KR102017078B1 - 매실을 이용한 복령 균사체 배양액 추출물의 피부 미백용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 매실 분말을 첨가하여 배양된 복령 균사체 추출물을 유효 성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따라 제조된 복령 균사체 추출물은 버섯 균사체로부터 유래한 것으로, 인체에 대한 부작용이나 독성이 없어서 안전하게 적용될 수 있다. 따라서 본 발명에 따라 제조된 복령 균사체 추출물을 사용하여 종래 사용되었던 피부 미백용 소재를 대체할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

매실을 이용한 복령 균사체 배양액 추출물의 피부 미백용 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION FOR SKIN WHITENING OF PORIA COCOS CULTURE EXTRACT USING JAPANESE APRICOT}

본 특허출원은 대한민국 농림축산식품부의 "농생명산업기술개발사업"의 일환으로서 "매실발효를 통한 추출물의 유용성분(유기산 등)/대사체 확보 및 이를 활용한 화장품 소재 개발"(주관기관: 순천대학교, 과제번호: 316009-05-1-SB050) 과제의 수행 결과물에 관한 것이다.

본 발명은 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 천연 추출물을 유효 성분으로 함유하여 독성이 없고 인체에 무해한 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부 노화(skin aging)를 크게 분류하면, 나이가 들어감에 따라 자연스럽게 발생하는 내인성 노화 (Intrinsic aging)와, 햇빛의 지속적인 누적된 노출에 의해 유발되는 광노화(Photoaging)가 있다. 이 중에서 광노화는 피부 노화의 주된 원인으로 최근 급격하게 변화하는 산업화와 환경오염으로 인해 오존층이 파괴되어 자외선 조사량이 심각하게 방출됨으로써 증가하고 있는 추세이다.

인체의 피부는 외부 환경으로부터 인체를 보호하며 생화학적으로 중요한 기능을 하는 조직이다. 피부는 크게 표피(epidermis), 표피 아래의 진피(dermis/corium) 및 피하(hypodermis)로 구분될 수 있다. 표피는 위쪽에서부터 각질층(stratum corneum), 과립층(granular layer), 유극층(stratum spinosum), 기저층(stratum basal)으로 구분되며, 진피는 유두층(papillary layer)과 그물층(망상층, reticular layer) 등으로 구분될 수 있다.

한편, 멜라닌은 자연계에 널리 존재하는 페놀계의 고분자 화합물로서 피부의 표피층에 존재하는 검은 색소이다. 멜라닌은 자외선(UV)의 빛에너지를 흡수하여 UV에 의한 손상으로부터 피부를 보호하고, 피부 생체 내에 생긴 아민, 유리기, 유해산소 및 프리라디칼 등을 잡아주는 등 외부 유해인자로부터 피부를 보호한다.

자외선 (Ultraviolet; UV)은 태양에서 발생되는 400 ㎚ 이하의 파장을 가지는 광선으로 생체에 많은 변화를 가져온다. 피부의 생리적 기능과 관련해서, UV는 진피의 유두층과 그물층까지 영향을 미칠 뿐만 아니라, 탄력소(elastin)와 아교질(collagen)을 붕괴시킴으로써, 피부의 탄력 감소, 조기 노화, 모세혈관의 확장 및 손상을 야기하여, 피부의 기저층을 와해시키며, 피부암 발생 가능성도 높아진다.

모발 역시 태양 광선에 노출되면 건조해지고, 강도가 감소되며, 표면이 거칠어지고 쉽게 부서지게 된다. 이렇게 태양 광선에 의한 광화학적 분해는 모발이나 피부 단백질과 멜라닌에 자극을 주어 내부 세포, 세포막 혼합체, 멜라닌의 파괴가 일어나게 된다. 멜라닌은 검은 색소와 단백질의 복합체이며 사람의 머리카락과 피부색을 이루는 색소로서 양이 많으면 피부색이 황갈색에서 흑갈색을 띄고 양이 적을수록 색이 엷어지게 된다.

멜라닌의 경우 외부 환경, 자외선으로부터 피부세포를 보호하는 역할을 하지만, 과도한 자외선 노출이나 피부 노화로 인해 멜라닌이 과잉생성 될 경우 피부에 색소가 침착되어 기미, 주근깨를 형성하며 멜라닌 전구물질의 독성으로 피부암의 원인이 되기도 한다. 따라서 이러한 색소 침착 현상을 방지하기 위해서는 멜라닌 생성 과정의 일부분을 저해하여 멜라닌의 생성을 감소시켜야 한다.

멜라닌을 만드는 세포인 멜라노사이트(melanocyte)는 표피의 맨 밑에 위치하는 기저층에 존재하는데, 자외선 과다로 피부가 자극을 받으면 타이로시네이즈(tyrosinase)라는 효소가 멜라노사이트 내의 타이로신(tyrosine)을 산화시키고, 산화된 타이로신은 멜라닌을 만든다. 새로 만들어진 피부 세포가 오래된 피부세포를 밀어 올리면서 오래된 세포는 각질이 되어 떨어져 나가는데, 생성된 멜라닌을 함유한 새 피부세포가 표피의 유극층과 과립층을 거쳐 각질층으로 올라오면서 피부가 검게 보인다. 인체 내에는 멜라닌을 분해하는 효소가 없기 때문에, 각질 세포(keratinocyte)가 표피에서 떨어져 나갈 때 멜라닌이 같이 피부에서 떨어져 나가 제거된다.

이때, 멜라닌의 생합성에서 가장 중요한 단계는 타이로시네이즈(tyrosinase)의 촉매작용을 통하여 일어나는 초기 반응으로 표피의 기저층에 존재하는 멜라노사이트(melanocyte) 내의 멜라노좀(melanosome)이라는 소포체에서 먼저 tyrosinase, tyrosinase related protein-1(TRP-1)과 도파크롬 타우토머레이즈(dopachrome tautomerase; DCT)등의 효소에 의해 생성된다.

이 중에서도 앞서 언급된 tyrosinase는 멜라닌 생성의 첫 단계를 일으키는 중요한 효소로, 타이로신이 3,4-디하이드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxy phenylalanine; DOPA/도파)을 경유하여, 도파퀴논(DOPAquinone)으로 전환되고, 도파퀴논으로부터 자동 산화 반응과 효소 반응으로 도파크롬(DOPAchrome)을 거쳐 흑갈색의 공중합체인 멜라닌을 생성하게 된다.

현재 과도하게 생성된 멜라닌의 부정적인 기능 때문에 미백제의 개발에 있어서, 멜라닌 생합성 대사에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 그 중에서도 멜라닌 생성의 주요 효소인 타이로시네이즈 (tyrosinase) 활성을 저해함으로써 멜라닌 생성을 억제시켜 미백 효과를 유도할 수 있다.

피부 미백과 관련하여, 특히, tyrosinase 효소 활성을 억제하는 물질로 알려진 코지산(kojic acid), 알부틴을 비롯한 하이드로퀴논(hydroquinone), 비타민C 및 이들의 유도체와 각종 식물 추출물이 사용되어 왔다. 우리나라 『식품의약품안전처』의 「기능성 화장품 기준 및 시험방법」 고시에 따르면, 피부 미백과 관련한 원료로서, 나이아신아마이드(Niacinamide), 닥나무 추출물, 아스코빌글루코사이드(Ascobyl Glucoside), 아스코빌테트라이소팔미테이트Ascorbyl Tetraisopalmitate, 알부틴(Arbutin), 알파-비사보롤(alpha-bisabolol), 에틸아스코빌에테르(Ethyl Ascorbyl Ether), 유용성 감초 추출물(Oil Soluble Licorice(Glycyrrhiza) Extract) 등을 사용할 수 있다고 언급하고 있다.

이들 성분은 ⅰ) 피부세포에서 멜라닌을 만드는데 관여하는 효소인 타이로시네이즈가 활성화되는 것을 억제(닥나무추출물과 알부틴, 알파-비사볼롤, 유용성감초추출물), ⅱ) 타이로시네이즈 효소에 자극받은 타이로신이 산화되는 것을 방지(아스코빌글루코사이드, 에틸아스코빌에테르, 아스코빌테트라이소팔미테이트), ⅲ) 생성된 멜라닌이 멜라노사이트에서 각질 형성 세포로 넘어가는 단계를 억제(나이아신아마이드)하는 방법으로 피부 미백에 효과를 갖는 것으로 알려져 있다.

그러나 이런 물질들은 불안정하여 분해나 착색, 이취, 효과의 불분명, 피부와 제형 안전성 등의 문제가 제기되고 있으며, 돌연변이 유발 및 세포 독성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다. 따라서 기존 미백제가 갖고 있는 여러 단점을 극복하고자 최근에는 피부에 안전한 천연물을 이용한 미백 소재에 대한 연구 및 개발이 진행되고 있다.

본 발명의 목적은 생체에 대한 독성이 없어 인체에 안전하게 적용될 수 있는 천연 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명은 매실 분말을 첨가하여 배양된 복령(Poria cocos) 균사체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

일례로, 상기 매실 분말은 상기 복령 균사체의 배양용 배지 중에 0.1 내지 10%(w/v)의 농도로 첨가될 수 있다.

또한, 상기 복령 균사체의 추출물은 상기 복령 균사체의 배양액에 물, C₁~C₅ 알코올, 글리콜 및 이들의 조합으로 구성되는 추출 용매를 1:3 내지 3:1의 중량비로 가하여 얻어지는 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 복령 균사체의 원균이 배양액에 대하여 1 내지 20 mL/L의 농도로 접종될 수 있다.

또한, 상기 피부 미백용 화장료 조성물 중에 상기 복령 균사체의 추출물이 100 내지 1000 ㎍/mL의 농도로 함유될 수 있다.

본 발명에 따라 매실 분말을 첨가하여 배양된 복령 균사체의 추출물은 미백 효과가 탁월하여 피부 미백용 화장료 조성물의 유효성분으로 첨가될 수 있다.

본 발명에 따른 유효성분은 생명체에서 추출되어, 인체에 대한 아무런 독성이 없이 안전하게 사용될 수 있다. 따라서 종래 피부 미백 화장료 중에 사용되었던 알부틴 등의 성분을 대체하여 산업적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 복령 균사체 추출물을 제조하는 공정을 개략적으로 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 제조된 복령 균사체 추출물의 버섯 타이로시네이즈(mushroom tyrosinase)의 저해 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 제조된 복령 균사체 추출물의 흑색종양(멜라노마, melanoma) 세포에 대한 독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 제조된 복령 균사체 추출물의 멜라노마 세포 내 타이로시네이즈(tyrosinase) 활성 저해 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 제조된 복령 균사체 추출물의 멜라닌 생합성 저해 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 필요한 경우에 첨부하는 도면을 참조하면서 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 매실 분말을 첨가하여 배양된 복령 균사체의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장품에 관한 것이다. 도 1은 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 복령 균사체 추출물을 제조하는 공정을 개략적으로 나타낸 순서도이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 복령 균사체 추출물은 매실 분말을 첨가하여 복령 균사체를 배양하는 단계(s110 단계), 배양된 복령 균사체의 추출물을 얻는 단계(s120 단계)를 포함하고, 필요에 따라 복령 균사체 추출물을 1차로 필터링(여과)하는 단계(s130 단계), 여과된 복령 균사체 추출물을 농축/증발(evaporation)시키는 단계(s140 단계), 멸균 단계(s150 단계) 및 냉동 보관하는 단계(s160 단계)를 포함한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물 중의 피부 미백 효과를 발휘하는 유효 성분인 복령(Poria cocos)은 담자균류 민주름버섯목 구멍장이버섯과의 버섯으로서, 소나무 등의 나무뿌리에 기생한다. 균핵(菌核)은 지하에 있는 소나무뿌리에 크기 10∼30cm로 형성되고 둥근 모양 또는 길쭉하거나 덩어리 모양이다. 내부의 색이 흰 것은 백복령, 붉은 것은 적복령이라고 하는데, 본 발명에 따르면 백복령 또는 적복령 균사체를 사용할 수 있다.

복령은 소변을 못보고 배와 전신의 부종, 담음으로 해수, 구토, 설사가 있을 때 및 신경과민에 의한 건망증, 유정에 쓰며 심장부종에도 사용한다. 약리작용으로는 이뇨, 억균작용, 장관이완작용, 궤양예방효과, 혈당강하작용, 심장수축력 증가, 면역증강작용, 항종양작용 등이 보고되었다.

본 발명에 따르면, 매실 분말을 첨가하여 복령을 배양한다(s110 단계). 하나의 예시적인 실시형태에서, 매실 분말은 동결건조하여 보관된 매실 분말을 이용할 수 있으며, 배실 분말은 복령 균사체를 재배하기 위한 배양액(배지)에 0.1 내지 10%(w/v), 바람직하게는 1.0 내지 3.0%(w/v)의 농도로 첨가될 수 있다. 매실 분말의 첨가량이 전술한 범위를 충족할 때, 복령 균사체 추출물의 피부 미백 활성이 우수하다.

이때, 종균으로 접종되는 복령 균사체는 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 실시예에서는 '신농버섯연구소'에서 재배한 복령 균사체 원균(본 명세서에서 신농 균주라 칭하는 경우가 있다)을 이용할 수 있다. 일례로, 복령 균사체의 원균은 배양액에 대하여 1 내지 20 mL/L의 농도로 접종될 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 복령 균사체 원균 절편(대략 3 내지 10 mm 크기)을 접종할 수 있다.

매실 분말이 첨가되어 복령 균사체를 재배하기 위한 생육 배지는 감자 추출 배지(potato dextrose broth)는 물론이고, 그 외에도 현미 배지, 옥수수 배지, 보리쌀 배지, 대두박 배지, 밀 배지, 톱밥 배지(예를 들어 소나무 절단) 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다. 매실 분말이 첨가된 생육 배지에 복령 균사체 원균을 접종한 뒤에 대략 20 내지 30℃, 바람직하게는 25±2℃에서 7일 내지 15일 가량 배양하여, 복령 균사체가 충분히 배양, 재배될 수 있다.

복령 균사체의 배양이 종료되면, 복령 균사체 배양액을 이용하여 추출 공정을 진행함으로써, 복령 균사체의 추출물을 얻을 수 있다(s120 단계). 추출 용매는 특별히 한정되지는 않지만, 물, C₁~C₅ 알코올, 글리콜 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다. 추출 용매로 사용되는 알코올은 50% 내지 100%의 메탄올 및/또는 에탄올을 포함하며, 글리콜은 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜일 수 있다. 바람직하게는 80% 내지 100%의 알코올(예를 들어 발효 주정)일 수 있다.

이때, s110 단계에서 얻어지는 복령 균사체 배양액과, 추출 용매는 1:3 내지 3:1, 바람직하게는 1:2 내지 2:1, 가장 바람직하게는 1:2 내지 1:1의 중량비로 배합될 수 있다. 복령 균사체 배양액에 대하여 추출 용매의 함량이 3:1 미만인 경우, 추출이 충분히 이루어지지 않을 수 있으며, 복령 균사체 배양액에 대하여 추출 용매의 함량이 1:3을 초과하더라도 추출 효과는 상승하지 않으며, 후술하는 농축 등에서 과량의 추출 용매를 제거하여야 하기 때문에 생산성의 저하를 일으킬 수 있다.

예를 들어, 복령 균사체 추출물은 온침 추출물, 냉침 추출법 또는 열 추출법 등을 사용하여 얻어질 수 있으며, 통상적인 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 일례로, 전술한 추출 용매를 사용하여 50 내지 100℃에서 1 내지 20시간 가열 추출하여 얻어질 수 있거나, 추출 용매를 5 내지 30℃에서 1 내지 10일간 침적시켜 얻어질 수 있다. 필요한 경우, 복령 균사체의 추출 효율을 높이기 위하여 추출 과정을 수회 이상 반복 수행할 수 있다.

필요한 경우, 상기 추출 용매로 추출한 추출물은 이후, 헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 분획 과정을 더욱 실시할 수 있다.

전술한 복령 균사체 추출물 또는 분획 과정을 수행하여 수득한 복령 균사체 추출 분획물에 대하여 1차로 여과지를 이용하여 필터하고(s130 단계), 1차 여과된 복령 균사체 추출물/추출 분획물은 농축 또는 건조 과정을 수행하여 추출 용매/분획 용매를 제거할 수 있다(s140 단계). 일례로, 1차 필터는 여과지를 이용하거나 감압 여과기를 이용할 수 있으며, 상기 농축은 감압 농축기, 일예로 회전 증발기를 이용하여 감압농축할 수 있으며, 상기 건조는 일예로 동결건조법으로 수행할 수 있다.

아울러, 필요한 경우 농축 공정(s140 단계)이 완료된 복령 균사체 추출물/분획물에 대하여 2차로 멸균 멤브레인 필터와 같은 멸균 필터를 이용한 2차 필터 과정이 수행될 수 있으며(s150 단계), 복령 균사체 추출물은 사용 시까지 급속 냉동고(deep freezer)에 보관할 수 있다(s160 단계).

즉, 본 발명에 따라 매실 분말을 첨가하여 배양한 복령 균사체의 추출물은 전술한 과정을 통해 수득된 추출액을 농축 및 동결건조를 통하여 수분을 완전히 제거시킨 것일 수 있으며, 상기 수분을 완전히 제거시킨 복령 균사체 추출물은 분말형태로 사용하거나 상기 분말을 증류수 또는 통상의 용매에 녹여 사용할 수 있다.

본 발명의 예시적인 실시예에 따르면, 매실 분말을 첨가하여 배양시킨 복령 균사체 추출물은 버섯 타이로시네이즈(mushroom tyrosinase)는 물론이고, 멜라닌 합성에 관여하는 타이로시네이즈의 활성을 저해할 뿐만 아니라(도 2 및 도 4 참조), 세포에 대한 독성이 없어서 인체에 무해할 것으로 보이며(도 3 참조), 멜라닌의 생합성을 저해한다(도 5 참조).

타이로시네이즈(Tyrosinase)는 멜라닌 합성 과정에서 속도결정단계인 초기 반응에 관여하는 가장 중요한 효소이다. 또한 멜라닌 합성의 주요한 단계를 나타내는 효소로 타이로신(tyrosine)을 DOPA로 전환하는 tyrosine hydroxylase 활성과 DOPA를 DOPAquinone으로 산화하는 DOPA oxidase 활성을 가지고 있다.

즉, 피부에 멜라닌 색소가 침착되는 것과 관련해서 타이로시네이즈라는 효소에 의한 일련의 산화 과정을 통해 멜라닌 중합체가 과량으로 생성되어 피부에 축적되는 것으로 알려져 있다. 타이로시네이즈는 티로신(Tyr)을 멜라닌 중합체 생성의 중간물질인 도파(DOPA, 3,4-dihydroxy phenylalanine), 도파퀴논(DOPA-quinone)으로 전환시키는 멜라닌 생성과정에서 가장 중요한 효소이다. 본 발명의 예시적인 실시형태에 따르면, 본 발명에 따라 얻어진 복령 균사체 추출물은 멜라닌이 생성되는 초기 과정에 관여하는 티로시나아제의 활성을 억제하기 때문에, 피부 미백을 위한 유효성분으로 사용될 수 있다. 예시적인 실시형태에 따라, 본 발명의 화장료 조성물 중에 상기 유효 성분은 100 내지 1000 ㎍/mL의 농도로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 피부 미백용 화장료 조성물은 피부 미백을 위한 유효성분으로서 매실 분말을 첨가하여 배양시킨 복령 균사체 추출물 이외에도, 통상적으로 화장품에 배합되는 다른 성분을 배합할 수 있다. 첨가될 수 있는 배합 성분으로는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면활성제, 유기 및 무기 안료, 유기분체, 자외선흡수제, 방부제, 살균제, 산화방지제, 항산화제, 식물추출물, pH 조정제, 알코올, 발포제, 충전제, 자외선 흡수제, 안료, 착색제, 겔화제 또는 농축제, 향료, 혈행촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계유지, 실리콘계유지, 불소계유지, 동물유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬,트리(카프릴,카프린산)글리세릴,트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜,디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜,디카프릴산프로필렌글리콜,디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸,시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸,말산디이소스테아릴,히드록시스테아르산2-에틸헥실,숙신산디2-에틸헥실,아디핀산디이소부틸,세바신산디이소프로필,세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴,이소스테아르산피트스테릴,올레인산피트스테릴,12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산공중합체, 알킬변성실리콘유, 아미노변성실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유(rice bran oil, rice germ oil, 항산화), 밀겨유(wheet germ oil, 항산화), 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유(castor oil), 해바라기유(sunflower seed oil, 항산화), 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀배아유, 시아버터, 월견초유(달맞이꽃, Evening Primrose oil, EPO, 항염), 아르간 나무 유(argan tree oil), 망고 버터(mango butter, 항건조), meadowfoam seed oil, 로즈힙 오일(rose hip oil, 생합성촉진), 홍화유(safflower oil), , 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상라놀린, 경화피마자유, 쉐어버터(shea butter) 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성고분자, 지용성고분자 등을 들 수 있다. 수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제(연화제)로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면활성제로서는 비이온성 계면활성제, 음이온성계면활성제, 양이온성계면활성제, 양성계면활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면활성제로서는 자기유화형모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE ( 폴리옥시에틸렌) 솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POE ㆍPOP ( 폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POE ㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가 대두 인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화가수분해콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면활성제로서는염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린유도체제4 급암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린유도체형, 아미드아민형등의양성계면활성제 등을 들 수 있다. 필요한 경우, 이러한 계면활성제는 유화제 또는 보습제로도 사용될 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체 등의 무기안료; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지등의 유기안료 및 전술한 무기안료와 유기안료의 복합안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산 금속염; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘등의아실아미노산다가금속염; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지 지방산 아실아르기닌 등의N-아실염기성아미노산; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의알파-아미노지방산; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 항산화제를 함유하는 것이 유용할 수 있다. 항산화제의 예로는 비타민, 예컨대, 비타민C 및 그 유도체, 예를 들면, 아스코르빈산초산염, 인산염및팔미트산염; 비타민A 및 그 유도체; 엽산 및 그 유도체; 비타민E 및 그 유도체, 예컨대, 토코페릴아세테이트; 플라본또는플라보노이드; 아미노산, 예컨대, 히스티딘, 글리신, 티로신, 트립토판 및 이들 유도체; 이미다졸, 예컨대, 시스-또는 트란스-유로카닌산 및 이들 유도체; 펩티드, 예컨대, D,L-카르노신, D-카르노신, L-카르노신 및 이들유도체; 카로티노이드 및 카로틴, 예컨대, α-카로틴, β-카로틴; 리코핀; 요산 및 그 유도체; α-히드록시산, 예컨대, 시트르산, 젖산, 말산; α-히드록시지방산, 예컨대, 팔미트산, 피틴산, 락토페린; 스틸벤및그유도체; 만노스 및 그 유도체; 리포닌산 및 그 유도체, 예컨대, 디히드로리포닌산; 페룰라산및 그 유도체; 티올, 예컨대, 글루타치온, 시스테인 및 시스틴이 있다. 비타민A 또는 비타A 팔미테이트(레티놀) 및 비타민E 를 첨가하는 것이 특히 바람직하다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급알코올을 들 수 있다.

발포제로는, 예로 디소듐 N-카르복시에톡시에틸-N-(코코일아미도에틸)아미노아세테이트, 소듐 라우릴 에테르 술페이트, 소듐 라우로일 사르코시네이트(sarcosinate), 트리에탄올아민 라우릴 술페이트 및 소듐코코일 이세티오네이트(isethionate) 및 코코넛 지방산의 혼합물을 언급할 수 있다.

충전제로는, 특히 다우 코닝(Dow Corning)사에서 폴리트랩(Polytrap)의 이름으로 시판중인 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트/라우릴 메타크릴레이트 공중합체와 같은 아크릴 공중합체를 언급할 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산및그염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert -부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐) 벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

통상의 착색제로는 처리 및 무처리된 염료를 사용할 수도 있다.

겔화제 또는 농축제로는, 천연 고무(크산탄 고무), 폴리사카라이드(히드록시프로필메틸셀룰로오스 또는 카르복시메틸셀룰로오스), 카르복시비닐 중합체(카르보머), 아크릴 공중합체, 폴리아크릴아미드 및 특히 세삑(Seppic) 사에서 세피겔(Sepigel) 305의 이름으로 시판중인 폴리아크릴아미드, C₁₃-C₁₄ 이소파라핀 및 라우레트(Laureth)-7의 혼합물, 또는 옥시에틸렌화 메틸글루코오스와 같은 옥시에틸렌화 당 유도체, (베헨산/에이코산 이산) 글리세릴 및 (베헨산/에이코산 이산) 폴리글리세릴-10, 지방산 금속염, 히드록시스테아린산, 덱스트린 지방산 에스테르, 이눌린 지방산 에스테르, 설탕 지방산 에스테르, 아실화 셀루비오스, 디벤질리덴소르비톨, 아미노산계 겔화제, 무수규산, 유기변성점토 광물, 연무상 실리카, 알루미나, 가교형 유기폴리실록산, 폴리에틸렌 왁스 또는 파라핀 왁스 등의 탄화수소 왁스, 카나우바 왁스 또는 칸델릴라 왁스 등의 식물성 왁스, 한천 및 젤라틴 등일 수 있다.

향료의 비제한적인 예는 캠퍼유, 귤오일, 페퍼민트오일, 쟈스민 앱솔루트, 파인오일, 라임오일, 라벤더오일, 로즈오일 및 머스크오일 등일 수 있다. pH 조정제의 비제한적인 예는 에데트산, 에데트산나트륨, 염화나트륨, 쿠엔산, 쿠엔산나트륨, 수산화나트륨, 수산화칼륨 및 트리에탄올아민 등일 수 있다. 색소의 비제한적인 예는 청색 1호, 청색 204호, 적색 3호 및 황색 201호 등일 수 있다. 점도조정제의 비제한적인 예는 폴리비닐알콜(PVA), 메틸셀룰로스(MC), 에틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 히드록시프로필에틸셀룰로스, 이 외의 셀룰로스 유도체, 폴리비닐피릴리돈(PVP), 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 알긴산 또는 이의 염, 카라기난, 퀸스시드 파우드, 알칼리게네스 산생 다당류, 카르복시비닐폴리머, 아크릴산염, 아크릴산폴리머(쇄상형, 가교형) 및 아크릴산ㅇ메타크릴산알킬 공중합체 등일 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 내지 5 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 3 중량%로 배합된다.

본 발명의 화장료 조성물은 화장품 업계에서 통상적으로 제조되는 임의의 제형으로 조제될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 또 하나의 실시형태로서, 본 발명은 상기 화장료 조성물을 포함하는 화장품을 제공한다. 화장품은 예를 들어 「화장품법」에 따라 인체를 청결, 미화하여 매력을 더하고 용모를 밝게 변화시키거나 피부ㅇ모발의 건강을 유지 또는 증진하기 위하여 인체에 바르고 문지르거나 뿌리는 등 이와 유사한 방법으로 사용되는 물품으로서 인체에 대한 작용이 경미한 것으로 정의될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 화장품은 피부 미백 효과를 갖는 기능성 화장품일 수 있다. 본 발명에 따른 화장품은 인체에 적용하였을 때, 피부 미백의 효과를 나타내는 것이 확인되었으므로, 기능성 화장품의 일종이다.

예를 들어, 본 발명에 따른 화장품은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 또는 아이섀도로 제형화된 것일 수 있다.

이하, 예시적인 실시예를 참조하면서 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예에 기재된 발명으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 복령 추출물 제조

매실 분말을 첨가하여 배양시킨 복령 균사체 추출물을 다음과 같이 제조하였다. 복령 원료로서 신농버섯연구소에서 구입한 백복령 균주와, 홍복령 균주를 각각 사용하였으며, 매실의 과육을 동결건조한 분말을 사용하였다. 생육 배지인 감자추출배지(Potato dextrose broth; PDB) 1000 mL을 사용하고, 배양액을 기준으로 매실 과육의 동결건조 분말 0.1%(w/v)을 첨가하고, 복령 균사체 절편 5 mL를 접종한 뒤, 25℃에서 9일 동안 Shaking Incubator에서 배양하였다. 배양된 복령 균사체가 함유된 배양액을 균질화 한 후, 발효 주정과 1:1 비율로 혼합하고, 14℃에서 1일간 Shaking Incubator에서 추출을 수행하였다. 얻어진 추출물을 Wattman 2호 paper filter를 이용하여 여과하였다. 여과된 추출물을 회전진공농축기를 이용하여 농축을 진행하고, 농축된 시료를 멸균 멤브레인 필터(0.45 ㎛)를 이용하여 다시 여과한 후, -80℃에서 보관한 후 차후에 사용하였다. 이하, 실시예 및 비교예에 따라 복령 균사 절편으로부터 배양된 복령 균사체 및 추출물에 대하여 '신농 균주'라고 지칭될 수 있다.

실시예 2 ~ 5 : 복령 추출물 제조

배양액을 기준으로 매실 과육의 동결건조 분말 0.3%(w/v) 첨가(제조예 2), 1%(w/v) 첨가(제조예 3), 3%(w/v) 첨가(제조예 4), 10%(w/v) 첨가(제조예 5)한 것을 제외하고 실시예 1의 절차를 반복하여 복령 추출물을 제조하였다.

비교예 1 : 추출물 제조

배지에 복령 균사체를 첨가하지 않고 매실 분말만을 첨가(비교예 1), 배지에 매실 분말 1%(w/v)을 첨가하지 않고 복령 균사체만을 접종(비교예 2, 배지+신농 균주)한 것을 제외하고 실시예 1의 절차를 반복하여 추출물을 제조하였다.

실험예 1 : 매실 분말 첨가 복령 균사체 추출물의 버섯 타이로시네이즈 활성 저해 측정

실시예 1 내지 5와, 비교예 1 내지 2에서 각각 제조된 추출물과, 양성 대조군으로서 비타민C의 버섯 타이로시네이즈(mushroom tyrosinase) 활성 억제 정도를 측정하였다. 제조된 추출물 비타민C의 농도를 각각 100 ㎍/mL, 300 ㎍/mL, 1000 ㎍/mL로 설정한 뒤에, 각각의 추출물에 대하여 다음과 같은 방법으로 버섯 타이로시네이즈의 활성 저해 정도를 측정하였다. 반응구는 67 mM sodium phosphate buffer (pH 6.8)에 10mM L-DOPA 및 시료 용액의 혼합액에 mushroom tyrosinase(125U/mL)을 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 492nm에서 측정하였다. mushroom tyrosinase 저해활성은 시료 용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

저해율 (%) = ( 1 - 시료 첨가군의 흡광도 / 무첨가군의 흡광도) × 100

본 실험예에 따른 버섯 타이로시네이즈(mushroom tyrosinase)의 저해 활성을 측정한 결과를 도 2에 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 실시예에 따라 매실 분말을 첨가하여 배양한 복령 균사체 추출물에서 버섯 타이로시네이즈의 활성을 저해하는 것을 확인하였다. 특히, 매실 분말을 배양액 대비 1%(w/v) 첨가하여 배양된 복령 균사체 추출물 1000 ㎍/mL에서의 버섯 타이로시네이즈의 활성 저해 정도는, 비타민C 100 ㎍/mL에서의 버섯 타이로시네이즈의 활성 저해 정도와 유사한 것을 확인하였다.

실험예 2 : 세포 생존율 측정

실시예 및 비교예에서 각각 제조된 추출물을 사용하여 멜라노마 세포에 대한 생존율을 측정하여 세포 독성 여부를 확인하였다. 세포 생존율은 CCK-8(Cell Counting Kit-8) 시약을 이용하여 측정하였다. 96-well plate에 B16F0 멜라노마 세포를 1 × 10⁵ cells/well농도로, 인간 섬유아세포인 CCD986SK 세포를 1 × 10⁴ cells/well 농도로 접종한 후, 각 well에 시료를 다양한 농도(100, 500, 1000 ㎍/mL)로 처리하여 세포 생존율을 확인하였다. 투여하여 CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. CCK-8 용액을 첨가하고 3시간 후 micro plate reader(USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 대조그룹과 비교하였다. 본 실험예에 따른 측정 결과를 도 3에 나타낸다. 실시예에 따라 매실 분말을 첨가하여 배양된 복령 균사체 추출물은 고농도로 처리하더라도 멜라노마 세포는 95% 이상의 생존율을 확인하여, 본 실험에 사용하는 시료의 농도에서 독성이 없음을 확인하였다.

실험예 3: 세포 내 타이로시네이즈 활성 저해 효과 측정

외부 자극에 따른 B16F0 세포 내 tyrosinase의 활성에 대하여, 실시예 1 내지 5에 따라 매실 분말을 첨가하여 배양한 복령 균사체 추출물의 영향을 측정하였다. 외부 자극제로 α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone; 1000 ㅅM)을 사용하였으며 세포내 tyrosinase 활성 저해는 Matinez-Esparza의 방법을 변형시켜 측정하였다. 6-well plate에 1 × 10⁶ cells/well로 세포를 분주하고 positive control로 α-MSH를 처리하여 자극하였다. 1시간 후 시료를 처리하였고, 48시간 배양한 후, 세포를 수집하여 1%(w/v) Triton X-100을 함유한 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.5)를 1 mL 가하여 용해하였다. 그 후 원심분리하여 얻은 상등액을 타이로시네이즈 활성과 단백질 정량에 이용하고, cell pellet은 멜라닌 정량에 사용하였다. 96-well plate에 시료 처리 후 얻은 상등액 100 μL를 분주하고 0.2 ㎍/mL 3,4-hydroxyphenylalamine(DOPA)이 첨가된 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 6.5)를 100 μL씩 넣고 37℃에서 2시간 배양한 다음 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 반응은 3회 이상 측정하였다. 본 실험예에 따른 측정 결과를 도 4에 나타낸다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 매실 추출물이나 복령 추출물과 비교해서, 매실 분말을 첨가하여 배양시킨 복령 균사체 추출물은 타이로시네이즈의 활성을 더욱 저해하는 것으로 확인되었다. 일례로. 매실 추출물의 타이로시네이즈 활성 저해율(21.62%±0.01)과 비교해서, 매실 분말을 배지에 0.1%(w/v), 0.3%(w/v), 1%(w/v), 3%(w/v), 그리고 10%(w/v) 첨가하여 배양한 복령 추출물의 타이로시네이즈 활성 저해율은 각각 31.40%±0.01, 33.82%±0.01, 59.44%±0.01, 45.27%±0.02, 그리고 37.98%±0.02로 나타났다. 특히, 매실 분말을 배지에 1%(w/v), 3%(w/v) 첨가하여 배양시킨 복령 추출물에서 타이로시네이즈의 활성이 크게 억제된 것을 확인하였다. 이러한 타이로시네이즈 활성 억제 효과는, 양성 대조그룹으로 사용된 알부틴 1000 ㎍/mL(35.13%±0.00)보다 더 높은 효과를 발휘한 것을 또한 알 수 있다.

실험예 4: 멜라노마 세포 내 멜라닌 생합성 저해 효과 측정

실험예 3에서 Tyrosinase 활성을 측정하는 과정에서 얻은 pellet에 10% DMSO를 함유한 1N NaOH 용액 200 ㎕를 가하고 90℃에서 항온조에서 30분 방치하여 멜라닌을 완전히 용해시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 양은 합성 멜라닌을 사용하여 작성된 표준 검량선에서 구하고, 실험그룹의 멜라닌 양은 대조그룹의 멜라닌 양에 대한 백분율로 계산하였다. 멜라닌 양은 각 well에서 측정한 단백질 농도를 기준으로 ㎍/㎎ protein으로 표기하였다. 본 실험예에 따른 측정 결과를 도 5에 나타낸다.

B16F0 악성 흑색종 멜라노마 세포를 이용한 멜라닌 생합성 저해 효과는 Matinez-Esparza 의 방법을 변형시켜 측정하였다. B16F0 악성 흑색종 멜라노마 세포에 실시예 1-5에서 얻어진 복령 균사체 추출물을 1000 ㎍/mL의 농도로 각각 처리하고 48시간 배양한 다음 멜라닌 생성량을 측정하였다. 실험에 사용한 농도에서 세포 독성은 거의 나타나지 않았으며, 복령 균사체를 배양할 때 첨가한 매실 분말의 첨가 함량에 따라 멜라닌 생성이 감소하였다.

매실 추출물의 경우 약 44%±0.06의 멜라닌 생성감소를 확인하였다. 그러나 매실 분말을 0.1%(w/v), 0.3%(w/v), 1%(w/v), 10%(w/v) 첨가하여 배양한 복령 균사체 추출물에서 멜라닌 생성 감소 효과가 보다 낮았으며, 특히 매실 분말을 3%(w/v) 첨가하여 배양한 복령 균사체 추출물에서 멜라닌 생성 감소 효과가 더 높이 나타난 것을 확인하였다(50.25%±0.01). 특히, 양성 대조군으로 사용된 알부틴이 1000 ㎍/mL에서 42.36%±0.01의 감소율을 보인 것과 비교하여 볼 때, 본 발명에 따라 매실 분말을 첨가하여 배양시킨 복령 발효 추출물은 알부틴 보다 우수한 멜라닌 생성 저해 효과를 나타내는 것으로 나타났다.

상기에서는 본 발명의 예시적인 실시형태 및 실시예에 기초하여 본 발명을 설명하였으나, 본 발명이 전술한 실시형태 및 실시예에 기재된 기술사상으로 한정되지 않는다. 오히려 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 전술한 실시형태 및 실시예에 기초하여 다양한 변형과 변경을 용이하게 추고할 수 있다. 하지만, 이러한 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 사실은 첨부하는 청구범위에서 분명하다.

Claims (5)

1. 매실 분말을 첨가하여 배양된 복령(Poria cocos) 균사체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 매실 분말은 상기 복령 균사체의 배양용 배지 중에 0.1 내지 10%(w/v)의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 복령 균사체의 추출물은 상기 복령 균사체의 배양액에 물, C₁~C₅ 알코올, 글리콜 및 이들의 조합으로 구성되는 추출 용매를 1:3 내지 3:1의 중량비로 가하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
   
4. 제 1항에 있어서,
   상기 복령 균사체의 원균이 배양액에 대하여 1 내지 20 mL/L의 농도로 접종되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
   
5. 제 1항에 있어서,
   상기 피부 미백용 화장료 조성물 중에 상기 복령 균사체의 추출물이 100 내지 1000 ㎍/mL의 농도로 함유되는 피부 미백용 화장료 조성물.

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