KR101561654B1 - 구기자 원산지판별을 위한 단일염기다형성마커와 이를 이용한 판별키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 국내산과 중국산 구기자 판별이 가능한 6개의 단일염기다형성 마커(SNP marker)와 마커 검출을 위한 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(AS-PCR)법의 프라이머 쌍을 제공하며, 국내산과 중국산 구기자 판별을 위한 일반 및 다중 PCR법에 관한 것으로, 이를 통해 구기자의 원산지를 판별할 수 있으며, 원산지 판별을 위한 키트를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)을 이용하여 국내산과 중국산 구기자를 판별하는 방법 및 이를 이용한 판별키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(AS-PCR)법을 이용하여, 6개 SNP 마커(Marker)의 증폭 유무로 원산지를 판별하는 방법과 이를 이용한 키트에 관한 것이다.
일반적으로 농산물의 원산지판별은 이화학적인 분석방법을 활용하여 개발되어 왔다. 그러나 이화학적 분석방법의 대상이 되는 생물체의 대사산물이나 유기·무기성분들은 생물체의 생육환경에 따라 차이를 나타낼 수 있기 때문에, 생물체 내 환경에 따라 변화되지 않고 전달되는 유전물질인 핵산(DNA)의 분석이 품종 또는 원산지 등을 구별하는 좋은 도구로 활용될 수 있다.
최근 분자유전학 및 유전자 분석기술의 발달로 DNA 분자수준에서 경제형질 관련 유전자 탐색 및 질병관련 유전자 발굴 등 SNP를 포함한 유전자마커(genetic marker) 개발이 활발히 진행되고 있다.
또한 DNA등 유전자를 대상으로 한 PCR (Polymorase chain reaction)기술을 이용하는 RAPD(random amplified polymorphic DNA), SSCP(single strand conformation polymorphisms) 기법 및 microsatellite(MS 또는 simple sequence repeat이라 함) 등 다양한 DNA 분석기법을 이용하여 종판별 및 개체식별 등 다양한 산업 전반에 걸쳐 본 기술이 활용되고 있다.
이러한 예로, 소의 개체식별을 위한 유전자마커(공개특허 10-2013-0055039), 한우 및 수입우 판별을 위한 단일염기다형성마커(공개특허 10-2013-0064197), 국내산 콩 품종의 판별을 위한 유전자마커(황태영 등, 2012, Kor. L. Breed. Sci, vol.44, p258-272), 국내 육성 사과 품종의 판별 마커(조강희 등, 2010, Kor. J. Hort. Sci. Technol. vol. 28, p828~835), 벼 품종 식별 유전자마커(등록특허 10-0974264) 및 국내외산 벼 품종 식별 SNP 마커(등록특허 10-0713669)등 다양한 동·식물 품종 및 원산지 식별에 활용되고 있다.
이러한 유전자 기법 중 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응법(Allele-specific PCR)은 SNP를 검출하는 방법으로, 프라이머 말단에 SNP가 위치하도록 디자인하여 프라이머 끝(3` end)부분의 단일염기가 결합되거나 결합되지 못하는 특징을 이용, 유전자 증폭산물의 형성 유무를 확인하여 SNP형을 확인하는 방법이다. 이러한 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응법은 SNP 검출을 위해 다양하게 활용되고 있다.
최근 농수산물 시장개방에 따라 농산물의 원산지 관리 등 국내 농산물에 대한 보호 및 육성에 대한 관심이 높아지고 있다.
특히 구기자의 경우 국내산과 중국산의 가격이 2배 이상 차이가나며, 이로 인해 원산지 둔갑 등 부정유통 사례가 증가되고 있다.
이러한 상황에서 국내 구기자 생산 농가의 소득 보전과 국내 품종 보존을 위해 원산지 판별법 개발이 시급한 실정이다.
현재까지 DNA 수준에서 구기자 원산지판별법은 단순염기반복다형성(SSR, Simple sequence repeat)을 이용한 방법이 보고된 바 있으나(공개특허 10-2010-0112499), SSR의 경우 고가의 분석 장비를 필요로 하며, 분석기법이 복잡하고, 비용이 비싸 현장적용에 어려움이 많았다.
따라서 본 발명에서는 분석이 용이한 단일염기다형성(SNP)을 이용한 구기자 원산지판별법 개발을 추진하였다.
본 발명을 위해 차세대염기서열분석(next generation sequencing) 기술과 AS-PCR기법을 활용하였으며, 이를 통해 본 발명을 완성하였다.
상기의 문제점을 해결하고자 본 발명에서는 고가의 분석 장비를 요하지 않으며, 분석기법이 단순하고, 비용이 저렴하여 현장적용에 용이한 구기자 원산지판별을 위한 단일염기다형성마커와 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응법 및 이를 이용한 판별키트를 제공하고자 한다.
더욱 상세하게는 구기자의 원산지를 판별하는 방법에 있어서, a) 구기자의 탐색된 유전변이에 대한 유전자마커로서 프라이머를 선발하는 단계; b) 상기 a)의 프라이머를 사용하여 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(AS-PCR)을 하는 단계; 및 c) 상기 b)의 단계 후 생성된 유전자증폭산물을 측정하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 구기자의 원산지를 판별하는 방법을 제공하고자 한다.
결국, 본 발명의 목적은 국내산과 중국산 구기자를 판별하는 유전자마커, 즉 단일염기다형성마커(SNP marker)와 그 판별 방법 및 이를 이용한 키트를 제공하는데 있다.
본 발명은 대립유전자 특이 중합효소반응 (AS-PCR)법으로 국내산과 중국산 구기자를 판별하는 서열번호 1 내지 12 중 어느 하나에 기재된 염기서열의 프라이머를 제공한다.
그리고 상기의 프라이머를 이용하여 구기자의 원산지를 구별하는 것을 특징으로 하는 원산지판별용 키트를 제공하며, 더욱 상세하게는 상기 원산지판별용 키트는 단일 또는 다중 PCR법을 이용하는 것을 특징으로 하는 구기자의 원산지 판별용 키트를 제공한다.
또한 구기자의 원산지를 판별하는 방법에 있어서, a) 구기자의 탐색된 유전변이에 대한 유전자마커로서 프라이머를 선발하는 단계; b) 상기 a)의 프라이머를 사용하여 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(AS-PCR)을 하는 단계; 및 c) 상기 b)의 단계 후 생성된 유전자증폭산물을 측정하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 구기자의 원산지를 판별하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 a)의 프라이머 중 서열번호 1과 2는 서열번호 13의 476번째 염기인 단일염기다형 (SNP) C와 A를, 서열번호 3과 4는 서열번호 14의 21번째 염기인 단일염기다형 G와 A를, 서열번호 5와 6은 서열번호 15의 21번째 염기인 단일염기다형 G와 T를, 서열번호 7과 8은 서열번호 16의 27번째 염기인 단일염기다형 G와 T를, 서열번호 9과 10은 서열번호 17의 238번째 염기인 단일염기다형 G와 T를, 서열번호 11과 12은 서열번호 18의 20번째 염기인 단일염기다형 G와 T를 구별하는 것을 특징으로 하는 구기자의 원산지를 구별하는 방법을 제공한다.
단일염기다형성 마커(SNP marker)를 이용하여 국내산과 중국산 구기자의 판별이 가능하며, 이를 통하여 원산지 부정유통 방지 등 원산지 관리업무에 활용이 가능하다. 또한 우수한 국내 구기자 유전자원의 보존과 개량에 효과를 얻을 수 있다.
또한 본 발명은 국내산과 중국산 구기자를 판별하기 위한 프라이머를 포함, 구기자 원산지 판별용 키트가 제공될 수 있다.
실시 예에 따르면, 상기 키트는 SNP 마커 LK1, 2, 3, 4, 5, 6을 검출하기 위한 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응법 (AS-PCR)에 사용되는 프라이머 쌍을 포함하고 있으며, 단일 및 다중 PCR법을 이용하여 검출하는 방법을 포함하고 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, SNP 마커 LK1, 2, 3을 검출하기 위한 프라이머 쌍을 이용한 유전자산물의 확인을 통해 국내산 구기자를 판정 할 수 있으며, SNP 마커 LK4, 5, 6을 검출하기 위한 프라이머 쌍을 이용한 유전자산물의 확인을 통해 중국산 구기자를 판정 하는 것을 특징으로 하는 원산지판별 방법이 제공 될 수 있다.
도 1은 국내산과 중국산 구기자 판별을 위한 단일 PCR(Single PCR) 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 국내산과 중국산 구기자 판별을 위한 다중 PCR(Multiplex PCR) 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 국내산과 중국산 구기자 판별을 위한 다중 PCR(Multiplex PCR) 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 구기자 원산지판별을 위한 단일염기다형성마커와 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응법 및 이를 이용한 판별키트에 관한 것이다.
본 발명은 국내산과 중국산 구기자를 판별하기 위한 프라이머를 포함, 구기자 원산지 판별용 키트가 제공될 수 있다. 실시 예에 따르면, 상기 키트는 SNP 마커 LK1, 2, 3, 4, 5, 6을 검출하기 위한 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응법 (AS-PCR)에 사용되는 프라이머 쌍을 포함하고 있으며, 단일 및 다중 PCR법을 이용하여 검출하는 방법을 포함하고 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, SNP 마커 LK1, 2, 3을 검출하기 위한 프라이머 쌍을 이용한 유전자산물의 확인을 통해 국내산 구기자를 판정 할 수 있으며, SNP 마커 LK4, 5, 6을 검출하기 위한 프라이머 쌍을 이용한 유전자산물의 확인을 통해 중국산 구기자를 판정 하는 것을 특징으로 하는 원산지판별 방법이 제공 될 수 있다.
본 발명은 대립유전자 특이 중합효소반응 (AS-PCR)법으로 국내산과 중국산 구기자를 판별하는 서열번호 1 내지 12 중 어느 하나에 기재된 염기서열의 프라이머를 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 프라이머를 이용하여 구기자의 원산지를 구별하는 것을 특징으로 하는 원산지판별용 키트를 제공한다.
상기 원산지판별용 키트는 단일 또는 다중 PCR법을 이용하는 것을 특징으로 하는 구기자의 원산지 판별용 키트일 수 있다.
구기자의 원산지를 판별하는 방법에 있어서,
a) 구기자의 탐색된 유전변이에 대한 유전자마커로서 프라이머를 선발하는 단계;
b) 상기 a)의 프라이머를 사용하여 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(AS-PCR)을 하는 단계; 및
c) 상기 b)의 단계 후 생성된 유전자증폭산물을 측정하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 구기자의 원산지를 판별하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 a)의 프라이머 중 서열번호 1과 2는 서열번호 13의 476번째 염기인 단일염기다형 (SNP) C와 A를, 서열번호 3과 4는 서열번호 14의 21번째 염기인 단일염기다형 G와 A를, 서열번호 5와 6은 서열번호 15의 21번째 염기인 단일염기다형 G와 T를, 서열번호 7과 8은 서열번호 16의 27번째 염기인 단일염기다형 G와 T를, 서열번호 9과 10은 서열번호 17의 238번째 염기인 단일염기다형 G와 T를, 서열번호 11과 12은 서열번호 18의 20번째 염기인 단일염기다형 G와 T를 구별하는 것을 특징으로 하는 구기자의 원산지를 구별하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명인 구기자 원산지판별을 위한 단일염기다형성마커와 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응법, 이를 이용한 판별키트 및 구기자의 원산지를 판별하는 방법에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 국내산과 중국산에서 특이적으로 나타나는 유전자 증폭산물(PCR product)을 확인하여 원산지를 판별하는 것을 특징으로 하는 원산지판별용 키트가 제공될 수 있다.
국내산과 중국산 구기자 구별을 위한 유전자마커(SNP marker) 개발 및 분석방법은 아래의 방법에 의해 진행되었다.
<
실시예
>
공시재료
국내산과 중국산 구기자의 유전자염기서열 분석 및 유전자변이 발굴을 위한 시료는 충청남도 농업기술원 청양구기자시험장으로부터 국내산 9종, 중국산 3종을 분양받아 사용하였고, 그 시료는 표 1에 정리하였다.
| 구분 | 품종명 | 비고 |
| 국내산 | 청양재래, 명안, 장명, 진도재래, 청당, 청대, 청명, 청운, 호광 | 국내 재배 품종 |
| 중국산 | 중국2, 중국3, 중국7 | 중국 재배 품종 |
구기자 게놈
DNA
의 추출
구기자 게놈 DNA는 QuickGene-Mini80(KURABO Industries LTD, Japan) 시스템과 QuickGene DNA tissue Kit S(KURABO Industries LTD, Japan)를 이용하여 추출하였다.
시료 0.1g에 tissue lysis buffer 225ul와 proteinase K 25ul를 첨가한 후 55℃에서 40분간 반응시켰다. 반응이 끝난 시료를 8,000 x g에서 3분간 원심분리하고, 원심분리 한 시료에서 상층액 200 ul를 취하였다.
상층액 200 ul에 lysis buffer 175 ul와 에탄올 250 ul를 첨가하여 15초간 잘 혼합한 후, column을 통과시켜 불순물을 제거하였다.
Column을 wash buffer 700 ul로 3번 washing 한 후 멸균증류수 50 ul을 이용하여 column으로부터 게놈 DNA를 회수하였다.
추출된 게놈 DNA는 ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer(NanoDrop Technologies, USA)을 이용하여 농도와 순도를 확인 한 후 차세대염기서열분석에 사용하였다.
차세대염기서열분석법을 이용한 구기자 염기서열 분석 및
유전자변이
탐색
국내산과 중국산 구기자의 대량 유전자 염기서열 분석을 위하여 454 GS-FLX(Roche, USA) 및 HiSeqTM 2000(Illumina, USA) platform을 활용하였다. 구기자의 염기서열분석 및 변이 탐색을 위하여, 우선 기준염기서열(reference sequence)을 제작하였다.
기준염기서열 작성은 국내에서 가장 많이 재배되고 있는 청양재래 품종을 대상으로 454 GS-FLX Sequencer(Roche, USA)를 통해 진행하였고, 청양재래 품종을 제외한 국내산 8종과 중국산 3종의 염기서열 분석은 HiSiqTM 2000 platform(Illumina)을 이용하여 진행하였다.
차세대염기서열분석은 각 회사에서 제공하는 표준매뉴얼에 따라 분석하였다. 각각의 차세대염기서열분석을 통해 얻어진 염기서열 중 Q-value값이 최소 20이상인 경우, 이를 염기서열 비교 및 유전자변이 탐색에 활용하였다.
청양재래 품종의 염기서열 정보 중 3,000bp이상인 57개의 contig를 기준염기서열로 작성하였고, 이를 바탕으로 나머지 국내산 8종과 중국산 3종의 염기서열을 비교 분석하여 유전자 변이를 탐색하였다.
총 624개의 단일염기다형(SNP)이 확인되었으며, 이중 국내산과 중국산 품종 간 특이적으로 나타나는 SNP를 선발하여 sanger method를 이용한 염기서열 재확인 대상으로 선발하였다. 염기서열의 비교, SNP 발굴 등 모든 염기서열 분석은 Genomics Workbench(CLC Bio, Denmark)프로그램을 활용하여 진행하였다.
탐색된
유전변이에 대한 확인(
resequencing
) 및
유전자마커
선발
624개의 탐색된 SNP 중 국내산과 중국산 구기자에서 특이적으로 나타나는 11종의 SNP를 1차 선발하였다. 국내산 및 중국산 구기자 시료 각 12종을 대상으로 선발된 11종의 SNP에 대한 염기서열 재분석(resequencing)을 진행하였다. 염기서열 재분석을 위한 PCR은 반응산물이 400~500bp가 되도록 프라이머를 합성하고, PCR 반응 후 반응산물은 Multi-well filter plate(Pall Corporation, USA)로 정제한 후 BigDyeⓡ Terminator (v3.1) Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems, UK)을 사용하여 수행하였다.
정제한 PCR 산물 2 ul에 5X Buffer 1.75 ul, Big Dye 0.5 ul 및 primer 5 pmol/ul를 첨가한 후 총 10 ul가 되도록 멸균증류수를 첨가하였다. 반응은 96℃에서 10초간 가열한 후 50℃에서 5초, 60℃에서 4분간 34회 반복하여 수행하였다.
PCR 반응 후 에탄올로 정제한 후 건조하고, 건조된 시료에 Hi-DiTM Formamide 8 ul를 첨가하고 95℃에서 2분간 반응시킨 후 염기서열 분석 장비인 ABI 3730xl(Applied Biosystems)을 통해 각 개체의 염기서열을 결정하였다.
염기서열 분석을 통해 얻어진 유전자 염기서열은 SNP 확인을 위하여 Lasergene SeqMan program(DNASTAR, Inc., USA)을 이용 분석하였다.
염기서열 재분석(resequencing) 결과 최종 6개의 SNP가 확인되었고, 이를 국내산과 중국산 구기자 판별을 위한 SNP 마커(LK1, 2, 3, 4, 5와 6)로 선발하였다.
대립유전자 특이
중합효소연쇄반응(AS-PCR)법을
이용한 구기자 원산지 판별
6개의 SNP 마커를 대상으로 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(AS-PCR)법을 이용하여, 국내산과 중국산 구기자를 판별하기 위해 아래(표2)와 같이 서열번호 1부터 12까지의 프라이머를 이용하였다.
| 구분 | 마커 이름 | 프라이머 염기서열(5`-3`) | 유전자증폭산물(bp) | |
| 국내산 특이적 | LK1 | 정방향(서열번호1) | TATCGCTGCAAACCCCGAGAT | 496 |
| 역방향(서열번호2) | ACCATTATTCCAACAGCTTG | |||
| LK2 | 정방향(서열번호3) | TTCGCTGGAGAGATAAATTGG | 446 | |
| 역방향(서열번호4) | AACAACGTCGATGAAGGCGT | |||
| LK3 | 정방향(서열번호5) | CGTTGGAGAGGAGCGCATTG | 389 | |
| 역방향(서열번호6) | TATCAAGTCAAGAGGACGAG | |||
| 중국산 특이적 | LK4 | 정방향(서열번호7) | GGAAAATCGAAAATATAAAAAAGCTGG | 318 |
| 역방향(서열번호8) | GTTCTTTGGTCTCATCCTCGATACTGA | |||
| LK5 | 정방향(서열번호9) | TGAAAGGCGTCAATAAAAAG | 260 | |
| 역방향(서열번호10) | TATTTCACAATTTCACATTGTTC | |||
| LK6 | 정방향(서열번호11) | ATGAGTTTTATACAAGGTAG | 167 | |
| 역방향(서열번호12) | ACTTGATTTCGAATTTGACCA | |||
6개 SNP 마커의 개별 분석을 위한 단일 PCR방법(대립유전자 특이 중합효소연쇄반응)은 게놈 DNA 50 ng에 10x Buffer 2.5 ul, dNTP(each 2.5mM) 1 ul, 10 pmol로 희석한 정방향 및 역방향 프라이머 각 0.5 ul와 중합효소(Taq polymerase, Takara, Japan) 2U을 첨가한 후 멸균 증류수로 최종 25 ul가 되도록 증액하였다.
유전자의 증폭반응은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems, USA)을 이용하였으며, 94℃에서 15분간 변성 후 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 40초 반응을 30회 반복 수행하였다. PCR 증폭 산물은 1.5% agarose gel 상에서 전기영동을 통해 확인하였다. 단일 PCR의 결과는 [도 1]과 같다.
6개 SNP 마커를 한번에 분석하기 위한 다중 PCR법을 위해 혼합 프라이머를 제조하여 사용하였다.
다중 PCR을 위한 혼합 프라이머는 6개 프라이머셋을 각 15, 15, 5, 2.5, 20 및 20 pmol의 농도가 되도록 혼합하여 제조하였다.
게놈 DNA 100 ng에 2x Multiplex Premix(Inclone, Korea) 12.5 ul와 혼합 프라이머 3 ul를 첨가한 후 멸균증류수로 총 25 ul가 되도록 증액하였다.
유전자의 증폭반응은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems, USA)을 이용하였으며, 94℃에서 15분간 변성 후 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분 20초 반응을 30회 반복 수행하였다. PCR 증폭 산물은 3% agarose gel 상에서 전기영동을 통해 확인하였다. 다중 PCR의 결과는 [도 2]와 같다.
본 발명의 검출방법(대립유전자 특이 중합효소반응법)에 있어 생성되는 유전자증폭산물(PCR product)은, 유전자마커 LK1의 경우 서열번호 1과 2를 이용하여 국내산 구기자의 C 유전자형에서 증폭되어 496bp 크기의 [서열번호 13]에 나타내었다(SNP:c/a).
ATCGCTGCAAACCCCGAGATATTATTACGGCAAAGGATGAACAAAAATCCAGAGCTCTGATTCAAATTTCTCTCGATTCATCCCCTCATGAGGAATTACCAAATCATTTGACCCTTCACCCATTCCAATATAAAGGATTGGTCAATCAAATAATAGATAGTAAATGGGTCGGTTTGAAAATAAATGAATTGCTAGTCGTAGAATATTATTCTCGTCAGACTTAAACCTCAGACTGAAACCAAGGGTTCGAAAAATTTTCTTCCCTTTAGGCGAAGTAAATTAACCCAAGGTTAAATAAGTTAAGTAAGATAAATCCGAGTTTGATCTGGATTTCCCCCATTTTTGTATCATAGACCAAGGATCTATTTTCATTCCTTGTCTACTCTTTCTTTCCAGTATTTTGATTATGATTAGTTTTTAGTATTCTATTTTAGCGTCACAACAATTAGGAATTGAGAATCTATAAAAGAAGGGT(C/A)TAGCTGTTGGAATAATGGT
유전자마커 LK2의 경우 서열번호 3과 4를 이용하여 국내산 구기자의 G 유전자형에서 증폭되어 446bp 크기의 [서열번호 14]의 염기서열와 같으며(SNP:g/a),
TTCGCTGGAGAGATAAACCG(G/A)TGGCCCTTTCCATTGTACAAGCAAGATTGGTTGGATTAGCTCACTTTTCTGTAGGTTATATATTCACTTATGCGGCTTTCTTGATTGCCTCTACGTCGGGCAAATTTGGTTAATATTTTTAATGTGTGTATCCTCGATAATCTCATTTCTTTCGACGGAGAGGGGGTCCACCTTCTTCTATTTCTACATCTAGGATTCGACTTGTATCATGGATACTAATAGGAATTCAACCATTATGGCAAGGAAAAGTTTGATTCAGAGGGAGAAGAAGAGGCAAAAATTGGAACAGAAATATCATTCGATTCGTCGATCCTCAAAAAAAGAAATAAGCAAGGTTCCGTCGTTGAGTGACAAATGGGAAATTTATGGAAAGTTACAATCCCTACCACGGAATAGTGCACCTACACGCCTTCATCGACGTTGTT
유전자마커 LK3의 경우 서열번호 5과 6를 이용하여 국내산 구기자의 G 유전자형에서 증폭되어 389bp 크기의 [서열번호 15]의 염기서열에 해당하고(SNP:g/t),
TCGTTGGAGAGGAGCGCATA(G/T)TTCTTTTATATTAAAATAGAACCAAATTGTTATCTACTAGCCATGTTTTCTTTCTGTGATAATGCCGTAGCGTAGGACTCCAGGAATTTTGGAAGCTGAACATGCTCAAAAGATGCCTAAAGCTTTTAGCTTTGATCATTCGACGCCGAGTGAAAGGGTTCCTCGCTAAAGAACCCCAAAGTTCCACTACAACCAAGGAAAGAGATAGATCACATCTTGGCCAAATGCCAATCCTCCTAGTTTGAAAGAGAAAAAGAGTGGAGATGTGCGAAAAAAGATCACTCCTAACTAACCAGTCAAGTGAAAGGAGCCCACTTACCCACTCTCCTTTCCCCCCATTGCTAGGAGCCTCGTCCTCTTGACTTGATA
유전자마커 LK4의 경우 서열번호 7과 8를 이용하여 중국산 구기자의 G 유전자형에서 증폭되어 318bp 크기의 [서열번호 16]에 해당하며(SNP:g/t),
GGAAAATCGAAAATATAAAAAAGCAG(G/T)CAAAACTCGTCTTTATTGAAAAATCGAAGAAAAGCCCTTTCATTAGAAGTAAGAAAGAACCTTTCTAGAAAAAAAGAAAGAGGACTGGAATCTATACATTGATTCACAATTTTTTGGAACCGTATGCATCAAAAGGCGCATGTACGGTTCCTAAGGGATACAATTTTACCCTAATCAACCGACTTTATCGAGAAAGATTACTTTTTTTAGGCCAAGGGATTAATAGCGAGATTTCGAATCAACTTATTGGTCTTATGGTATATCTCAGTATCGAGGATGAGACCAAAGAAC
유전자마커 LK5의 경우 서열번호 9과 10을 이용하여 중국산 구기자의 G 유전자형에서 증폭되어 260bp 크기의 [서열번호 17]에 해당하고(SNP:g/t),
TGAAAGGCGTCAATAAAAAGTAAAAATATGGACTAACTTAAACTAATTTAAAACTTAAATCGAATTTTCTATTCTTACTTATTCTGAGTCTTTGCTAAATACTTCAACTATTGAAATCAAGAAGTTACAATGGGTCAAATGATATGAAAGGGATTAATTACTGGTCTCCTTTGAAATAGGCCCATTTTTACCCAGGTTTTACCAGTAAATAGGTATAGATTTTCTGAATCAAAAAGA(G/T)AAGAATGTGAAATTGTGAAATA
유전자마커 LK6의 경우 서열번호 11과 12를 이용하여 중국산 구기자의 G 유전자형에서 증폭되어 167bp 크기의 [서열번호 18]에 해당 한다(SNP:g/t).
ATGAGTTTTATACAAGGTA(G/T)CGAACTTATGAATCTATTTTATTTTTTATTTTGTGGTTAGTCTTTGAATCTAGAAAGAATACAGAAATAGGCTAAGAATTCACTTCGAATGAATAAATTCAGAATATTGTTTCCTGATATCTCAATTGGTCAAATTCGAAATCAAGT
대립유전자 특이 중합효소연쇄반응 (AS-PCR)법을 통해 SNP 마커 LK1, 2와 3의 유전자 증폭산물인 496, 446과 389bp 크기의 증폭산물이 나타나는 경우 국내산 구기자로 판정하고, SNP 마커 LK4, 5와 6의 유전자 증폭산물인 318, 260과 167bp 크기의 증폭산물이 나타나는 경우 중국산 구기자로 판정할 수 있다.
본 발명은 국내산과 중국산 구기자간 차이를 보이는 6개의 단일염기다형성 마커(SNP marker)인 LK1, 2, 3, 4, 5와 6을 이용하여, 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(AS-PCR)법을 통해 원산지를 판별하는 방법을 제공하며, 6개 SNP 마커 분석을 위한 단일 및 다중 PCR법을 통해 구기자의 원산지를 판별하는 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 프라이머 중 서열번호 1과 2는 서열번호 13의 476번째 염기인 단일염기다형 (SNP) C와 A를, 서열번호 3과 4는 서열번호 14의 21번째 염기인 단일염기다형 G와 A를, 서열번호 5와 6은 서열번호 15의 21번째 염기인 단일염기다형 G와 T를, 서열번호 7과 8은 서열번호 16의 27번째 염기인 단일염기다형 G와 T를, 서열번호 9과 10은 서열번호 17의 238번째 염기인 단일염기다형 G와 T를, 서열번호 11과 12은 서열번호 18의 20번째 염기인 단일염기다형 G와 T를 구별하는 것을 특징으로 하는 구기자의 원산지를 구별하는 방법을 제공한다.
최근 농수산물 시장개방에 따라 농산물의 원산지 관리 등 국내 농산물에 대한 보호 및 육성에 대한 관심이 높아지고 있다.
특히 구기자의 경우 국내산과 중국산의 가격이 2배 이상 차이가나며, 이로 인해 원산지 둔갑 등 부정유통 사례가 증가되고 있다.
이러한 상황에서 국내 구기자 생산 농가의 소득 보전과 국내 품종 보존을 위해 원산지 판별법 개발이 시급한 실정이다.
본 발명은 구기자 원산지판별을 위한 단일염기다형성마커와 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응법 및 이를 이용한 판별키트로 원산지 식별에 활용할 수 있다.
<110> Republic of Korea
<120> Single nucleotide polymorphism marker and detection kit for
<130> 9337
<160> 18
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Lycium chinense
<400> 1
tatcgctgca aaccccgaga t 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Lycium chinense
<400> 2
accattattc caacagcttg 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Lycium chinense
<400> 3
ttcgctggag agataaattg g 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Lycium chinense
<400> 4
aacaacgtcg atgaaggcgt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Lycium chinense
<400> 5
cgttggagag gagcgcattg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Lycium chinense
<400> 6
tatcaagtca agaggacgag 20
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> Lycium chinense
<400> 7
ggaaaatcga aaatataaaa aagctgg 27
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> Lycium chinense
<400> 8
gttctttggt ctcatcctcg atactga 27
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Lycium chinense
<400> 9
tgaaaggcgt caataaaaag 20
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Lycium chinense
<400> 10
tatttcacaa tttcacattg ttc 23
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Lycium chinense
<400> 11
atgagtttta tacaaggtag 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Lycium chinense
<400> 12
acttgatttc gaatttgacc a 21
<210> 13
<211> 495
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The DNA sequense of [sequense number 1] PCR product
<400> 13
atcgctgcaa accccgagat attattacgg caaaggatga acaaaaatcc agagctctga 60
ttcaaatttc tctcgattca tcccctcatg aggaattacc aaatcatttg acccttcacc 120
cattccaata taaaggattg gtcaatcaaa taatagatag taaatgggtc ggtttgaaaa 180
taaatgaatt gctagtcgta gaatattatt ctcgtcagac ttaaacctca gactgaaacc 240
aagggttcga aaaattttct tccctttagg cgaagtaaat taacccaagg ttaaataagt 300
taagtaagat aaatccgagt ttgatctgga tttcccccat ttttgtatca tagaccaagg 360
atctattttc attccttgtc tactctttct ttccagtatt ttgattatga ttagttttta 420
gtattctatt ttagcgtcac aacaattagg aattgagaat ctataaaaga agggtctagc 480
tgttggaata atggt 495
<210> 14
<211> 446
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The DNA sequenses of [sequense number 2] PCR product
<400> 14
ttcgctggag agataaaccg gtggcccttt ccattgtaca agcaagattg gttggattag 60
ctcacttttc tgtaggttat atattcactt atgcggcttt cttgattgcc tctacgtcgg 120
gcaaatttgg ttaatatttt taatgtgtgt atcctcgata atctcatttc tttcgacgga 180
gagggggtcc accttcttct atttctacat ctaggattcg acttgtatca tggatactaa 240
taggaattca accattatgg caaggaaaag tttgattcag agggagaaga agaggcaaaa 300
attggaacag aaatatcatt cgattcgtcg atcctcaaaa aaagaaataa gcaaggttcc 360
gtcgttgagt gacaaatggg aaatttatgg aaagttacaa tccctaccac ggaatagtgc 420
acctacacgc cttcatcgac gttgtt 446
<210> 15
<211> 390
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The DNA sequense of [sequense number 5] PCR product
<400> 15
tcgttggaga ggagcgcata gttcttttat attaaaatag aaccaaattg ttatctacta 60
gccatgtttt ctttctgtga taatgccgta gcgtaggact ccaggaattt tggaagctga 120
acatgctcaa aagatgccta aagcttttag ctttgatcat tcgacgccga gtgaaagggt 180
tcctcgctaa agaaccccaa agttccacta caaccaagga aagagataga tcacatcttg 240
gccaaatgcc aatcctccta gtttgaaaga gaaaaagagt ggagatgtgc gaaaaaagat 300
cactcctaac taaccagtca agtgaaagga gcccacttac ccactctcct ttccccccat 360
tgctaggagc ctcgtcctct tgacttgata 390
<210> 16
<211> 318
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The DNA sequense of [sequense number 7] PCR product
<400> 16
ggaaaatcga aaatataaaa aagcaggcaa aactcgtctt tattgaaaaa tcgaagaaaa 60
gccctttcat tagaagtaag aaagaacctt tctagaaaaa aagaaagagg actggaatct 120
atacattgat tcacaatttt ttggaaccgt atgcatcaaa aggcgcatgt acggttccta 180
agggatacaa ttttacccta atcaaccgac tttatcgaga aagattactt tttttaggcc 240
aagggattaa tagcgagatt tcgaatcaac ttattggtct tatggtatat ctcagtatcg 300
aggatgagac caaagaac 318
<210> 17
<211> 260
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The DNA sequense of [sequense number 9] PCR product
<400> 17
tgaaaggcgt caataaaaag taaaaatatg gactaactta aactaattta aaacttaaat 60
cgaattttct attcttactt attctgagtc tttgctaaat acttcaacta ttgaaatcaa 120
gaagttacaa tgggtcaaat gatatgaaag ggattaatta ctggtctcct ttgaaatagg 180
cccattttta cccaggtttt accagtaaat aggtatagat tttctgaatc aaaaagagaa 240
gaatgtgaaa ttgtgaaata 260
<210> 18
<211> 167
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The DNA sequense of [sequense number 11] PCR product
<400> 18
atgagtttta tacaaggtag cgaacttatg aatctatttt attttttatt ttgtggttag 60
tctttgaatc tagaaagaat acagaaatag gctaagaatt cacttcgaat gaataaattc 120
agaatattgt ttcctgatat ctcaattggt caaattcgaa atcaagt 167
Claims (7)
- 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트,
서열번호 3의 프라이머 및 서열번호 4의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트,
서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트,
서열번호 7의 프라이머 및 서열번호 8의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트,
서열번호 9의 프라이머 및 서열번호 10의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 및
서열번호 11의 프라이머 및 서열번호 12의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 구기자 원산지 구별용 프라이머 세트. - 제1항에 있어서, 상기 구기자 원산지 구별용 프라이머 세트는 대립유전자 특이 중합효소반응(AS-PCR)법으로 국내산과 중국산 구기자를 구별하는 것을 특징으로 하는 구기자 원산지 구별용 프라이머 세트.
- 제1항 또는 제2항의 구기자 원산지 구별용 프라이머 세트를 이용하여 구기자의 원산지를 구별하는 것을 특징으로 하는 구기자의 원산지 판별용 키트.
- 제3항에 있어서, 상기 원산지판별용 키트는 단일 또는 다중 PCR법을 이용하는 것을 특징으로 하는 구기자의 원산지 판별용 키트.
- 구기자의 원산지를 판별하는 방법에 있어서,
a) 구기자의 탐색된 유전변이에 대한 유전자마커로서 제1항 또는 제2항의 구기자 원산지 구별용 프라이머 세트를 선발하는 단계;
b) 상기 a)의 프라이머 세트를 사용하여 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(AS-PCR)을 하는 단계; 및
c) 상기 b)의 단계 후 생성된 유전자증폭산물을 측정하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 구기자의 원산지를 판별하는 방법. - 제1항 또는 제2항의 구기자 원산지 구별용 프라이머 세트를 사용하여 구기자의 원산지를 구별하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 서열번호 13의 476번째 염기인 단일염기다형 (SNP) C와 A를 구별하고,
상기 서열번호 3의 프라이머 및 서열번호 4의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 서열번호 14의 21번째 염기인 단일염기다형 G와 A를 구별하며,
상기 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 서열번호 15의 21번째 염기인 단일염기다형 G와 T를 구별하고,
상기 서열번호 7의 프라이머 및 서열번호 8의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 서열번호 16의 27번째 염기인 단일염기다형 G와 T를 구별하며,
상기 서열번호 9의 프라이머 및 서열번호 10의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 서열번호 17의 238번째 염기인 단일염기다형 G와 T를 구별하고,
상기 서열번호 11의 프라이머 및 서열번호 12의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 서열번호 18의 20번째 염기인 단일염기다형 G와 T를 구별하는 것을 특징으로 하는 구기자의 원산지를 구별하는 방법.
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