KR102003144B1 - 타우에 대한 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

인간 타우 응집체에 대한 모노클로날 항체, 상기 타우 항체를 포함하는 조성물, 및 알츠하이머병, 진행성 핵상 마비 및 픽병을 포함한 신경퇴행성 질환의 치료를 위해 상기 타우 항체를 사용하는 방법.

Description

타우에 대한 항체 및 그의 용도
본 발명은 의약 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 타우에 대한 항체, 상기 타우 항체를 포함하는 조성물, 및 알츠하이머병 (AD), 진행성 핵상 마비 (PSP), 및 픽병 (PD)을 포함한 신경퇴행성 질환의 치료를 위해 상기 타우 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
타우는 미세소관 어셈블리 및 안정성을 촉진시키는 축삭 미세소관 결합 단백질이다. AD 및 PSP는 병리학상 비정상적인 타우 응집을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환이다. 더욱 구체적으로, AD 및 PSP에서, 과다인산화된 타우는 불용성 타우 원섬유 응집을 촉진시켜 미세소관의 탈안정화, 및 뉴런 독성을 유도하는 것으로 여겨지고 있다. 세포 배양물 및 뮤린 모델 연구 결과, 타우 응집체는 타우 응집체 형성을 유도하면서, 뉴런 시냅스 접합부 전역에 확산되고, 단량체 (천연 또는 비-응집된) 타우를 격리시키는 것으로 밝혀졌다. 신경퇴행성 질환 예컨대 AD 및 PSP에서의 타우 응집 및 축적의 신경해부학적 진행은 타우 원섬유 응집이 뉴런 네트워크를 따라 전파되고, 궁극적으로는 미세소관의 탈안정화를 일으키고, 궁극적으로는 국재화된 뉴런 기능 손상을 일으킨다는 것을 제안한다.
타우 응집의 밀도 및 신경해부학적 국재화는 AD 및 PSP 신경학적 증상 및 질환 진행과 강한 상관관계를 갖는다. 예를 들어, AD에서, 타우는 뉴런내 신경원섬유 엉킴 (NFT)을 형성하며, 이는 비강내 통과 영역에서부터 대뇌 변연계 영역까지, 신피질 영역에 이르기까지 차례로 발생하는 경향이 있고, 치매 중증도 및 뉴런 손실 정도와 상관관계를 갖는다. PSP에서, 타우 응집은 피질하부 및 피질 영역 내의 뉴런, 성상세포 및 희소돌기아교세포에서 관찰되며, 응집된 타우의 밀도는 뉴런 손실의 중증도와 상관관계가 있는 것으로 밝혀져 있다.
타우에 대한 항체는 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 8,926,974, 및 국제 공개 번호 WO2011/026031, WO2012/049570, 및 WO2013/050567에는 타우에 대한 항체 및 신경퇴행성 질환 예컨대 AD의 치료를 위한 타우 항체의 용도가 개시되어 있다. 그러나, 현재까지 타우를 표적화하는 항체 중 어느 것도 치료학적 용도에 대하여 승인받은 바 없으며, 현재 AD 또는 PSP용으로 승인받은 질환 조절 요법도 없다. 따라서, 대안적인 타우 항체가 여전히 요구되고 있다. 특히, 타우 응집체에 특이적으로 결합하고, 타우 응집체 형성, NFT 형성 및 뉴런 손실의 전파를 감소시키는 대안적인 타우 항체가 여전히 요구되고 있다. 상기 타우 항체는 바람직하게는 또한 개발, 제조 및/또는 제제화를 촉진시킬 수 있는 우수한 물리화학적 특성을 보유한다.
본 발명은 경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하며, 여기서 LCVR은 상보성 결정 영역 (CDR)인 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, HCVR은 CDR인 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 것인, 인간 타우에 결합하는 모노클로날 항체를 제공한다. 본 발명의 특정한 실시양태에 따라, LCDR1의 아미노산 서열은 서열식별번호(SEQ ID NO): 3에 의해 제시되고, LCDR2의 아미노산 서열은 서열식별번호: 4에 의해 제시되고, LCDR3의 아미노산 서열은 서열식별번호: 5에 의해 제시되고, HCDR1의 아미노산 서열은 서열식별번호: 6에 의해 제시되고, HCDR2의 아미노산 서열은 서열식별번호: 7에 의해 제시되고, HCDR3의 아미노산 서열은 서열식별번호: 8에 의해 제시된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 LCVR 및 HCVR을 포함하며, 여기서 LCVR의 아미노산 서열은 서열식별번호: 9에 의해 제시되고, HCVR의 아미노산 서열은 서열식별번호: 10에 의해 제시되는 것인, 인간 타우에 결합하는 모노클로날 항체를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 포함하며, 여기서 LC의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1에 의해 제시되고, HC의 아미노산 서열은 서열식별번호: 2에 의해 제시되는 것인, 인간 타우에 결합하는 모노클로날 항체를 제공한다.
본 발명은 인간 타우에 결합하는 모노클로날 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 인간 타우의 입체구조의 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체를 제공한다. 특정한 실시양태에서, 인간 타우의 입체구조의 에피토프는 인간 타우의 아미노산 잔기 7-9 및 312-322를 포함하며, 여기서 인간 타우의 아미노산 서열은 서열식별번호: 13에 의해 제시된다.
본 발명은 추가로 본 발명의 모노클로날 항체 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 추가로, 본 발명은 AD, PSP, 또는 PD의 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, AD, PSP, 또는 PD를 치료하는 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명은 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 더욱 특히, 본 발명은 AD, PSP, 또는 PD의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 모노클로날 항체를 투여하는 것을 포함하는, AD, PSP, 또는 PD를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 요법에 사용하기 위한 본 발명의 모노클로날 항체를 제공한다. 더욱 특히, 본 발명은 또한 AD, PSP, 또는 PD 치료에 사용하기 위한 본 발명의 모노클로날 항체를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 AD, PSP, 또는 PD의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 모노클로날 항체의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 핵산 분자 및 발현 벡터에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공한다. 특정한 실시양태에서, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 11에 의해 제시되고, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 12에 의해 제시된다.
추가로, 본 발명은 모노클로날 항체가 발현되도록 하는 조건 하에 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 숙주 세포로부터 LC 및 HC를 포함하는 모노클로날 항체를 회수하는 단계를 포함하며, 여기서 LC의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1에 의해 제시되고, HC의 아미노산 서열은 서열식별번호: 2에 의해 제시되는 것인 방법에 따라 제조된 모노클로날 항체를 제공한다.
본원에 사용되는 "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호연결된 2개의 HC 및 2개의 LC를 포함하는 면역글로불린 분자이다. 각 LC 및 HC의 아미노 말단부는 그 안에 함유되어 있는 CDR을 통해 주로 항원 인식을 담당하는 약 100-120개의 아미노산으로 이루어진 가변 영역을 포함한다. CDR은 프레임워크 영역 ("FR")으로 명명되는, 보존성이 더욱 큰 영역 사이에 산재되어 있다. 각 LCVR 및 HCVR은 아미노 말단에서부터 카르복시 말단까지 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된, 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. LC의 3개의 CDR은 "LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3"으로 지칭되고, HC의 3개의 CDR은 "HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3"으로 지칭된다. CDR은 항원과 특이적인 상호작용을 형성하는 잔기 대부분을 포함한다. 특정한 항원에 결합할 수 있는 항체의 기능적 능력은 6개의 CDR에 의해 크게 영향을 받는다. 본 발명의 항체의 LCVR 및 HCVR 영역 내의 CDR 도메인에의 아미노산 지정은 널리 공지된 카바트(Kabat) 넘버링 체계 (Kabat, et al., Ann. NY Acad . Sci. 190:382-93 (1971); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)), 및 노쓰(North) 넘버링 협약 (North et al., A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations, Journal of Molecular Biology, 406:228-256 (2011))에 기초한 것이다.
LC는 카파 또는 람다로 분류되며, 이는 각각 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 특정한 불변 영역을 특징으로 한다. 본 발명의 모노클로날 항체는 카파 LC를 포함한다. HC는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되며, 이는 각각 IgG, IgM, IgA, IgD, 또는 IgE로서 항체의 이소형을 정의한다. 본 발명의 모노클로날 항체는 IgG HC를 포함한다. IgG 항체는 하위부류, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4로 추가로 분류될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 IgG4이다. 각 HC의 카르복시 말단부는 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 정의한다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 각 HC의 불변 영역에 이펙터 기능을 감소시키는 1종 이상의 변형을 갖는다. 더욱 특정한 실시양태에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 IgG4이고, 잔기 230 및 231 (서열식별번호: 2의 예시된 HC에 기초한 잔기 넘버링) 둘 다에서의 아미노산 알라닌을 포함한 이펙터 기능을 감소시키는 양쪽 HC의 불변 영역에서의 변형을 갖는다. 더욱더 특정한 실시양태에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 IgG4이고, 잔기 230 및 231, 둘 다에서의 아미노산 알라닌을 포함한 이펙터 기능을 감소시키는 양쪽 HC의 불변 영역에서의 변형을 가지고, 잔기 224에서의 아미노산 프롤린을 포함한 안정성을 촉진시키는 양쪽 HC의 불변 영역에서의 추가의 변형, 및 잔기 443 (서열식별번호: 2의 예시된 HC에 기초한 잔기 넘버링)에서의 아미노산 리신의 결실을 갖는다.
본 발명의 항체는 모노클로날 항체 ("mAb")이다. 본 발명에 대한 mAb는 2개의 HC 및 2개의 LC를 함유하는 완전한 mAb이다. 본원에서 지칭되는 바와 같이, mAb는 그를 제조하는 방법이 아닌, 예를 들어, 임의의 진행성, 원핵성, 또는 파지 클론을 포함한 단일 카피 또는 클론으로부터 유래된 항체이다. 모노클로날 항체는 예를 들어, 하이브리도마 기술, 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술, 예를 들어, CDR-이식, 또는 상기 기술 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 기술의 조합에 의해 제조될 수 있다.
항체를 제조 및 정제하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, N.Y., chapters 5-8 and 15, ISBN 0-87969-314-2]에서 살펴볼 수 있다. 예를 들어, AD를 앓는 것을 특징으로 하는 환자의 뇌 조직으로부터 인간 타우 쌍형성한 나선형 필라멘트 ("PHF")로 마우스를 면역화시킬 수 있고 (Jicha et al., J. Neurosci. Res., 15:48(2), 128-132 (April, 1997)), 생성된 항체를 관련 기술분야에 널리 공지된 종래 방법을 사용하여 회수하고, 정제하고, 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 비인간 항체로부터 유래된 CDR 주변에 1종 이상의 인간 프레임워크 영역을 함유하도록 본 발명의 모노클로날 항체를 조작한다. 인간 프레임워크 생식계열 서열은 이뮤노진틱스(ImMunoGeneTics: INGT)로부터 그의 웹사이트, http://imgt.cines.fr을 통해, 또는 문헌 [The Immunoglobulin FactsBook by Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351]을 통해 입수할 수 있다. 본 발명의 특정한 실시양태에 따라, 본 발명의 모노클로날 항체에 사용하기 위한 특정한 생식계열 HC 프레임워크 및 LC 프레임워크 영역은 각각 5-51 및 A27을 포함한다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 항체, 또는 그를 코딩하는 핵산은 단리된 형태로 제공된다. 본원에 사용되는 "단리된"이라는 용어는 세포 환경에서 발견되는 다른 거대분자 종이 없는 또는 실질적으로 없는 단백질, 펩티드 또는 핵산을 지칭한다.
본 발명의 모노클로날 항체는 공지된 방법을 사용하여 제조 및 정제될 수 있다. 예를 들어, HC (예를 들어, 서열식별번호: 2에 의해 제조된 아미노산 서열) 및 LC (예를 들어, 서열식별번호: 1에 의해 제조된 아미노산 서열)를 코딩하는 cDNA 서열을 클로닝하고, GS (글루타민 신타제) 발현 벡터로 조작할 수 있다. 이어서, 조작된 면역글로불린 발현 벡터를 CHO 세포 내로 안정적으로 형질감염시킬 수 있다. 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 항체의 포유동물 발현은 전형적으로 Fc 영역 중 고도로 보존되는 N-글리코실화 부위에서 글리코실화를 유발할 것이다. 안정적인 클론은 타우 응집체에 특이적으로 결합하는 항체의 발현으로 확인할 수 있다. 생물반응기에서 항체 제조를 위해 무혈청 배양 배지로 양성 클론을 확장시킬 수 있다. 항체가 그 안으로 분비된 것인 배지를 종래 기술에 의해 정제할 수 있다. 예를 들어, 배지를 편리하게, 화합성 완충제, 예컨대 포스페이트 완충처리된 염수로 평형화된 단백질 A 또는 G 세파로스 FF 칼럼에 적용시킬 수 있다. 칼럼을 세척하여 비특이적인 결합 성분을 제거한한다. 결합된 항체를 예를 들어, pH 구배에 의해 용리시키고, 항체 분획을, 예컨대 SDS-PAGE에 의해 검출한 후, 풀링한다. 일반적인 기술을 사용하여 항체를 농축시키고/거나, 멸균 여과시킬 수 있다. 크기 배제, 소수성 상호작용, 이온 교환, 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 포함한 일반적인 기술에 의해 가용성 응집체 및 다량체를 효과적으로 제거할 수 있다. 생성물을 즉시 예를 들어, -70℃에서 냉동시킬 수 있거나, 또는 동결건조시킬 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체는 환자 치료에 사용될 수 있다. 더욱 특히, 본 발명의 항체는 AD, PSP, 및 PD를 포함하는, 타우병증으로 명명되는 신경퇴행성 장애 부류를 치료할 것으로 예상된다. 비록 본 발명의 모노클로날 항체가 AD, PSP, 및 PD 치료에 유용할 것으로 예상되지만, 상기 항체는 또한 만성 외상성 뇌병증을 포함한 다른 타우병증 치료에도 유용할 수 있다. 본원에서 상호교환적으로 사용되는 "치료" 및/또는 "치료하는" 및/또는 "치료하다"라는 것은 본원에 기술된 장애 진행의 저속화, 방해, 정지, 제어, 중단 또는 역전이 이루어질 수 있는 모든 프로세스를 지칭하는 것으로 의도되지만, 반드시 장애 증상 모두를 전체적으로 제거한다는 것을 나타내는 것은 아니다. 치료는 타우 응집체 형성, NFT 형성 및 뉴런 손실 중 적어도 1종의 전파를 감소시키는 것이 도움이 되는 인간에서의 질환 또는 장애를 치료하기 위해 본 발명의 항체를 투여하는 것을 포함하고; (a) 질환의 추가 진행을 억제시키는 것, 즉, 그의 발생을 정지시키는 것; 및 (b) 질환을 완화시키는 것, 즉, 질환 또는 장애를 퇴행시키거나, 또는 그의 증상 또는 합병증을 완화시키는 것을 포함한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "환자," "대상체," 및 "개체"라는 용어는 인간을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 환자는 추가로 타우 응집체 형성, NFT 형성, 및 뉴런 손실 중 적어도 1종의 전파를 감소시키는 것이 도움이 되는 질환, 장애, 또는 병태 (예를 들어, 신경퇴행성 장애)를 앓는 것을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 환자는 추가로 타우 응집체 형성, NFT 형성, 및 뉴런 손실 중 적어도 1종의 전파를 감소시키는 것이 도움이 되는 신경퇴행성 장애, 질환, 또는 병태의 발생 위험이 있는 것을 특징으로 한다.
본원에 사용되는 타우에 "결합하다 (또는 결합한다)"라는 용어는 인간 타우 응집체의 에피토프와 항체의 상호작용을 지칭한다. 더욱 바람직하게, 에피토프는 인간 타우의 입체구조의 에피토프이다. 특정한 실시양태에서, 타우에 "결합하다 (또는 결합한다)"라는 용어는 인간 타우 응집체의 아미노산 잔기 7-9 및 312-322 (서열식별번호: 13의 예시된 인간 타우에 기초한 잔기 넘버링)를 포함하는 입체구조의 에피토프와의 상호작용을 지칭한다. 예를 들어, 스플라이스 변이체로부터 생성되는 것과 같은, 인간 타우 단백질의 공지된 변이가 존재함을 이해하여야 한다. 그러나, 상기와 같은 공지된 변이도 서열식별번호: 13의 아미노산 잔기 7-9 및 312-322를 포함하는 입체구조의 에피토프를 보유한다. 그러나, 공지된 변이체는 서열식별번호: 13의 아미노산 잔기 7-9 및 312-322에 대한 변경된 잔기 넘버링을 유발할 수 있다. 비록 일부 변이체에서 잔기 넘버링이 변경될 수는 있지만, 상기 에피토프를 포함하는 아미노산은 동일한 것 그대로 유지된다. 본원에 사용되는 "에피토프"라는 용어는 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 인식되는 항원의 별개의 3차원 부위를 지칭한다.
본 발명의 모노클로날 항체는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있고, 본 발명의 모노클로날 항체 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체(들) 및/또는 희석제(들)를 포함하는 제약 조성물로 도입될 수 있다 (예를 들어, 일반적으로 의사에게 공지되어 있는 것과 같은 제제화 기술의 개요를 제공하는, 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, Loyd V., Ed., Pharmaceutical Press, 2012]). 제약 조성물에 대해 적합한 담체로는, 본 발명의 모노클로날 항체와 조합되었을 때, 분자의 활성을 유지시키고, 환자의 면역계와 비반응성인 임의의 물질을 포함한다.
본 발명의 모노클로날 항체를 포함하는 제약 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 질환 또는 장애의 위험이 있거나, 또는 그를 보이는 환자에게 비경구적 경로(예를 들어, 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 또는 경피적)에 의해서 투여될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 본원에서 상호교환적으로 사용되는 "유효량" 또는 "치료학상 유효량"으로 본 발명의 모노클로날 항체를 함유한다. 유효량은 원하는 치료학적 결과를 달성하는데 필요한 (투여 수단에 대한 및 기간 동안 및 투여량의) 양을 지칭한다. 모노클로날 항체의 유효량은 인자 예컨대 질환 상태, 개체의 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도할 수 있는 모노클로날 항체의 능력에 따라 달라질 수 있다. 유효량은 또한 본 발명의 모노클로날 항체의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 치료학상 유익한 효과가 능가하는 양이다.
조작된 타우 항체
본 발명의 모노클로날 타우 항체를 구축할 때, 화학적 및 물리적 안정성과 연관된 중요한 문제에 직면하였다. 직면한 문제로는 낮은 결합 친화도, 면역원성, 응집, HC 이량체화, 뿐만 아니라 가변 영역 탈아미드화, 산화, 이성질체화 및 미스폴딩을 포함하였다.
예를 들어, 먼저 3개의 MC-1 뮤린 HC CDR을 다중 인간 HC 프레임워크 생식계열 유전자로, 및 3개의 MC-1 뮤린 LC CDR을 다중 인간 LC 프레임워크 생식계열 유전자로 조작함으로써 아미노산 잔기 7-9 및 312-322 (서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 갖는 예시된 인간 타우에 기초한 잔기 넘버링)의 타우 단백질의 입체구조의 에피토프를 인식하는 뮤린 IgG1 항체 MC-1 ("MC-1") (Albert Einstein College of Medicine, Jicha et al., 1997)을 인간화하였다. MC-1의 인간화 구축물은 12개의 HC 프레임워크 생식계열 패밀리 (특이적인 인간 HC 프레임워크: 1-24, 1-46, 1-69, 2-05, 3-15, 3-23, 3-53, 3-72, 4-04, 4-39, 5-51, 및 6-01) 각각의 것 및 8개의 LC 생식계열 패밀리 (특이적인 인간 LC 프레임워크: A-26, A-27, B-2, B-3, L-2, L-12, O11, 및 O-2) 각각의 것을 나타내는, 중쇄 및 경쇄 프레임워크로 이루어진 96개의 상이한 조합을 사용하였다. 각 프레임워크 생식계열 유전자를 중쇄 및 경쇄 인간 IgG4 발현 벡터로 클로닝하고, 발현 및 ELISA에 의한 결합 분석을 위해 HEK293 세포로 형질감염시켰다. 비록 다중 프레임워크 쌍이 ELISA에서 인간 타우에 대하여 어느 정도 수준의 결합을 보이는 것으로 입증된 바 있지만, 생성된 항체 구축물은 불량한 결합 친화도, 응집, HC 이량체화, 및 화학적 안정성 문제 예컨대 탈아미드화, 산화 및 가변 영역에서의 이성질체화를 포함한 수많은 문제들을 보였다.
그러므로, 변형을 조작함으로써 개선된 결합 친화도, 제거 또는 감소된 HC 이량체화, 감소된 면역원성, 개선된 화학적 및 물리적 안정성을 보유하는 타우 항체를 개발하게 되었다. HCDR2 및 HCDR3, 및 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3에서 아미노산 변형 (MC-1 대비, 문헌 [Jicha et al., 1997])을 조작하였다. 본질적으로 상기 기술된 바와 같이, 변형된 뮤린 항체를 3개의 HC CDR을 다중 인간 HC 프레임워크 생식계열 유전자로, 및 3개의 LC CDR을 다중 인간 LC 프레임워크 생식계열 유전자로 조작함으로써 인간화하였다. 추가로, 단백질 안정성에 관한 광범위한 연구를 수행하였고, 조작된 모노클로날 항체를 발현 및 열안정성 특성 뿐만 아니라 결합 친화도 특성에 대해 스크리닝하였다. 7개의 CDR 돌연변이를 함유하는 모노클로날 항체 (아미노산 위치는 하기 표 1에 반영되어 있는 본 발명의 예시된 항체의 선형 아미노산 잔기 넘버링에 기초한 것이다: HCDR2 중 N61E 및 E62K에서; HCDR3 중 P103V 및 Y105D에서; LCDR1 중 G34Q; LCDR2 중 S57D에서; 및 LCDR3 중 H98L에서)는 본 발명의 모노클로날 항체 (MC-1 대비, 문헌 [Jicha et al., 1997])에 대한 결합 친화도, 화학적 및 물리적 안정성, 및 면역원성을 개선시키는 것으로 확인되었다. MC-1 또는 인간화 MC-1 항체 구축물의 특징 규명에서는 상기 변형 중 어느 것도 확인되지 않았다.
본 발명의 예시된 조작된 타우 모노클로날 항체는 표 1에 제시되어 있다. 예시된 조작된 타우 모노클로날 항체는 인간 HC 프레임워크 5-51 및 인간 LC 프레임워크 A27을 포함한다. 예시된 조작된 타우 모노클로날 항체의 다양한 영역의 관계는 하기와 같다 (아미노산 넘버링은 선형 넘버링을 준용하고; 아미노산의 가변 도메인으로의 지정은 www.imgt.org에서 이용가능한 인터내셔널 이뮤노제네틱스 인포메이션 시스템(International Immunogenetics Information System)®에 기초하고; 아미노산의 CDR 도메인으로의 지정은 널리 공지된 노쓰 넘버링 협약에 기초하되, 단, 예외적으로, HCDR2는 널리 공지된 카바트 넘버링 협약에 기초한다):
표 1: 본 발명의 예시된 조작된 타우 모노클로날 항체의 아미노산 영역.
Figure 112017081374487-pct00001
하기 실시예 및 검정은 본 발명의 모노클로날 항체가 타우 응집체의 전파와 연관된 신경퇴행성 장애 예컨대 AD, PSP, 또는 PD를 치료하는데 유용하다는 것을 입증한다. 그러나, 하기 실시예는 제한하는 것이 아니라, 예시로 기술된 것이며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
실시예
조작된 타우 항체의 발현
본질적으로 하기와 같이 본 발명의 조작된 타우 모노클로날 항체를 발현하고, 정제할 수 있다. 서열식별번호: 11의 DNA 서열 (서열식별번호: 1의 LC 아미노산 서열을 코딩함) 및 서열식별번호: 12의 DNA 서열 (서열식별번호: 2의 HC 아미노산 서열을 코딩함)을 함유하는 글루타민 신타제 (GS) 발현 벡터를 사용하여 전기천공에 의해 차이니즈 햄스터 난소 세포주 (CHO)를 형질감염시킨다. 발현 벡터는 SV 조기 (시미안 바이러스 40E) 프로모터 및 GS에 대한 유전자를 코딩한다. GS의 발현을 통해 CHO 세포가 필요로 하는 아미노산인 글루타민을 생화학적으로 합성할 수 있다. 형질감염후, 세포에 대하여 50μM L-메티오닌 술폭시민 (MSX)을 이용한 벌크 선택을 수행한다. MSX에 의한 GS 억제를 사용하여 선택 엄격도를 증가시킨다. 발현 벡터 cDNA가 숙주 세포 게놈의 전사 활성 영역 내로 통합되어 있는 세포를 내인성 수준의 GS를 발현하는 CHO 야생형 세포로부터 선택할 수 있다. 형질감염된 풀을 저밀도로 플레이팅하여 안정적인 발현 세포의 클론 증식에 가까운 증식이 일어날 수 있도록 허용한다. 마스터웰을 항체 발현에 대해 스크리닝한 후, 무혈청 현탁 배양물 중에서 규모를 확장하여 제조하는데 사용한다. 항체가 그 안으로 분비되었던, 정화된 배지를, 화합성 완충제, 예컨대 포스페이트 완충처리된 염수 (pH 7.4)로 평형화된 단백질 A 친화성 칼럼에 적용시킨다. 칼럼을 1M NaCl로 세척하여 비특이 결합 성분을 제거한다. 결합된 타우 모노클로날 항체를 예를 들어, pH (대략) 3.5의 시트르산 나트륨으로 용리시키고, 분획을 1M 트리스 완충제로 중화시킨다. 타우 모노클로날 항체 분획을, 예컨대 SDS-PAGE 또는 분석적 크기-배제에 의해 검출한 후, 이어서, 풀링한다. 가용성 응집체 및 다량체는 크기 배제, 소수성 상호작용, 이온 교환 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 포함한 일반 기술에 의해 효과적으로 제거될 수 있다. 일반 기술을 사용하여 본 발명의 타우 모노클로날 항체를 농축시키고/거나, 멸균 여과시킨다. 상기 크로마토그래피 단계 이후 타우 모노클로날 항체의 순도는 95% 초과이다. 본 발명의 타우 모노클로날 항체를 -70℃에서 즉시 냉동시키거나, 또는 수개월 동안 4℃에서 보관할 수 있다.
결합 동역학 및 친화도
비아코어(BIACORE)® 2000 장치 (25℃에서 HBS-EP+ 전개용 완충제 (지이 헬스케어(GE Healthcare), 10 mM Hepes pH7.4 + 150 mM NaCl + 3 mM EDTA + 0.05% 계면활성제 P20)로 프라이밍됨)로 측정되는 표면 플라스몬 공명 (SPR) 검정을 사용하여 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체의 인간 단량체 (예를 들어, 천연 또는 비-응집체) 타우 및 인간 타우 응집체 둘 다 (둘 다는 서열식별번호: 13으로 기술된 아미노산 서열을 가짐)에의 결합을 측정한다. 인간화 MC-1 항체 구축물 (프레임워크 조합: 5-51 중쇄, A27 경쇄를 가짐)의 인간 단량체 타우 및 인간 타우 응집체에의 결합을 동일한 방식으로 측정한다.
언급된 사항 이외에, 모든 시약 및 물질은 비아코어® AB (스웨덴 웁살라)로부터 입수한 것이다. 4개의 모든 유동 셀 (FC) 위에 고정화된 단백질 A를 함유하는 CM5 칩 (표준 NHS-EDC 아민 커플링을 사용하여 생성됨)을 사용하는 포획 방법을 이용한다. 항체 샘플을 전개용 완충제로 희석하여 0.5μg/mL로 제조한다. 단량체 타우 및 원섬유 타우를 전개용 완충제로 희석하여 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63, 7.82, 3.91, 1.95, 및 0 (블랭크) nM 농도로 제조한다. 각 분석 사이클은 (1) 별개의 유동 셀 (FC2, FC3, 및 FC4) 상에 항체 샘플을 포획; (2) 50 μL/분으로 250μL (300초)의 단량체 타우 또는 타우 원섬유 응집체를 각 FC 상에 주입; (3) 해리 단계를 모니터링하기 위해 20분 동안 완충제 유동으로 복귀; (4) 글리신 (pH1.5) 25 μL (30초) 주입으로 칩 표면 재생; (5) HBS-EP+ 50 μL (60초) 주입으로 칩 표면 평형화로 이루어진다.
타우 응집체에의 결합 데이터를 표준 이중-참조를 사용하여 프로세싱하고, 비아코어 2000 이벨류에이션 소프트웨어, 버전 4.1을 사용하여 1:1 결합 모델로 피팅하여 회합 속도 (k온, M-1s-1 단위), 해리 속도 (k오프, s-1 단위), 및 R최대 (RU 단위)를 결정한다. 평형 해리 상수 (KD)를 관계식 KD = k오프/k온으로부터 계산하였고, 이는 몰 단위이다. 빠른 온 및 오프 속도에 기인하여 상기 기술된 바와 같은 SPR에 의해서는 단량체 타우에의 결합 데이터를 정확하게 결정할 수 없다. 그러므로, 단량체 타우에의 결합에 대한 KD는 반응 단위 대비로 항원 농도를 플롯팅함으로써 항정 상태 결합 피트 모델을 사용하여 수득한다. 생성된 결합 데이터는 하기 표 2에 제시되어 있다.
표 2: 인간 단량체 및 응집체 타우 , 둘 다에 대한 SPR 결합 데이터.
Figure 112017081374487-pct00002
*KD 결과는 상기 결과가 결합력의 영향에 대하여 정규화되지 않은 바 상대적인 것으로 간주된다.
표 2에 제시된 결과는 실시예 1의 타우 모노클로날 항체가 단량체 타우에의 측정가능한 결합을 보유하지 않는 바, 이로써, 친화도 값을 (빠른 온 및 오프 속도에 기인하여) 비아코어 분석법에 의해 정확하게 결정할 수 있다는 것을 입증한다. 반대로, 표 2에 제시된 결과는 실시예 1의 타우 모노클로날 항체가 인간화 MC-1 항체 구축물과 비교 시 타우 응집체에 대하여 개선된 친화도를 보유한다는 것을 입증한다.
효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)을 사용하여 AD 뇌 균질액으로부터의 응집체 타우 원섬유에의 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체의 상대적인 결합 친화도를 결정한다. AD 환자의 뇌 피질 대략 80g으로부터 AD 뇌 균질액을 제조한다. 간략하면, 완충제 (TBS/1mM PMSF/1X 컴플리트(Complete)® 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈(Roche), p/n. 11 697 498 001) 및 포스파타제 억제제 (써모피셔(ThermoFischer), p/n. 78428))를 AD 뇌 조직에 약 10ml/1g (조직)으로 첨가한다. 휴대용 키네마티카 폴리트론을 속도 6-7로 사용하여 조직을 균질화시킨다. 이어서, 조직을 파르 밤 (파르 인스트루먼트(Parr Instrument), p/n. 4653)을 사용하여 1,500 psi 질소 하에 30분 동안 추가로 균질화시킨다. 균질액을 4℃에서 30분 동안 28,000g (J14 베크만 회전자)로 회전시킨다. 상청액을 수집하고, 풀링하고, 세파로스 400 수퍼플로우의 4 cm 고 보호 칼럼 상에서 전개시켜 좀 더 큰 파편을 제거한 후, 시간당 50 - 60 ml 유속으로 25 ml MC1-아피겔 10 칼럼 상에서 전개시켜 MC1-결합 타우 원섬유를 정제한다. 정제 회수율을 최대화시키기 위해, 상청액을 4℃에서 18-20시간 동안에 걸쳐 MC-1 칼럼을 통해 리사이클링한다. 보호 칼럼을 제거하고, MC1 칼럼을 TBS를 이용하여 적어도 40 칼럼 부피로 세척한다. 이어서, 결합된 타우 응집체를 2 칼럼 부피의 3 M KSCN으로 용리시켜 대략 1 ml의 분획을 수집한다. 마이크로타이터 플레이트 브래드포드 검정에 의해 각 용리된 분획 중의 단백질 농도를 체크한다. 양성 단백질 수준을 함유하는 분획을 풀링하고, 4℃에서 센트리콘 (밀리포어 울트라셀-30K)을 이용하여 약 2ml로 농축시키고, 슬라이드-A-라이저 카세트 (10K MWCO 3-12 ml, 피어스(Pierce))를 사용하여 1 리터 TBS에 대하여 밤새도록 투석시킨다. DA-9 포획 항체 및 CP27 검출 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해, AD 뇌 균질액으로부터 정제된 타우 원섬유 내의 타우의 농도를 측정한다.
PBS 중 정제된 타우 원섬유 (50μl)를 0.7 μg/ml의 전체 타우에 상응하는 농도로 96-웰 플레이트 (코스타르(Coastar), p/n. 3690)의 웰 상에 코팅한다. 플레이트를 4℃에서 밤새도록 인큐베이션한 후, 150μl의 PBST (0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS)로 3회에 걸쳐 세척하고, 실온에서 적어도 1시간 (통상적으로는 2시간) 동안 100μl BB3 (이뮤노케미스트리 테크놀로지(ImmunoChemistry Technology), p/n. 643) 중에서 차단시킨다. 차단 후, 차단 완충제를 웰로부터 제거한다. 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체 및 인간화 MC-1 항체 구축물 (프레임워크 조합: 5-51 중쇄, A27 경쇄를 가짐)을 1000nM 스톡이 될 때까지 0.25% 카세인 완충제 중에서 희석시킨 후, 2배 희석액으로 연속하여 23회에 걸쳐 희석시킨다. 50μl의 스톡 및 연속 희석된 항체 (실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 또는 인간화 MC-1 항체 구축물)를 별개의 웰에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 웰당 200μl PBST로 4회에 걸쳐 세척한다. 50μl의 항-인간 IgG-HRP 항체 (0.25% 카세인 완충제 중 1:4000으로 희석됨)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 웰당 200μl PBST로 4회에 걸쳐 세척한다. 50μl의 TMB/H2O2를 첨가하고, 실온에서 약 10분 동안 인큐베이션한다. 50μl 정지액 (2N H2SO4)을 첨가하여 반응을 정지시키고, 450nm에서 비색 신호를 측정한다. 데이터를 프리즘 6 (그래프패드) 프로그램에 입력하고, 비선형 회귀 곡선 피트 및 S자형 용량 곡선을 사용하여 EC50 값을 생성한다. 결과는 하기 표 3에 제시되어 있다.
표 3. 정제된 AD 타우 원섬유에의 결합의 EC 50 비교
Figure 112017081374487-pct00003
표 3에 반영되어 있는 바와 같이, 본 발명의 예시된 타우 모노클로날 항체는 정제된 타우 원섬유에 대하여 인간화 MC-1 항체 구축물보다 60배 개선된 친화도 (EC50에 의해 측정 시)를 입증한다.
직접적인 ELISA에 의해 타우 단량체 대비 타우 응집체에 대한 실시예 1의 타우 모노클로날 항체의 선택성을 결정한다. 실질적으로 상기 제공된 바와 같은 ELISA 방법에 따라, 재조합 타우 (r타우)를 "고"농도 (1μg/mL) 또는 "저"농도 (15ng/mL)에 상응하는 농도로 96-웰 플레이트 상에 코팅한다. 마이크로-웰 플레이트 상에 코팅되었을 때, 고농도의 r타우는 응집되고, 이로써, 응집된 타우에의 결합을 모의한다. 마이크로-웰 플레이트 상에 코팅되었을 때, 저농도의 r타우는 응집되고, 타우 단량체에의 결합을 모의한다. 고농도 또는 저농도의 타우로 코팅된 플레이트를 각각 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체에 노출시키고, 예시된 타우 모노클로날 항체의 각 농도의 r타우에의 결합을 실질적으로 상기 ELISA 검정에 기술된 바와 같이 측정한다. 결과는 하기 표 4에 제시되어 있다.
표 4. " 고"농도 대 " 저"농도의 r타우에의 결합의 EC 50 비교
Figure 112017081374487-pct00004
표 4에 반영된 바와 같이, 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체는 단량체 타우에 비하여 응집체 타우에 대해 120배 개선된 친화도 (EC50에 의해 측정 시)를 입증한다.
생체외 표적 결속 연구
"정상" 개체 (최소의 타우 응집을 보임); AD 환자 (심각한 타우 응집 및 NFT 형성, 뿐만 아니라 아밀로이드 플라크 병상을 보임); PD 환자 (심각한 타우 응집을 보임)로부터 수득된 포르말린-고정된 파라핀-포매된 (FFPE) 뇌 절편의 면역조직화학법 염색을 통해 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체의, 인간 뇌로부터 유래된 응집된 타우에의 결합을 결정한다. 배경 비-특이적인 염색 수준을 결정하기 위해 인간 타우를 전혀 보유하지 않는 "대조군" 야생형 마우스로부터 유래된 뇌 절편 상에서도 또한 염색을 수행한다.
FFPE 절편에서 파라핀을 제거하고, 재수화시킨다. 이후, 100℃에서 20분 동안 시트레이트 완충제 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), p/n. TA-250-PM1X) 중에서 절편을 가열한 후, dH20 중에서 절편을 냉각시키는 것을 포함하는 (랩 비전 PT 모듈 시스템 (써모 사이언티픽)을 이용함) 항원 회수를 절편에 대해 수행한다. 이어서, 절편을 하기 7개의 인큐베이션 단계에 노출시킨다 (실온에서): (1) 0.03% H2O2 중에서 10분; (2) PBST 중에 희석된 정상 염소 혈청 (벡터 랩스(Vector Labs.), p/n. S-1000)의 1:20 희석액 중에서 30분; (3) 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체 또는 인간화 MC-1 항체 구축물 (프레임워크 조합: 5-51 중쇄, A27 경쇄를 가짐) (예시된 타우 모노클로날 항체 및 인간화 MC-1 항체 구축물 둘 다는 절편과의 인큐베이션 이전에 1mg/ml로 정규화된 후, PBST 중에서 1:4000의 희석액으로 희석됨) 중에서 60분; (4) PBST 중 1.1μg/ml 농도의 (예시된 항체의 Fc 영역에 대한) 토끼 항-인간 IgG4 중 30분; (5) PBST 중에서 희석된 비오티닐화된 염소 항-토끼 IgG (벡터 랩스., p/n. BA-1000)의 1:200 희석액 중에서 30분: (6) 아비딘-비오틴 복합체 용액 (벡터 랩스., p/n. PK-7100) 중에서 30분: (7) 3,3'-디아미노벤지딘 (벡터 랩스., p/n. SK-4105) 중에서 5분. 상기 7개의 단계의 각 단계 사이에 절편을 PBST를 사용하여 세척한다. 상기 7개의 인큐베이션 단계 후, 절편을 헤마톡실린으로 대조염색하고, 탈수시키고, 커버슬립으로 덮는다. 마우스 "대조군" 조직 절편의 경우에, 인큐베이션 단계 (3)에서 예시된 타우 모노클로날 항체 및 인간화 MC-1 항체 구축물 둘 다의 1:8000 희석액을 사용함으로써 (1:4000 희석액과 대조); 및 인큐베이션 단계 (4) 및 (5)를 단일로, PBST 중 비오티닐화된 염소 항-인간 IgG (벡터 랩스., p/n. BA-3000)의 1:200 희석액 중에서 30분인 것로 대체함으로써 상기 프로토콜을 변형시킨다.
실질적으로 상기 기술된 바와 같은 방법 후, 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체의 인간 뇌로부터 유래된 타우에의 결합에 관한 분석을 수행한다. 결과는 하기 표 5에 제시되어 있다.
표 5. FFPE AD 뇌 절편에서의 응집된 타우에의 결합에 관한 반정량적 분석.
Figure 112017081374487-pct00005
표 5에 제시된 결과는 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체가 인간화 MC-1 항체 구축물과 비교 시 AD 및 PD 환자 둘 다로부터의 해마 뇌 절편 중 응집된 타우에 대하여 유의적으로 더 높은 수준의 염색을 입증한다는 것을 반영한다. 표 5에 제시된 결과는 또한 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체가 인간화 MC-1 항체 구축물보다 더 높은 비-특이적인 결합을 입증하지 않음 (예시된 타우 모노클로날 항체가 정상 대조군 인간 절편에서 최소량의 응집된 타우에의 결합을 입증함)을 입증한다. 추가로, AD 및 PD는 타우를 코딩하는 유전자의 독특한 스플라이싱 변이체를 특징으로 하기 때문에, 상기 결과는 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체가 AD 및 PD 둘 다의 타우 응집체에 공통된 인간 타우의 아미노산 잔기 7-9 및 312-322 (서열식별번호: 13의 예시된 인간 타우에 기초한 잔기 넘버링)를 포함하는 입체구조의 에피토프에 특이적으로 결합한다는 결론을 뒷받침한다.
타우 응집체 전파의 시험관내 중화
대략 5개월령 P301S 마우스로부터의 균질액 뇌 프렙은 천연, 비-응집체 타우의 존재 하에 천연 타우의 응집을 유도하고, 타우 응집의 전파 유사 효과를 입증하는 것으로 공지되어 있다. 4.5 내지 5개월령 P301S 마우스로부터의 뇌 조직의 사르코실 불용성 균질액 프렙을 초음파 처리하고, OPTI-MEM (라이프 테크.(Life Tech.)에 의한 깁코(GIBCO), p/n. 31985-062)으로 희석시켜 (프렙당) 측정된 타우 최종 농도가 0.77 μg/ml가 되도록 만든다. 각 프렙을 실온에서 30분 동안 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체 (농도: 21.00, 7.00, 2.33, 0.78, 0.26, 0.09, 0.03, 및 0.01μg/ml) 또는 인간화 MC-1 항체 구축물 (농도: 50.00, 16.67, 5.56, 1.85, 0.62, 0.21, 0.07, 0.02 및 0.01μg/ml) 중 1종과 인큐베이션한다.
인간 타우의 돌연변이체 형태 (1N4L, 잔기 301에 프롤린 대신 세린으로 치환되어 있는 것 (P301S) (서열식별번호: 13의 예시된 인간 타우에 기초한 잔기 넘버링))를 유도가능하게 발현하도록 HEK293 세포 (인간 배아 신장 세포주)를 전기천공에 의해 형질감염시킨다. (Falcon B., et al., J. Biol. Chem. 290:1049-1065, 2015). 안정하게 형질감염된 HEK293 세포를 완전 배지 (D-MEM 배지 (인비트로젠, p/n. 11965-092), 10% 우태아 혈청 (인비트로겐, p/n. 16000), 1x 페니실린 스트렙토마이신 (인비트로겐, p/n. 15140-122), 5μg/ml 블라스티시딘 (인비트로겐, p/n. R210-01), 200μg/ml 제오신 (인비트로겐, p/n. R250-01)) 중 96-웰 플레이트의 웰에 1x104개의 세포/웰인 농도로 플레이팅한다. 플레이트를 37℃에서 3일 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 1 mg/ml 테트라시클린을 웰당 1:1000의 희석률로 (최종 농도가 1 μg 테트라시클린/ml 배지가 될 때까지) 첨가하여 돌연변이체 타우의 발현을 유도한다. 이어서, 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 배양 배지를 제거하고, 상기 각 농도 중 1종의, 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체 또는 인간화 MC-1 항체 구축물 (상기 기술된 바와 같이 제조됨) 중 1종과 함께 50μl의 균질액 프렙을 첨가한다. 플레이트를 3시간 동안 인큐베이션한 후, 균질액 프렙을 제거하고, 1μg/ml 테트라시클린 및 동일한 각 농도의 예시된 타우 모노클로날 항체 또는 인간화 MC-1 항체 구축물과 함께 100μl 완전 배지를 각자의 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 배지를 제거하고, 100μl 완전 배지 및 동일한 각 농도의 예시된 타우 모노클로날 항체 또는 인간화 MC-1 항체 구축물을 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 세포를 200μl DPBS로 세척하고, 배출시킨다.
세포를 웰당 50μl H 완충제 (2 mM EGTA, 5 mM EDTA, 프로테아제 및 포스파타제 억제제 (써모 사이언티픽, p/n. 784420)를 함유하는 TBS pH7.4) 중에 재현탁시키고, 10분 동안 초음파조에서 초음파 처리한다. BCA™ 프로테인 어세이(BCA™ Protein Assay) (써모 사이언티픽, p/n. PI-23227)에 의해 전체 단백질 농도를 결정한다. 샌드위치 ELISA에 의해 타우 응집체 수준을 측정한다. 96-웰 플레이트를 4℃에서 밤새도록 50μl의 2μg/ml AT8 항체로 코팅한다. 플레이트를 PBST로 3회에 걸쳐 세척한 후, 실온에서 1시간 동안 100μl의 BB3으로 차단한다. 출발 농도 40 μg/ml에서부터 최종 농도 0.3125 μg/ml까지의 2배 희석액을 이용하는 0.25% 카세인 완충제 중에서의 연속 희석에 의해 AD 뇌 전체 추출물을 사용하여 표준 곡선을 작성한다. 세포 용해물을 0.25% 카세인 완충제 중에 전체 단백질 농도가 약 0.1 mg/ml가 될 때까지 희석시킨다. 이어서, 50 ul의, 각 표준 샘플 희석액 또는 희석된 세포 샘플을 차단된 플레이트의 개별 웰에 첨가하고, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBST로 4회에 걸쳐 세척한다. 비오티닐화된 CP27 항체를 0.25% 카세인 완충제 중에 1:2000으로 희석시킨 후, 이어서, 50μl를 샘플을 함유하는 웰 내로 첨가한다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBST로 4회에 걸쳐 세척한다. 스트렙아비딘-HRP (인비트로겐, p/n. SNN2004)를 0.25% 카세인 완충제 중에 1:5000으로 희석시킨 후, 이어서, 50μl를 각 웰 내로 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 플레이트를 PBST로 4회에 걸쳐 세척하고, H2O2 및 TMB의 1:1 혼합물 (써모 사이언티픽, p/n. 34021) 50μl를 첨가한다. 플레이트를 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고, 50μl의 H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시킨다. 450nm 또는 650nm에서 비색 신호를 결정한다. 각 샘플 중 전체 단백질 수준에 대하여 AT8-양성 타우 수준을 정규화한다. 각 샘플에 대한 정규화된 값을 대조군 샘플 (항체로 처리되지 않음) 중의 AT8-양성 타우 수준에 대하여 추가로 정규화한다. 100에서 추가로 정규화된 값을 감산하여 각 샘플에서의 타우 응집체 전파의 백분율 억제를 측정하고, 각 샘플에 대한 억제 값의 백분율을 프리즘 6 소프트웨어 프로그램 (그래프패드)에 입력하고, EC50 값 생성을 위해 비선형 회귀 곡선 피트 및 S자형 용량 곡선을 적용한다. 본 결과는 하기 표 6에 제시되어 있다.
표 6. 타우 응집체 전파 억제를 나타내는 EC 50 값.
Figure 112017081374487-pct00006
표 6에 제시된 결과는 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체가 유도된 타우 응집체 전파 억제를 대략 30배 정도의 개선을 입증한다는 것을 반영한다.
타우 응집체 전파의 생체내 중화
대략 5개월령 P301S 마우스로부터의 균질액 뇌간 프렙은 정상적인 10주된 암컷 P301S 마우스의 해마 내로의 주사 시 천연, 비-응집체 타우의 응집을 유도하는 것으로 공지되어 있으며, 이는 타우 응집의 전파 유사 효과를 입증하는 것이다. 4.5 내지 5개월령 P301S 마우스로부터의 뇌간 조직의 균질액 프렙을 실질적으로 상기 기술된 바와 동일하게 제조한다.
정상적인 10주된 암컷 P301S 마우스의 해마의 좌반구에 5μl 균질액 뇌 프렙 및 7.5μg의 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체 (N=12); 또는 7.5 μg의 대조군 인간 IgG4 항체 (N=11)를 주사한다. 주사후 4주째, 마우스를 희생시키고, 좌반구 및 우반구를 수집하고, 파라핀에 포매시키고, 6μm 연속 절편을 유리 슬라이드에 탑재한다. 브레그마 (A-P = -2.30)를 함유하는 슬라이드에서 파라핀을 제거하고, 포매된 조직을 재수화시키고, 시트레이트 완충제 중에서 20분 동안 100℃까지 슬라이드를 가열시킴으로써 항원 회수를 수행한다. 슬라이드를 dH2O 중에서 냉각시키고, 실온에서 하기 단계에 따라 인큐베이션한다: (a) (0.03%) H2O2 중에서 10분; (b) 정상 염소 혈청의 1:20 희석액 중에서 30분; (c) PG-5 항체 (PBST 중에 희석됨) (예시바 대학교의 알버트 아인슈타인 의과대학(Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University)의 피터 데이비스(Peter Davies) 박사의 랩으로부터 입수한 PG-5 항체; PG-5 항체는 인산화되었을 때, 타우의 잔기 409의 세린에 특이적으로 결합한다 (서열식별번호: 13의 예시된 인간 타우에 기초한 잔기 넘버링))의 1:8000 희석액 중에서 60분; (d) 비오티닐화된 염소 항-마우스 IgG 항체의 1:200 희석액 (PBST 중에 희석됨) 중에서 30분; (e) 아비딘-비오틴 복합체 용액 중에서 30분: 및 (f) 3,3'-디아미노벤지딘 중에서 5분. 각 단계 사이에 세척하는데 PBST를 사용한다. 3,3'-디아미노벤지딘 중에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 절편을 헤마톡실린으로 대조염색한 후, 이어서, 재수화시키고, 커버슬립으로 덮는다. 20x 배율로 스캔스코프 AT 슬라이드 스캐너 (아페리오(Aperio))에 의해 염색 신호를 측정한다. PG-5 면역반응성을 정량화하고, 이미지스코프 소프트웨어 (v. 11.1.2.780, 아페리오)의 양성 픽셀 알고리즘을 사용하여 백분율로서 표시한다. 결과는 하기 표 7에 제시되어 있다.
표 7. 각각 좌측 및 우측 해마에서의 평균 % PG -5 면역반응성.
Figure 112017081374487-pct00007
표 7에 제시된 결과는 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체가 대조군 IgG4 항체와 비교 시 좌측 및 우측 해마 둘 다에서 타우 응집의 수준을 감소시킨다는 것을 입증한다. 제시된 바와 같이, 예시된 타우 모노클로날 항체는 대조군 IgG4 항체와 비교 시 각각 좌측 해마에서는 타우 응집을 60.5% 초과로 감소시키고, 우측 해마에서는 타우 응집을 66.5% 초과로 감소시킨다. 이러한 결과는 예시된 타우 모노클로날 항체가 타우 응집 전파에 대하여 중화 활성을 보유한다는 것을 입증하는 것이다.
Tg4510 뮤린 모델에서의 생체내 효능 분석
트랜스제닉 Tg4510 마우스는 인간 타우의 돌연변이체 형태 (4R0N, 잔기 301에 프롤린 대신 류신으로 치환되어 있는 것 (P301L), 문헌 [Ramsden M., et al., J. Neuroscience., 25: 10637-10647 (2005)] 및 [Santacruz K., et al., Science (2005)]; 서열식별번호: 13의 예시된 인간 타우에 기초한 잔기 넘버링)를 발현한다. Tg4510 마우스는 해마 및 신피질 영역에서 높은 수준의 P301L 돌연변이체 인간 타우 발현을 보이는데, 이는 연령-의존성 타우 응집 진행을 입증하는 것이다.
본 발명의 타우 항체는 Tg4510 마우스에서 면역원성 반응을 유도할 수 있다. 그러므로, 설치류 모델에서의 만성 투여를 위한 본 발명의 타우 모노클로날 항체의 치료학적 잠재능을 시험하기 위해, 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체 대비 동일한 입체구조의 에피토프를 표적화하고, 유사한 수준의 개선된 친화도를 반영하는 대용물 뮤린 타우 항체를 구축한다. (실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체에 대하여) 상기 기술된 바와 같은 ELISA에 의해 측정 시 정제된 AD 타우 원섬유에 대하여 대용물 타우 항체는 13.1 pM인 친화도 (EC50)를 갖는다.
8주령 암컷 Tg4510 마우스를 3개의 별개 군으로 나눈다. 제1군 (N=15)에는 대조군 마우스 IgG1 항체 (15mg/kg)를 9주 동안 주 2회에 걸쳐 주사한다. 제2군 (N=15)에는 MC-1 하이브리도마를 주사맞은 마우스 복수로부터 생산된 재조합 MC-1 항체 (15mg/kg)를 9주 동안 주 2회에 걸쳐 주사한다. 제3군 (N=15)에는 대용물 뮤린 타우 항체 (15mg/kg)를 9주 동안 주 2회에 걸쳐 주사한다. 최종 투여 후, 마우스를 희생시키고, 그의 뇌를 수집한다. 피질 및 해마 절편의 일부를 수집하고, 파라핀에 포매시키고, 6μm 연속 절편을 면역조직화학법 용도의 유리 슬라이드 상에 탑재한다.
수집된 뇌의 피질 영역 중 나머지 부분은 피질 부피보다 10배 더 큰 부피의 H 완충제 중에서의 펄스 초음파 처리에 의해 균질화시키고, 4℃에서 20분 동안 21,000g로 회전시키고, 각 피질로부터의 상청액 분취물을 수집하고, BCA™ 프로테인 어세이 (써모 사이언티픽, p/n. PI-23227)에 의해 제조사의 프로토콜에 따라 전체 단백질 수준을 결정한다. 상청액 나머지를 4℃에서 1시간 동안 100,000g로 회전시키고, 상청액을 폐기하고, 수득된 불용성 펠릿을 (폐기된 상청액 부피의 ½ 부피의) H 완충제 중에 재현탁시킨다. 재현탁된 펠릿을 초음파 처리하고, 실질적으로 상기 기술된 바와 같이 AT8 포획 항체 및 CP27 검출 항체를 사용하여 ELISA에 의해 각 펠릿 중의 AT8-양성 타우 응집체 수준을 결정한다. AT8-양성 타우 응집체 수준을 전체 단백질 수준에 대하여 정규화한다.
유사하게, 수집된 뇌로부터의 해마 중 나머지 부분은 해마 부피보다 10배 더 큰 부피의 H 완충제 중에서의 펄스 초음파 처리에 의해 균질화시키고, 4℃에서 20분 동안 21,000g로 회전시키고, 각 해마로부터의 상청액을 수집하고, 전체 단백질 수준을 결정한다. 실질적으로 상기 기술된 바와 같이 AT8 포획 항체 및 CP27 검출 항체를 사용하여 ELISA에 의해 각 상청액 중의 AT8-양성 타우 응집체 수준을 결정한다. AT8-양성 타우 응집체 수준을 전체 단백질 수준에 대하여 정규화한다. 결과는 하기 표 8에 제시되어 있다.
표 8. ELISA에 의해 측정된 피질 및 해마 뇌 균질액 중의 AT8-양성 타우 응집체의 수준.
Figure 112017081374487-pct00008
표 8에 제시된 결과는 대용물 뮤린 타우 항체가 대조군 mIgG1 처리된 마우스와 비교 시 피질 및 해마 둘 다에서 타우 응집체 수준을 각각 24% 및 35%만큼 감소시켰다는 것을 입증한다. 본 결과는 추가로 재조합 뮤린 MC-1 항체로 처리된 마우스는 대조군 mIgG1 처리된 마우스와 비교 시 타우 응집체 수준을 감소시키는데 있어 개선되지 않았다는 것을 보여준다.
수집된 뇌로부터 제조된 파라핀 포매된 절편의 피질 및 해마에서의 타우 응집 수준을 실질적으로 상기 기술된 바와 같이 PG-5를 사용하여 면역조직화학법에 의해 측정한다. log10 값으로 변환시켜 데이터를 정규화하고, 결과는 하기 표 9에 요약되어 있다.
표 9. 피질 및 해마에서의 % PG -5 면역반응성의 평균 log 10 값.
Figure 112017081374487-pct00009
표 9에 제시된 결과는 대용물 뮤린 타우 항체는 대조군 mIgG1 항체와 비교 시 피질 (18%만큼) 및 해마 (43%만큼) 둘 다에서 타우 응집체의 수준을 감소시킨 반면, 재조합 뮤린 MC-1 항체는 대조군 mIgG1 항체와 비교 시 피질 또는 해마에서 타우 응집체 수준의 현저한 감소를 입증하지는 못했다는 것을 입증한다.
조작된 타우 모노클로날 항체의 물리-화학적 특성
실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체는 우수한 용해도, 화학적 안정성 및 물리적 안정성을 입증한다.
용해도:
편리한 투약이 이루어질 수 있도록 하는데 충분히 높은 용해도가 요구된다. 예를 들어, 1.0 mL 주사에 의해 100 kg 환자 내로 1 mg/kg 용량을 투여하는데 100mg/ml의 용해도가 요구될 것이다. 추가로, 고농도의 고분자량 (HMW) 응집 없이 항체를 단량체 상태로 유지시키는 것 또한 바람직할 수 있다. 10 K 분자량 컷-오프 필터 (아미콘 U.C. 필터, 밀리포어(Millipore), 카탈로그 번호 UFC903024)를 이용하여 15mg의 예시된 항체를 100μl 미만인 부피로 농축시켜 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체의 용해도를 분석한다. 나노드롭 2000 (써모 사이언티픽)을 사용하여 A280에서의 UV 흡광도에 의해 샘플의 최종 농도를 측정하였다.
실질적으로 상기 기술된 바와 같은 방법 후, 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체는 140 mg/ml 초과 (10 mM 시트레이트 완충제 중 pH 6에서); 177 mg/ml 초과 (150 mM NaCl을 포함하는 10 mM 시트레이트 완충제 중 pH 6에서); 및 170 mg/ml 초과 (PBS 완충제 중 pH 7.4에서)인 용해도를 나타낸다. 추가로, 오직 낮은 수준의 HMW만이 (~3 내지 ~5.4%) 고농도로 존재하고, 어떠한 상 분리도 관찰되지 않는다.
화학적 및 물리적 안정성:
화학적 안정성은 충분한 저장 수명을 갖는 약물 제제의 개발을 촉진시킨다. 예시된 타우 항체를 10 mM 시트레이트 및 완충처리된 pH 4, 5, 6, 또는 7 중에서 1mg/ml 농도로 제제화하여 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체의 화학적 안정성을 사정한다. 가속 분해 연구에서 제제화된 샘플을 4℃, 25℃, 또는 40℃에서 4주 동안 인큐베이션한다. 표준 방법에 따라 모세관 등전점 포커싱 (cIEF)을 사용하여 화학적 변화를 반영하는 것인 항체의 전하 프로파일 변화를 사정한다.
실질적으로 상기 기술된 바와 같은 방법 후, 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체는 하기 표 10에 제시된 화학적 안정성 결과를 입증한다.
표 10. cIEF에 의해 측정된, 4℃에서 인큐베이션된 샘플 대비 4주 동안에 걸친 % 주요 피크의 변화, 및 SEC에 의해 측정된 % HMW 응집체의 변화에 관한 요약.
Figure 112017081374487-pct00010
표 10에 제시된 결과는 40℃에서 4주 동안의 보관 후, 실시예 1의 예시된 타우 항체는 pH5로 제제화되었을 때, 주요 피크의 백분율은 단지 1.1 백분율 포인트 감소, 및 pH6 (항체 제제화에 사용되는 일반적 pH)으로 제제화되었을 때에는 단지 0.3 백분율 포인트 감소를 보였다는 것을 입증한다. 추가로, 질량 분석법 분석은 40℃에서의 4주 동안 보관 후, 오직 최소량의 분해만이 관찰되었다는 것을 입증하며 (~1.5% LCDR1 탈아미드화, 모든 CDR 서열에서 5% 미만 분해), 이는 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체가 충분한 화학적 안정성을 가지며, 이로써, 적절한 저장 수명을 갖는 용액 제제의 개발을 촉진시킨다는 것을 시사한다.
비교 목적으로, pH8 하에 40℃에서 2주 동안 항체를 인큐베이션함으로써 인간화 MC-1 항체 구축물 (프레임워크 조합: 5-51 중쇄, A27 경쇄를 가짐)의 화학적 및 물리적 안정성을 수행한다. 인간화 MC-1 항체 구축물은 LCDR1의 12% 탈아미드화, HCDR3에서의 5% 탈아미드화 및 10% 이성질체화, 및 HC 프레임워크에서의 3% 산화를 포함한 유의적인 화학적 분해를 보였다.
4주 가속 분해 연구 후, 예시된 모노클로날 항체를 10 mM 시트레이트 및 완충처리된 pH 4 또는 6 중에서 1 mg/ml 농도로 제제화하여 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체의 결합 친화도를 사정한다. 제제화된 샘플을 가속 분해 연구에서 4℃ 또는 40℃에서 4주 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 실질적으로 상기 기술된 바와 같은 ELISA 방법에 따라 직접적인 ELISA에 의해 96-웰 플레이트 상에 코팅된 r타우 (15 ng/ml)에 대한 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체의 결합 친화도를 결정한다. 이중으로 수행된, 상기 기술된 결합 친화도 연구의 결과는 하기 표 11에 제시되어 있다.
표 11. 가속 분해 연구 이후의 EC 50 비교.
Figure 112017081374487-pct00011
표 11은 r타우에 대한 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체의 결합 친화도는 4℃에서 인큐베이션된 대조군 샘플과 비교 시 4주 가속 분해 후 샘플의 경우에 유사하게 유지되었다는 것을 입증한다.
서열
서열식별번호: 1 - 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체의 LC
Figure 112017081374487-pct00012
서열식별번호: 2 - 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체의 HC
Figure 112017081374487-pct00013
서열식별번호: 3 - 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체의 LCDR1
Figure 112017081374487-pct00014
서열식별번호: 4 - 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체의 LCDR2
Figure 112017081374487-pct00015
서열식별번호: 5 - 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체의 LCDR3
Figure 112017081374487-pct00016
서열식별번호: 6 - 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체의 HCDR1
Figure 112017081374487-pct00017
서열식별번호: 7 - 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체의 HCDR2
Figure 112017081374487-pct00018
서열식별번호: 8 - 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체의 HCDR3
Figure 112017081374487-pct00019
서열식별번호: 9 - 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체의 LCVR
Figure 112017081374487-pct00020
서열식별번호: 10 - 실시예 1의 예시된 타우 모노클로날 항체의 HCVR
Figure 112017081374487-pct00021
서열식별번호: 11 - 예시된 LC (서열식별번호: 1)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
Figure 112017081374487-pct00022
서열식별번호: 12 - 예시된 HC (서열식별번호: 2)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
Figure 112017081374487-pct00023
서열식별번호: 13 - 인간, 전장 타우의 아미노산 서열
Figure 112017081374487-pct00024
SEQUENCE LISTING <110> ELI LILLY AND COMPANY <120> ANTIBODIES TO TAU AND USES THEREOF <130> X20624 <150> US 62/121,116 <151> 2015-02-26 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC of exemplified tau monoclonal antibody of Example 1 <400> 1 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gln Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Asp Asn Arg Phe Ser Gly Ile Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr Leu Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 2 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC of exemplified tau monoclonal antibody of Example 1 <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Ser Ile Lys Tyr Glu Lys Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Asn Tyr Val Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 340 345 350 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 of exemplified tau monoclonal antibody of Example 1 <400> 3 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gln Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 of exemplified tau monoclonal antibody of Example 1 <400> 4 Tyr Lys Val Asp Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 of exemplified tau monoclonal antibody of Example 1 <400> 5 Ser Gln Ser Thr Leu Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 of exemplified tau monoclonal antibody of Example 1 <400> 6 Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 of exemplified tau monoclonal antibody of Example 1 <400> 7 Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Ser Ile Lys Tyr Glu Lys Asn Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 of exemplified tau monoclonal antibody of Example 1 <400> 8 Ala Arg Arg Gly Asn Tyr Val Asp Asp 1 5 <210> 9 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCVR of exemplified tau monoclonal antibody of Example 1 <400> 9 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gln Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Asp Asn Arg Phe Ser Gly Ile Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr Leu Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 10 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCVR of exemplified tau monoclonal antibody of Example 1 <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Ser Ile Lys Tyr Glu Lys Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Asn Tyr Val Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide Sequence Encoding the Exemplified LC (SEQ ID NO:1) <400> 11 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatc agaacaccta tttacattgg 120 taccagcaga aacctggcca ggctcccagg ctcctcatct ataaagttga caaccgattt 180 tctggcatcc cagacaggtt cagtggcagt gggtctggga cagacttcac tctcaccatc 240 agcagactgg agcctgaaga ttttgcagtg tattactgtt ctcaaagtac actggttccg 300 ctcacgttcg gcggagggac caaggtggag atcaaacgga ccgtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgc 657 <210> 12 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide Sequence Encoding the Exemplified HC (SEQ ID NO: 2) <400> 12 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggcta cacattcagt aactactgga tagagtgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatgggggag attttacctg gaagtgatag tattaagtac 180 gaaaagaatt tcaagggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagaaggggg 300 aactacgtgg acgactgggg ccagggcacc ctggtcaccg tctcctcagc ttctaccaag 360 ggcccatcgg tcttcccgct agcgccctgc tccaggagca cctccgagag cacagccgcc 420 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cgaagaccta cacctgcaac 600 gtagatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagtccaa atatggtccc 660 ccatgcccac cctgcccagc acctgaggcc gccgggggac catcagtctt cctgttcccc 720 ccaaaaccca aggacactct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 780 gacgtgagcc aggaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggatgg cgtggaggtg 840 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagttcaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 900 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 960 aacaaaggcc tcccgtcctc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1020 gagccacagg tgtacaccct gcccccatcc caggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1080 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggaaagcaat 1140 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1200 ttcctctaca gcaggctaac cgtggacaag agcaggtggc aggaggggaa tgtcttctca 1260 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacac agaagagcct ctccctgtct 1320 ctgggt 1326 <210> 13 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequence of Human, Full-Length Tau <400> 13 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 210 215 220 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 225 230 235 240 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val 245 250 255 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln 275 280 285 Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser 305 310 315 320 Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln 325 330 335 Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser 340 345 350 Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn 355 360 365 Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala 370 375 380 Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser 385 390 395 400 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser 405 410 415 Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val 420 425 430 Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 435 440

Claims (16)

  1. 경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하며,
    LCVR의 아미노산 서열은 서열식별번호: 9에 의해 제시되고,
    HCVR의 아미노산 서열은 서열식별번호: 10에 의해 제시되는 것인
    인간 타우에 결합하는 모노클로날 항체.
  2. 제1항에 있어서, 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 포함하며,
    LC의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1에 의해 제시되고,
    HC의 아미노산 서열은 서열식별번호: 2에 의해 제시되는 것인
    모노클로날 항체.
  3. 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는
    DNA 분자.
  4. 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 분자, 및
    서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 분자
    를 포함하며,
    서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 경쇄, 및
    서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄
    를 포함하는 모노클로날 항체를 발현할 수 있는 것인 포유동물 세포.
  5. 제3항의 DNA 분자를 포함하며,
    서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 경쇄, 및
    서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄
    를 포함하는 모노클로날 항체를 발현할 수 있는 포유동물 세포.
  6. 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 경쇄, 및
    서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄
    를 포함하는 모노클로날 항체를 제조하는 방법이며,
    상기 모노클로날 항체가 발현되도록 하는 조건 하에 포유동물 세포를 배양하는 단계, 및
    발현된 모노클로날 항체를 회수하는 단계
    를 포함하며, 상기 포유동물 세포는
    (i) 제4항의 포유동물 세포, 또는
    (ii) 제5항의 포유동물 세포인
    방법.
  7. 제6항의 방법에 의해 제조된 모노클로날 항체.
  8. 유효량의 제1항 또는 제2항의 모노클로날 항체를 포함하는, 알츠하이머병, 진행성 핵상 마비 또는 픽병을 치료하기 위한 제약 조성물.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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