KR102012710B1

KR102012710B1 - 피시알-리버스 블랏 교잡 어세이 기반 y 염색체 상에 존재하는 단일 염기 다형성 진단방법 및 그 응용

Info

Publication number: KR102012710B1
Application number: KR1020180000683A
Authority: KR
Inventors: 이혜영; 왕혜영; 임시근; 이경명; 오세희
Original assignee: 연세대학교 원주산학협력단; 대한민국(관리부서: 행정안전부 국립과학수사연구원장)
Priority date: 2018-01-03
Filing date: 2018-01-03
Publication date: 2019-08-21
Also published as: KR20190083123A

Abstract

a)검체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;b)상기 DNA로부터 각각의 프라이머쌍을 이용하여 Y 염색체 하플로그룹(haplogroup) 마커 유전자 단편을 PCR 증폭하는 단계;및 c)상기 Y 염색체 하플로그룹(haplogroup) 마커 유전자 검출용 올리고머 프로브가 부착되어 있는 고체 서포트와 상기 단계 b)에서 얻어진 PCR 증폭산물을 하이브리드 형성시키는 PCR-리버스 블랏 하이브리드형성 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 Y 염색체 상에 존재하는 단일 염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP) 진단을 위한 정보제공방법 및 이 방법에 사용되는 조성물 및/또는 그 키트에 관한 것이다.

Description

피시알-리버스 블랏 교잡 어세이 기반 Y 염색체 상에 존재하는 단일 염기 다형성 진단방법 및 그 응용{A DIAGNOSTIC METHOD FOR SNP IN Y CHROMOSOME USING PCR-REVERSE BLOT HYBRIDIZATION ASSAY AND USE OF THE SAME}

본 발명은 피시알-리버스 블랏 교잡 어세이 기반 Y 염색체 상에 존재하는 단일 염기 다형성 진단방법 및 그 응용에 관한 것이다.

용의자가 없는 미제사건의 해결이나 불상변사자의 신원확인을 위해서는 범죄현장에 남겨진 DNA나 변사자의 DNA를 통해 대상자의 범위를 축소할 수 있는 정보가 필요하다. 이를 위해 법유전학 현장에서는 다양한 유전자 표지자(genetic marker)를 이용하여 미지의 시료로부터 사람이나 동물을 식별하기 위한 연구를 진행하고 있다.

유전자 표지자는 일정한 DNA 서열로 사람 또는 동물에게서 염색체의 알려진 위치를 확인할 수 있는 것이다. 유전자 표지자는 유전자 좌위에 있는 돌연변이나 변형에 의해 일어난 다양성을 보여줄 수 있다. STR(Short tandem repeat, 단연쇄반복)은 현재 법유전학 분야에서 가장 일반적으로 사용되는 유전자 표지자로 상염색체 상에 존재하며 2-4개의 염기가 반복되는 특성을 가지며, 사람마다 그 횟수가 다른 다형성을 갖기 때문에 개인식별에 이용될 수 있다. 어떤 사건 현장에서 수거된 각종 증거물에서 유래한 DNA와 용의자의 DNA를 STR 분석으로 유전자형을 비교하면 범인을 증명하는 중요한 단서가 된다. STR 분석은 개인식별력이 매우 높기 때문에 법유전학에서 가장 일반적으로 사용하는 분석법이지만 용의자를 특정하기 위해서는 STR 정보를 알고 있는 대조 시료가 반드시 필요하다. 따라서 이런 비교분석적인 특성 때문에 완벽히 일치하는 STR 정보가 없는 경우에는 사건 현장의 DNA는 미지의 상태로 남게 되는 한계점을 지닌다. [Committee on Identifying the Needs of the Forensic Sciences Community National Research Council. Strengthening Forensic Science in the United States: A Path Forward. https://www.ncjrs.gov/pdffiles1/nij/grants/228091.pdf, 2009, Santos, F., Machado, H., Silva, S. Forensic DNA databases in European countries: is size linked to performance. Life Sci. Soc. Policy. 2013;9:12.]

이런 한계점을 극복하기 위해서 개발되는 다양한 유전자 표지자 중에서 AIM(ancestry-informative marker)은 서로 다른 지리적 영역에서 서로 다른 빈도로 나타나는 SNP(Single Nucleotide Polymorphism, 단일염기 다형성)로, 다수의 AIM을 분석하면 각 지리적 영역에서 도출된 개인의 조상을 추정할 수 있다.

SNP를 이용한 생물지리학적 기원을 추정하는 마커는 크게 세 가지로 구분되는데, 그 중에서 Y 염색체는 남성에게만 존재하는 성염색체로 부계 혈통 연구에 사용된다. Y 염색체의 끝부분은 pseudoautosomal region으로 X염색체와 재조합이 일어나는 부분이며, 나머지 약 95% 부분은 NRPY(Non-Recombining Portion of Y chromosome)로 X염색체와 교차가 일어나지 않아 부계로 유전되기 때문에, 부계 유전 및 친족 조사, 인류 진화 연구 등 다양한 분야에 이용된다. [Jobling MA, Tyler-Smith C. The human Y chromosome: an evolutionary marker comes of age. Nat Rev Genet. 2003 Aug;4(8):598-612.]

Y염색체 하플로그룹(haplogroup)은 Y-DNA 중에서 유전자 재조합이 발생하지 않는 부분에 하나 이상의 SNP가 발생되어 공통의 선조를 공유하는 집단으로, 크게 A그룹에서 T그룹까지 20개로 구분되며 그 하위 그룹은 대략 2,000개의 그룹이 존재한다. 최근 연구에 의하면 인류 Y 염색체 하플로그룹은 약 600여 개의 SNP로 311여 개의 그룹을 분류할 수 있다. 여러 연구에 의해 하플로그룹의 전 세계 지리적인 지역 분포가 밝혀졌으며 Y 염색체 상의 SNP 조합으로 개체의 하플로그룹을 구분할 수 있다. [Karafet TM1, Mendez FL, Meilerman MB, Underhill PA, Zegura SL, Hammer MF. New binary polymorphisms reshape and increase resolution of the human Y chromosomal haplogroup tree. Genome Res. 2008 May;18(5):830-8]

기존 많은 연구들에 의해서 전세계에 주로 발견되는 하플로 그룹들이 밝혀진 상태로, 유럽에서는 하플로 그룹 K와 R이, 아프리카에서는 A,B,D,E그룹, 아시아에서는 C와 O가 우세하며, 아메리카에서는 K, Q그룹이 많이 나타난다고 알려져 있다. 따라서 하플로 그룹의 추정은 인종이나 국적을 파악하는 용도로 이용될 수 있다(도 1).

그동안 SNP 유전형질 분석을 위해 allelic-specific hybridization, primer extension, allele-specific oligonucleotide ligation, invasive cleavage 등 다양한 방법들이 시도되었고, [Sobrino B, Brion M, Carracedo A. SNPs in forensic genetics: a review on SNP typing methodologies. Forensic Sci Int. 2005 Nov 25;154(2-3)] 특히 최근에는 Y-SNP 유전형질 분석법으로 SNaPshot으로 대표되는 SBE (Single Base Extension)법으로, 타겟 DNA를 증폭시킨 후, 잔여 dNTP와 primer를 제거한 후, ddNTP가 들어있는 SBE reaction kit를 넣어 SNP부위의 단일 염기를 신장시키고 반응을 종결 후, 남은 ddNTP를 제거하고 capillary electrophoresis로 단일 염기의 시퀀싱을 진행하는 방법으로, 결과분석은 소프트웨어를 이용해서 할 수 있고 최대 10개의 snp를 한번에 분석할 수 있다. 또한, 수많은 유전자를 한 번에 분석이 가능한 NGS(Nest Generation Sequencing)법이 이용되고 있다. [Geppert M, Roewer L. SNaPshot® minisequencing analysis of multiple ancestry-informative Y-SNPs using capillary electrophoresis. Methods Mol Biol. 2012;830:127-40, Qian X, Hou J, Wang Z, Ye Y, Lang M, Gao T, Liu J, Hou Y. Next Generation Sequencing Plus (NGS+) with Y-chromosomal Markers for Forensic Pedigree Searches. Sci Rep. 2017 Sep 12;7(1)]

그러나, 기존 법유전학 분야에 이용되는 Y-SNP 유전형질 분석법은 상용화된 제품이 없어서 실험실내 자체적으로 실험을 진행하다 보니 실험 과정이 매우 복잡하고 결과 분석에 고가의 첨단 장비가 필요하다는 단점이 있다. 따라서 시간과 노동력을 줄이기 위해서 Y-SNP 정보를 대략적으로 파악할 수 있는 스크리닝 검사법의 개발이 필요하다.

[선행 특허문헌]

대한민국 특허공개번호 제1020140079665호

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 Y 염색체에 존재하는 SNP 정보를 파악할 수 있는 스크리닝 검사방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 Y 염색체에 존재하는 SNP 정보를 파악할 수 있는 스크리닝 검사방법에 사용되는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규한 Y 염색체에 존재하는 SNP 정보를 파악할 수 있는 스크리닝 검사방법에 사용되는 키트를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a)검체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;b)상기 DNA로부터 각각의 프라이머쌍을 이용하여 Y 염색체 하플로그룹(haplogroup) 마커 유전자 단편을 PCR 증폭하는 단계;및 c)상기 Y 염색체 하플로그룹(haplogroup) 마커 유전자 검출용 올리고머 프로브가 부착되어 있는 고체 서포트와 상기 단계 b)에서 얻어진 PCR 증폭산물을 하이브리드 형성시키는 PCR-리버스 블랏 하이브리드형성 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 Y 염색체 상에 존재하는 단일 염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP) 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 각각의 프라이머쌍은 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍; 서열번호 13 및 14의 프라이머쌍; 서열번호 15 및 16의 프라이머쌍; 및 서열번호 17 및 18의 프라이머쌍으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머쌍인 것이 바람직하고,

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 프라이머쌍은 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍; 서열번호 13 및 14의 프라이머쌍; 서열번호 15 및 16의 프라이머쌍; 및 서열번호 17 및 18의 프라이머쌍으로 이루어진 프라이머쌍 조성물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 서열번호 2의 프라이머; 서열번호 4의 프라이머; 서열번호 6의 프라이머; 서열번호 8의 프라이머; 서열번호 10의 프라이머; 서열번호 12의 프라이머; 서열번호 14의 프라이머; 서열번호 16의 프라이머; 및 서열번호 18의 프라이머는 5'말단에 바이오틴(biotin)이 표지된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 Y 염색체 하플로그룹(haplogroup) 마커는 M217, M175, RPS4Y711, M145, M89, M9, M214m P31, 및 M122인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 올리고머 프로브는 서열번호 19 내지 서열번호 36으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브인 것이 바람직하고,

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 올리고머 프로브는 서열번호 19 내지 서열번호 36으로 이루어진 프로브 조성물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 올리고머 프로브는 5'말단에 아민(amine)이 표지된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍; 서열번호 13 및 14의 프라이머쌍; 서열번호 15 및 16의 프라이머쌍; 및 서열번호 17 및 18의 프라이머쌍으로 이루어진 Y 염색체 상에 존재하는 단일 염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP) 진단용 프라이머 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 19 내지 서열번호 36의 프로브로 이루어진 Y 염색체 상에 존재하는 단일 염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP) 진단용 프로브 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 Y 염색체 하플로그룹(haplogroup) 마커 유전자 단편을 PCR 증폭하는 프라이머쌍 및 Y 염색체 하플로그룹(haplogroup) 마커 유전자 검출용 올리고머 프로브를 포함하는 Y 염색체 상에 존재하는 단일 염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP) 진단을 위한 피시알-리버스 블랏 교잡 어세이용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머쌍은 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍; 서열번호 13 및 14의 프라이머쌍; 서열번호 15 및 16의 프라이머쌍; 및 서열번호 17 및 18의 프라이머쌍인 것이 바람직하고,

상기 올리고머 프로브는 서열번호 19 내지 서열번호 36의 프로브인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 Y염색체의 유전자형의 구별이 가능하도록 PCR-REBA (Reverse blot hybridization assay)법을 개발, 그 유용성을 확인하기 위해, 전 세계적으로 주요한 Y염색체 하플로 그룹을 포함하고 동아시아인에게서 특히 많이 분포하는 하위그룹을 포함하도록 9가지 마커를 선정하여 (도 2), ISOGG의 기준에 따라 phylogenetic tree를 그리면 총 10가지 하플로그룹을 구분이 가능하며, 이 10개 그룹은 전세계 Y하플로그룹 분포에 따라서 African, european과 american, asian으로 추정이 가능하도록 고안하였다. PCR-REBA는 별도의 소프트웨어가 필요없고 간단한 장비와 실험방법으로 진행되며 비교적 저렴하다는 장점이 있는 개발법이다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 Y염색체의 유전자형의 구별이 가능하도록 PCR-REBA (Reverse blot hybridization assay)법은 별도의 소프트웨어가 필요없고 간단한 장비와 실험방법으로 진행되며 비교적 저렴하다는 장점이 있어서, Y 염색체 상에 존재하는 단일 염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP) 진단을 위한 새로운 방법으로 사용될 수 있다.

도 1은 Y염색체 하플로그룹의 계통수,
도 2는 9개의 이중대립 Y SNP 마커,
도 3은 REBA Y-SNP 를 위한 PCR 증폭 산물의 결과. M, 100-bp DNA ladder (Bioneer, Daejeon, South Korea); 1, M217 (386bp), 2, M175 (350bp), 3, RPS4Y711 (350bp), 4, M145 (350bp), 5, M89 (415bp), 6, M9 (340bp), 7, M214 (403bp), 8, P31 (373bp), 9, M122 (372bp),
도 4는 REBA Y-SNP 프로브 검증 그림,
A) 2800M 표준 DNA를 이용한 REBA 결과,
B) REBA에 의한 9개의 Y 유전자의 probe의 교차반응 결과,Lane 1, M217-WT, 2, M217-MT, 3, M175-WT, 4, RPS4Y711-WT, 5, RPS4Y711-MT, 6, M214-WT, 7, M145-WT, 8, M89-WT, 9, M89-MT, 10, M9-MT, 11, P31-WT, 12, M122-WT, 13, Negative control,
C) 표준 DNA를 이용한 REBA의 특이도 결과, A, 남성 표준 DNA를 이용한 REBA결과, B, 여성 표준 DNA를 이용한 REBA 결과,
도 5는 REBA probe 검증을 위한 시퀀싱 결과,
A) M217,
B) M175,
C) RPS4Y711,
D) M145,
E) M89,
F) M9
G)M214,
H) P31,
I) M122,
도 6은 남성 DNA를 이용한 REBA결과

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1.재료

개발된 프라이머와 프로브의 검증을 위해 상용화된 human genomic DNA인 2800M male control DNA (Promega, WI, USA)와 female control DNA 9947A (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) control DNA가 사용되었으며, 임상적 유용성을 평가하기 위해 사용된 남성 DNA 샘플은 총 38개의 다국적 남성 DNA로 국립과학수사연구원로부터 제공받아 테스트되었다.

실시예 2. REBA Y-SNP의 유전자 수집 및 분석

미국 국립생물정보센터 (National center for biotechnology information, NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Genbank에서 표적으로 하는 PCR 프라이머와 올리고뉴클레오타이드 프로브는 M217, M175, RPS4Y711, M145, M89, M9, M214m P31, M122의 9개의 다양한 유전자를 검색하여 염기서열을 수집하였다. 멀티얼라인 (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin)을 수행한 후 표적으로 하는 각각의 유전자들이 공통으로 가지는 염기서열 부위에서 2쌍의 primer를 디자인하였고, 그 중 reverse primer에는 PCR-REBA법을 위해 biotin을 5'말단에 붙였다. 그리고 2쌍의 primer 내부에 존재하는 9개의 Y-SNP 마커의 특이 부위에서 각각의 변이를 검출할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 디자인하였고 각 올리고뉴클레오타이드 프로브에는 얇은 막과 펩타이드 결합을 할 수 있도록 하기 위해 5'말단에 amine기를 붙였다. 디자인한 primer와 올리고뉴클레오타이드 프로브는 바이오니아(대전, 한국)에 합성을 의뢰하였다.

실시예 3. PCR

추출한 각 남성 genomic DNA를 주형으로 상용화된 Prime Taq Premix (2X) (Genet Bio, 논산, 한국)를 이용하여 PCR을 수행하였다. Prime Taq Premix (2X)의 조성은 primer Taq polymerase 1unit/10㎕, 2X reaction buffer, 4mM MgCl2, enzyme stabilizer, sedment, loading dye, pH 9.0, 0.5mM of each dATP, dCTP, dGTP, dTTP이다. PCR을 위한 각 조성은 Prime Taq premix (2X) 10㎕, 한 쌍의 10 pmole primer를 각각 1㎕, ultrapure water 3㎕, 각 남성 및 대조군 genomic DNA 5㎕로 총량을 20㎕로 하였다. PCR 반응은 초기 변성과정을 위해 95℃ 5분, 일차 증폭을 위해 95℃ 30초, 60℃ 30초 반응을 40번 반복 후 완전한 신장반응을 위해 72℃ 10분간 반응시켰다. PCR 반응이 완료된 PCR 산물은 2% TBE (Tris-borate-ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) agarose gene (W/V ratio)에서 290 bolt로 20분간 전기영동하여 ethidium bromide에 10분간 염색 후 자외선 투과조명기로 증폭여부를 확인하였다.

실시예 4. REBA Y- SNP 의 수행

증폭한 PCR 산물을 이용한 REBA Y-SNP는 제조자가 제시한 실험조건을 이용하여 시행하였으며 실험방법은 다음과 같다. PCR 산물에 동량의 Denaturation solution (0.2N NaOH, 0.2mM EDTA)을 섞어 실온에 5분간 반응시켜 이중가닥의 PCR 반응산물을 단일가닥으로 변성하였다. 반응하는 동안 Y 염색체 특이 올리고뉴클레오타이드 프로브가 부착된 얇은 막 REBA Y-SNP membrane에 2X SSPE/0.1% SDS으로 희석시켜 보관 트레이에 넣은 후 50℃에서 30분간 반응시키고, WS (washing solution)을 이용하여 63℃에서 10분간 두 번 씻어준 후 1:2000 (v/v)으로 희석한 alkaline phosphatase-labeled streptavidin conjugate (Roche, Mannheim, Germany)을 처리하여 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 membrane을 CDS (conjugate dilution solution)로 실온에 1분간 2회 세척하고, alkaline phosphatase에 반응하는 발색용 기질 용액인 NBT-BCIP (로슈, 미국) 에 10분간 발색시킨 후 육안으로 나타나는 형광 시그날을 통해 검출 여부를 판단하였다.

상기 실시예의 결과는 하기와 같다.

1 PCR 증폭결과

Y-SNP의 유전형을 확인하기 위한 9가지 유전자에 대한 PCR증폭 결과로, M217 (386bp), M175 (350bp), RPS4Y711 (350bp), M145 (350bp), M89 (415bp), M9 (340bp), M214 (403bp), P31 (373bp), M122 (372bp) 의 유전자들이 각각 해당사이즈에 맞게 증폭됨을 확인할 수 있었다 (도 3)

2. 표준 남성 DNA를 이용한 REBA Y-SNP 프로브 검증 결과

표준 남성 DNA (2800M)을 통해 증폭된 PCR 산물을 이용하여 제작된 Y 유전형에 특이적인 올리고 뉴클레오타이드 프로브의 반응여부를 확인하기 위하여 PCR-REBA를 수행하였으며 표준 남성 DNA는 9개의 유전자 중 M217 WT (Wild type), M175 WT, RPS4Y711 WT, M214 WT, M145 WT, M9 MT (Mutant type), P31 WT, M89 MT로 해당 타겟의 프로브에 반응을 하였으며, 특이도를 확인하기 위하여 여성 control DNA (9947A)를 이용하여 REBA를 수행한 결과 아무것도 나오지 않음을 확인할 수 있었다 (도 4).

또한, Y-SNP의 REBA결과가 일치하는지 검증하기 위해 시퀀싱을 진행하였으며, 모든 유전자가 REBA 결과와 일치하는 것을 확인할 수 있었다 (도 5).

3. 임상 샘플을 이용한 REBA Y-SNP의 유용성 평가

각 마커들에 대한 WT-MT의 유전형을 확인하기 위해 다양한 33명의 남성 DNA 샘플로 PCR-REBA를 진행하여 본 결과 (도 6), REBA결과에 따라 중국계 6명 (C3그룹-1, O2그룹-1, O3그룹-4), 인도네시아계 10명 (O그룹-3, O2그룹-4, O3그룹-3), 한국계 5명 (O2그룹-3, O3그룹-2), 타이계 6명 (K그룹-1, O2그룹-5), 몽골계 4명 (C3그룹-4), 국적을 알 수 없는 7명 (K그룹-4, O2그룹-1, O3그룹-2) 각각의 하플로그룹을 분석할 수 있었다. (표 1).

이 중 7명에 해당되는 샘플에 대하여 상염색체에 존재하는 SNP들을 분석하여 생물지리학적 조상에 대한 정보를 제공하는 시판되는 키트 (ForenSeq DNA Signature Prep Kit, illumina) 와 레바(REBA) 결과를 비교하였으며, 그 결과 상염색체 분석법으로 동아시아인이라고 나온 샘플들은 레바에서 O2그룹 1개와 O3그룹 2개로 분석되었고, 유럽인이라고 나온 4개 샘플은 레바에서 모두 K그룹으로 분류되어 두 결과가 서로 일치하여 REBA의 유용성을 확인할 수 있었다 (표 2)

Nationality	No. (%) of samples	Haplogroup	N (%)
China	6 (15.8)	C3	1 (16.7)
		O2	1 (16.7)
		O3	4 (66.6)
Indonesia	10 (26.3)	O	3 (30.0)
		O2	4 (40.0)
		O3	3 (30.0)
Korea	5 (13.2)	O2	3 (60.0)
Korea	5 (13.2)	O3	2 (40.0)
Thai	6 (15.8)	K	1 (16.7)
Thai	6 (15.8)	O2	5 (83.3)
Mongolia	4 (10.5)	C3	4 (100)
Unknown	7 (18.4)	K	4 (57.1)
		O2	1 (14.3)
		O3	2 (28.6)
Total	38 (100)

표 1은 REBA Y-SNP를 이용한 다국적 남성 DNA의 하플로 그룹의 분석

Autosomal SNPs assay by NGS	PCR-REBA
Autosomal SNPs assay by NGS	No. of O2	No. of O3	No. of K
East Asian	1	2
European			4

표 2는 REBA법과 상염색체 분석법 간의 비교

No.	Marker		Primer sequence (5'-3')	Amplicon size (bp)
1	M217	Forward	TCGTACAGATCTGTTTCGAGATCATTC(서열번호 1)	157
		Reverse	5' biotin- AAGCTGCTGTGGCTTTCATCAA(서열번호 2)
2	M175	Forward	GTACCCAAATCAACTCAACTCCAGT(서열번호 3)	108
		Reverse	5' biotin- TTTTTTCTACTGATACCTTTGTTTCTGTTC(서열번호 4)
3	RPS4Y₇₁₁	Forward	TCTCTCCTCCCTTTCTTTCTGTACTTAC(서열번호 5)	128
		Reverse	5' biotin- AGCCTCTTATCTCTCTCTTCAGCAA(서열번호 6)
4	M145	Forward	TAGCGGCATACTTGCCTCCA(서열번호 7)	109
		Reverse	5' biotin- GCTAGGTTCCTCCCACTCCTT(서열번호 8)
5	M89	Forward	ATCCTATGAGGTGCCATGAAAGTG(서열번호 9)	151
		Reverse	5' biotin- CACTTTGGGTCCAGGATCACC(서열번호 10)
6	M9	Forward	CTTTCAGGACCCTGAAATACAGAACT(서열번호 11)	105
		Reverse	5' biotin- TGTAAGACATTGAACGTTTGAACATGT(서열번호 12)
7	M214	Forward	ACACACTGGAAAGAAAAAGAATGCTG(서열번호 13)	127
		Reverse	5' biotin- AGCCATGGAAATGCCACTTCA(서열번호 14)
8	P31	Forward	TTGGGGAACAGGTAGGTGGTAT(서열번호 15)	122
		Reverse	5' biotin- ATATCGTGCCATTGCACACCAG(서열번호 16)
9	M122	Forward	GTGACTTTGAGAGTCACTTGCTCT(서열번호 17)	133
		Reverse	5' biotin- ACTCTACTTAGTTGCCTTTTGGAAATGAA(서열번호 18)

표 3은 REBA에 사용된 프라이머 염기서열

No.	Marker		Primer sequence (5'-3')
1	M217	WT	5' amine- GTTGGGTGACACAAACTCTTCAGAAG(서열번호 19)
		MT	5' amine- TTGGGTGACACCAACTCTTCAGA(서열번호 20)
2	M175	WT	5' amine- TGCCTTCTCACTTCTCTTCTCAAG(서열번호 21)
		MT	5' amine- CACATGCCTTCTCACTTCTCAAGA(서열번호 22)
3	RPS4Y₇₁₁	WT	5' amine- ACCTTGGATTTCCCTGCCCA(서열번호 23)
		MT	5' amine- CCTTGGATTTCTCTGCCCAG(서열번호 24)
4	M145	WT	5' amine- ACACCAGAAAGAAAGGCGAGAG(서열번호 25)
		MT	5' amine- CCAGAAAGAAAGGCAAGAGCCA(서열번호 26)
5	M89	WT	5' amine- AATCTCATCTCTCACTTTGCCTGA(서열번호 27)
		MT	5' amine- CTAAGGTTATGTACAAAAATCTTATCT(서열번호 28)
6	M9	WT	5' amine- GGCCTAAGATGGTTGAATCCTCTT(서열번호 29)
		MT	5' amine- GGCCTAAGATGGTTGAATGCTCTT(서열번호 30)
7	M214	WT	5' amine- TCGTTTATTTTTCTGTTGTTTTCAGACAG(서열번호 31)
		MT	5' amine- TCGTTTATTTTTCCGTTGTTTTCAGACA(서열번호 32)
8	P31	WT	5' amine- GGTTTTTTTTTGGTTGTTTTTTTGGGGT(서열번호 33)
		MT	5' amine- TTGGTTGCTTTTTTGGGGTTTTTTTG(서열번호 34)
9	M122	WT	5' amine- ATTTTCCCCTGAGAGCATGAATTAGT(서열번호 35)
		MT	5' amine- GATTTTCCCCTGAGAGCGTGAAT(서열번호 36)

표 4는 REBA에 사용된 프로브 염기서열

No.	Marker		Primer sequence (5'-3')	Amplicon size (bp)
1	M217	Forward	ATACCATCGTCAATAAATTTCAACTAGGTA(서열번호 37)	386
		Reverse	CTAGCTTCATAAAAACTGGTTGAGGA(서열번호 38)
2	M175	Forward	CATAGACACCATAAAGGGAGAAAAAC(서열번호 39)	350
		Reverse	TCTCTTGCAGCATTTTCAGTTAGC(서열번호 40)
3	RPS4Y₇₁₁	Forward	GCAGATAACCTCTAGGAGACATGT(서열번호 41)	350
		Reverse	CACATTAAGAAACGAGAATTCACTGTTT(서열번호 42)
4	M145	Forward	AAAGCCTAGGGTTCAGCAAGAGTA(서열번호 43)	350
		Reverse	ATAGTGGCTCATGTTGCTTGAGTTC(서열번호 44)
5	M89	Forward	CTGGAACAGCTGAGCCATCC(서열번호 45)	415
		Reverse	TTTAACACTCCAGTTAGGAGATCCC(서열번호 46)
6	M9	Forward	GCGGCGTCTTTGATCTCTCA(서열번호 47)	340
		Reverse	TGCATAATGAAGTAAGCGCTACCT(서열번호 48)
7	M214	Forward	GACCAGCCTGAGCAATATGGTAA(서열번호 49)	403
		Reverse	CTTGAGGTTGATTGCAGGATTCATAG(서열번호 50)
8	P31	Forward	ACGAGCCTGATGATGGACGTGTT(서열번호 51)	373
		Reverse	ATGGTCACATGGGTAAAGGAGATG(서열번호 52)
9	M122	Forward	TTGCTTTGTTAGATTCTGGTGTTGC(서열번호 53)	372
		Reverse	TTACATGGGTTTTTCTTCCTTTCTACCA(서열번호 54)

표 5는 시퀀싱에 사용된 프라이머 염기서열

<110> UNIVERSITY INDUSTRY FOUNDATION, YONSEI UNIVERSITY WONJU CAMPUS National Forensic Service <120> A DIAGNOSTIC METHOD FOR SNP IN Y CHROMOSOME USING PCR-REVERSE BLOT HYBRIDIZATION ASSAY AND USE OF THE SAME <130> P17-0243HS <160> 54 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 tcgtacagat ctgtttcgag atcattc 27 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 aagctgctgt ggctttcatc aa 22 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gtacccaaat caactcaact ccagt 25 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ttttttctac tgataccttt gtttctgttc 30 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 tctctcctcc ctttctttct gtacttac 28 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 agcctcttat ctctctcttc agcaa 25 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 tagcggcata cttgcctcca 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 gctaggttcc tcccactcct t 21 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 atcctatgag gtgccatgaa agtg 24 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 cactttgggt ccaggatcac c 21 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 ctttcaggac cctgaaatac agaact 26 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 tgtaagacat tgaacgtttg aacatgt 27 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 acacactgga aagaaaaaga atgctg 26 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 agccatggaa atgccacttc a 21 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 ttggggaaca ggtaggtggt at 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 atatcgtgcc attgcacacc ag 22 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 gtgactttga gagtcacttg ctct 24 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 actctactta gttgcctttt ggaaatgaa 29 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 19 gttgggtgac acaaactctt cagaag 26 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 20 ttgggtgaca ccaactcttc aga 23 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 21 tgccttctca cttctcttct caag 24 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 22 cacatgcctt ctcacttctc aaga 24 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 23 accttggatt tccctgccca 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 24 ccttggattt ctctgcccag 20 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 25 acaccagaaa gaaaggcgag ag 22 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 26 ccagaaagaa aggcaagagc ca 22 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 27 aatctcatct ctcactttgc ctga 24 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 28 ctaaggttat gtacaaaaat cttatct 27 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 29 ggcctaagat ggttgaatcc tctt 24 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 30 ggcctaagat ggttgaatgc tctt 24 <210> 31 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 31 tcgtttattt ttctgttgtt ttcagacag 29 <210> 32 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 32 tcgtttattt ttccgttgtt ttcagaca 28 <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 33 ggtttttttt tggttgtttt tttggggt 28 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 34 ttggttgctt ttttggggtt tttttg 26 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 35 attttcccct gagagcatga attagt 26 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 36 gattttcccc tgagagcgtg aat 23 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 37 ataccatcgt caataaattt caactaggta 30 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 38 ctagcttcat aaaaactggt tgagga 26 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 39 catagacacc ataaagggag aaaaac 26 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 40 tctcttgcag cattttcagt tagc 24 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 41 gcagataacc tctaggagac atgt 24 <210> 42 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 42 cacattaaga aacgagaatt cactgttt 28 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 43 aaagcctagg gttcagcaag agta 24 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 44 atagtggctc atgttgcttg agttc 25 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 45 ctggaacagc tgagccatcc 20 <210> 46 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 46 tttaacactc cagttaggag atccc 25 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 47 gcggcgtctt tgatctctca 20 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 48 tgcataatga agtaagcgct acct 24 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 49 gaccagcctg agcaatatgg taa 23 <210> 50 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 50 cttgaggttg attgcaggat tcatag 26 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 51 acgagcctga tgatggacgt gtt 23 <210> 52 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 52 atggtcacat gggtaaagga gatg 24 <210> 53 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 53 ttgctttgtt agattctggt gttgc 25 <210> 54 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 54 ttacatgggt ttttcttcct ttctacca 28

Claims

a)검체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
b)상기 DNA로부터 각각의 프라이머쌍을 이용하여 Y 염색체 하플로그룹(haplogroup) 마커 유전자 단편을 PCR 증폭하는 단계;및
c)상기 Y 염색체 하플로그룹(haplogroup) 마커 유전자 검출용 올리고머 프로브가 부착되어 있는 고체 서포트와 상기 단계 b)에서 얻어진 PCR 증폭산물을 하이브리드 형성시키는 PCR-리버스 블랏 하이브리드형성 단계;
를 포함하고,
상기 프라이머쌍은 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍; 서열번호 13 및 14의 프라이머쌍; 서열번호 15 및 16의 프라이머쌍; 및 서열번호 17 및 18의 프라이머쌍으로 이루어진 프라이머쌍 조성물이고,
상기 올리고머 프로브는 서열번호 19 내지 서열번호 36으로 이루어진 프로브 조성물인 것을 특징으로 하는 Y 염색체 상에 존재하는 단일 염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP) 진단을 위한 정보제공방법.
삭제
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제1항에 있어서, 상기 서열번호 2의 프라이머; 서열번호 4의 프라이머; 서열번호 6의 프라이머; 서열번호 8의 프라이머; 서열번호 10의 프라이머; 서열번호 12의 프라이머; 서열번호 14의 프라이머; 서열번호 16의 프라이머; 및 서열번호 18의 프라이머는 5'말단에 바이오틴(biotin)이 표지된 것을 특징으로 하는 정보제공방법.
제1항에 있어서, 상기 Y 염색체 하플로그룹(haplogroup) 마커는 M217, M175, RPS4Y711, M145, M89, M9, M214m P31, 및 M122인 것을 특징으로 하는 정보제공방법.
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제1항에 있어서, 상기 올리고머 프로브는 5'말단에 아민(amine)이 표지된 것을 특징으로 하는 정보제공방법.
서열번호 1 및 2의 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍; 서열번호 13 및 14의 프라이머쌍; 서열번호 15 및 16의 프라이머쌍; 및 서열번호 17 및 18의 프라이머쌍 및
서열번호 19 내지 서열번호 36의 프로브를 포함하는 Y 염색체 상에 존재하는 단일 염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP) 진단용 조성물.
제9항에 있어서, 상기 서열번호 2의 프라이머; 서열번호 4의 프라이머; 서열번호 6의 프라이머; 서열번호 8의 프라이머; 서열번호 10의 프라이머; 서열번호 12의 프라이머; 서열번호 14의 프라이머; 서열번호 16의 프라이머; 및 서열번호 18의 프라이머는 5'말단에 바이오틴(biotin)이 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제9항에 있어서, 상기 올리고머 프로브는 5'말단에 아민(amine)이 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.
Y 염색체 하플로그룹(haplogroup) 마커 유전자 단편을 PCR 증폭하는 프라이머쌍 및 Y 염색체 하플로그룹(haplogroup) 마커 유전자 검출용 올리고머 프로브를 포함하고,
상기 프라이머쌍은 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍; 서열번호 13 및 14의 프라이머쌍; 서열번호 15 및 16의 프라이머쌍; 및 서열번호 17 및 18의 프라이머쌍이고,
상기 올리고머 프로브는 서열번호 19 내지 서열번호 36의 프로브인 Y 염색체 상에 존재하는 단일 염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP) 진단을 위한 피시알-리버스 블랏 교잡 어세이용 키트.
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