KR102007414B1

KR102007414B1 - 천연 혼합추출물 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102007414B1
Application number: KR1020190003793A
Authority: KR
Inventors: 박순애
Original assignee: 박순애
Priority date: 2019-01-11
Filing date: 2019-01-11
Publication date: 2019-08-05

Abstract

본 발명은 천연 혼합추출물 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항산화, 콜라겐 합성 촉진, 피부 잔주름 개선, 피부자극 완화 및 항염증의 효과를 갖는 천연물 혼합물로부터 추출된 천연 혼합추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공함으로써, 우수한 피부 개선 효과를 제공할 수 있는 천연 혼합추출물 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

천연 혼합추출물 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{Methods for manufacturing of natural mix extract and the cosmetic composition containing the same}

피부 염증은 물리적, 화학적 그리고 항체 등의 면역적 요인에 의해서 발생된다.

대부분 외부 환경에 인한 화학물질 접촉에 따른 피부 염증성 질환은 면역작용에 손상을 주어 피부 외상에 따른 심리적 장애를 발생하기도 한다.

본 발명에서 설명하고 있는 블랙커민(Nigella sativa)은 아시아와 중동 전역에서 자생하고 있는 한해살이 식물로서, 열매가 열리는데 이 검은 씨드(seed) 부분을 건조 분쇄하여 향신료로 이용하거나 씨드에서 추출한 정유를 향수나 립스틱에 사용한다.

블랙커민씨드는 지중해의 검은 보석으로 불리며, 고대 이집트와 중동 지역에서 2000년 이상 약초로 쓰이며 모든 질병을 치료해온 만병통치약이다.

블랙커민씨드는 다양한 필수지방산을 포함하고 있으며, 면역질환, 천식, 알레르기 개선에 도움을 주는 것으로 알려져 있다.

또한, 본 발명에서 설명하고 있는 캐모마일(Chamaemelum nobile 또는 Matricaria recutita)은 국화과(Asteraceae)의 여러해살이풀로 주로 유럽, 북아메리카와 아르헨티나에서 많이 서식한다.

캐모마일은 저먼캐모마일, 로만캐모마일, 다이야스 캐모마일 등으로 다양한 품종을 가지고 있으며 꽃은 식용차로 널리 이용된다.

캐모마일은 로마제국의 팽창과 함께 유럽전역에퍼진 역사가 오랜 약초의 하나로서 유럽에서 가정상비약이라 하면 캐모마일을 연상할 만큼 보편화된 약초이다.

캐모마일의 식용 차는 불면증에 진정작용이 있으며 소염제 및 소화기계통에 항염작용과, 강장작용, 발한작용이 있어, 감기에 마시면 땀이 나면서 열이 내리게 된다고 알려져 있다.

또한, 본 발명에서 설명하고 있는 티트리(Melaleuca alternifolia)는 도금양목 도금양과에 속하는 상록교목이며, 늪지대에서 자라는 이 식물은 줄기를 잘라내도 잘 자랄 만큼 생명력이 강하다.

티트리는 신선한 차를 찾던 도중 호주와 뉴질랜드 해안 일대에서 발견되었으며, 티트리 나무 주변의 물이 붉은 갈색으로 변해있어 홍차와 비슷하다고 생각하여 차로 마시기 시작하여 tea tree라는 이름의 유래가 되었다.

주로, 티트리는 오일의 형태로 증류하여 사용하는 경우가 많은데, 항균성과 항진균성 등의 효능으로 상처 소독제, 여드름 진정제, 무좀 치료제, 호흡기 질환 치료제 등으로 알려져 있다.

따라서, 최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연 추출물로부터 얻어진 항산화, 항염, 자극 완화 등의 기능을 가진 화장품 원료에 많은 관심이 집중되고 있다.

천연물 추출물은 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연물 추출물을 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 높아지고 있다.

그러나, 통상의 방법으로 수득된 천연물 추출물을 함유하는 화장료 제품은 항산화, 항염 및 자극 완화 등의 기능성이 효과적으로 구현되지 아니하며, 추출물의 활성이 지속적으로 유지, 제어되지 않으므로 실용성이 높지 않았다.

따라서, 피부 항염 및 자극 완화 등의 개선을 위해 인체에 안전할 뿐만 아니라, 피부 개선 효과가 우수한 천연 유래 화장료 제품의 개발 필요성이 꾸준히 대두되고 있는 상황이다.

또한, 단일의 천연 원료를 단순 추출물 형태로 사용하는 경우, 피부 개선 효과를 구현하기 위한 다양한 종류의 유효성분이 포함되지 않을 수 있어 최근 화장품 업계에서 점차 트렌드로 자리잡고 있는 복합 기능성 화장품 개발에 적합하지 않으므로, 이를 개선하기 위한 다양한 연구가 이루어지고 있다.

따라서, 본 발명을 통해 블랙커민씨드, 캐모마일, 티트리잎에 포함된 다양한 유용성분이 다량 함유된 추출물의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

대한민국등록특허번호 제10-1513892호 대한민국공개특허번호 제10-2015-0019672호 대한민국등록특허번호 제10-0889973호 대한민국등록특허번호 제10-1315325호

본 발명의 목적은 항산화, 콜라겐 합성 촉진, 피부 잔주름 개선, 피부자극 완화 및 항염증의 효과를 갖는 천연물 혼합물로부터 추출된 천연 혼합추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 과제를 해결하기 위한, 천연 혼합추출물 제조방법은,

블랙커민씨드, 캐모마일 및 티트리잎을 증숙하는 천연물증숙단계(S100);

상기 증숙된 블랙커민씨드, 캐모마일 및 티트리잎을 건조하는 천연물건조단계(S200);

상기 증숙과 건조를 3회 반복하는 반복단계(S300);

상기 증숙과 건조를 3회 반복한 블랙커민씨드, 캐모마일, 티트리잎을 추출하는 추출단계(S400);를 포함함으로써, 본 발명의 과제를 해결하게 된다.

본 발명인 천연 혼합추출물 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 통해, 항산화, 콜라겐 합성 촉진, 피부 잔주름 개선, 피부자극 완화 및 항염증의 효과를 갖는 천연물 혼합물로부터 추출된 천연 혼합추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공함으로써, 우수한 피부 개선 효과를 제공하게 된다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 천연 혼합추출물 제조방법의 공정도이다.

본 발명의 일실시예에 따른 천연 혼합추출물 제조방법은,

상기 증숙과 건조를 3회 반복하는 반복단계(S300);

상기 증숙과 건조를 3회 반복한 블랙커민씨드, 캐모마일, 티트리잎을 추출하는 추출단계(S400);를 포함하는 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 블랙커민씨드, 캐모마일 및 티트리잎이 전체 중량부에 대하여 각각 1~30 중량부임을 특징으로 한다.

이때, 상기 제조방법으로 제조된 천연 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 천연 혼합추출물은 상기 화장료 조성물 전체에 대해 0.001 ~ 30.0 중량부가 함유되는 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 화장료 조성물의 제형은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초화장료 제형; 수중유형 또는 유중수형의 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형; 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 화장료 조성물은 노화 방지용인 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 화장료 조성물은 피부자극 완화용인 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명에 의한 천연 혼합추출물 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 실시예를 통해 상세히 설명하도록 한다.

블랙커민씨드, 캐모마일 및 티트리잎으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 천연물로부터 단순추출한 추출물인 경우, 생체 외에서는 유효한 효능을 나타내지만, 이를 피부 외용제 또는 화장품 원료로 적용한 경우에는 실질적으로 그 효과가 만족스럽지 못한 문제점이 있다.

따라서, 본 발명은 블랙커민씨드, 캐모마일 및 티트리잎을 증숙하는 천연물증숙단계(S100);

상기 증숙과 건조를 3회 반복하는 반복단계(S300);

좀 더 구체적으로 설명하자면, 블랙커민씨드, 캐모마일 및 티트리잎으로부터 화장품 원료로서 상용성이 우수하고, 피부 효능효과를 가진 화장료 조성물을 제공하기 위해 블랙커민씨드, 캐모마일, 티트리잎을 증숙하기 위하여 온도 90 내지 100 ℃에서 1 내지 2시간 동안 시판되는 증자기를 이용하여 증숙하는 천연물증숙단계(S100);와

상기 증숙된 블랙커민씨드, 캐모마일 및 티트리잎을 수분함량이 5% 내지 10%가 되도록 온도 60℃ 내지 90 ℃에서 3시간 내지 6시간 동안 건조하는 천연물건조단계(S200);와

상기 천연물을 천연물증숙단계(S100)와 천연물건조단계(S200)를 3회 반복하여 실시하는 반복단계(S300);와

상기 증숙과 건조를 3회 반복된 블랙커민씨드, 캐모마일, 티트리잎을 추출하는 추출단계(S400);로부터 수득된 추출물을 유효성분으로 함유하는데, 상기의 단계를 통해 수득된 추출물은 단순 천연물 혼합물로부터 추출한 추출물보다 총 페놀함량 및 총 플라보노이드 함량이 증가한 것을 본 발명의 실험예에서 확인하였다.

한편, 본 발명에 유효성분으로 함유되는 추출물은 항산화 효과, 세포내 활성산소 제거 효과, 프로콜라겐 생합성 촉진효과, 엘라스틴 생성 촉진효과, 염증유발관련 효소(hyaluronidase) 활성 억제효과, 자외선 조사에 의한 세포독성 완화효과 등이 우수하다는 사실을 확인할 수 있었고, 그로부터 제조된 본 발명의 화장료 조성물은 피부 주름개선 효과의 노화 방지 효능, 항염증 효과 및 피부 자극 완화 효능이 우수하다는 사실도 확인할 수 있었다.

한편, 천연물 혼합물은 바람직하게 블랙커민씨드, 캐모마일 및 티트리잎이 각각 1~30 중량부로 조성된 것이 좋다.

한편, 본 발명에서 추출물은 바람직하게 화장료 조성물 전체 100중량부에 대해 0.001~30.0 중량부가 함유되는 것이 좋은데, 0.001 중량부 미만으로 포함되는 경우에는 피부개선효과가 미미하고, 30.0 중량부를 초과하는 경우에는 재료 투입량 대비 효율성이 떨어져 경제적이지 못하기 때문이다.

한편, 본 발명에서 추출물은 바람직하게 추출 후, 감압농축 또는 동결건조된 것이 좋고, 이때, 감압농축 또는 동결건조된 추출물은 가장 바람직하게 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜 중 선택되는 어느 하나 이상의 용매에 용해된 것이 좋으며, 이때, 감압농축 또는 동결건조된 추출물은 가장 바람직하게 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜 중 선택되는 어느 하나 이상의 용매에 0.001~30.0 중량부 용해된 것이 좋다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물의 제형으로는 일예로 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초화장료 제형; 수중유형 또는 유중수형의 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형;이 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

본 발명에서 '천연물'이라 함은 블랙커민씨드, 캐모마일 및 티트리잎을 깨끗하게 각각 세척한 물질을 말한다.

본 발명에서 '여과된 추출물'이라 함은 블랙커민씨드, 캐모마일 및 티트리잎을 동일 중량부로 하여 각각 혹은 함께 비교예1 혹은 실시예1의 일련의 제법을 거쳐 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과된 물질을 말한다.

본 발명에서 '혼합물' 혹은 '천연물 혼합물'은 비교예1 혹은 실시예1의 일련의 제법에 의하여 '천연물'이 서로 섞이어 된 물질을 말한다.

본 발명에서 '추출물'이라 함은 상기 '혼합물' 혹은 '천연물 혼합물'을 용매에 용해하여 추출한 물질을 말한다.

상기 '추출물'을 '천연 혼합추출물'이라고도 한다.

비교예 1: 천연물 혼합물로부터 추출물 제조

세절하여 음건한 블랙커민씨드 50g, 캐모마일 50g, 티트리잎 50g을 95%(v/v) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조시킨 후, 수득한 동결 건조물을 15 중량% 함유되도록 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜 혼합용매에 용해하여 천연물 혼합물로부터 추출물(이하 '비교추출물'이라고 칭함)을 제조하였다.

실시예 1: 천연물 혼합물로부터 증포추출물 제조

세절한 블랙커민씨드 50g, 캐모마일 50g, 티트리잎 50g을 세척한 후, 스텐채반에 정렬하여 증숙기 넣고, 온도 95 ℃에서 2시간 동안 1회 증숙하였다. 증숙된 천연물을 열풍건조기에 넣고, 온도 85~90 ℃에서 6시간 1회 건조하였다.

상기 동일한 제조방법으로 각각 2회와 3회로 반복하여 증숙과 건조를 통해 증포가 완료된 천연물 혼합물을 95%(v/v) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조시킨 후, 수득한 동결 건조물을 15 중량% 함유되도록 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜 혼합용매에 용해하여 증포된 천연물 혼합물로부터 추출물(이하 '증포추출물'이라고 칭함)을 제조하였다.

본 발명에서는 상기 블랙커민씨드, 캐모마일 및 티트리잎이 전체 중량부에 대하여 각각 1~30 중량부임을 특징으로 한다.

여기에서 전체 중량부라함은 블랙커민씨드, 캐모마일 및 티트리잎을 모두 합한 중량을 말한다.

실험예 1: 증포추출물에 함유된 성분 분석 및 함량 측정

본 실험예 1에서는 상기 비교예 1에서 제조된 비교추출물과 실시예 1에서 제조된 증포추출물의 주요성분 중 페놀성 물질, 플라보노이드, 플라보노이드 배당체 등을 정성분석하고, 페놀함량과 총 플라보노이드 함량을 비교하였다.

먼저 페놀성 물질, 플라보노이드, 플라보노이드 배당체 등의 정성분석은 아래와 같이 수행하였다.

(1) 페놀성 물질, 플라보노이드의 정성분석

비교예 1(비교추출물)과 실시예 1(증포추출물)에 각각 2.5% FeCl₃ 에탄올 용액을 1-2 방울 떨어뜨려 방치할 때, 암녹색으로 정색하거나 침전의 생성 여부를 관찰하였다.

(2) 플라보노이드 배당체의 정성분석

진한 황산법을 이용, 비교예 1과 실시예 1에서 얻은 시료에 각각 5㎖의 진한 황산을 점적하여 황색 및 황적색 침전의 생성을 관찰하였다.

(3) 당의 정성분석

비교예 1과 실시예 1에 각각 5% a-나프톨 알콜 시액 2-3 방울을 넣은 후 농황산을 기벽을 통하여 가할 때 경계면에 적자색이 나타나는지 관찰하였다.

정성분석을 수행한 결과, 비교예 1과 실시예 1에서 얻은 산물에 페놀성 물질, 플라보노이드, 플라보노이드 배당체가 함유되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

총 페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량 측정은 아래와 같이 수행하였다.

(4) 총 페놀함량 측정

비교예 1과 실시예 1에서 얻은 시료 1㎖에 각각 증류수 10㎖을 첨가한 후, 2의 Folin-Ciocalteu phenol reagent(Sigma)를 첨가하여 혼합한 다음, 실온에서 5분간 반응시켰다.

이 반응물에 20% 소듐 카보네이트를 2㎖ 첨가하여 혼합한 다음, 상온에서 1시간 반응시킨 후 680nm에서 흡광도를 측정하였다.

이때, 지표물질은 갈릭산(gallic acid)을 사용하였다.

(5) 총 플라보노이드 함량 측정

비교예 1과 실시예 1에서 얻은 시료 1.5㎖에 각각 동량의 메탄올에 용해된 2% AlCl_3ㆍ6H₂O을 혼합한 다음, 상온에서 10분간 반응을 시킨 후 367nm에서 흡광도를 측정하였다.

이때, 지표물질은 카테킨(catechin)을 사용하였다.

총 페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량 측정 결과(표 1), 실시예 1이 비교예 1 보다 총 페놀함량 및 총 플라보노이드 함량이 높은 것을 확인할 수 있었으며, 총 페놀함량과 플라보노이드 함량이 비교예 1에 비해 각각 60% 이상 증가한 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 단순 추출에 의해 제조된 비교추출물 보다 천연물을 증숙과 건조를 반복한 증포를 수행한 후 추출한 추출물이 총 페놀함량 및 총 플라보노이드 함량을 증가시킬 수 있다는 사실을 확인하였고, 이를 바탕으로 천연물 증포추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 화장료 조성물을 제조하였다.

실험예 2: NBT법을 이용한 항산화 효과 측정

상기 비교예 1과 실시예 1에서 수득된 추출물의 항산화 수준을 확인하기 위해 항산화제로 잘 알려진 BHT(Butylated hydroxy toluene)를 비교시료로 사용하였고, 항산화 측정은 NBT법을 이용하였다.

NBT법은 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시키고, 생성된 활성산소와 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)가 반응하여 생성된 청색을 파장 560nm에서 측정하는 방법으로, 활성산소 소거율을 측정하였으며, 측정방법은 아래와 같다.

바이엘병에 0.05M의 Na₂CO₃ 2.4, 3mM의 크산틴 용액 0.1, 3mM의 EDTA 용액 0.1, BSA 용액 0.1, 0.72mM의 NBT 용액 0.1를 가하고 여기에 시료용액을 각각 첨가한 후, 25에서 10분간 방치하였다.

방치 후, 크산틴 옥시다제 용액 0.1를 가하여 빠르게 교반한 다음, 25에서 20분간의 배양을 하였고, 여기에 6mM의 CuCl₂용액 0.1을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도(St)를 측정하였다.

공시험은 시료용액 대신 증류수를 사용한 것으로 상기와 동일한 방법으로 흡광도(Bt)를 측정하였다.

시료용액의 블랭크(Blank)는 크산틴 옥시다제 용액 대신 증류수를 사용해 상기와 동일한 방법으로 흡광도(Bo)를 측정하였다.

측정 결과는 수학식 1에 의하여 산출하였다.

<수학식 1>

활성산소 소거율(%) = [1-(St-So)/(Bt-Bo)] × 100

St : 시료용액의 효소 반응 후의 560에서의 흡광도,

Bt : 공시험용액의 효소 반응 후의 560에서의 흡광도,

So : 효소 무첨가 시료용액의 효소 반응 전의 560에서의 흡광도,

Bo : 효소 무첨가 공시험용액의 효소 반응 전의 560에서의 흡광도

NBT법을 이용한 항산화 효과를 측정한 결과(표 2), 증포추출물은 비교추출물이나 양성 대조군인 BHT에 비해 같은 농도에서 좀 더 우수한 항산화효과를 발휘하는 것을 확인할 수 있었다.

위의 결과로부터 본 발명의 유효성분인 증포추출물의 우수한 항산화효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명의 현저한 효과를 추론할 수 있었다.

실험예 3: DPPH법을 이용한 항산화 효과 측정

본 비교예 1과 실시예 1에서 수득된 추출물의 항산화 수준을 확인하기 위해 항산화제로 잘 알려진 BHT를 비교샘플로 사용하였고, 항산화 측정은 DPPH법을 이용하였다.

DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 자유라디칼 소거활성을 측정하는 것이다.

피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정한다.

각 시료를 0.1% 농도로 준비한 후, 각각 96-웰 플레이트에 넣었다. 여기에 100uM 메탄올용액으로 제조된 DPPH를 첨가하여 용액의 총 부피가 200㎕가 되도록 하였다.

이것을 37℃에서 30분간 방치한 후 560nm에서 흡광도(St)를 측정하였다.

자유라디칼 소거활성(%)은 다음의 수학식 2로 산출하였다.

<수학식 2>

자유라디칼 소거활성(%)= {100-(B/A)}X100

A : 본 발명의 추출물을 처리하지 않은 대조군 웰의 흡광도,

B : 본 발명의 추출물을 처리한 실험군 웰의 흡광도.

DPPH 법을 이용하여 항산화 효과를 측정한 결과(표 3), 증포추출물은 비교추출물이나 양성 대조군인 BHT에 비해 우수한 항산화 효과를 발휘하는 것을 확인할 수 있었다.

위 결과로부터 오메기주 발효추출물의 우수한 항산화 효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명의 현저한 효과를 추론할 수 있었다.

실험예 4: 세포내 활성산소 소거 효과 측정

본 비교예 1과 실시예 1에서 수득된 추출물에 대하여 자외선에 의해 세포 내에서 생성되는 활성산소의 소거 효과를 측정하기 위해 EGCG(epigallocatechin gallate)를 비교샘플로 사용하였고, 형광물질을 이용하여 아래와 같은 실험을 수행하였다.

본 실험예 4에서 사용한 세포주는 독일 암연구센터의 퓌세니그 박사(Dr. Fusenig)로부터 분양받은 인간 각질세포 HaCaT 세포주(Human keratinocytes HaCaT cell line)로서 이를 형광측정용 96-웰 블랙 플레이트(well black plate)에 웰당 2.0 × 10⁴개로 분주하고 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 첨가된 DMEM(Dulbeccos Modification of Eagles Medium, FBS 10%, Gibco, USA) 배지를 사용하여 37, 5% CO₂조건에서 1일간 배양한 후, 각각의 시료를 0.01% 농도로 처리하였다.

시험 시료를 넣고 24시간 배양한 후, HCSS(HEPES-buffered control salt solution)로 세척하여 남아있는 배지를 제거하고 HCSS에 20μM로 준비된 DCFH-DA (2',7'- dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Molecular Probes, USA)를 100㎕ 가하고 37℃, 5% CO₂조건에서 20분간 배양한 후, HCSS로 세척하였다.

이후 농도별로 처리된 HCSS를 100㎕ 가한 후, 초기에 활성산소로 산화된 DCF(dichlorofluorescein)의 형광도를 형광플레이트리더(Ex;485 nm, Em;530nm)로 측정하였다.

이후 UVB(20mJ/cm²)를 조사하고 각 시료를 처리한 후, 형광도를 형광플레이트 리더(Ex;485 nm, Em;530nm)로 측정하였다.

활성산소의 소거 효과를 측정한 결과(표 4), 증포추출물은 EGCG와 동일한 농도에서 EGCG보다 높은 활성산소 소거율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

위 결과로부터 증포추출물의 우수한 활성산소 소거 효과를 확인할 수 있었다.

실험예 5: 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진효과 측정

본 실험예 5에서는 비교예 1과 실시예 1에서 수득된 추출물의 피부기질 성분인 타입 1 프로콜라겐의 생합성을 촉진하는 효과를 확인하기 위하여 TGF-β를 양성대조군으로 사용하였고, 프로콜라겐 분석(procollagen assay)을 아래와 같이 수행하였다.

신생아의 포피조직에서 분리한 사람진피섬유아세포(human dermal fibroblast)는 Modern Tissue Technology(MTT, Korea)로부터 분양받아 DMEM/F-12(3:1) 배지에 10% 우태아혈청(FBS)을 첨가하여 1×10⁴cell/㎠ 농도로 배양하였다.

70-80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3~4차 계대배양된 세포를 실험에 이용하였다.

프로콜라겐의 양을 측정하는 실험을 위해서 섬유아세포를 48 웰 플레이트(well plate)에 90% 이상 배양한 후, 각각의 시료를 0.02% 농도로 가하고, 24시간 후에 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐타입-1C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit)(MK101, Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다.

프로콜라겐 생합성 촉진효과를 측정한 결과(표 5), 증포추출물을 0.02% 처리한 경우 프로콜라겐의 생합성은 34% 촉진되었으며, 세포신호전달 물질 TGF-β와 유사한 효과를 나타내었다.

위 결과로부터 증포추출물의 우수한 프로콜라겐 생합성 촉진효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 제조된 본 발명 증포추출물의 피부 개선효과를 추론할 수 있었다.

실험예 6: 엘라스타제 활성 억제효과 측정

본 실험예 6에서는 실시예 1에서 수득된 증포추출물의 엘라스틴 생성 촉진효과를 측정하기 위해, 사람으로부터 직접 채취하거나 상업적으로 구입한 사람의 섬유 아세포에 발효 생약추출물을 처리하여 엘라스타제(elastase) 활성 억제효과를 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 사람의 섬유 아세포를 배양용 플라스크에 넣고 약 70～80 % 정도 자랄 때까지 배양하였다.

이후, 증포추출물을 1일간 처리한 후 세포배양액을 채취하여 상업적으로 이용 가능한 엘라스틴 측정기구를 이용하여 엘라스틴 생성 정도를 측정하였다[Bieth J: Biochem med., 11, 350-357(1974), Schwartz DE: J.Invest Dermatol., 86, 63-68(1986)].

즉, 엘라스타제의 기질인 Suc-(Ala) 3 NA를 이용하여, NA가 분해되면서 생기는 색의 변화를 흡광도를 이용하여, 엘라스타제의 활성도를 측정하였다.

이때, 증포추출물을 처리하지 않은 군을 대조군으로 사용하였다.

엘라스타제 활성 억제율을 측정한 결과(표 6), 증포추출물은 농도의존적으로 엘라스타제의 활성 억제율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

상기의 결과로부터 증포추출물의 우수한 노화 방지 및 탄력 증진 효과를 확인할 수 있었다.

실험예 7: 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과 측정

본 실험예 7에서는 실시예 1에서 수득한 증포추출물의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화효과를 측정하였다.

섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1x10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다.

각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다.

이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것) 1㎖를 첨가하였다.

여기에 평가대상 증포추출물을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다.

24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500㎕와 MTT 용액(2.5㎎/㎖) 60㎕를 넣은 후, 2시간 동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다.

배양 후 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04 N)을 500㎕씩 넣어주었다.

그리고 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565nm 흡광도를 측정하였다.

수학식 3에 의해 세포생존율(%)을 측정하고 자외선에 의한 세포독성 완화율은 수학식 4에 의하여 계산하였다.

<수학식 3>

세포생존율(%) =(St-Bo)/(Bt-Bo)X 100

Bo : 세포배양배지만을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

<수학식 4>

자외선에 의한 세포독성 완화율(%) =1-(St-Bo)/(Bt-Bo)X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율

자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과를 측정한 결과(표 7), 증포추출물은 0.02% 농도에서 자외선에 의한 세포 독성을 51% 완화하여 자외선에 의한 세포독성에 대하여 세포를 효과적으로 방어함을 알 수 있었다.

위의 결과로부터 증포추출물의 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과가 우수함을 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명의 자외선에 의한 피부자극 완화효과를 추론할 수 있었다.

실험예 8: 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과 측정

본 실험예 8에서는 실시예 1에서 수득한 증포추출물의 항염증효과를 측정하기 위해 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제 정도를 측정하였다.

사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5X10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다.

각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다.

이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후, PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350㎕를 첨가하였다.

여기에 평가대상 증포추출물을 처리한 후, 5시간 동안 배양하였다. 배양을 한 후, 배양 상층액을 150㎕ 취하여 IL-1α를 정량함으로써 증포추출물의 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 판단하였다.

IL-1α의 양은 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)을 이용하여 정량하였으며, IL-1α의 생성율은 수학식 5에 의해 계산하였다.

<수학식 5>

염증성 사이토카인 발현 억제율(%) =1-(St-Bo)/(Bt-Bo)X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α 생성량

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α 생성량

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α 생성량

자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 측정한 결과(표 8), 0.02% 농도에서 49% 억제하여, 증포추출물은 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 확인할 수 있었다.

위의 결과로부터 본 발명 추출물의 항염증 효과를 추론할 수 있었다.

실험예 9: 자외선 조사에 의한 프로스타글란딘 생합성 억제효과 측정

본 실험예 9에서는 실시예 1에서 수득한 증포추출물의 프로스타글란딘(prostaglandin E₂;이하, PGE₂ 로 칭함) 생합성 억제효과를 평가하기 위하여 사람의 표피 조직에서 분리한 각질형성세포(Keratinocyte)를 24-웰 시험 플레이트에 5x10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다.

FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하고 18시간 동안 배양한 다음, 상기 각질형성세포에 최종농도가 50μM이 되도록 아스피린(aspirin)을 처리하여 각질형성세포에 존재하는 프로스타글란딘 생합성 효소(prostaglandin E₂ synthetase, 또는 cyclooxygenase, 이하 COX) 활성을 제거하였다.

아스피린 처리 2시간 후에 각질형성세포가 들어있는 각 웰을 PBS로 2회 세척하고 각 웰에 100㎕의 PBS를 넣었다.

이 각질형성세포에 UVB 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 30mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 각 웰에 각질형성세포 배양액(keratinocyte growth media, Clonetics, Biowhittacker사, MD, USA) 250㎕를 첨가하였다.

여기에 평가하고자 하는 증포추출물 시료를 처리한 후 16시간 동안 배양하였다.

배양 상층액을 적당량 취하여 16시간 동안 생합성된 PGE₂(prostaglandin E₂)를 정량함으로서 증포추출물의 프로스타글란딘 억제효과를 판단하였다.

PGE₂의 양은 효소면역분석법(enzyme immunoassay)을 이용하여 정량하였다.

자외선조사에 의한 프로스타글란딘 생합성 억제효과를 측정한 결과(표 9), 증포추출물은 자외선에 의한 프로스타글란딘의 생성을 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다.

특히, 생성되는 PGE₂는 주로 COX-2 효소에 의해 만들어지는 것으로 알려져 있으므로 상기 실험을 통해 증포추출물이 COX-2 효소의 유도작용 또는 활성을 억제함을 추론할 수 있었다.

상기 결과로부터 증포추출물의 우수한 프로스타글란딘 생합성 억제효과를 확인할 수 있었다.

실시예 2: 증포추출물을 함유하는 화장료 제조

본 실시예 2에서는 실시예 1에서 수득한 증포추출물을 함유하는 화장료를 제조하였다.

제조된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 10에 나타낸 바와 같다.

우선 표 10에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존하였고, 나)상에 가)상을 가하여 예비유화 후, 호모믹서로 균일하게 유화하고 서서히 냉각하여 크림(실시예 2)을 제조하였다.

실험예 10: SLS에 의한 피부 자극 완화효과 측정

본 실험예 10에서는 실시예 1에서 수득한 증포추출물을 함유한 화장료의 자극 완화 효과를 인체 첩포 실험으로 평가하였다.

일반적 화장품 처방(크림, 로션, 스킨, 에센스)에 자극을 일으키는 SLS(sodium lauryl sulfate) 1%와 실시예 2를 혼용하여 24시간, 48시간, 72시간 동안 첩포한 후, 자극 유발지수를 바탕으로 자극완화 효과를 평가한 것이다.

20 ~ 50세의 건강한 남녀 50명의 팔 상박 부위에 FINN CHAMBER(FINLAND)를 이용하여 제품을 0.3mg씩 첩포하고, 24시간 후 급성 자극 지수를 평가하였다.

평가 후 재차 동일한 부위에 동량의 제품을 첩포하고 48시간 및 72시간 후의 지연성 자극 지수를 평가하였다.

SLS에 의한 피부 자극 완화효과를 측정한 결과, SLS를 단독으로 첩포한 부분은 24시간 후부터 피부에 붉게 자극이 나타났으나, 증포추출물을 함유하는 실시예 2는 첩포하고 24시간, 48시간, 72시간 경과 후에도 아무런 피부 발작을 일으키지 않았다.

상기 결과로부터 증포추출물이 화장료에 혼용되었을 때 자극을 유발시키는 기재(계면 활성제, 향, 알콜 등)에 의한 피부 자극을 감소시킬 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 증포추출물을 함유하는 화장수 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합 용해하였다.

실시예 1에서 수득한 증포추출물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 증포추출물을 함유하는 화장수를 제조하였다.

실시예 4: 증포추출물을 함유하는 유액 제조

세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰 부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열, 혼합, 용해하고, 실시예 1에서 수득한 증포추출물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해시켰다.

양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형 유액을 제조하였다.

실시예 5: 증포추출물을 함유하는 미용액 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히알루론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 1에서 수득한 증포추출물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 미용액을 제조하였다.

상기와 같은 제조방법을 통해 항산화, 콜라겐 합성 촉진, 피부 잔주름 개선, 피부자극 완화 및 항염증의 효과를 갖는 천연물 혼합물로부터 추출된 천연 혼합추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공함으로써, 우수한 피부 개선 효과를 제공할 수 있게 된다.

상기와 같은 내용의 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시된 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다.

본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구 범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

S100 : 천연물증숙단계
S200 : 천연물건조단계
S300 : 반복단계
S400 : 추출단계

Claims

천연 혼합추출물 제조방법에 있어서,
블랙커민씨드, 캐모마일, 티트리잎을 증숙하기 위하여 온도 90 내지 100 ℃에서 1 내지 2시간 동안 시판되는 증자기를 이용하여 증숙하는 천연물증숙단계(S100);와
상기 증숙된 블랙커민씨드, 캐모마일 및 티트리잎을 수분함량이 5% 내지 10%가 되도록 온도 81℃ 내지 90 ℃에서 3시간 내지 6시간 동안 건조하는 천연물건조단계(S200);와
상기 천연물을 천연물증숙단계(S100)와 천연물건조단계(S200)를 3회 반복하여 실시하는 반복단계(S300);와
상기 증숙과 건조를 3회 반복한 블랙커민씨드, 캐모마일, 티트리잎을 추출하는 추출단계(S400);를 포함하되,
상기 블랙커민씨드, 캐모마일 및 티트리잎이 전체 중량부에 대하여 각각 0.001~30.0 중량부임을 특징으로 하는 천연 혼합추출물 제조방법.
삭제
제 1항의 제조방법으로 제조된 천연 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 천연 혼합추출물은 상기 화장료 조성물 전체에 대해 0.001 ~ 30.0 중량부가 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 화장료 조성물의 제형은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초화장료 제형; 수중유형 또는 유중수형의 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형; 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
삭제
제 3항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 피부자극 완화용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.