KR102003606B1

KR102003606B1 - 미녹시딜 유효성분으로 함유하는 지방줄기세포의 발모능 증진용 조성물

Info

Publication number: KR102003606B1
Application number: KR1020170136418A
Authority: KR
Inventors: 성종혁; 최나현
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2017-10-20
Filing date: 2017-10-20
Publication date: 2019-07-24
Also published as: KR20190044242A

Abstract

본 발명은 미녹시딜 유효성분으로 함유하는　지방줄기세포의　발모능 증진용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게 본 발명은 미녹시딜 유효성분으로 함유하는　지방줄기세포의　발모능 증진용 조성물, 이를 이용한 지방줄기세포의 발모능 증진 방법, 상기 방법에 의해 발모능이 증진된 지방줄기세포를 포함하는 탈모증 예방, 치료 또는 발모 촉진용 약학적 조성물, 의약외품 조성물 및 화장품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 미녹시딜 처리된 지방줄기세포는 증식능 및 이동능이 현저히 증가하고, 성장인자의 분비가 증가하였으며, 이를 동물 모델에 투여하였을 때 대조군에 비해 성장기 모발 유도 및 발모 효과가 현저히 증가하였다. 따라서 본 발명에 따른 미녹시딜 처리된 지방줄기세포는 탈모 예방, 탈모 또는 무모증 치료, 발모 개선 및 촉진용 조성물로 유용하며, 구체적으로 본 발명의 지방줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 하는 탈모 예방 또는 발모 개선용 의약품 조성물, 의약외품 조성물 또는 화장품 조성물로 유용하게 쓰일 수 있다.

Description

미녹시딜 유효성분으로 함유하는 지방줄기세포의 발모능 증진용 조성물{Composition for enhancing the action for hair growth of adipose stem cell comprising Minoxidil as an active ingredient}

본 발명은 미녹시딜 유효성분으로 함유하는　지방줄기세포의　발모능 증진용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게 본 발명은 미녹시딜 유효성분으로 함유하는　지방줄기세포의　발모능 증진용 조성물, 이를 이용한 지방줄기세포의 발모능 증진 방법, 상기 방법에 의해 발모능이 증진된 지방줄기세포를 포함하는 탈모증 예방, 치료 또는 발모 촉진용 약학적 조성물, 의약외품 조성물 및 화장품 조성물에 관한 것이다.

최근 미용에 대한 관심이 높아지면서 탈모 치료에 관한 관심 또한 높아지고 있다. 현재 탈모 치료법으로 가장 많이 쓰이고 있는 방법은 자기 자신의 머리털을 이용하여 이식하는 자가 모발이식 수술법과 미녹시딜(Minoxidil)과 프로페시아(Propecia)를 사용하는 약물 치료가 널리 사용되고 있다.

미녹시딜의 경우 혈관확장을 통한 모세포에 영양공급 증가 및 칼륨 채널 개방 효과(potassium channel opening effect) 등을 통해 모발 성장을 유도하며, 프로페시아의 경우 DHT(dihydrotestosterone)의 생성을 저해하는 효과로 모발 성장을 유도하는 것이다. 이 두 약물 모두 치료할 당시에는　발모　효능이 나타나나, 치료가 중단되면 탈모가 다시 진행되고 모발성장의 효과보다는 탈모방지의 효과가 더욱 크며, 특히 성기능 장애, 임신한 여성의 경우 기형아 출산과 같은 부작용이 나타날 수 있다는 문제점이 있다.

최근, 탈모와 관련된 유전자를 모낭에 전달하거나 유전자 발현을 차단하는 방법으로 시술되는 유전자 치료법이 개발되었으나, 치료의 효능 및 안전성이 불확실하고, 치료비용이 고가이어서 임상 적용이 용이하지 않다는 문제점이 있다. 이러한 이유로 유전자 치료 외에　줄기세포를 이용한 탈모치료 방법이 최근 각광받고 있다.

지방유래줄기세포(Adipose-derived Stem Cells)는 중간엽 줄기세포로 피부의 상처치유 및 노화예방 효과를 나타낸다(Kim et al., J Dermatol Sci 53:96-102, 2009; Altman et al., Stem Cells 27:250-258, 2009). 최근 연구에서 저산소 상태 또는 비타민 C를 전처리한 지방줄기세포에 의해 모발 주기가 휴지기(telogen)인 마우스가 성장기(anagen)로 전환되는 것을 확인하였으며(Won et al., J Dermatol Sci 57:134-137,2010; Kim et al., Stem Cells Dev 23:1364-1376, 2014), 이는 지방줄기세포의 모발 재생능 향상에 의한 것임을 알 수 있다. 또한, 지방줄기세포에서 발현되어 분비된 성장인자 PDGF-A는 모낭줄기세포의 활성을 조절하고 모발주기에서 성장기(anagen)를 유도한다는 것이 알려져 있다(Festa et al., Cell 146:761-771, 2011, Tomita et al., J Dermatol Sci 43:105-115, 2006). 그러나 지방줄기세포에서 미녹시딜의 기능 및 효과는 아직까지 확인된 바가 없다.

본 발명자들은 지방줄기세포의 생산 수율 향상 및 발모 효과 증대를 위한 방법을 개발하기 위해 예의 연구한 끝에 미녹시딜 처리에 의해 지방줄기세포의 증식, 이동 및 성장인자 분비가 증가하고, 이로 인해 모발 재생능이 향상되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 미녹시딜(Minoxidil)을 유효성분으로 함유하는 지방줄기세포의 발모능 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 미녹시딜을 유효성분으로 함유하는 배지에서 지방줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 지방줄기세포의 발모능 증진 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 미녹시딜 처리된 지방줄기세포 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 탈모증 예방, 치료 또는 발모 촉진용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 미녹시딜 처리된 지방줄기세포 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 탈모 예방 또는 발모 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 미녹시딜 처리된 지방줄기세포 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 탈모 예방 또는 발모 개선용 화장품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 미녹시딜(Minoxidil)을 유효성분으로 함유하는 지방줄기세포의 발모능 증진용 조성물을 제공한다.

본　발명에서　지방줄기세포(지방유래　줄기세포, Adipose-derived stem cells)는 개체의　지방조직에서 얻을 수 있는 성체줄기세포(Adult stem cells)를 말한다. 이러한　지방　줄기세포는　지방세포는 물론 근육세포, 연골세포, 뼈세포 등 다양한 종류의 세포로 분화될 수 있는 능력을 가진 다분화능력세포(Multipotent stem cell)이며, 스스로 증식할 수 있는 능력이 있다. 본 발명에서의　지방　줄기세포는 이에 한정되지는 않으나, 주로 인간의 피하지방조직에서부터　지방흡입(liposuction) 방법으로 수득할 수 있으며, 바람직하게는 자신의 피하지방조직에서 수득한 자가　지방　줄기세포일 수 있다.

상기에서　지방흡입 방법은 주사기를 이용하여 몸에서　지방을 채취하는 것으로 일반적으로, 복부나 둔부의 피하　지방조직에서 미세도관을 이용해　지방을 흡입한 후 이를 원심분리를 하여 정제하는 방법을 말한다. 이러한 방법을 통하여 비교적 많은 양의 세포를 추출할 수도 있으나, 충분히　지방세포로 분화되지 않은 세포는 이식 후　발모와 관련된　지방세포 등으로의 분화를 확신할 수 없으며, 완전히 성숙한　지방세포는 세포수집 과정에서 손실되거나 이식 후 생착율이 떨어지는 등 효율이 낮고, 대부분의 경우　발모　촉진이나 탈모 예방/치료에 활용하기에는 충분하지 않은 양으로 추출되므로 본 발명의 기술을 이용하여 발모능을 높이는 경우 큰 의미가 있다.

본 발명에서 지방줄기세포의 발모능을 높이기 위하여 처리되는 미녹시딜은 1 ~ 1000 μM의 농도로 처리되는 것이 바람직하다. 본 발명의 지방줄기세포 배양 시 미녹시딜을 추가로 넣은 배지에서 24 내지 96시간 동안 배양함으로써 발모능을 증진시킬 수 있다. 즉, 본 발명은 미녹시딜을 포함하는 배지에　지방　줄기세포를 접종하고 24 내지 96시간 동안 배양하는 것에 의해서 수행될 수 있다.

미녹시딜은 일차적으로 경구형 혈관 확장약으로서, 말초동맥의 평활근을 직접 이완시킴으로써 혈압을 강하시키는 항고혈압제로 개발되었다. 그러나 외용제로서 발모 효과가 알려지면서 남성형 탈모치료제로 널리 사용되고 있다. 본 발명에서는 지방줄기세포 배양 시 미녹시딜을 처리하는 경우 지방줄기세포의 발모능이 증진되는 점을 확인되었다.

본 발명은 또한 미녹시딜을 유효성분으로 함유하는 배지에서　지방줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는　지방줄기세포의　발모능 증진 방법을 제공한다.

본 발명의 배양 배지에 함유되는 미녹시딜은 상기한 바와 같이 1 ~ 1000 μM 농도로 첨가될 수 있다.

본 발명의 배양 단계는 미녹시딜을 포함하는 배지에　지방줄기세포를 접종하고 24 내지 96시간 동안 배양하는 것일 수 있다.

본 발명에서 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 이러한 다양한 배양 방법은 다양한 문헌(예를 들면, James et al., Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions)에 개시되어 있다. 세포의 성장방식에 따라 현탁배양과 부착배양을 배양방법에 따라 회분식과 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다.

배양에 사용되는 배지는　지방　줄기세포의 배양 요구조건을 적절하게 만족시켜야 하다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원, 미량원소 성분 및 성장인자 등을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예로는, 포도당, 자당, 유당, 과당(fructose), 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은　지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은　지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예로는, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기　질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에, 아미노산 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 적절한 방식으로 첨가하여, pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는　지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 바람직하게 본 발명에서 배양 배지는 동물세포 배양 기술분야에서 통상적으로 사용되는 배지를 사용할 수 있으며, 상업적으로 입수 가능한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), DMEM-F12(mix of DMEM and Ham's F-12 medium), MEM(Minimum Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), α-MEM(MEM Alpha Modification), RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute 1640), M199/F12(Medium 199 and Ham's F-12 medium), IMEM(Improved MEM), MCDB 131 배지 등을 사용할 수 있으며, 상기 배지를 기본으로 사용하여 상기한 바와 같이 미녹시딜을 추가로 첨가한 것을 사용할 수 있다. 아울러, 필요시 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)이나 성장인자 또는 분화관련 인자를 추가로 포함할 수 있으며,　줄기세포　배양을 위해 통상적으로 사용되는 항생제, 예를 들어, 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 카나마이신(kanamycin), 암피실린(ampicillin) 또는 암포테리신 B(amphotericin B) 등과 같은 항생제를 단독으로 또는 혼합하여 첨가할 수 있다. 배양시에는 통상의 동물세포의 배양 조건에서와 같이 일정농도(예를 들어 5%)의 CO₂를 유지시킬 수 있다. 배양시의 온도는 보통 20 ℃ 내지 45 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 내지 40 ℃를 유지할 수 있다.

배양 종료 후에 배양액과 지방줄기세포를 분리하기 위해 원심분리(centrifugation) 또는 여과(filtration)과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 미녹시딜에 의한 지방줄기세포의 활성화를 확인하기 위하여 미녹시딜 처리 후 지방줄기세포의 이동(migration) 및 튜브 형성(tube formation)이 증가되는 것을 확인하였다(도 1).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 미녹시딜 처리한 지방줄기세포의 파라크린 효과의 증대를 알아보기 위하여 CXCL1(chemokine (C-X-C motif) ligand 1) 및 PD-ECGF(platelet-derived endothelial cell growth factor)의 발현 증가를 확인하였다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 털이 제거된 마우스의 등 부위에 미녹시딜로 처리한　지방줄기세포를 이식하여 모발 생성 효과를 확인하였다. 대조군으로 생리식염수만 주입한 그룹(Vehicle) 및 미녹시딜로 활성화되지 않은　지방줄기세포를 이식한 그룹을 사용하여 비교하였다. 그 결과, 미녹시딜로 활성화된　지방줄기세포를 이식한 그룹이 대조군에 비하여 모발이 더 빠르고 풍부하게 생성되어 더 우수한 모발　증식 효과가 있음을 알 수 있었다. 특히, 미녹시딜의 활성화로　지방줄기세포의　발모능이 더 높아짐을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명은 미녹시딜 처리된　지방줄기세포를 포함하는　탈모 예방 또는 발모　촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "탈모"는 모발이 완전히 두피 밖으로 빠져나오는 현상을 의미한다. 탈모가 진행되고 있는 사람은 성장기가 짧아지고 휴지기가 긴 모발 주기를 가지게 되는데, 하기 실시예에서 입증된 바와 같이 미녹시딜 처리된 지방줄기세포 또는 이의 배양액은 모발을 휴지기에서 성장기로 전환시키고, 피부조직에서 발모 및 양모와 관련된 성장인자의 발현을 증가시키는 바 탈모를 예방, 개선 또는 치료하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 용어 "발모"는 두피에서 모발이 나는 것을 의미하고, 구체적으로 탈모된 부위 또는 털이 없는 부위(무모 부위)에 모낭을 형성하여 털이 나도록 유도하는 것을 의미한다. 이는 당업계에서 모발의 길이가 길어지는 것(즉, 모발 성장)을 의미하는 "육모" 또는 "양모"와 동일한 의미로 사용된다.

구체적으로 본 발명은 미녹시딜 처리된　지방줄기세포를 유효성분으로 함유하는　탈모증 예방, 치료 또는 발모 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 방법에 의해서　발모능이 증진된　지방　줄기세포를 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.

약학적으로 허용되는 담체는 완충액, 주사용 멸균수, 일반 식염수 또는 인산염 완충 식염수, 슈크로스, 히스티딘, 염 및 폴리솔베이트 등과 같은 여러 성분을 함유할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 일반 의약품 제제의 형태, 예를 들어, 임상투여 시 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다.

단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌 글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서,　의약　조성물은 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 적용되는 질환의 종류에 따라 투여경로가 결정되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의　의약　조성물은 발모촉진 또는 탈모의 예방 및 치료에 사용되기 때문에 피부에 국소적으로 적용되는 방식으로 투여되는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 발모 촉진용　의약　조성물은 국소 투여용 주사제인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 의약 조성물은 유효량의 지방줄기세포 또는 이의 배양액을 포함할 때 바람직한 탈모증 예방, 치료 또는 발모 촉진 효과를 제공할 수 있다. 본 발명에 있어서, '유효량'이라 함은 탈모증 예방, 치료 또는 발모 촉진 효과가 나타나는 조성물의 양을 의미한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 지방줄기세포 또는 이의 배양액의 유효량은 조성물이 제품화되는 형태, 상기 화합물이 피부에 적용되는 방법 및 피부에 머무르는 시간 등에 따라 달라질 것이다. 예컨대, 상기 조성물이 탈모증 예방 또는 치료를 위한 의약품으로 제품화되는 경우에는 일상적으로 피부에 적용하게 되는 화장품으로 제품화되는 경우에 비해 높은 농도로 지방줄기세포 또는 이의 배양액을 포함할 수 있을 것이다.

또한, 본 발명의　의약　조성물 또는 치료제의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 투여 시간, 투여 경로 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 미녹시딜 처리된 지방줄기세포는 세포치료에서 적은 양의 세포를 사용하고도 동일한 발모 촉진 효과를 얻을 수 있으므로, 세포치료에 있어서 지방줄기세포의 투여량을 낮출 수 있는 효과가 있다.

본 발명은 또한 미녹시딜 처리된　지방줄기세포를 유효성분으로 함유하는 탈모 예방 또는 발모 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

본 발명의 미녹시딜 처리된　지방줄기세포를 의약외품 조성물의 유효성분으로 사용할 경우, 탈모 예방 또는 발모 개선 효과를 나타내는 상기 지방줄기세포 또는 그 배양액을 그대로 첨가하거나, 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 탈모 예방 또는 발모 개선용 의약외품 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정하지 않으며, 탈모 예방 또는 발모 촉진 효과를 나타내는 것으로 당업계에 공지된 의약외품의 형태로 다양하게 제형화될 수 있다. 상기 제형화된 의약외품은 연고제, 크림제, 겔제, 액상제, 에멀전, 패취 또는 분무제인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로 헤어토닉, 헤어로션, 헤어크림, 헤어스프레이, 헤어무스, 헤어젤, 헤어컨디셔너, 헤어샴푸, 헤어 린스, 헤어팩, 헤어트리트먼트, 눈썹발모제, 속눈썹발모제, 속눈썹영양제, 애완동물용 샴푸, 애완동물용 린스, 손 세정제, 세제, 비누, 소독청결제, 물티슈, 마스크, 연고제, 패치 또는 필터 충진제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 의약외품을 모두 포함한다.

또한, 각 제형에 있어서 탈모 예방 또는 발모 촉진용 의약외품 조성물은 다른 성분들을 기타 의약외품의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용목적에 따라 적합하게 결정될 수 있고, 예를 들면 점증제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체 등을 포함할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 미녹시딜 처리된 지방줄기세포 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 탈모 예방 또는 발모 개선용 화장품 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 화장품은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 및 헤어스프레이 등 다양한 형태로 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 화장품은 유효성분이 미녹시딜 처리된 지방줄기세포 또는 이의 배양액뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "발모촉진" 또는 "탈모방지"는 당업계에서 이용되는 다른 용어 양모 또는 육모 촉진을 포함하는 의미이다.

본 발명의 발모 촉진용　의약　조성물 또는 화장품이 적용될 수 있는 부위는 두피뿐만 아니라 발모를 필요로 하는 신체 부위라면 어디나 적용할 수 있다. 예를 들면, 외상으로 인한 흉터로 모발 또는 털이 손상된 부위 또는 단순 미용효과를 목적으로 하는 넓은 이마 또는 M형 이마, 속눈썹 또는 눈썹 및 무모증의 상태 호전에도 사용할 수 있다.

본 발명에서는 생후 약 7주부터 약물을 투여하여 성장기(anagen)로 유도되는 것을 비교하기 위해 C3H/HeN 마우스의 상전이 동물모델(telogen to anagen transition model)을 사용하였다.

본 발명의 용어 "성장기(anagen)"는 모발의 반복되는 성장주기 가운데 주기의 90% 정도를 차지하는 모발이 성장하는 단계를 말하며, "휴지기(telogen)"는 모근(hair root) 아래쪽에서 모발을 성장시키는 모구 부분의 세포 분열이 멈추고, 일시 정지되어 모발이 빠지게 되는 시기를 말한다.

본 발명에 따른 미녹시딜 처리된 지방줄기세포는 증식능 및 이동능이 현저히 증가하고, 성장인자의 분비가 증가하였으며, 이를 동물 모델에 투여하였을 때 대조군에 비해 성장기 모발 유도 및 발모 효과가 현저히 증가하였다. 따라서 본 발명에 따른 미녹시딜 처리된 지방줄기세포는 탈모 예방, 탈모 또는 무모증 치료, 발모 개선 및 촉진용 조성물로 유용하며, 구체적으로 본 발명의 지방줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 하는 탈모 예방 또는 발모 개선용 의약품 조성물, 의약외품 조성물 또는 화장품 조성물로 유용하게 쓰일 수 있다.

도 1은 미녹시딜 처리에 따른 지방줄기세포의 이동(A, B) 및 튜브 형성능(C) 향상 효과를 나타낸 것이다(A, 스크래치 분석; B, 트랜스웰(transwell)을 이용한 이동능력 테스트; C, 튜브 형성 테스트 결과).
도 2는 미녹시딜 처리에 따른 성장인자 발현의 증가를 확인한 결과이다.
도 3은 미녹시딜 처리에 의한 지방줄기세포의 발모 효과 증대를 확인한 결과이다(A, 모발 재생 확인 결과; B, 실험 14일째 재생된 모발 무게 측정 결과).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 　1.　지방조직으로부터　지방유래　줄기세포(Adipose- DerivedStemCell )의 분리 및 배양

피하지방으로부터 공지된 방법(Kim　et al. J Dermatol Sci　53:96-102, 2009)의 지방흡입술로 인간 지방유래 줄기세포를 수득하였다. 구체적으로, 병원으로부터 공급받은 인간 지방조직을 PBS(일반적으로 사용되는 버퍼)로 2번 세척한 후 0.075% 콜라게나아제(collagenase)를 첨가하여 37℃ 인큐베이터에서 50분간 흔들어 배양하였다. 그 다음으로 상기 배양액에 PBS와 α-MEM 배지를 절반씩 섞은 배지를 첨가한 다음, 1200 rpm에서 원심분리하고 상층액을 제거한 후 펠렛(pellet)으로 가라앉은 물질만을 사용하였다. 분리된 펠렛에 다시 PBS를 넣고 세게 섞은 다음 100 μm 나일로 mesh로 걸러낸 후 원심분리하고 펠렛만을 수득하여 배지에 섞어 배양하였다. 수득된 지방줄기세포는 10% FBS(GIBCO, Invitrogen), 1% 페니실린/스트렙토마이신(GIBCO)이 포함된 α-MEM 배지(Hyclone, Thermo Scientific)로 37℃, 5% CO₂에서 배양하여, 7 ~ 9 계대의 세포를 사용하였다. 유세포분석을 통해 CD44, CD73, CD90, CD105, HLA-1 및 PODXL의 양성 발현 및 CD34 및 CD45의 음성발현 특성을 확인하고(Kim　et al. Cell Death Dis 　4:e588, 2013; Kim　et al., Cell Biol Int　38:32-40, 2014), 지방세포, 골세포 및 연골세포로 분화하는 다분화능을 확인하였다(Song　et al. Stem Cells Dev 　17:451-461, 2008).

실시예 2. 미녹시딜 처리에 따른 지방줄기세포의 이동 및 튜브 형성능 향상 효과

미녹시딜 처리에 따른 지방줄기세포의 이동능력 향상을 확인하기 위하여, 스크래치 분석(assay)과 트랜스웰(transwell)을 이용한 이동능력 테스트를 수행하였다.

구체적으로, 스크래치 분석을 위해 동일 개수의 세포를 6 웰(well) 접시에 완전히 채울 때까지 배양한 다음 적당한 도구를 사용하여 스크래치를 생성하였고, FBS가 없는 배지와 20 μM, 50 μM 농도의 미녹시딜을 첨가한 배지로 구분하여 일정 시간 동안 관찰하고 사진을 찍어 결과를 분석하였다. 그 결과, 도 2A에 나타낸 바와 같이 지방줄기세포에 미녹시딜을 처리한 후 세포 이동 수가 증가한 것을 알 수 있었다.

또한, 트랜스웰(transwell)을 이용한 이동능력 테스트는 동일개수의 세포를 트랜스웰에 시딩(seeding)한 후 아래쪽 챔버 부분에 FBS가 없는 배지와 20 μM, 50 μM 농도의 미녹시딜을 첨가한 배지에서 일정 시간 동안 배양한 후 크리스탈 염색약으로 염색하여 트랜스웰 멤브레인을 이동한 세포의 개수를 분석하였다. 그 결과 도2B에 나타낸 바와 같이, 미녹시딜 처리 후 농도 의존적으로 지방줄기세포의 이동능력이 향상된 것을 알 수 있었다.

또한, 미녹시딜 처리에 따른 지방줄기세포의 튜브 형성능(tube formration) 증가를 확인하기 위해, 12 웰(well) 접시에 마트리겔(materigel)을 코팅한 후 동일 개수의 세포를 시딩(seeding)하고 EBM(endothelial basal cell medium)과 미녹시딜을 첨가하여 일정 시간 동안 배양한 후 사진을 찍고 튜브의 개수를 분석하였다. 그 결과 도 2C에 나타낸 바와 같이, 미녹시딜의 농도에 의존적으로 지방줄기세포의 튜브 형성능이 증가한 것을 알 수 있었다.

실시예 3. 미녹시딜 처리에 따른 지방줄기세포의 파라크린 효과 증가

구체적으로, 지방줄기세포에 20 μM, 50 μM 농도의 미녹시딜을 처리하고 3일후 트리졸(Trizol)로 세포막을 깼다. 다음으로 전체 시료의 1/5부피의 클로로포름을 첨가하여 세게 섞은 후 14000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상층액을 조심스럽게 수득한 후 동량의 이소프로판올 첨가하여 섞고, 30분 이상 냉동 보관하였다가 다시 14000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 펠렛(pellet)만을 수득하기 위하여 상층액을 버리고 70% 에탄올로 한 번 세척한 후 수득한 펠렛을 건조시켜서 RNA 를 분리하였다. 동정된 RNA와 역전사 효소를 반응하여 cDNA를 합성하였다. 생성된 cDNA, 알맞은 프라이머, SYBR 효소 혼합물을 첨가하여 실시간 PCR(real-time PCR)한 후 하우스 키핑 유전자(house keeping gene)인 GAPDH로 보정하여 결과를 도출하였다.

본 실시예에 사용된 프라이머 서열은 하기 [표 1]에 나타내었다.

명칭	서열	서열번호
GAPDH forward	5'-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3'	1
GAPDH reverse	5'-TGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3'	2
CXCL1forward	5'-CATCCAAAGTGTGAACGTGA-3'	3
CXCL1 reverse	5'-CTTAACTATGGGGGATGCAG-3'	4
PD-ECGF forward	5'-GCTGTATCGTGGGTCAGAGT-3'	5
PD-ECGF reverse	5'-AGAATGGAGGCTGTGATGAG-3'	6

그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이 미녹시딜 처리 후 세포성장인자 중 발모효과와 관련이 있는 것으로 알려진 CXCL1과 PD-ECGF의 발현이 유의미하게 증가한 것을 알 수 있었다.

실시예 4. 미녹시딜 처리에 따른 지방줄기세포의 발모효과 증가

본 실시예에서는 지방줄기세포에 미녹시딜을 처리함으로써 발모 효과가 증가하는 것을 확인하였다.

구체적으로, 모발주기의 휴지기 단계에 있는 상전이 동물모델(telogen to anagen transition model)인 7주령의 C3H/HeN 마우스의 등을 면도한 후, FBS 처리한 1 x 10⁴　지방줄기세포(대조군) 및 10 ng/ml 미녹시딜로 24시간 전처리된 지방줄기세포(실험군)를 각각 마우스의 등에 피하 주입하였다(Kim　et al., Stem Cells Dev　23:1364-1376, 2014). 모발주기가 유도되는 표시인 피부 다크닝(darkening)을 모니터링하고, 15일 후 등쪽 모발을 면도하여 무게를 측정하였다.

그 결과, 모발의 성장기 유도는 세포 주입 부위에 한정되지는 않았으며, 피부의 다크닝(darkening) 또는 모발 재생은 등의 모든 부위에서 나타났다(도 3A). 또한, 14일 후 측정한 모발의 무게는 미녹시딜로 전처리된 지방줄기세포군에서 3배 이상 현저히 증가한 것을 알 수 있었다(도 3B).

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Composition for enhancing the action for hair growth of adipose stem cell comprising Minoxidil as an active ingredient <130> 1063041 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward <400> 1 cgagatccct ccaaaatcaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse <400> 2 tgtggtcatg agtccttcca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL1forward <400> 3 catccaaagt gtgaacgtga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL1 reverse <400> 4 cttaactatg ggggatgcag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-ECGF forward <400> 5 gctgtatcgt gggtcagagt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-ECGF reverse <400> 6 agaatggagg ctgtgatgag 20

Claims

미녹시딜(Minoxidil)을 유효성분으로 함유하는, 지방줄기세포의 증식 또는 이동 촉진용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 미녹시딜은 1 ~ 1000 μM 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 지방줄기세포의 증식 또는 이동 촉진용 조성물.
미녹시딜이 첨가된 배지에서 지방줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 지방줄기세포의 증식방법.
제3항에 있어서,
상기 미녹시딜은 1 ~ 1000 μM 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 지방줄기세포의 증식방법.
제3항에 있어서,
상기 방법으로 증식된 지방줄기세포는 하기 특성 중 하나 이상을 가지는 것을 특징으로 하는 지방줄기세포의 증식방법:
ⅰ) 세포 이동능력 증가;
ⅱ) CXCL1 및 PD-ECGF의 발현 증가;
ⅲ) 모발의 성장기 유도.
제3항에 있어서,
상기 배양 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), DMEM-F12(mix of DMEM and Ham's F-12 medium), MEM(Minimum Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), α-MEM(MEM Alpha Modification), RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute 1640), M199/F12(Medium 199 and Ham's F-12 medium), IMEM(Improved MEM) 및 MCDB 131 배지로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 지방줄기세포의 증식방법.
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