 결과적으로, 환자-특이적 기록은 구체화된 인구 집단에 속하는 것으로서의 환자 확인 및/또는 위험 평가를 나타낼 수 있다. 대안적으로, 환자-특이적 기록은 진단, 예후, 치료 결과의 예측, 치료 전략에 대한 권고사항 및/또는 처방을 포함할 수 있으며, 이는 통상 환자의 성좌 기록의 인구 집단 분석 기록과의 비교를 적어도 일부 기준으로 한다.
고려된 상이한 유전자 서열 대상의 추가로 바람직한 사용에 있어서, 참조 상이한 유전자 서열 대상이 생성되고 (예를 들어 상기 기재한 바와 같은 컨센서스 기록으로서) 데이터베이스에 저장된다. 개인의 상이한 유전자 서열 대상에서의 다수의 부분적으로 상이한 스트링과 참조 상이한 유전자 서열 대상에서의 다수의 부분적으로 상이한 스트링 사이의 편차를 측정하여, 개인에 대한 개별적 편차 기록을 생성시키고, 이를 사용하여 개인-특이적 편차 프로파일을 생성시킬 수 있다. 따라서, 하나 이상의 생리학적 매개변수 (예를 들어 의사에 의해 지시된 흔한 CBC) 를 사용하는 것 대신, (바람직하게는) 개인의 전체 게놈에 대한 상이한 유전자 서열 대상을 참조 상이한 유전자 서열 대상과 비교하여, 상당히 더 포괄적인 정보 수집물에 도달한다. 가장 통상적으로는, 개인-특이적 편차 프로파일을 정상 또는 참조 상이한 유전자 서열 대상에 대한 참조 기록에 대해 매치시켜, 특정 병상 또는 질환에 매치되는 것으로서 상기 개인을 정확하고 빠르게 확인한다.
그러므로 상이한 관점에서, 본원에서 나타낸 시스템 및 방법이 일부 이상 게놈, 전사체 및/또는 프로테옴에 있어서의 변형으로 인한 질환 또는 병상의 진단 또는 분석에 특히 유용하다는 것이 이해되어야 한다. 기타 질환 및 병상 중에서, 특히 고려되는 질환 및 병상은 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS), 에디슨병, 성인 호흡곤란 증후군, 알레르기, 강직성 척추염, 아밀로이드증, 빈혈, 천식, 죽상동맥경화증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 갑상선염, 전립성 비대증, 기관지염, 체디아크-히가시 증후군, 담낭염, 크론병, 아토피 피부염, 피부근염, 진성 당뇨병, 폐기종, 태아적아구증, 결절성 홍반, 위축성 위염, 사구체신염, 굿파스튜어 증후군, 통풍, 만성 육아종 질환, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 과호산구증가증, 과민성대장 증후군, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심근 또는 심막 염증, 골관절염, 골다공증, 췌장염, 다낭성 난소 증후군, 다발성근염, 건선, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 강피증, 중증복합면역결핍증 (SCID), 쇼그렌 증후군, 전신과민증, 전신성 홍반성 낭창, 전신 경화증, 혈소판감소성 자반병, 궤양성 대장염, 포도막염, 베르너 증후군, 암의 합병증, 혈액투석 및 체외순환, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 원충 및 연충 감염; 및 선암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 골수종, 육종, 기형암종, 및 특히, 부신, 방광, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 자궁경부, 담낭, 신경절, 위장관, 심장, 신장, 간, 폐, 근육, 난소, 췌장, 부갑상선, 음경, 전립선, 타액선, 피부, 지라, 고환, 흉선, 갑상선 및 자궁의 암, 정좌불능증, 알츠하이머병, 기억상실증, 루게릭병 (ALS), 운동 실조증, 조울증, 긴장증, 뇌성마비, 뇌혈관 질환 크로이츠펠트-야콥병, 치매, 우울증, 다운 증후군, 지연성 운동장애, 긴장 이상, 뇌전증, 헌팅턴병, 다발성 경화증, 근이영양증, 신경통, 신경섬유종증, 신경병증, 파킨슨병, 피크병, 망막색소변성증, 정신분열증, 계절성 정서장애, 노인성 치매, 뇌졸중, 투렛 증후군 및 특히 뇌의 선암, 흑색종 및 기형암종을 포함하는 암, 암 예컨대 선암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 골수종, 육종, 기형암종, 및 특히, 부신, 방광, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 자궁경부, 담낭, 신경절, 위장관, 심장, 신장, 간, 폐, 근육, 난소, 췌장, 부갑상선, 음경, 전립선, 타액선, 피부, 지라, 고환, 흉선, 갑상선 및 자궁의 암; 면역 장애 예컨대 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS), 에디슨병, 성인 호흡곤란 증후군, 알레르기, 강직성 척추염, 아밀로이드증, 빈혈, 천식, 죽상동맥경화증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 갑상선염, 기관지염, 담낭염, 접촉성 피부염, 크론병, 아토피 피부염, 피부근염, 진성 당뇨병, 폐기종, 림프구세포독소를 갖는 우발성 림프구감소증, 태아적아구증, 결절성 홍반, 위축성 위염, 사구체신염, 굿파스튜어 증후군, 통풍, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 과호산구증가증, 과민성대장 증후군, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심근 또는 심막 염증, 골관절염, 골다공증, 췌장염, 다발성근염, 건선, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 강피증, 쇼그렌 증후군, 전신과민증, 전신성 홍반성 낭창, 전신 경화증, 혈소판감소성 자반병, 궤양성 대장염, 포도막염, 베르너 증후군, 암의 합병증, 혈액투석 및 체외순환, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 원충 및 연충 감염, 외상, 브루톤의 X-상관관계 무감마글로불린혈증, 공통가변성 면역결핍증 (CVI), 디죠지 증후군 (흉선형성부전), 흉선 형성이상, 단독성 IgA 결핍, 중증복합면역결핍증 (SCID), 혈소판감소증 및 습진을 갖는 면역결핍 (비스코트-알드리히 증후군), 체디아크-히가시 증후군, 만성 육아종 질환, 유전성 결관신경 부종 및 쿠싱병과 관련된 면역결핍; 및 발달 장애 예컨대 신세뇨관 산증, 빈혈, 쿠싱 증후군, 연골무형성 왜소증, 뒤시엔느 및 베커 근이영양증, 뇌전증, 생식샘 발생장애, WAGR 증후군 (빌름스 종양, 무홍채증, 비뇨 생식기 기형, 및 정신 지체), 스미스-마제니스 증후군, 골수이형성 증후군, 유전성 점막표피 이형성, 유전성 각피증, 유전성 신경병증 예컨대 샤르코-마리-투스병 및 신경섬유종증, 갑상선 기능 저하증, 수두증, 발작 장애 예컨대 시드남 무도증 및 뇌성마비, 척추파열, 무뇌증, 두개척추파열, 선천성 녹내장, 백내장, 감음 신경성 청력 손실, 및 대상의 임의의 조직, 기관 또는 계, 예를 들어, 뇌, 부신, 신장, 골격계 또는 생식계에 포함되는 세포 성장 및 분화, 배아발생, 및 형태발생과 관련된 임의의 장애, 및 내분비 장애 예컨대 성선기능저하증, 시한 증후군, 요붕증, 칼라만병, 핸드-쉴러-크리스찬병, 렛테러-시웨병, 유육종증, 공터기안 증후군 및 왜소증을 포함하는 뇌하수체 기능저하증과 관련된 장애; 말단비대증, 거인증 및 부적합 항이뇨 호르몬 (ADH) 분비 증후군 (SIADH) 을 포함하는 뇌하수체기능항진증; 및 갑상선종, 점액수종, 박테리아 감염 관련 급성 갑상선염, 바이러스 감염 관련 아급성 갑상선염, 자가면역성 갑상선염 (하시모토병) 및 크레틴병을 포함하는 갑상선 기능 저하증과 관련된 장애; 갑상선 중독증 및 이의 다양한 형태, 그레이브스병, 전경골 점액수종, 중독성 다결절 갑상선종, 갑상선암 및 플러머병을 포함하는 갑상선 기능 항진증과 관련된 장애; 및 콘 질환 (만성 고칼륨혈증) 을 포함하는 부갑상선 기능항진증과 관련된 장애; 호흡기 장애 예컨대 알레르기, 천식, 급성 및 만성 염증성 폐 질환, ARDS, 폐기종, 폐울혈 및 부종, COPD, 간질성 폐질환 및 폐암; 암 예컨대 선암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 골수종, 육종, 기형암종, 및 특히, 부신, 방광, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 자궁경부, 담낭, 신경절, 위장관, 심장, 신장, 간, 폐, 근육, 난소, 췌장, 부갑상선, 음경, 전립선, 타액선, 피부, 지라, 고환, 흉선, 갑상선 및 자궁의 암; 및 면역 장애 예컨대 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS), 에디슨병, 성인 호흡곤란 증후군, 알레르기, 강직성 척추염, 아밀로이드증, 빈혈, 천식, 죽상동맥경화증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 갑상선염, 기관지염, 담낭염, 접촉성 피부염, 크론병, 아토피 피부염, 피부근염, 진성 당뇨병, 폐기종, 림프구세포독소를 갖는 우발성 림프구감소증, 태아적아구증, 결절성 홍반, 위축성 위염, 사구체신염, 굿파스튜어 증후군, 통풍, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 과호산구증가증, 과민성대장 증후군, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심근 또는 심막 염증, 골관절염, 골다공증, 췌장염, 다발성근염, 건선, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 강피증, 쇼그렌 증후군, 전신과민증, 전신성 홍반성 낭창, 전신 경화증, 혈소판감소성 자반병, 궤양성 대장염, 포도막염, 베르너 증후군, 암의 합병증, 혈액투석 및 체외순환, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 원충 및 연충 감염, 및 외상을 포함한다.
예시적 분석 구현예
도 7 - 10 에 관한 하기 토의에서, 상기 토의한 분석의 예시적 구현예를 제공한다.
도 7 은 도 8 - 10 에 대해, 그리고 상기 토의한 바와 같은 추가적 분석에 사용할 수 있는, 상이한 유전자 서열 대상을 도출하는 방법 200 을 설명한다. 방법 200 은 유전자 데이터베이스에 대한 접근을 제공하는 것을 포함하는 단계 210 으로 시작한다. 바람직한 유전자 데이터베이스는 적어도, 한 조직으로부터의 제 1 유전자 서열 스트링, 및 가능하게는 상이한 조직인 두 번째 조직으로부터의 제 2 유전자 서열 스트링을 저장한다. 각각의 유전자 서열 스트링은 바람직하게는 하나 이상의 상응하는 서브스트링을 포함한다.
단계 220 은 가능하게는 네트워크를 통해, 또는 하나 이상의 응용 프로그램 인터페이스 (API) 를 통해 유전자 데이터베이스와 연결되는 서열 분석 엔진에 대한 접근을 제공하는 것을 포함한다. 단계 230 은 바람직하게는, 분석 엔진이 상응하는 서브스트링 중 하나의 하나 이상의 알려져 있는 위치를 사용하여 제 1 및 제 2 유전자 서열 스트링을 점증적으로 동기화시켜 부분적인 정렬을 생성시키는 것을 포함한다. 부분적인 정렬을 생성시키는 것은 여러 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 단계 231 은 유전자 서열 스트링 중 하나 내의 선험적으로 알려져 있는 위치를 기준으로 서브스트링 중 하나 이상을 정렬하는 것을 포함할 수 있다. 추가로, 단계 233 은 서브스트링 중 하나 이상에 대한 알려져 있는 위치를 포함하는 알려져 있는 참조 스트링을 기준으로 서브스트링을 정렬하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 단계 235 는 서브스트링 자체의 길이 미만의 길이를 갖는 윈도우 내 서브스트링을 정렬하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 예는 단계 237 을 포함하는데, 이는 스트링 중 하나 이상의 전체 길이에 걸쳐 유전자 서열 스트링을 반복하여 점증적으로 동기화시키는 것을 포함한다.
부분적인 정렬이 어떻게 얻어지는지에 관계없이, 방법 200 은 단계 240 에서 부분적인 정렬을 사용하여 분석 엔진에 의해 부분적인 정렬 내 유전자 서열 스트링 사이의 부분적으로 상이한 스트링을 계속하여 생성시킨다. 마지막으로, 단계 250 에서 분석 엔진은 부분적으로 상이한 스트링을 사용하여 상이한 서열 데이터베이스에서의 상이한 유전자 서열 대상을 업데이트한다. 상이한 유전자 서열 대상은 이후 추가의 검토 또는 분석에 사용될 수 있다.
도 8 은 예를 들어, 상이한 유전자 서열 대상을 기준으로 건강 관리 서비스를 제공하는 방법 300 을 설명한다. 단계 310 은 저장 장치 (예를 들어 하드 드라이브, 솔리드 스테이트 드라이브, 파일 시스템, 휴대폰 메모리, 메모리 카드 등) 를 포함하는 의료 기록 데이터베이스와 정보적으로 연결되는 분석 엔진에 대한 접근을 제공하는 것을 포함한다. 의료 기록 데이터베이스는 바람직하게는 한 명 이상의 환자에 대한 상이한 유전자 서열 대상을 저장한다.
단계 320 은 분석 엔진이 환자의 상이한 유전자 서열 대상에서의 부분적으로 상이한 스트링의 성좌 또는 부분적으로 상이한 스트링의 존재를 사용하여 환자-특이적 데이터 세트를 생성시키는 것을 포함한다. 추가로, 분석 엔진은 단계 330 에서 환자-특이적 데이터 세트를 기준으로 환자-특이적 지시사항을 생성시킨다. 예를 들어, 분석 엔진은 환자-특이적 데이터 세트 내 환자의 부분적으로 상이한 스트링 속성을 유사한 상이한 스트링을 갖는 알려져 있는 조건에 대해 비교할 수 있다. 따라서 분석 엔진은 가능하게는 진단, 예후, 치료 결과의 예측, 치료 전략에 대한 권고사항, 위험 평가, 처방, 또는 기타 유형의 지시사항을 포함하는 하나 이상의 환자-특이적 지시사항을 생성시킬 수 있다.
상이한 유전자 서열 대상은 또한 도 9 에서 설명한 바와 같은 인구 집단 분석 방법 400 내에서 사용될 수 있다. 단계 410 은 의료 기록 데이터베이스에서 상이한 유전자 서열 대상을 수득하거나 저장하는 것을 포함하고, 이때 상기 의료 기록 데이터베이스는 사람들의 인구 집단 전체에 걸친 정보를 저장한다. 의료 기록 데이터베이스에서의 기록이 인구 집단 속성에 따라 구축된 질의 (예를 들어 인구 통계, 민족성, 질병, 지리, 근로 조건, 노출 등) 에 의해 수득될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 상이한 유전자 서열 대상의 결과 세트는 유럽 혈통의 집 코드 (zip code) 에 거주하고 있는 모든 남성을 표적으로 하는 질의를 제출함으로써 생성될 수 있다. 바람직하게는 의료 기록 데이터베이스는 분석 엔진과 통신적으로 연결된다.
단계 420 은 분석 엔진이 다수의 상이한 유전자 서열 대상 내 부분적으로 상이한 스트링의 성좌를 확인하는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 성좌는 개체 (동일한 지리학적 지역을 방문했던 개체일 수 있음) 의 특정 인구 집단에 대한 부분적으로 상이한 스트링을 포함할 수 있다. 분석 엔진은 또한 성좌에 대한 정보를 포함하는 성좌 기록을 생성시킨다.
단계 430 은 분석 엔진이 성좌 기록을 사용하여 인구 집단 분석 기록을 생성시키는 것을 포함할 수 있으며, 이는 하나 이상의 출력 장치 상에 표시될 수 있다. 예시적 인구 집단 분석 기록은 부성 또는 모성 확인, 계통 정보, 인구 집단 지표, 또는 기타 인구 집단 정보를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서 방법 400 은, 분석 엔진이 의료 기록 데이터베이스 내 환자 관련된 상이한 유전자 서열 대상에서 유래한 개별 환자의 성좌 기록을 하나 이상의 생성된 인구 집단 분석 기록에 대해 비교하는 단계 440 을 포함한다. 따라서 환자의 유전적 상황은 "정규화된" 인구 집단에 대해 비교될 수 있다. 추가로 단계 445 에서, 분석 엔진은 상기 정보로부터 환자-특이적 기록을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 환자 특이적 기록은 특정 인구 집단 내에 속하는 환자의 위험 평가를 포함할 수 있거나, 이전에 토의한 바와 같은 환자 지시사항을 포함할 수 있다.
상이한 유전자 서열 대상의 또 다른 사용을 도 10 의 방법 500 에 의해 나타낸다. 방법 500 은 개인의 상이한 유전자 서열 대상을 사용하여 알려져 있는 참조물에 대한 개인-특이적 편차 프로파일을 유도하는 것을 나타낸다. 단계 510 은, 분석 엔진과 통신적으로 연결되는 의료 기록 데이터베이스에 참조 상이한 유전자 서열 대상을 저장하는 것을 포함한다. 참조 상이한 유전자 서열 대상은 인구 집단 또는 인구 집단 부분, 표준형 개인, 또 다른 개인, 또는 기타 유형의 참조물에 대한 통계적 평균일 수 있다.
단계 520 은 분석 엔진이 하나 이상의 개인의 상이한 유전자 서열 대상과 하나 이상의 참조 상이한 유전자 서열 대상 사이의 편차를 계산하는 것을 포함한다. 분석 엔진은 또한, 편차를 기술하는 속성을 포함하는 편차 기록으로 상기 편차를 변환시킬 수 있다. 편차 기록이 편차의 하나 이상의 규모에 관한 정보 (예를 들어 차이 수, 차이 길이 등) 를 포함할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
단계 530 에서 분석 엔진은 편차 기록을 사용하여 개인-특이적 편차 프로파일을 생성시킨다. 분석 엔진은 원하는 포맷에 따른 프로파일을 나타내도록 하나 이상의 컴퓨팅 장치를 추가 구성할 수 있다. 일부 구현예에서, 편차 프로파일은 일반인이 판독하기에 용이한 그래픽 방식으로 개인에게 표시될 수 있으나, 표시된 정보는 유전학자, 의사, 보험 회사 또는 기타 독립체에게 제시될 때 보다 복잡해질 수 있다.
본 발명은, 단지 본 발명의 특정 양태 및 구현예의 설명 목적으로 포함되며 제한하는 목적은 아닌 하기의 실시예를 참조로 보다 쉽게 이해될 것이다.
실시예
실시예 I: 참조 게놈을 통한 데이터세트 동기화
모든 숏-리드는 동일한 참조 게놈에 대해 정렬되어, 참조 게놈이 다수의 관련된 샘플로부터 자연적인 방법으로 서열 데이터를 체계화시키게 한다. BamBam 은 2 개의 숏-리드 서열분석 데이터세트 (하나는 종양으로부터의 것이고 다른 하나는 동일 환자로부터의 매치된 정상 세포 ("생식세포") 임), 및 참조 게놈을 취하고, 이들 데이터세트를 판독하여, 동일한 게놈 위치에 중첩되는 데이터세트 모두에서의 모든 서열이 동시에 처리가능해진다. 이는 이러한 데이터를 처리하기 위한 가장 효율적인 방법인 한편, 직렬화 방식으로 해내기에 어렵거나 불가능할 수 있는 복잡한 분석을 또한 가능하게 하는데, 이때 각각의 데이터세트는 스스로 처리되고, 결과는 이후에 단지 병합된다.
이러한 방법은 2 개 초과의 관련된 서열분석 데이터세트로 쉽게 확장가능하다. 예를 들어, 3 개의 샘플, 매치된 정상, 종양 및 재발 샘플을 서열분석한다면, 상기 방법을 사용하여 종양 & 재발 샘플에 대해 특이적인 변화, 및 재발에 대해서만 특이적인 변화를 탐색할 수 있는데, 이는 재발 종양이 짐작컨대 이것이 유래된 본래 종양으로부터 다소 변화되었다는 것을 제시한다. 또한, 이러한 동일 방법을 사용하여, 어린이, 아버지 및 어머니로부터 주어진 어린이 게놈 서열분석 샘플의 유전된 부분을 측정할 수 있다.
실시예 II: 체세포 및 생식세포 변이 추출
BamBam 이 서열 데이터를 게놈 전체에 걸쳐 동시에 파일 쌍으로 유지시키기 때문에, 종양 및 생식세포 BAM 파일 모두로부터 뿐 아니라 인간 참조물로부터 서열분석 데이터를 필요로 하는 복잡한 돌연변이 모델이 용이하게 실행될 수 있다. 이러한 모델은 생식세포 유전자형 (생식세포 리드 및 참조 뉴클레오티드가 주어짐) 및 종양의 유전자형 (생식세포 유전자형, 단순 돌연변이 모델, 종양 샘플에서의 오염 정상 조직 분율의 추정, 및 종양 서열 데이터가 주어짐) 모두의 동시 확률을 최대화하는 것을 목표로 한다.
최적의 종양 및 생식세포 유전자형을 발견하기 위해서, 하기 식에 의해 정의된 가능성을 최대화하는 것을 목표로 한다:
Figure 112016051389041-pat00001
(1).
상기 식 중에서, r 은 관찰된 참조 대립형질이고, α 는 정상 오염 분율이고, 종양 및 생식세포 유전자형은
Figure 112016051389041-pat00002
및
Figure 112016051389041-pat00003
에 의해 정의된다 (이때,
Figure 112016051389041-pat00004
임). 종양 및 생식세포 서열 데이터는 각각 하기의 리드 세트:
Figure 112016051389041-pat00005
및
Figure 112016051389041-pat00006
로서 정의되며, 관찰 기준은
Figure 112016051389041-pat00007
이다. 모델에서 사용한 모든 데이터는 사용자-정의된 기준 및 맵핑 품질 역치를 초과해야만 한다.
생식세포 유전자형이 주어진 생식세포 대립형질의 확률은 4 개의 뉴클레오티드에 대해 하기와 같이 다항식 (multinomial) 으로서 모델화된다:
Figure 112016051389041-pat00008
.
상기 식 중에서,
Figure 112016051389041-pat00009
은 이러한 위치에서의 생식세포 리드의 총 수이고
Figure 112016051389041-pat00010
는 각각의 관찰된 대립형질을 지지하는 리드이다. 기저 확률 (base probability),
Figure 112016051389041-pat00011
는 독립적인 것으로 추정되며, 유전자형
Figure 112016051389041-pat00012
에 의해 나타내어지는 2 개의 어버이 대립형질 중 어느 하나에서 유래하는 한편, 또한 서열분석기의 대략적인 기준 오류율을 포함한다. 생식세포 유전자형에 대한 사전 확률 (prior) 은 하기와 같이 참조 기준을 조건으로 한다:
Figure 112016051389041-pat00013
.
상기 식 중에서,
Figure 112016051389041-pat00014
는 상기 위치가 동형 참조인 확률이고,
Figure 112016051389041-pat00015
는 이형 참조인 확률이고,
Figure 112016051389041-pat00016
는 동형 비-참조인 확률이다. 이때, 생식세포 사전 확률은 알려져 있는, 유전된 SNP 에 대한 어떠한 정보도 포함하지 않는다.
종양 리드 세트의 확률은 하기와 같은 다항식으로서 다시 정의된다:
Figure 112016051389041-pat00017
.
상기 식 중에서,
Figure 112016051389041-pat00018
은 이러한 위치에서의 생식세포 리드의 총 수이고,
Figure 112016051389041-pat00019
는 종양 데이터세트에서의 각 관찰된 대립형질을 지지하는 리드이며, 각 종양 리드의 확률은 종양 및 생식세포 유전자형 모두에서 유래한 기저 확률의 혼합이고 이는 정상 오염 분율, α 에 의해 하기와 같이 조절되고:
Figure 112016051389041-pat00020
,
종양 유전자형의 확률은 생식세포 유전자형에서의 단순 돌연변이 모델에 의해 정의된다:
Figure 112016051389041-pat00021
.
상기 식 중에서, 돌연변이가 없을 확률 (예를 들어,
Figure 112016051389041-pat00022
) 은 최대치이며 전이 (transition) 확률 (즉, A → G, T → C) 은 전환 확률 (즉, A → T, T → G) 의 4 배일 것이다. 다항 분포에 대한 모든 모델 매개변수, α,
Figure 112016051389041-pat00023
,
Figure 112016051389041-pat00024
,
Figure 112016051389041-pat00025
, 및 기저 확률,
Figure 112016051389041-pat00026
는 사용자 정의가능하다.
선택된 종양 및 생식세포 유전자형,
Figure 112016051389041-pat00027
,
Figure 112016051389041-pat00028
는 (1) 을 최대화시키는 것들이고, 하기에 의해 정의되는 사후 확률은:
Figure 112016051389041-pat00029
추론된 유전자형 쌍에서의 신뢰도를 점수 매기는데 사용될 수 있다. 종양 및 생식세포 유전자형이 상이한 경우, 추정 체세포 돌연변이(들) 는 이의 각각의 신뢰도에 따라 보고될 것이다.
종양 및 생식세포 유전자형 모두의 결합 공산 (joint likelihood) 을 최대화시키는 것은, 특히 하나 또는 둘 모두의 서열 데이터세트가 특정 게놈 위치의 로우 커버리지 (low coverage) 를 갖는 상황에서, 추론된 유전자형 모두의 정확도를 향상시키는 것을 돕는다. 다른 돌연변이 추출 알고리즘, 예컨대 단일 서열분석 데이터세트를 분석하는 MAQ 및 SNVMix 는 비-참조 또는 돌연변이 대립형질의 지지가 낮은 경우 오류를 좀 더 만들어낼 가능성이 있다 (Li, H., et al. (2008) Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores, Genome Research, 11, 1851-1858; Goya, R. et al. (2010) SNVMix: predicting single nucleotide variants from next-generation sequencing of tumors, Bioinformatics, 26, 730-736).
주어진 게놈 위치에서의 모든 리드로부터 대립형질 지지물을 수집하는 것에 추가로, 리드에 대한 정보를 수집하고 (예컨대 가닥이 정방향 또는 역방향인지 여부, 리드 맵, 리드 내 대립형질 위치, 대립형질의 평균 품질 등), 위양성 추출 (false positive call) 을 선택적으로 걸러내는데 사용한다. 대립형질 모두에 대한 대립형질 위치 및 가닥의 무작위 분포가 변이체를 지지하는 것으로 예측되며, 상기 분포가 이러한 무작위 분포로부터 상당히 편중된 경우 (즉, 모든 변이체 대립형질이 리드의 맨 끝 근처에서 발견됨), 이는 변이 추출 (variant call) 이 의심된다는 것을 제시한다.
실시예 III: 전체 및 대립형질-특이적 카피 수
전체 체세포 카피 수는, 종양 또는 생식세포 데이터에서의 커버리지에 따라 윈도우의 게놈 폭을 확장시키고 축소시키는 동적 윈도잉 (dynamic windowing) 접근 방식을 사용하여 계산된다. 상기 방법은 0 폭 (zero width) 의 윈도우로 초기화된다. 종양 또는 생식세포 서열 데이터로부터의 각각의 고유한 리드는 종양 계수, Nt, 또는 생식세포 계수, Ng 로 집계될 것이다. 각 리드의 출발 위치 및 중지 위치는 윈도우 부위를 한정할 것이며, 새로운 리드가 현재 윈도우의 경계를 넘어감에 따라 확장된다. 종양 또는 생식세포 계수가 사용자-정의 역치를 초과하는 경우, 윈도우 크기 및 위치가 기록될 뿐 아니라, Nt, Ng 및 상대 커버리지 Nt 도 기록된다. 국부 리드 커버리지에 따른 Ng 윈도우 크기 맞춤은 로우 커버리지 부위 (예를 들어, 반복 부위) 에서는 큰 윈도우를, 또는 체세포 증폭을 나타내는 부위에서는 작은 윈도우를 생성시켜, 암플리콘의 게놈 해상도를 증가시키고 증폭의 경계를 한정하는 능력을 증가시킬 것이다.
나타낸 바와 같이 (도 2 참조), 생식세포에서 이형으로 간주되는 위치만이 포함되는 것을 제외하고는, 대립형질-특이적 카피 수는 유사하게 계산된다. 이형성은 2 개의 상이한 대립형질을 갖는 것으로 여겨지는 (하나의 대립형질이 각각의 어버이에 의해 주어짐) 생식세포 내 위치로서 정의된다. 다수 및 소수 카피 수는 동일한 게놈 이웃에서의 데이터를 집계하기 위해 전체 카피 수에 대해 상기 기재된 동일한 동적 윈도잉 기술을 사용하여 계산된다. 이형 부위에서의 다수 대립형질은 게놈 위치가 중첩되는 종양 데이터세트에서 최대 수의 지지 리드를 갖는 대립형질로서 본원에서 정의되는 한편, 소수 대립형질은 최소 지지를 갖는 대립형질이다. 종양 및 생식세포 데이터 모두에서의 다수 대립형질로 인한 모든 계수는 다수 카피 수의 계산을 유도하며, 이는 소수 대립형질에 대해서도 유사하다. 다수 및 소수 대립형질 계수는 이후 생식세포 데이터에서의 대립형질 둘 모두의 계수, Ng 에 의해 정규화되어, 다수 및 소수 카피 수가 계산된다.
대립형질-특이적 카피 수는 이형성 손실 (카피-중립 및 카피-손실 모두) 뿐 아니라 단일 대립형질에 대해 특이적인 증폭 또는 결실을 나타내는 게놈 부위를 확인하는데 사용된다. 상기 마지막 사항은 잠재적 질환 유발 대립형질을 구분하는데 있어서 특히 중요한데, 이들이 종양 서열 데이터에서 증폭되거나, 또는 결실되지 않기 때문이다. 또한, 반접합성 손실을 겪는 부위 (예를 들어, 1 개의 어버이 염색체 팔 (arm)) 를 사용하여, 서열분석된 종양 샘플 내 정상 오염물의 양을 직접 추정할 수 있는데, 이는 상기 기재된 생식세포 및 종양 유전자형의 모델링을 향상시키는데 사용될 수 있다.
도 2 는 대립형질-특이적 카피 수 계산의 개관을 보여준다. 생식세포 변이 추출 알고리즘에 의해 측정되는 바와 같이, 이형 유전자형을 갖는 위치는 생식세포 및 종양 서열분석 데이터 모두를 사용하여 측정된다. 이들 위치에 중첩되는 모든 리드가 수집되며, 이형 유전자형에서의 2 개 대립형질 각각에 대한 리드 지지가 종양 및 생식세포 모두에서 발견된다. 다수 대립형질은 최고 지지를 갖는 대립형질인 것으로 측정되며, 다수 카피 수는 생식세포에서의 상기 위치에서의 리드 전체 수에 의해 상기 계수를 정규화시켜 계산된다.
실시예 IV: 유전자형의 위상화 (phasing)
BamBam 은, 종양 내 대규모 게놈 증폭 또는 결실에 의해 유발된 대립형질 불균형을 이용하여, 생식세포에서 발견된 모든 이형 위치를 위상화하고자 한다. 다수 표 염기 추출 (The majority vote base call) 은 종양 서열 데이터에서의 모든 위치에서 선택되어, 종양에 존재하는 위상 반수체형을 구성한다. 다수 표는 숏-리드 풀 (pool) 에서 관찰된 가장 많은 대립형질을 선택하는데, 이는 결실 이벤트 후 종양에 남아 있는 대립형질 또는 증폭 이벤트의 복제된 대립형질을 선별해야 한다. 각각의 위치에서, 생식세포의 대립형질 상태가 또한 확인되는데, 이때 위치는 필요 리드 지지를 갖는 오직 1 개의 대립형질만이 존재하는 경우 동형인 것으로, 그리고 2 개 이상의 대립형질이 필요 리드 지지를 갖는 경우 이형인 것으로 간주된다. 종양의 반수체형이 2 개의 어버이 반수체형 중 하나를 나타내는 것으로 추정되는데, 제 2 의 어버이 반수체형은 종양 반수체형에 속하지 않는 생식세포 대립형질의 서열로서 유래된다. 이러한 절차는 종양 내의 대립형질 비율에 상관없이 게놈 전반에 걸쳐 (genome-wide) 사용되어, 주요 대립형질 (major allele) 과 비주요 대립형질 (minor allele) 사이에 동등하게 나뉘어 있는 부위에서 본질적으로 무작위인 유전자형의 반수체형 지정이 예측된다. 생식세포 서열의 정확한 위상화는 종양 내 단일 게놈 이벤트 (예를 들어, 국지적인 증폭 또는 결실) 로 인한 일관된 대립형질 불균형을 나타내는 부위에서만 일어날 것이다. 종양-유래 반수체형의 인증 (Validation) 은 종양-유래 반수체형을 HapMap 프로젝트 (International HapMap Consortium (2007), Nature, 7164: 851-861) 로부터 이용가능한 위상화된 유전자형에 대해 비교함으로써 이루어질 수 있다.
실시예 V: 페어드 -앤드 클러스터링 (paired-end clustering) 을 사용하는 구조 변이 추론
추정 염색체내 및 염색체간 재배열을 확인하기 위해서, BamBam 은 참조 서열의 비대응 부위에 대한 페어 맵에서의 각각의 리드인 불일치 페어드 리드를 탐색한다. 염색체내 불일치 쌍은 비정상적으로 큰 삽입물 크기를 갖는 것들 (즉, 페어드 리드를 분리시키는 참조물에서의 게놈 거리가 사용자-정의된 역치를 초과함) 또는 부정확한 기원으로 맵핑되는 것들 (즉, 역위) 이다. 염색체간 불일치 쌍은 상이한 염색체에 대해 맵핑되는 페어드 리드에 의해 정의된다. 다른 쌍과 동일한 위치에 대해 정렬하는 모든 불일치 페어드-앤드 리드는, 숏-리드 라이브러리의 준비에 있어서 단지 PCR 증폭 단계의 결과인 다수의 리드에 의해 지지된 추출 재배열이 회피되도록 제거된다. 이러한 방법의 개관을 도 3 에 나타낸다.
모든 불일치 페어드-앤드 리드는 그의 게놈 위치에 따라 클러스터링되어 중단점이 존재하는 것으로 여겨지는 대략적인 게놈 부위를 규정한다. 통합 과정은 추정 중단점의 양측에서의 다른 리드에 중첩되는 고유한 리드를 함께 그룹화하는 것으로 이루어진다. 모든 중첩 리드의 가닥 기원은 또한 매치되거나 페어의 클러스터에 포함되지 않아야만 한다. 클러스터에서의 중첩되는 불일치 쌍의 수가 사용자-정의된 역치를 초과하는 경우, 재배열을 기술하는 중단점이 정의된다. 동일 위치에서 생식세포 및 종양 데이터세트 둘 모두에 재배열이 존재하는 경우, 이는 하기와 같이 비교된다. 생식세포 재배열은 종양 및 생식세포 데이터세트가 동일한 재배열을 지지하는 것을 필요로 하는데, 이는 생식세포에서 관찰된 구조 변이가 종양에서 어딘가 반전되어 참조물과 정확히 일치할 가능성이 대단히 낮기 때문이다. 한편, 체세포 재배열은 오직 종양 서열분석 데이터에서만 관찰되어야 하며, 생식세포 데이터세트에는 실질적으로 존재하지 않는다. 이러한 요건을 충족하는 재배열은 후-처리 분석 및 시각화를 위해 저장되는 한편, 이를 충족시키지 않는 재배열은 서열분석 기기, 샘플 준비 (예컨대 전체 게놈 증폭), 또는 사용한 숏-리드 맵핑 알고리즘의 체계적 편향에 의해 유발된 인위적 재배열로서 폐기된다.
도 3 은 구조 변이 추출의 개관을 보여준다. 추정 구조 변이의 초기 확인은 불일치적으로 맵핑된 리드 쌍을 사용하여 BamBam 에 의해 확인되는데, 이때 리드 모두는 참조 게놈에 대해 완전히 맵핑되지만, 비정상적인, 비-참조 방식으로 수행된다. BamBam 에 의해 발견된 추정 중단점은 이후 임의의 이용가능한 분할-리드 (split-read) 를 사용하여 bridget 으로 지칭되는 프로그램에 의해 정밀화된다.
실시예 VI: 분할-리드를 사용하는 구조 변이의 정밀화 (refinement)
BamBam 에 의해 초기에 발견된 중단점은, 본래, 중단점의 실제 접합부에 중첩될 수 없는 완전히 맵핑된 리드를 사용하는 점에 있어서 대략적인데, 이는 참조물 (또는 생식세포 데이터세트, 체세포 재배열의 경우) 에 존재하지 않는 서열을 나타내기 때문이다. 중단점 위치에 대한 지식을 정밀화하기 위해서, Bridget 으로 지칭되는 프로그램을 개발하였으며, 이를 도 4 에 요약하였다.
Bridget 은 BamBam 에 의해 발견된 대략적인 중단점을 제공하며 완전히 맵핑된 메이트 (mate) 에 의해 추정 중단점 근처에 고정되는 모든 비정렬된 (unaligned) 리드를 탐색한다. 이들 비맵핑된 (unmapped) 리드 각각은 재배열의 중단점 접합부에 중첩되는 "분할 리드" 일 가능성을 갖는다. 중단점 양측을 둘러싸는 국부화 게놈 서열은 고유 타일 한 세트 (현재 타일 크기 = 16bp) 로 분해되고, 타일 서열의 타일 데이터베이스 및 참조 게놈 내 그의 위치가 만들어진다. 리드를 동일 크기의 타일로 분해시키고 리드 내 그의 위치를 기록함으로써, 유사한 타일 데이터베이스가 각각의 비정렬된 리드에 대해 구축된다. 참조 타일 데이터베이스와 비정렬된 타일 데이터베이스를 비교하여, 참조물 내 각각의 비정렬된 타일의 게놈 위치를 측정한다. 중단점 양쪽에 대한 것인, 참조물 및 비정렬 리드 모두에서 인접한 타일의 최대 세트를 측정함으로써 이들 위치의 "이중 포괄 세트 (Dual spanning set)" 가 계산된다.
참조물 좌표에서의 "이중 포괄 세트" 의 최소 및 최대 게놈 위치로, 중단점 위치 뿐 아니라 서열의 배위 (또는 꼬임(strandedness)) 가 정확히 측정된다. 중단점의 좌측 및 우측 경계를 기술하는 정보로, 재배열된 서열이 완전히 정의되는데, 즉, 좌측면은 [염색체 = chr1, 위치 = 1000bp, 가닥 = 정방향] 으로 정의되고, 우측면은 [염색체 = chr5, 위치 = 500,000bp, 가닥 = 역방향] 으로 정의된다. 중단점의 서열 상동성 (즉, 짧은 서열, 예컨대 "CA" 는 중단점 두 경계 모두에서 동일한 것으로 관찰되나, 두 서열의 접합부에서의 정렬 리드에서 단 1 회 관찰됨) 은 또한 이들 이중 포괄 세트로부터 측정된다.
각각의 비정렬된 리드에 대해서, 이중 포괄 세트로 중단점의 잠재적 위치가 측정된다. 각각의 비정렬된 리드로 중단점에 대한 약간 상이한 위치 (중단점 근처의 서열 오류, 반복 참조물 등으로 인함) 를 측정할 수 있기 때문에, 이중 포괄 세트로부터 측정된 모든 중단점 위치는 가능한 접합부 서열을 생성시키는데 사용된다. 모든 비맵핑된 리드는 이들 가능한 접합부 서열 각각에 대해 새로이 정렬되고, 리드가 본래 서열에 대해 얼마나 잘 정렬되는지에 대해서 그의 정렬에서의 전체적 향상이 측정된다. 정렬 스코어에 있어서의 최대 향상을 산출하는 접합부 서열은 참 (true) 재배열에 대한 최상의 후보물로서 판단된다. 이러한 최상 접합부 서열이 정렬 스코어에 있어서 약간의 개선을 산출하거나 개선이 없는 경우, 참 재배열을 나타낼 개연성이 낮으므로 상기 접합부 서열은 폐기된다. 이러한 경우 분할-리드 확인의 결여가, BamBam 에 의해 발견된 본래 구조적 재배열이 인위적일 수 있다는 증거라는 것이 또한 측정될 수 있다.
도 4 는 구조적 재배열이 발생한 게놈에서의 위치를 정확히 확인하기 위한 예시적 방법을 보여준다. 타일 (또는 kmer) 은 잠재적 분할 리드 및 참조 게놈 모두에 대해 측정된다. 이중 포괄 세트가 측정되는데 (상기 도면의 하부에서 두꺼운 적색 및 보라색 상자로서 나타냄), 이는 재배열된 서열을 어떻게 구축하는지를 완전히 정의한다. 이중 포괄 세트는 분할 리드에서의 SNP 또는 서열 오류에 대해 견고 (robust) 하다.
실시예 VII: 종양-특이적 게놈 브라우저
모든 결과 출력물을 BamBam 에 의해 시각화하기 위해서, 도 5 에서 나타낸 바와 같이 단일 종양 샘플에서 발견된 모든 게놈 변이체를 이의 매치되는 정상물에 대해 동시에 디스플레이하는 종양 게놈 브라우저를 개발하였다. 이는 전체 & 대립형질 특이적 카피 수, 염색체내 및 염색체간 재배열, 및 돌연변이 및 작은 삽입-결실 (indel) 을 디스플레이할 수 있다. 이는 선형 및 원형 플롯 모두로 데이터를 디스플레이하는데, 이들 중 원형 플롯이 염색체간 재배열을 디스플레이하는데 훨씬 더 적합하다.
단일 이미지에서 데이터를 함께 디스플레이함으로써, 사용자는 단일 샘플의 데이터를 신속히 탐색할 수 있으며 카피 수 변화와 구조 변이 사이의 관계를 이해할 수 있다. 예를 들어, 큰 염색체내 결실-유형 재배열은 중단점들 사이의 부위에서의 카피 수에 있어서 일치성 감소 (concordant drop) 를 가져야한다. 또한, 카피 수와 함께 돌연변이 데이터를 디스플레이하여, 사용자가 체세포 돌연변이가 이후 증폭되었는지, 또는 야생형 대립형질이 종양에서 결실되었는지를 이해할 수 있게 되는데, 필수 데이터포인트 모두는 이러한 샘플의 종양 형성에 있어서의 게놈 유전자자리 (locus) 의 중요성을 제시한다.
도 5 는 예시적인 종양-특이적 게놈 브라우저를 보여준다. 상기 브라우저는 BamBam 에 의해 발견된 모든 고수준 체세포 차이를 단일 이미지로 보여주어, 다수의 별개 데이터세트를 합성하여 종양의 게놈의 전반적 그림이 제공될 수 있게 한다. 브라우저는 상기 보여준 바와 같이, 단지 몇 번의 클릭만으로 전체 게놈 관점으로부터 단일 염기 해상도로 게놈 부위를 빠르게 확대 및 축소할 수 있다.
실시예 VIII: 컴퓨터 요건
BamBam 과 Bridget 모두 C 로 작성되어, 오직 표준 C 라이브러리 및 최신 SAMtools 원시 코드를 필요로 한다 (http://samtools.sourceforge.net 에서 이용가능). 이는 클러스터 전체에 걸친 일련의 작업 (예를 들어, 염색체 당 하나의 작업) 으로 분해되거나 단일 과정으로 실행될 수 있다. 각각 수천억 bp (billions of 100bp) 리드를 포함하는 한 쌍의 250GB BAM 파일을 처리하여, BamBam 은 단일 과정으로서 대략 5 시간에, 또는 보통의 클러스터 (24 노드) 에서 약 30 분에 이의 전체-게놈 분석을 마칠 것이다. BamBam 의 컴퓨터 요건은 경미한 것이며, 단지 단일 게놈 위치에 중첩되는 리드 데이터를 저장하기에 충분한 RAM 및 종양 또는 생식세포 게놈에서 발견된 잘 지지된 변이를 저장하기에 충분한 디스크 공간을 필요로 한다.
Bridget 은 또한 크게 중요하지 않은 컴퓨터 요건을 갖는다. 단일 기기에서의 실시 시간 (runtime) 은 통상 1 초 미만이며 이는 중단점 부근의 임의의 잠재적 분할-리드 및 참조 서열을 모으기에 필요한 시간을 포함하고, 참조물 및 분할-리드 모두에 대한 타일 데이터베이스를 만들고, 모든 이중 포괄 세트를 측정하고, 잠재적 접합부 서열을 구축하고, 참조물 및 각각의 접합부 서열 모두에 대해 모든 분할-리드를 재정렬하고, 최상의 접합부 서열을 측정한다. 고도로 증폭되거나 높은 수의 비맵핑 리드를 갖는 부위는 Bridget 의 실행 시간을 증가시키지만, 이는 Bridget 의 용이한 평행성 (parallelizability) 에 의해 완화될 수 있다.
실시예 IX: 게놈 DNA 의 단리
혈액 또는 기타 조직 샘플 (2-3 ml) 을 환자로부터 수집하고 사용시까지 -80℃ 에서 EDTA-함유 튜브에 저장한다. 게놈 DNA 를 제조사의 지시사항에 따라 DNA 단리 키트를 사용하여 (PUREGENE, Gentra Systems, Minneapolis MN) 혈액 샘플로부터 추출한다. DNA 순도를, Beckman 분광계로 측정한 260 nm 및 280 nm 에서의 흡광도 비 (1 cm 광행로; A260/A280) 로서 측정한다.
실시예 X: SNP 의 확인
환자의 DNA 샘플로부터의 유전자 부위를 상기 부위에 대해 특이적으로 디자인된 프라이머를 사용하여 PCR 로 증폭한다. PCR 산물을 상기 개시된 바와 같은 당업자에게 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 서열분석한다. 서열 트레이스 (trace) 에서 확인된 SNP 를 Phred/Phrap/Consed 소프트웨어를 사용하여 확인하고, NCBI SNP 데이터뱅크에 기탁된 알려져 있는 SNP 와 비교한다.
실시예 XI: 통계적 분석
값을 평균 ± SD 로서 표시한다. χ2 분석 (Web Chi Square Calculator, Georgetown Linguistics, Georgetown University, Washington DC) 을 사용하여, 정상 대상 및 장애가 있는 환자에서의 유전자형 빈도 사이의 차이를 평가한다. 사후 검증 (post-hoc analysis) 과 함께 1 방향 ANOVA 를 나타낸 바와 같이 수행하여, 상이한 환자군 사이의 혈류역학을 비교한다.
본원의 발명적 개념을 벗어나지 않고, 이미 기술한 것들 외에 더 많은 변형을 가할 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 그러므로 본 발명의 주제는 첨부된 특허청구범위의 범주를 제외하고는 제한되지 않는다. 또한, 명세서 및 특허청구범위 모두를 이해함에 있어서, 모든 용어는 문맥과 일관적으로 가능한 가장 넓은 방식으로 이해되어야 한다. 특히, 용어 "포함하다" 및 "포함하는" 은 요소, 성분 또는 단계를 비독점적인 방식으로 지칭하는 것으로서 이해되어야 하며, 이는 언급된 요소, 성분 또는 단계가 존재하거나, 이용되거나, 명백히 언급되지 않는 다른 요소, 성분 또는 단계와 조합될 수 있다는 것을 나타낸다. 명세서 특허청구범위에서 A, B, C ... 및 N 으로 이루어지는 군에서 선택되는 어떤 것 중 하나 이상을 지칭하는 경우, 본문은 A + N, 또는 B + N 등이 아닌, 상기 군에서의 오직 하나의 요소를 요구하는 것으로서 이해되어야 한다.

Claims (23)

  1. 하기를 포함하는, 컴퓨터-기반 서열 분석 시스템:
    각각 건강한 조직 및 병든 것으로 의심되는 조직과 관련되고, 각각 건강한 조직 및 병든 것으로 의심되는 조직으로부터의 리드를 포함하는 제 1 디지털 서열 데이터 세트 및 제 2 디지털 서열 데이터 세트를 저장하도록 구성된 컴퓨터 판독 가능 메모리; 및
    컴퓨터 판독 가능 메모리와 연결되고 소프트웨어 명령의 실행 시, 하기를 수행하기 위해 구성되는, 적어도 하나의 프로세서를 갖는 서열 분석 엔진:
    제 1 디지털 서열 데이터 세트 및 제 2 디지털 서열 데이터 세트 내의 공통 서열 위치를 결정하고;
    적어도 한 쌍의 서열 적체물의 리드가 공통 서열 위치에 오버랩하는, 제 1 및 제 2 디지털 서열 데이터 세트로부터 리드의 적어도 한 쌍의 서열 적체물(pileups)을 생성시키고;
    적어도 한 쌍의 서열 적체물의 리드의 함수로서 공통 서열 위치에서의 건강한 조직 및 병든 것으로 의심되는 조직에 대한 유전자형을 추론하고;
    공통 서열 위치에서의 건강한 조직 및 병든 것으로 의심되는 조직의 유전자형 사이의 서열 차이를 확인하고;
    적어도 한 쌍의 서열 적체물 내의 리드에 기반하여 하나 이상의 위양성을 추출하고;
    서열 차이를 상이한 서열 대상(differential sequence object)으로서 저장함.
  2. 제 1 항에 있어서, 제 1 및 제 2 디지털 서열 데이터 세트는 동일한 사람의 조직으로부터 도출되는 시스템.
  3. 제 1 항에 있어서, 제 1 및 제 2 디지털 서열 데이터 세트는 피로부터 도출되는 시스템.
  4. 제 1 항에 있어서, 제 2 디지털 서열 데이터 세트는 종양 조직으로부터 도출되는 시스템.
  5. 제 1 항에 있어서, 제 1 및 제 2 디지털 서열 데이터 세트 중 적어도 하나는 DNA 서열을 포함하는 시스템.
  6. 제 1 항에 있어서, 제 1 및 제 2 디지털 서열 데이터 세트 중 적어도 하나는 RNA 서열을 포함하는 시스템.
  7. 제 6 항에 있어서, RNA 서열이 다음 유형의 RNA 중 적어도 하나를 나타내는 시스템:
    mRNA, rRNA, tRNA, miRNA, 및 asRNA.
  8. 제 1 항에 있어서, 제 1 및 제 2 디지털 서열 데이터 세트 중 적어도 하나는 게놈 서열을 포함하는 시스템.
  9. 제 1 항에 있어서, 제 1 및 제 2 디지털 서열 데이터 세트 중 적어도 하나는 프로테옴 서열을 포함하는 시스템.
  10. 제 9 항에 있어서, 프로테옴 서열은 폴리펩티드 서열을 포함하는 시스템.
  11. 제 1 항에 있어서, 제 1 및 제 2 디지털 서열 데이터 세트는 숏리드를 포함하는 시스템.
  12. 제 1 항에 있어서, 적어도 한 쌍의 서열 적체물은 최대 100 개 위치를 갖는 리드를 포함하는 시스템.
  13. 제 1 항에 있어서, 적어도 한 쌍의 서열 적체물은 30 개 초과의 리드를 포함하는 시스템.
  14. 제 1 항에 있어서, 제 1 및 제 2 디지털 서열 데이터 세트 중 적어도 하나는 적어도 10억개의 리드를 포함하는 시스템.
  15. 제 1 항에 있어서, 위양성은 제 1 및 제 2 디지털 서열 데이터 세트 내 리드의 리드 정보에 기반하여 추출되는 시스템.
  16. 제 15 항에 있어서, 리드 정보는 하나 이상의 하기를 포함하는 시스템:
    리드가 맵핑하는 스트랜드, 리드 내의 대립형질 위치, 및 대립형질의 평균 특성.
  17. 제 1 항에 있어서, 위양성은 대립형질 분포에 기반하여 추출되는 시스템.
  18. 제 17 항에 있어서, 대립형질 분포가 변이체 대립형질이 리드의 꼬리(tail) 근처에서 발견되는 것을 나타내는 시스템.
  19. 제 17 항에 있어서, 위양성은 대립형질 분포가 예상된 분포로부터 편중될 경우 추출되는 시스템.
  20. 제 19 항에 있어서, 예상된 분포는 무작위 분포인 시스템.
  21. 제 1 항에 있어서, 상이한 서열 대상이 적어도 하나의 변이 추출(variant call)을 포함하는 시스템.
  22. 컴퓨터 판독 가능 메모리 및 서열 분석 엔진을 포함하는 컴퓨터-기반 서열 분석 시스템을 이용하는 방법으로서, 하기를 포함하는 방법:
    컴퓨터 판독 가능 메모리 내에 각각 건강한 조직 및 병든 것으로 의심되는 조직과 관련되고, 각각 건강한 조직 및 병든 것으로 의심되는 조직으로부터의 리드를 포함하는 제 1 디지털 서열 데이터 세트 및 제 2 디지털 서열 데이터 세트를 저장하고;
    제 1 디지털 서열 데이터 세트 및 제 2 디지털 서열 데이터 세트 내의 공통 서열 위치를 결정하고;
    적어도 한 쌍의 서열 적체물의 리드가 공통 서열 위치에 오버랩하는, 제 1 및 제 2 디지털 서열 데이터 세트로부터 리드의 적어도 한 쌍의 서열 적체물(pileups)을 생성시키고;
    적어도 한 쌍의 서열 적체물의 리드의 함수로서 공통 서열 위치에서의 건강한 조직 및 병든 것으로 의심되는 조직에 대한 유전자형을 추론하고;
    공통 서열 위치에서의 건강한 조직 및 병든 것으로 의심되는 조직의 유전자형 사이의 서열 차이를 확인하고;
    적어도 한 쌍의 서열 적체물 내의 리드에 기반하여 하나 이상의 위양성을 추출하고;
    서열 차이를 상이한 서열 대상(differential sequence object)으로서 저장함.
  23. 적어도 하나의 프로세서에 의해 실행될 때, 적어도 하나의 프로세서가 하기를 수행하도록 하는 소프트웨어 명령들을 저장하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체:
    저장 장치로부터, 각각 건강한 조직 및 병든 것으로 의심되는 조직과 관련되고, 각각 건강한 조직 및 병든 것으로 의심되는 조직으로부터의 리드를 포함하는 제 1 디지털 서열 데이터 세트 및 제 2 디지털 서열 데이터 세트를 검색하고;
    제 1 디지털 서열 데이터 세트 및 제 2 디지털 서열 데이터 세트 내의 공통 서열 위치를 결정하고;
    적어도 한 쌍의 서열 적체물의 리드가 공통 서열 위치에 오버랩하는, 제 1 및 제 2 디지털 서열 데이터 세트로부터 리드의 적어도 한 쌍의 서열 적체물(pileups)을 생성시키고;
    적어도 한 쌍의 서열 적체물의 리드의 함수로서 공통 서열 위치에서의 건강한 조직 및 병든 것으로 의심되는 조직에 대한 유전자형을 추론하고;
    공통 서열 위치에서의 건강한 조직 및 병든 것으로 의심되는 조직의 유전자형 사이의 서열 차이를 확인하고;
    적어도 한 쌍의 서열 적체물 내의 리드에 기반하여 하나 이상의 위양성을 추출하고;
    서열 차이를 상이한 서열 대상(differential sequence object)으로서 저장함.
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