BR112017015259B1 - Anticorpos monoclonais anti-tau, composição farmacêutica e uso dos mesmos - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS PARA TAU E SEUS USOS. Anticorpos monoclonais para agregado de tau humana, composições compreendendo tais anticorpos de tau e métodos de utilização de tais anticorpos de tau para o tratamento de doenças neurodegenerativas incluindo doença de Alzheimer, Paralisia Supranuclear Progressiva e doença de Pick.

Description

[0001] A presente invenção pertence ao campo da medicina. Par ticularmente, a presente invenção se refere a anticorpos para tau, composições compreendendo tais anticorpos de tau e métodos de utilização de tais anticorpos de tau para o tratamento de doenças neuro- degenerativas incluindo doença de Alzheimer (DA), Paralisia Supranuclear Progressiva (PSP) e doença de Pick (PiD).

[0002] Tau é uma proteína de ligação a microtúbulos axonais que promove formação e estabilidade de microtúbulos. DA e PSP são doenças neurodegenerativas patologicamente caracterizadas por agregação aberrante de tau. Mais especificamente, em DA e PSP, acredita-se que tau hiperfosforilada promova a agregação de tau em fibrilas insolúveis, levando à desestabilização de microtúbulos, e toxicidade neuronal. Estudos de modelo de murino e cultura celular mostraram que agregados de tau se espalham por junções de sinapse neuronal e sequestram tau monomérico (nativo ou não agregado), induzindo a formação de agregados de tau. A progressão neuroanatômica de acumulação e agregação de tau em doenças neurodegenerativas, tais como DA e PSP, sugere que a agregação de tau em fibrilas se propaga ao longo de redes neuronais, resultando em desestabilização de microtúbulos e, em última instância, função neuronal deficiente localizada.

[0003] A densidade e a localização neuroanatômica da agregação de tau correlaciona-se fortemente com os sintomas neurológicos de DA e PSP e com a progressão da doença. Por exemplo, na DA, a tau forma os emaranhados neurofibrilares intraneuronais (NFTs), que tendem a se desenvolver em sequência a partir das regiões transentorri- nais, para as límbicas e para as neocorticais, e que se correlacionam com a gravidade da demência e com a extensão da perda neuronal. Na PSP, a agregação de tau é vista em neurônios, astrócitos e oligo- dendrócitos dentro de regiões corticais e subcorticais, e a densidade de tau agregada mostrou-se correlacionada com a gravidade da perda neuronal.

[0004] Os Anticorpos para tau são conhecidos. Por exemplo, a Pa tente dos Estados Unidos N°. 8.926.974 e as Publicações Internacionais N°s. WO2011/026031, WO2012/049570 e WO2013/050567 descrevem anticorpos para tau e usos de anticorpos de tau para o tratamento de doenças neurodegenerativas, tais como DA. No entanto, até o momento, nenhum anticorpo tendo como alvo tau foi aprovado para uso terapêutico e atualmente não há terapias de modificação de doença aprovadas para DA ou PSP. Dessa forma, permanece a necessidade de anticorpos de tau alternativos. Em particular, permanece a necessidade de anticorpos de tau alternativos que se ligam especificamente a agregados de tau e que reduzem a propagação da formação de agregados de tau, formação de NFT e perda neuronal. Tais anticorpos de tau, preferencialmente, também possuem boas propriedades físico-químicas para facilitar o desenvolvimento, fabricação e/ou formulação.

[0005] A presente invenção fornece um anticorpo monoclonal que se liga à tau humana e que compreende uma região variável de cadeia leve (LCVR) e uma região variável de cadeia pesada (HCVR), em que a LCVR compreende regiões de determinação de complementaridade (CDRs) LCDR1, LCDR2 e LCDR3 e a HCVR compreende CDRs HCDR1, HCDR2 e HCDR3. De acordo com modalidades particulares da presente invenção, a sequência de aminoácido de LCDR1 é dada pela SEQ ID NO: 3, a sequência de aminoácido de LCDR2 é dada pela SEQ ID NO: 4, a sequência de aminoácido de LCDR3 é dada pela SEQ ID NO: 5, a sequência de aminoácido de HCDR1 é dada pela SEQ ID NO: 6, a sequência de aminoácido de HCDR2 é dada pela SEQ ID NO: 7, e a sequência de aminoácido de HCDR3 é dada pela SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal que se liga à tau humana, compreendendo uma LCVR e uma HCVR, em que a sequência de aminoácido da LCVR é dada pela SEQ ID NO: 9 e a sequência de aminoácido da HCVR é dada pela SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade adicional, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal que se liga à tau humana, compreendendo uma cadeia leve (LC) e uma cadeia pesada (HC), em que a sequência de aminoácido da LC é dada pela SEQ ID NO: 1 e a sequência de aminoácido da HC é dada pela SEQ ID NO: 2.

[0006] A presente invenção fornece um anticorpo monoclonal que se liga à tau humana. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal que se liga a um epítopo conformacio- nal de tau humana. Em uma modalidade particular, o epítopo confor- macional de tau humana inclui resíduos de aminoácido 7-9 e 312-322 de tau humana, em que a sequência de aminoácido da tau humana é dada pela SEQ ID NO: 13.

[0007] A presente invenção ainda fornece composições farmacêu ticas compreendendo um anticorpo monoclonal da presente invenção e um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Além disso, a presente invenção fornece um método de tratamento de DA, PSP ou PiD compreendendo administrar, a um paciente em necessidade desta, uma composição farmacêutica da presente invenção.

[0008] Além disso, a presente invenção fornece um método de tra tamento de doenças neurodegenerativas. Mais particularmente, a presente invenção fornece um método de tratamento de DA, PSP ou PiD compreendendo administrar, a um paciente em necessidade desta, uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal da presente invenção.

[0009] A presente invenção também fornece o anticorpo monoclo nal da presente invenção para uso em terapia. Mais particularmente, a presente invenção também fornece o anticorpo monoclonal da presente invenção para uso no tratamento de DA, PSP ou PiD.

[0010] Em uma modalidade, a presente invenção fornece o uso do anticorpo monoclonal da presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de DA, PSP ou PiD.

[0011] A presente invenção também se refere a moléculas de áci do nucleico e vetores de expressão codificando o anticorpo monoclonal da presente invenção. Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de po- linucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de po- linucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade adicional, a presente invenção fornece uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, e compreendendo uma sequência de poli- nucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo a sequência de aminoáci- do de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade particular, a sequência de po- linucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 1 é dada pela SEQ ID NO: 11 e a sequência de po- linucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 2 é dada pela SEQ ID NO: 12.

[0012] Além disso, a presente invenção fornece um anticorpo mo noclonal preparado de acordo com um processo, em que o dito processo compreende cultivar uma célula hospedeira compreendendo uma sequência de polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 e uma sequência de poli- nucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo a sequência de amino- ácido de SEQ ID NO: 2, sob condições tais que o anticorpo monoclo nal é expresso, e recuperar da referida célula hospedeira um anticorpo monoclonal compreendendo uma LC e uma HC, em que a sequência de aminoácido da LC é dada pela SEQ ID NO: 1 e a sequência de aminoácido da HC é dada pela SEQ ID NO: 2.

[0013] Como usado neste documento, um "anticorpo" é uma molé cula de imunoglobulina compreendendo 2 HCs e 2 LCs interconecta- das por ligações dissulfeto. A porção amino terminal de cada LC e HC inclui uma região variável de cerca de 100-120 aminoácidos primariamente responsáveis por reconhecimento de antígeno através das CDRs nela contidas. As CDRs são intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura ("FR - framework região"). Cada LCVR e HCVR é composta de 3 CDRs e 4 FRs, dispostas a partir de terminais amino para terminais carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As 3 CDRs da LC são referidas como "LCDR1, LCDR2 e LCDR3", e as 3 CDRs da HC são referidas como "HCDR1, HCDR2 e HCDR3". As CDRs contêm a maior parte dos resíduos que formam interações específicas com o antígeno. A capacidade funcional de um anticorpo de se ligar a um antígeno particular é amplamente influenciada pelas seis CDRs. A atribuição de aminoácidos a domínios CDR dentro das regiões LCVR e HCVR dos anticorpos da presente invenção é baseada na bem conhecida convenção de numeração Kabat (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190: 382-93 (1971); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication N°. 91-3242 (1991)), and North numbering convention of Molecular Biology (North et al., A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations, Journal of Molecular Biology, 406:228-256 (2011)).

[0014] As LCs são classificadas como kappa ou lambda, que são, cada uma, caracterizada por uma região constante particular como conhecido na técnica. Os anticorpos monoclonais da presente invenção incluem LCs kappa. HCs são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou epsilon, e definem o isótopo de um anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, respectivamente. Os anticorpos monoclonais da presente invenção incluem HCs IgG. Anticorpos IgG podem ser ainda divididos em subclasses, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Em uma modalidade particular, os anticorpos monoclonais da presente invenção são IgG4. A porção carbóxi terminal de cada HC define uma região constante primariamente responsável pela função efetora. Em uma modalidade particular, os anticorpos monoclonais da presente invenção têm uma ou mais modificações na região constante de cada HC que reduz a função efetora. Em uma modalidade mais particular, os anticorpos monoclonais da presente invenção são IgG4 e têm modificações na região constante de ambas HCs que reduzem a função efetora incluindo o aminoácido alanina em ambos os resíduos 230 e 231 (numeração de resíduo baseada na HC exemplificada de SEQ ID NO: 2). Em uma modalidade ainda mais particular, os anticorpos monoclonais da presente invenção são IgG4 e têm modificações na região constante de ambas HCs que reduzem a função efetora incluindo o aminoácido ala- nina em ambos os resíduos 230 e 231 e têm modificações adicionais na região constante de ambas HCs que promovem estabilidade incluindo o aminoácido prolina no resíduo 224 e a exclusão do aminoácido lisina no resíduo 443 (numeração de resíduo baseada na HC exemplificada de SEQ ID NO: 2).

[0015] Os anticorpos da presente invenção são anticorpos mono- clonais ("mAbs"). Os mAbs para a presente invenção são mAbs completos contendo 2 HCs e 2 LCs. Como referido aqui, mAbs são anticorpos derivados de uma única cópia ou clone incluindo, por exemplo, qualquer clone eucariótico, procariótico ou de fago, e não o método pelo qual é produzido. Anticorpos monoclonais podem ser produzidos, por exemplo, por tecnologias de hibridoma, tecnologias recombinan- tes, tecnologias de exibição de fago, tecnologias sintéticas, por exemplo, enxerto de CDR ou combinações dessas ou outras tecnologias conhecidas na técnica.

[0016] Métodos de produção e purificação de anticorpos são bem conhecidos na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, em Harlow and Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, N.Y., chapters 5-8 e 15, ISBN 0-87969-314-2. Por exemplo, camundongos podem ser imunizados com filamentos helicoidais emparelhados ("PH F") de tau humana de tecido cerebral de pacientes caracterizados como tendo DA (Jicha et al., J. Neurosci. Res., 15:48(2), 128-132 (april, 1997)), e os anticorpos resultantes podem ser recuperados, purificados, e a sequência de aminoácidos determinada usando métodos convencionais bem conhecidos na técnica. Os anticorpos monoclonais da presente invenção são desenvolvidos para conter uma ou mais regiões de estrutura humana circundando CDRs derivadas de um anticorpo não humano. Sequências de linha germinal de estrutura humana podem ser obtidas de ImMunoGeneTics (INGT) através de seu website, http://imgt.cines.fr, ou de The Immunoglobulin FactsBook de Marie-Paule Lefranc e Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. De acordo com modalidades particu-lares da presente invenção, regiões de estrutura LC e de estrutura HC de linha germinal particulares para uso em anticorpos monoclonais da presente invenção incluem 5-51 e A27, respectivamente.

[0017] Em modalidades particulares da presente invenção, o anti corpo, ou o ácido nucleico que o codifica, é provido na forma isolada. Como usado neste documento, o termo "isolado" se refere a uma proteína, peptídeo ou ácido nucleico que é livre ou substancialmente livre de outras espécies macromoleculares encontradas em um ambiente celular.

[0018] Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser preparados e purificados usando métodos conhecidos. Por exem- plo, sequências de cDNA codificando uma HC (por exemplo, a sequência de aminoácido dada pela SEQ ID NO: 2) e uma LC (por exemplo, a sequência de aminoácido dada pela SEQ ID NO: 1) podem ser clonadas e desenvolvidas em um vetor de expressão de GS (glu- tamina sintetase). O vetor de expressão de imunoglobulina desenvolvido pode ser, então, estavelmente transfectado em células CHO. Como uma pessoa versada na técnica irá apreciar, a expressão em mamíferos de anticorpos resultará em glicosilação, tipicamente em sítios de N-glicosilação altamente conservados na região Fc. Clones estáveis podem ser verificados para expressão de um anticorpo que se liga especificamente a agregados de tau. Clones positivos podem ser expandidos em meio de cultura sem soro para produção de anticorpo em biorreatores. Meios em que um anticorpo tenha sido secretado podem ser purificados por técnicas convencionais. Por exemplo, o meio pode ser convenientemente aplicado a uma coluna de Proteína A ou G Sepharose FF que tenha sido equilibrada com um tampão compatível, tal como solução salina tamponada com fosfato. A coluna é lavada para remover componentes de ligação não específicos. O anticorpo ligado é eluído, por exemplo, por gradiente de pH e frações de anticorpo são detectadas, tal como por SDS-PAGE, e então agrupadas. O anticorpo pode ser concentrado e/ou filtrado de modo estéril usando técnicas comuns. Multímeros e agregado solúvel podem ser efetivamente removidos por técnicas comuns, incluindo exclusão por tamanho, interação hidrofóbica, troca iônica ou cromatografia em hidroxiapatita. O produto pode ser imediatamente congelado, por exemplo, a -70°C, ou pode ser liofilizado.

[0019] Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser usados no tratamento de pacientes. Mais particularmente, espera- se que os anticorpos da presente invenção tratem uma classe de distúrbios neurodegenerativos, denominada taupatias, que inclui DA, PSP e PiD. Embora espera-se que os anticorpos monoclonais da presente invenção sejam úteis no tratamento de DA, PSP e PiD, tais anticorpos podem também ser úteis no tratamento de outras taupatias, incluindo en- cefalopatia traumática crônica. Conforme usado intercambiavelmente neste documento, "tratamento" e/ou "tratando" e/ou "tratar" destinam-se a referir-se a todos os processos em que pode haver uma desaceleração, interrupção, parada, controle, pausa ou reversão da progressão dos distúrbios descritos neste documento, mas não necessariamente indicam uma total eliminação de todos os sintomas do distúrbio. Tratamento inclui a administração de um anticorpo da presente invenção para tratamento de uma doença ou condição em um ser humano que poderia beneficiar- se de redução na propagação de pelo menos uma dentre formação de agregado de tau, formação de NFT e perda neuronal, e inclui: (a) inibição de maior progressão da doença, isto é, interrupção de seu desenvolvimento; e (b) alívio da doença, isto é, causar a regressão da doença ou distúrbio ou aliviar seus sintomas ou complicações.

[0020] Conforme usado intercambiavelmente neste documento, o termo "paciente", "pessoa" e "indivíduo" se refere a um ser humano. Em determinadas modalidades, o paciente é ainda caracterizado com uma doença, distúrbio ou condição (por exemplo, um distúrbio neuro- degenerativo) que poderia beneficiar-se de uma redução na propagação de pelo menos uma dentre formação de agregado de tau, formação de NFT e perda neuronal. Em outra modalidade, o paciente é ainda caracterizado como estando em risco de desenvolver um distúrbio, doença ou condição neurodegenerativa que poderia beneficiar-se de uma redução na propagação de pelo menos uma dentre formação de agregado de tau, formação de NFT e perda neuronal.

[0021] Como usado neste documento, o termo "ligar-se a (ou liga se a)" tau se refere a uma interação de um anticorpo com um epítopo de agregado de tau humana. Mais preferencialmente, o epítopo é um epítopo conformacional de tau humana. Em uma modalidade particular, o termo "ligar-se a (ou liga-se a)" tau se refere a uma interação com um epítopo conformacional incluindo resíduos de aminoácido 7-9 e 312-322 de agregado de tau humana (numeração de resíduo baseada na tau humana exemplificada de SEQ ID NO: 13). Deve ser compreendido que existem variações conhecidas de proteína tau humana, por exemplo resultante de variantes de fusão. Tais variações conhecidas, no entanto, possuem o epítopo conformacional incluindo resíduos de aminoácido 7-9 e 312-322 de SEQ ID NO: 13. As variantes conhecidas, no entanto, podem resultar em numeração alterada de resíduo para os resíduos de aminoácido 7-9 e 312-322 de SEQ ID NO: 13. Embora a numeração de resíduo possa ser alterada em algumas vari-antes, os aminoácidos compreendendo o epítopo permanecem os mesmos. O termo "epítopo", como usado neste documento, se refere a sítios tridimensionais discretos de um antígeno que são reconhecidos pelos anticorpos monoclonais da presente invenção.

[0022] Um anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser incorporado em uma composição farmacêutica que pode ser preparada por métodos bem conhecidos na técnica e compreende um anticorpo monoclonal da presente invenção e um ou mais veículo(s) e/ou di- luente(s) farmaceuticamente aceitável (por exemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 22a Edition, Loyd V., Ed., Pharmaceutical Press, 2012, que fornece um compêndio de técnicas de formulação geralmente conhecidas por praticantes). Veículos adequados para composições farmacêuticas incluem qualquer material que, quando combinado com o anticorpo monoclonal da presente invenção, retém a atividade da molécula e é não reativo com o sistema imune do paciente.

[0023] Uma composição farmacêutica compreendendo um anti corpo monoclonal da presente invenção pode ser administrada a um paciente em risco de, ou apresentando, doenças ou distúrbios, con- forme descrito neste documento, por vias parentéricas (por exemplo, subcutânea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular ou transdérmi- ca). Uma composição farmacêutica da presente invenção contém uma quantidade "eficaz" ou "terapeuticamente eficaz", conforme usado in- tercambiavelmente neste documento, de um anticorpo monoclonal da presente invenção. Uma quantidade eficaz se refere a uma quantidade necessária (em dosagens e por períodos e para os meios de administração) para alcançar o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade eficaz do anticorpo monoclonal pode variar de acordo com fatores, tais como um estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo monoclonal em obter uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade eficaz é também uma em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo monoclonal da presente invenção são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.

Anticorpo Tau Construído

[0024] Problemas consideráveis associados a estabilidade física e química foram encontrados ao construir um anticorpo monoclonal de tau da presente invenção. Os problemas encontrados incluíram baixa afinidade de ligação, imunogenicidade, agregação, dimerização de HC, bem como desamidação, oxidação, isomerização e desdobramento de região variável.

[0025] Por exemplo, o anticorpo IgG1 de murino MC-1 ("MC-1") (Albert Einstein College de Medicine, Jicha et al., 1997), que reconhece um epítopo conformacional de proteína tau em resíduos de amino- ácido 7-9 e 312-322 (numeração de resíduo baseada na proteína tau humana exemplificada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13), foi inicialmente humanizado produzindo das três CDRs de HC de murinho MC-1 em vários genes de linha germinal de estrutura de HC humana e as três CDRs de LC de murino MC-1 em vários genes de linha germinal de estrutura de LC humana. Construtos humaniza- dos de MC-1 utilizaram 96 combinações diferentes de estruturas de cadeia leve e pesada, representando cada uma das doze famílias de linha germinal de estrutura de HC (estruturas de HC humanas específicas: 1-24, 1-46, 1-69, 2-05, 3-15, 3-23, 3-53, 3-72, 4-04, 4-39, 5-51 e 6-01) e cada uma das oito famílias de linha germinal de LC (estruturas de LC humanas específicas: A-26, A-27, B-2, B-3, L-2, L-12, O11 e O- 2). Os respectivos genes de linha germinal de estrutura foram clona- dos em vetores de expressão IgG4 humanos de cadeia leve e pesada e transfectados em células HEK293 para expressão e análise de ligação por ELISA. Embora vários pares de estrutura tenham demonstrado algum nível de ligação a tau humana em ELISA, construtos de anticorpo resultantes apresentaram uma infinidade de problemas incluindo baixa afinidade de ligação, agregação, dimerização de HC e problemas de estabilidade química, tais como desamidação, oxidação e iso- merização nas regiões variáveis.

[0026] Modificações foram, portanto, projetadas para desenvolver anticorpos de tau com melhor afinidade de ligação, dimerização de HC reduzida ou eliminada, menor imunogenicidade e melhor estabilidade física e química. Modificações de aminoácido (em relação a MC-1, Jicha et al., 1997) foram projetadas em HCDR2 e HCDR3 e LCDR1, LCDR2 e LCDR3. O anticorpo de murino modificado foi humanizado produzindo as três CDRs de HC em vários genes de linha germinal de estrutura de HC humana e as três CDRs de LC em vários genes de linha germinal de estrutura de LC humana essencialmente como descrito acima. Além disso, estudos extensivos de estabilidade de proteína foram realizados e os anticorpos monoclonais construídos foram selecionados para propriedades de expressão e termoestabilidade, bem como propriedades de afinidade de ligação. Um anticorpo monoclonal contendo sete mutações de CDR (a posição de aminoácido é baseada em numeração de resíduo de aminoácido linear de um anticorpo exemplificado da presen te invenção refletido na Tabela 1: HCDR2 em N61E e E62K; HCDR3 em P103V e Y105D; LCDR1 em G34Q; LCDR2 em S57D; e LCDR3 em H98L) foi identificado como melhorador da afinidade de ligação, estabilidade física e química e imunogenicidade para anticorpos monoclonais da presente invenção (em relação a MC-1, Jicha et al., 1997). Nenhuma das modificações acima foi identificada em caracterizações de MC-1 ou nos construtos de anticorpo MC-1 humanizados.

[0027] Um anticorpo monoclonal de tau construído exemplificado da presente invenção é apresentado na Tabela 1. O anticorpo monoclonal de tau construído exemplificado inclui estrutura de HC humana 5-51 e estrutura de LC humana A27. A relação das várias regiões do anticorpo monoclonal de tau construído exemplificado é como segue (a numeração de aminoácidos aplica numeração linear; a atribuição de aminoácidos a domínios variáveis é baseada no International Immunogenetics Information System® disponível em www.imgt.org; a atribuição de aminoácidos a domínios CDR é baseada na bem conhecida convenção de numeração North, com a exceção de HCDR2 que é baseada na bem conhecida convenção de numeração Kabat): Tabela 1: Regiões de aminoácido de um anticorpo monoclonal de tau construído exemplificado da presente invenção.

[0028] Os Exemplos e ensaios a seguir demonstram que os anti corpos monoclonais da presente invenção são úteis para o tratamento de distúrbios neurodegenerativos associados à propagação de agregados de tau, tais como DA, PSP ou PiD. Deve ser compreendido, no entanto, que os seguintes Exemplos são apresentados para fins de ilustração e não, de limitação e que várias modificações podem ser feitas por um versado na técnica.

Exemplos Expressão de Anticorpo de Tau Construído

[0029] Anticorpos monoclonais de tau construídos da presente in venção podem ser expressos e purificados essencialmente como a seguir. O vetor de expressão de glutamina sintetase (GS) contendo a sequência de DNA de SEQ ID NO: 11 (codificando a sequência de aminoácido de LC de SEQ ID NO: 1) e a sequência de DNA de SEQ ID NO: 12 (codificando a sequência de aminoácido de HC de SEQ ID NO: 2) é usado para transfectar uma linha celular de ovário de hamster chinês (CHO) por eletroporação. O vetor de expressão codifica um promotor precoce de SV (Vírus Símio 40E) e o gene para GS. A expressão de GS permite a síntese bioquímica de glutamina, um amino- ácido requerido pelas células CHO. Após transfecção, as células pas-sam por seleção em massa com 50μM de L-metionina sulfoximina (MSX). A inibição de GS por MSX é utilizada para aumentar o rigor da seleção. Células com integração do cDNA de vetor de expressão em regiões transcricionalmente ativas do genoma de célula hospedeira podem ser selecionadas contra células CHO do tipo selvagem, que expressam um nível endógeno de GS. Agrupamentos transfectados são plaqueadas em baixa densidade para permitir crescimento próximo a clonal de células de expressão estáveis. As cavidades principais (masterwells) são selecionados para expressão de anticorpo e, então, expandidas em culturas de suspensão sem soro a serem usadas para produção. O meio clarificado, em que o anticorpo foi secretado, é aplicado a uma coluna de afinidade de Proteína A que foi equilibrada com um tampão compatível, tal como solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4). A coluna é lavada com 1M de NaCl para remover componentes de ligação não específicos. O anticorpo monoclonal de tau ligado é eluído, por exemplo, com citrato de sódio em pH (aprox.) 3,5 e as frações são neutralizadas com 1M de tampão Tris. Frações de anticorpo monoclonal de tau são detectadas, tal como por SDS-PAGE ou exclusão por tamanho analítica, e são, então, agrupadas. Multímeros e agregado solúvel podem ser efetivamente removidos por técnicas comuns, incluindo exclusão por tamanho, interação hidrofóbica, troca iô- nica ou cromatografia em hidroxiapatita. O anticorpo monoclonal de tau da presente invenção é concentrado e/ou filtrado de modo estéril usando técnicas comuns. A pureza do anticorpo monoclonal de tau após essas etapas de cromatografia é superior a 95%. O anticorpo monoclonal de tau da presente invenção pode ser imediatamente congelado a -70°C ou armazenado a 4°C por vários meses.

Afinidade e Cinética de Ligação

[0030] Ensaio de Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR), medido com um instrumento BIACORE® 2000 (iniciado com tampão contínuo de HBS-EP+ (GE Healthcare, 10 mM de Hepes pH 7,4 + 150 mM de NaCl + 3 mM de EDTA + 0,05% de tensoativo P20) a 25°C), é usado para medir a ligação de anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 para ambos agregados de tau humana e tau mo- nomérica humana (por exemplo, nativa ou não agregada) (ambos tendo a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 13). A ligação de construto de anticorpo MC-1 humanizado (tendo a combinação de estrutura: 5-51 cadeia pesada, A27 cadeia leve) a agregado de tau humana e tau monomérica humana é medida da mesma forma.

[0031] Salvo indicação em contrário, todos os reagentes e materi- ais são da BIACORE® AB (Upsala, Sweden). Um chip CM5 contendo proteína A imobilizada (gerada usando acoplamento de amina NHS- EDC padrão) em todas as quatro células de fluxo (FC) é usado para empregar uma metodologia de captura. Amostras de anticorpo são preparadas a 0,5μg/mL por diluição em tampão contínuo. Tau mono- mérica e tau fibrilar são preparadas para concentrações de 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31,25, 15,63, 7,82, 3,91, 1,95 e 0 (nulo) nM por diluição em tampão contínuo. Cada ciclo de análise consiste em: (1) capturar amostras de anticorpo em células de fluxo separadas (FC2, FC3 e FC4); (2) injetar 250μL (300 segundos) de agregado de tau fibrilar ou tau monomérica na respectiva FC a uma taxa de 50 μL/min; (3) retornar para o fluxo de tampão por 20 minutos para monitorar a fase de dissociação; (4) regenerar as superfícies de chip com 25 μL (30 segundos) de injeção de glicina, pH 1,5; (5) equilíbrio de superfícies de chip com uma injeção de 50 μL (60 segundos) de HBS- EP+.

[0032] Os dados de ligação a agregado de tau são processados usando dupla referenciação padrão e ajuste a um modelo de ligação 1:1 usando software de avaliação Biacore 2000, versão 4.1, para determinar a taxa de associação (kon, M-1s-1 unidades), taxa de dissociação (koff, s-1 unidades), e Rmax (RU unidades). A constante de equilíbrio de dissociação (KD) foi calculada a partir da relação KD = koff/kon, e está em unidades molares. Os dados de ligação a tau monomérica não podem ser determinados precisamente por SPR como descrito acima devido a taxas liga e desliga rápidas. Portanto, KD para ligação a tau monomérica é obtida usando um modelo de ajuste de ligação de estado constante da plotagem da concentração de antígeno versus a unidade de resposta. Os dados de ligação resultantes são providos na Tabela 2. Tabela 2: Dados de ligação SPR a agregado de tau e tau monomérica humana. Resultados de *KD são considerados relativos uma vez que os resultados não são normalizados para influência de avidez.

[0033] Os resultados providos na Tabela 2 demonstram que o an ticorpo monoclonal de tau do Exemplo 1 não possui ligação mensurável a tau monomérica, tal que um valor de afinidade possa ser precisamente determinado por análise Biacore (devido a taxas de ligar e desligar rápidas).

[0034] Por outro lado, os resultados providos na Tabela 2 demons tram que o anticorpo monoclonal de tau do Exemplo 1 possui melhor afinidade para agregado de tau em comparação ao construto de anticorpo MC-1 humanizado.

[0035] Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (ELISA) é usado para determinar afinidade de ligação relativa do anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 a fibrilas de tau agregadas de homo- genatos cerebrais de DA. Homogenatos cerebrais de DA são preparados a partir de aproximadamente 80g de córtex do cérebro de pacientes com DA. Em suma, tampão (coquetel inibidor de protease TBS/1mM PMSF/1X Complete® (Roche, p/n. 11 697 498 001) e inibidor de fosfatase (ThermoFischer, p/n. 78428)) são adicionados ao tecido cerebral de DA em cerca de 10mL/1g (tecido). O tecido é homogeneizado usando um Kinematica Polytron portátil em velocidade 6-7. O tecido é, então, adicionalmente homogeneizado usando Parr Bomb (Parr Instrument, p/n. 4653) a 1500 psi de nitrogênio por 30 minutos. O homogenato é girado a 28.000g (rotor J14 Beckman) por 30 minutos a 4°C. O sobrenadante é coletado, agrupado e passado em uma coluna de alta proteção de 4 cm de Sepharose 400 Superflow para remover detritos maiores, em seguida, passado em uma coluna MC1-Affigel 10 de 25 mL em uma taxa de fluxo de 50 - 60 mL por hora, a fim de purificar fibrilas de tau de ligação a MC1. Para maximizar a recuperação de purificação, os sobrenadantes são reciclados através de coluna de MC-1 por 18-20 horas a 4°C. A coluna de proteção é removida e a coluna de MC1 é lavada com TBS com pelo menos 40 volumes de coluna. Os agregados de tau ligados são, então, eluído com 2 volumes em coluna de 3M KSCN, coletados em frações de aproximadamente 1 mL. A concentração de proteína em cada fração eluída é verificada por ensaio Bradford em placa de microtitulação. Frações contendo níveis positivos de proteína são agrupadas, concentradas para cerca de 2mL usando Centricon (Millipore Ultracel-30K) a 4°C, e dialisadas usando um cassete Slide-A-Lyzer (10K MWCO 3-12mL, Pierce) durante a noite contra 1 litro de TBS. A concentração de tau dentro das fibrilas de tau purificadas de homogenato cerebral de DA é medida por ELISA sanduíche usando anticorpo de captura de DA-9 e anticorpo de detecção de CP27.

[0036] Fibrilas de tau purificadas (50μL) em PBS são revestidas em cavidades de placas de 96 cavidades (Coastar, p/n. 3690) em uma concentração correspondente a 0,7 μg/mL de tau total. As placas são incubadas durante a noite a 4°C, em seguida, lavadas três vezes com 150μL de PBST (PBS contendo 0,05% de Tween-20), bloqueadas em 100μL de BB3 (ImmunoChemistry Technology, p/n. 643) à temperatura ambiente por pelo menos 1 hora (geralmente 2 horas). Após o bloqueio, o tampão de bloqueio é removido das cavidades. O anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 e um construto de anticorpo MC-1 humanizado (tendo a combinação de estrutura: 5-51 cadeia pesada, A27 cadeia leve) são diluídos em 0,25% de tampão de caseína para 1000nM estoque, em seguida, diluídos 23 vezes em série com diluições duplas. 50μL de estoque e anticorpo diluído em série (tau monoclonal exemplificada do Exemplo 1 ou construto de anticorpo MC-1 humanizado) são adicionados a cavidades separadas e incubadas por 2 horas à temperatura ambiente, após o que a placa é lavada quatro vezes com 200μL de PBST por cavidade. 50μL de anticorpos IgG-HRP anti-humano (diluídos a 1:4000 em 0,25% de tampão de caseína) são adicionados e incubados por 1 hora à temperatura ambiente, após cujo tempo a placa é lavada com 200μL de PBST por cavidade 4 vezes. 50μL de TMB/H2O2 são adicionados e incubados à temperatura ambiente por cerca de 10 minutos. A reação é interrompida pela adição de 50μL de solução de paragem (2N H2SO4) e o sinal co- lorimétrico é medido a 450nm. Os dados são inseridos no programa Prism 6 (GrapH Pad) e valores EC50 são gerados usando um ajuste de curva de regressão não linear e resposta de dose sigmoidal. Os resultados são apresentados na Tabela 3. Tabela 3. Comparação EC50 de Ligação a Fibrilas de Tau DA Purificadas

[0037] Como refletido na Tabela 3, o anticorpo monoclonal de tau exemplificado da presente invenção demonstra uma afinidade melhorada em 60 vezes (conforme medido por EC50) para fibrilas de tau purificadas em comparação a construto de anticorpo MC-1 humanizado.

[0038] A seletividade de anticorpo monoclonal de tau do Exemplo 1 para agregados de tau versus monômero de tau é determinada por ELISA direto. Após o procedimento ELISA substancialmente como provido acima, tau recombinante (rTau) é revestida em placas de 96 cavidades em uma concentração correspondente a concentração "alta" (1μg/mL) ou concentração "baixa" (15ng/mL). Alta concentração de rTau, quando revestida em placas de microcavidades, agrega, simulando ligação à tau agregada. Baixa concentração de rTau, quando revestida em placas de microcavidades, simula ligação a monômero de tau. As placas, revestidas com altas ou baixas concentrações de rTau, respectivamente, são expostas a anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 e a ligação de anticorpo monoclonal de tau exemplificado às respectivas concentrações de rTau é medida substancialmente como descrito no ensaio ELISA acima. Os resultados são providos na Tabela 4. Tabela 4. Comparação EC50 de Ligação para Concentração "Alta" vs. "Baixa" de rTau

[0039] Como refletido na Tabela 4, o anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 demonstra uma afinidade melhorada em 120 vezes (conforme medido por EC50) para tau agregada em comparação à tau monomérica.

Estudos de Acoplamento a Alvo Ex Vivo

[0040] A ligação de anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 a tau agregada derivada de cérebros humanos é determinada através de coloração imuno-histoquímica de seções de cérebro impregnadas em parafina fixadas por formalina (FFPE) obtidas de: um indivíduo "normal" (apresentando mínima agregação de tau); um paciente com DA (apresentando agregação severa de tau e formação de NFT, bem como patologia de placa amiloide); um paciente com PiD (apresentando agregação severa de tau). Coloração é também reali- zada em seções de cérebro derivadas de um camundongo de tipo selvagem "de controle" que não possui nenhuma tau humana a fim de determinar níveis de coloração não específica anteriores.

[0041] A seções FFPE são desparafinizadas e reidratadas. Portan to, a recuperação de antígeno (usando o sistema de módulo Lab Vision PT, Thermo Scientific) é realizada nas seções que incluem seções de aquecimento em tampão de citrato (Thermo Scientific, p/n. TA-250- PM1X) por 20 minutos a 100°C, em seguida, resfriamento das seções em dH20. As seções são, então, expostas às seguintes sete etapas de incubação (à temperatura ambiente): (1) 10 minutos em 0,03% de H2O2; (2) 30 minutos em diluição 1:20 de soro de cabra normal (Vector Labs., p/n. S-1000) diluído em PBST; (3) 60 minutos em anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 ou construto de anti-corpo MC-1 humanizado (tendo a combinação de estrutura: 5-51 cadeia pesada, A27 cadeia leve) (ambos o anticorpo monoclonal de tau exemplificado e o construto de anticorpo MC-1 humanizado são normalizados para 1mg/mL, em seguida, diluídos em PBST para uma diluição de 1:4000 antes de incubação com as seções); (4) 30 minutos em IgG4 anti-humano de coelho (elevado contra a região Fc do anticorpo exemplificado) em uma concentração de 1,1μg/mL em PBST; (5) 30 minutos em diluição 1:200 de IgG anticoelho de cabra biotinilado (Vector Labs., p/n. BA-1000) diluído em PBST: (6) 30 minutos em solução complexa de avidina-biotina (Vector Labs., p/n. PK-7100); (7) 5 minutos em 3,3‘-diaminobenzidina (Vector Labs., p/n. SK-4105). As seções são lavadas entre cada uma das 7 etapas acima usando PBST. Após as sete etapas de incubação acima, as seções são contrastadas com hematoxilina, desidratadas e tampadas. Para seções de tecido "de controle" de camundongo, o protocolo acima é modificado na etapa de incubação (3) usando uma diluição 1:8000 (em oposição a uma diluição 1:4000) de ambos o anticorpo monoclonal de tau exem- plificado e o construto de anticorpo MC-1 humanizado; e por substituição das etapas de incubação (4) e (5) com uma única diluição 1:200 de 30 minutos de IgG anti-humano de cabra biotinilado (Vector Labs. p/n. BA-3000) em PBST.

[0042] Após os procedimentos substancialmente como descritos acima, uma análise da ligação do anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 a derivados de tau de cérebros humanos é realizada. Os resultados são providos na Tabela 5. Tabela 5. Análise semiquantitativa de ligação a tau agregada em seções de cérebro de DA FFPE.

[0043] Os resultados providos na Tabela 5 refletem que o anticor po monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 demonstra níveis significativamente mais altos de coloração para tau agregada, de ambos pacientes DA e PD, em seções cerebrais do hipocampo em comparação a construto de anticorpo MC-1 humanizado. Os resultados providos na Tabela 5 também demonstram que o anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 não demonstra ligação não específica superior ao construto de anticorpo MC-1 humanizado (anticorpo monoclonal de tau exemplificado demonstra ligação à quantidade mínima de tau agregada em seções humanas de controle normal). Além disso, porque DA e PD são caracterizadas por variantes de junção distintas da tau de codificação de gene, esses resultados suportam uma conclusão de que o anticorpo monoclonal de tau exemplifica- do do Exemplo 1 especificamente se liga ao epítopo conformacional compreendendo resíduos de aminoácido 7-9 e 312-322 de tau humana (numeração de resíduo baseada na tau humana exemplificada de SEQ ID NO: 13) comum a agregados de tau de ambas DA e PD.

Neutralização In Vitro de Propagação de Agregado de Tau

[0044] Preparações de homogenato cerebral de camundongos P301S de aproximadamente 5 meses de idade são conhecidas por, na presença de tau não agregada nativa, induzir a agregação da tau nativa e demonstrar um efeito semelhante à propagação de agregação de tau. Preparações de homogenato Sarkosyl-insolúvel de tecido cerebral a partir de camundongos P301S de 4,5 a 5 meses de idade são soni- cadas e diluídas com OPTI-MEM (GIBCO de Life Tech., p/n. 31985062) para levar a tau medida (por prep.) a uma concentração final de 0,77 μg/mL. Cada preparação é incubada por 30 minutos à temperatura ambiente com um de anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 (nas concentrações: 21,00, 7,00, 2,33, 0,78, 0,26, 0,09, 0,03 e 0,01μg/mL) ou construto de anticorpo MC-1 humanizado (nas concentrações: 50,00, 16,67, 5,56, 1,85, 0,62, 0,21, 0,07, 0,02 e 0,01μg/mL).

[0045] Células HEK293 (uma linha celular de rim embrionária hu mana) são transfectadas por eletroporação para expressar de forma induzível uma forma mutante de tau humana (1N4L, que tem uma serina substituída por prolina no resíduo 301 (P301S) (numeração de resíduo baseada na tau humana exemplificada de SEQ ID NO: 13)). (Falcon B., et al., J. Biol. Chem. 290:1049-1065, 2015). Células HEK293 estavelmente transfectadas são plaqueadas em uma concentração de 1x104 células/cavidade nas cavidades de uma placa de 96 cavidades em meio completo (meio D-MEM (Invitrogen, p/n. 11965092), 10% de soro bovino fetal (Invitrogen, p/n. 16000), 1x pen. strep (Invitrogen, p/n. 15140-122), 5μg/mL de Blasticin (Invitrogen, p/n. R210-01), 200μg/mL de Zeocin (Invitrogen, p/n. R250-01)). As placas são incubadas por três dias a 37°C. Após incubação, 1 mg/mL de te- traciclina é adicionado a uma diluição de 1:1000 por cavidade (para uma concentração final de meio de 1 μg de tetraciclina/mL) para induzir a expressão de tau mutante. As placas são, então, incubadas por 24 horas a 37°C. Após incubação, o meio de cultura é removido e 50μL de preparação de homogenato com uma das respectivas concentrações de um de anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 ou construto de anticorpo MC-1 humanizado (preparado como descrito acima) são adicionados. As placas são incubadas por três horas, após o que a preparação de homogenato é removida e 100μL de meio completo com 1μg/mL de tetraciclina e a mesma respectiva concentração de anticorpo monoclonal de tau exemplificado ou construto de anticorpo MC-1 humanizado são adicionados a cada respectiva cavidade. As placas são incubadas por 24 horas a 37°C, após o que o meio é removido e 100μL de meio completo e a mesma respectiva concentração de anticorpo monoclonal de tau exemplificado ou construto de anticorpo MC-1 humanizado são adicionados às respectivas cavidades. As placas são incubadas por 48 horas a 37°C. Após incubação, as células são lavadas com 200μL de DPBS e drenadas.

[0046] Células são ressuspensas em 50μL de tampão H (TBS pH 7,4 contendo 2 mM de EGTA, 5 mM de EDTA, inibidor de protease e fosfatase (Thermo Scientific, p/n. 784420)) por cavidade e sonicado em banho por 10 minutos. A concentração de proteína total é medida por Ensaio de Proteína BCA™ (Thermo Scientific, p/n. PI-23227). Os níveis de agregado de tau são determinados por ELISA sanduíche. Placas de 96 cavidades são revestidas com 50μL de 2μg/mL de anticorpo AT8 a 4°C durante a noite. As placas são lavadas três vezes com PBST, então, bloqueadas com 100μL de BB3 por 1 hora à temperatura ambiente. Uma curva padrão é preparada usando extrato total de cérebro de DA por diluição em série em 0,25% de tampão de caseína usando diluições duplas a partir de uma concentração de partida de 40 μg/mL para uma concentração final de 0,3125 μg/mL. Os lisados celulares são diluídos em 0,25% de tampão de caseína para uma concentração de proteína total de cerca de 0,1 mg/mL. 50 ul de cada diluição de amostra padrão ou de amostras celulares diluídas são, então, adicionadas em cavidades separadas de placas bloqueadas e incubadas a 4°C durante a noite, após o que as placas são lavadas quatro vezes com PBST. O anticorpo CP27 biotinilado é diluído 1:2000 em 0.25% de tampão de caseína e 50μL são, então, adicionados a cavi-dades contendo amostras. As placas são incubadas à temperatura ambiente por 2 horas, após o que as placas são lavadas quatro vezes com PBST. Estrepavidina-HRP (Invitrogen, p/n. SNN2004) é diluída 1:5000 em 0.25% de tampão de caseína e 50μL são, então, adicionados em cada cavidade e as placas são incubadas à temperatura ambiente por 1 hora. Após incubação, as placas são lavadas 4 vezes com PBST e 50μL de uma mistura 1:1 de H2O2 e TMB (Thermo Scientific, p/n. 34021) são adicionados. As placas são incubadas à temperatura ambiente por 10 minutos e a reação é interrompida pela adição de 50μL de H2SO4. O sinal colorimétrico é medido a 450nm ou 650nm. Os níveis de tau AT8-positiva são normalizados contra níveis de prote-ína total em cada amostra. Os valores normalizados para cada amostra são ainda normalizados contra níveis de tau AT8-positiva em amostras de controle (não tratadas com anticorpo). A porcentagem de inibição de propagação de agregado de tau em cada amostra é determinada por subtração dos valores adicionalmente normalizados de 100 e a porcentagem de valor de inibição para cada amostra é inserida no programa Prism 6 Software (GrapH Pad) aplicando ajuste de curva de regressão não linear e resposta de dose sigmoidal para geração de valores de EC50. Os resultados são providos na Tabela 6. Tabela 6. Valores de EC50 representativos de inibição da propagação de agregado de tau.

[0047] Os resultados providos na Tabela 6 refletem que o anticor po monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 demonstra uma melhora de aproximadamente 30 vezes na inibição da propagação de agregado de tau induzida.

Neutralização In Vivo de Propagação de Agregado de Tau

[0048] Preparações de homogenato de tronco cerebral de camun dongos P301S de aproximadamente 5 meses de idade são conhecidas por, quando da injeção em hipocampo de camundongos P301S fêmeas de 10 semanas de idade normais, induzir a agregação de tau não agregada nativa, demonstrando um efeito semelhante à propagação de agregação de tau. Preparações de homogenato de tecido de tronco cerebral a partir de camundongos P301S de 4,5 a 5 meses de idade são preparadas substancialmente da mesma forma descrita acima.

[0049] Camundongos P301S fêmeas normais com 10 semanas de idade são injetados no hemisfério esquerdo do hipocampo com 5μL de preparação de homogenato cerebral e: 7,5μg de anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 (N=12); ou 7,5μg de anticorpo IgG4 humano de controle (N=11). Quatro semanas pós-injeção, os camundongos são sacrificados e os hemisférios esquerdo e direito são coletados, impregnados em parafina, e seções em série de 6μm são montadas em lâminas de vidro. As lâminas contendo bregma (A-P = - 2,30) são desparafinizadas, o tecido impregnado é reidratado e a recuperação de antígeno é realizada por aquecimento da lâmina para 100°C por 20 minutos em tampão de citrato. As lâminas são arrefeci- das em dH2O e incubadas à temperatura ambiente de acordo com as seguintes etapas: (a) 10 minutos em (0,03%) H2O2; (b) 30 minutos em uma diluição 1:20 de soro de cabra normal; (c) 60 minutos em uma diluição 1:8000 de anticorpo PG-5 (diluído em PBST)( anticorpo PG-5 obtido do laboratório de Dr. Peter Davies, Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University; o anticorpo PG-5 especificamente se liga a serina no resíduo 409 de tau quando fosforilado, numeração de resíduo baseada na tau humana exemplificada de SEQ ID NO: 13); (d) 30 minutos em uma diluição de 1:200 de anticorpo IgG anticamundongo de cabra biotinilado (diluído em PBST); (e) 30 minutos em solução complexa de avidina-biotina; e (f) 5 minutos em 3,3‘-diaminobenzidina. PBST é usado para lavagem entre as respectivas etapas. Após a incubação de 5 minutos em 3,3‘-diaminobenzidina, as seções são contrastadas com hematoxilina, em seguida, reidratadas e tampadas. O sinal de coloração é medido por Scanscope AT Slide Scanner (Aperio) em ampliação de 20x. A imunorreatividade de PG-5 é quantificada e expressa como uma porcentagem usando o algoritmo de pixel positivo de Imagescope Software (v. 11.1.2.780, Aperio). Os resultados são providos na Tabela 7. Tabela 7. % Média de Imunorreatividade de PG-5 no hipocampo esquerdo e direito, respectivamente.

[0050] Os resultados providos na Tabela 7 demonstram que o an ticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 reduz o nível de agregação de tau tanto no hipocampo direito como no esquerdo em comparação ao anticorpo IgG4 de controle. Como mostrado, o anticor- po monoclonal de tau exemplificado produz uma redução 60,5% maior na agregação de tau no hipocampo esquerdo, e uma redução 66,5% maior na agregação de tau no hipocampo direito, respectivamente, em comparação ao anticorpo IgG4 de controle. Esses resultados demonstram que o anticorpo monoclonal de tau exemplificado possui atividade neutralizante contra propagação de agregação de tau.

Análise de Eficácia In Vivo no Modelo de Murino Tg4510

[0051] Camundongos Tg4510 transgênicos expressam uma forma mutante de tau humana (4R0N, que tem uma leucina substituída por prolina no resíduo 301 (P301L), Ramsden M., et al., J. Neuroscience., 25: 10637-10647 (2005) e Santacruz K., et al., Science (2005); numeração de resíduo baseada na tau humana exemplificada de SEQ ID NO: 13). Camundongos Tg4510 exibem altos níveis de expressão da tau humana mutante P301L nas regiões do hipocampo e neocórtex, o que demonstra progressão de agregação de tau dependente de idade.

[0052] Anticorpos de tau da presente invenção podem induzir uma resposta imunogênica em camundongos Tg4510. Portanto, ia fim de testar o potencial terapêutico dos anticorpos monoclonais de tau da presente invenção para administração crônica em um modelo de roedor, um anticorpo de tau de murino substituto é construído tendo como alvo o mesmo epítopo conformacional e refletindo níveis similares de afinidade melhorada em relação ao anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1. O anticorpo de tau substituto tem uma afinidade (EC50) para fibrilas de tau de DA purificadas, medida por ELISA como descrito acima (para anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1), de 13,1 pM.

[0053] Camundongos Tg4510 fêmeas com oito semanas de idade são agrupados em 3 grupos separados. O primeiro grupo (N=15) é injetado com um anticorpo IgG1 de camundongo de controle (15mg/kg) duas vezes por semana por 9 semanas. O segundo grupo (N=15) é injetado duas vezes por semana por 9 semanas com anticorpo MC-1 recombinante (15mg/kg) produzido a partir de ascites de camundongos injetados com hibridoma de MC-1. O terceiro grupo (N=15) é injetado com anticorpo de tau de murino substituto (15mg/kg) duas vezes por semana por 9 semanas. Após a administração final, os camundongos são sacrificados e seus cérebros, coletados. Porções de seções de córtex e hipocampo são coletadas, impregnadas em parafina e seções em série de 6μm são montadas em lâminas de vidro para utilização em imuno-histoquímica.

[0054] O restante da região de córtex de cérebros coletados é ho mogeneizado por sonicação pulsada em um volume de tampão H 10 vezes maior do que volume de córtex, girado a 21.000g por 20 minutos a 4°C e uma alíquota de sobrenadante de cada córtex é coletada e os níveis de proteína total são determinados por Ensaio de Proteína BCA™ (Thermo Scientific, p/n. PI-23227) de acordo com o protocolo do fabricante. O restante do sobrenadante é girado a 100.000g por 1 hora a 4°C, o sobrenadante é descartado e o pélete insolúvel obtido é ressuspenso em tampão H (em um volume de ^ do volume de sobre- nadante descartado). O pélete ressuspenso é sonicado e os níveis de agregado de tau AT8-positivo em cada pélete são determinados por ELISA usando anticorpo de captura de AT8 e anticorpo de detecção de CP27 substancialmente como descrito acima. Os níveis de agregado de tau AT8-positivo são normalizados contra níveis de proteína total.

[0055] Da mesma forma, o restante de hipocampo dos cérebros coletados é homogeneizado por sonicação pulsada em um volume de tampão H 10 vezes maior do que o volume de hipocampo, girado a 21.000g por 20 minutos a 4°C, e o sobrenadante de cada hipocampo é coletado e os níveis de proteína total são determinados. Os níveis de agregado de tau AT8-positivo no sobrenadante são determinados por ELISA usando anticorpo de captura de AT8 e anticorpo de detecção de CP27 substancialmente como descrito acima. Os níveis de agregado de tau AT8-positivo são normalizados contra níveis de proteína total. Os resultados são providos na Tabela 8. Tabela 8. Níveis de agregado de tau AT8-positivo em homogenato cerebral de hipocampo e córtex medidos através de ELISA.

[0056] Os resultados providos na Tabela 8 demonstram que o an ticorpo de tau de murino substituto reduziu os níveis de agregado de tau tanto no córtex como no hipocampo em 24% e 35%, respectivamente, em relação aos camundongos tratados com mIgG1 de controle. Os resultados ainda mostram que os camundongos tratados com anticorpo MC-1 de murino recombinante não apresentaram maior redução nos níveis de agregado de tau em comparação com camundongos tratados com mIgG1 de controle.

[0057] O nível de agregação de tau no córtex e no hipocampo das seções impregnadas em parafina preparadas a partir de cérebros coletados é também medido por imuno-histoquímica usando PG-5 substancialmente como descrito acima. Os dados são normalizados por conversão para valores de log10 e os resultados são sumarizados na Tabela 9. Tabela 9. Valor médio de logw de % de Imunorreatividade de PG-5 no córtex e hipocampo.

[0058] Os resultados providos na Tabela 9 demonstram que o an- ticorpo de tau de murino substituto reduz o nível de agregado de tau tanto no córtex (em 18%) como no hipocampo (em 43%) em relação ao anticorpo mIgG1 de controle, ao passo que o anticorpo MC-1 de murino recombinante não demonstrou redução sensível no nível de agregado de tau no córtex ou no hipocampo em relação ao anticorpo mIgG1 de controle.

Propriedades Físico-Químicas de Anticorpo Monoclonal de Tau Construído

[0059] O anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 demonstra boa solubilidade, estabilidade química e estabilidade física.

Solubilidade:

[0060] Solubilidade suficientemente alta é desejada para permitir do sagem conveniente. Por exemplo, uma dose de 1 mg/kg administrada por uma injeção de 1,0 mL em um paciente com 100 kg irá requerer solubilidade de 100mg/mL. Além disso, é também desejável manter o anticorpo em estado monomérico sem agregação em alto peso molecular (HMW) em alta concentração. A solubilidade do anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 é analisada concentrando-se 15mg do anticorpo exemplificado com um filtro de corte de peso molecular de 10k (filtros Amicon U.C., Millipore, catálogo # UFC903024) para um volume inferior a 100μL. A concentração final da amostra foi medida por absor- bância de UV a A280 usando um Nanodrop 2000 (Thermo Scientific).

[0061] Após procedimentos substancialmente como descrito aci ma, o anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 apresenta uma solubilidade superior a: 140 mg/mL (a pH 6 em 10 mM de tampão de citrato); 177 mg/mL (a pH 6 em 10 mM de citrato com 150 mM de NaCl); e 170 mg/mL (a pH 7,4 em tampão PBS). Além disso, apenas baixos níveis de HMW (de ~3 a ~5,4%) estão presentes em alta concentração e nenhuma separação de fase é observada.

Estabilidade física e química:

[0062] A estabilidade química facilita o desenvolvimento de formula ções de droga com suficiente vida útil. A estabilidade química do anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 é avaliada por formulação do anticorpo de tau exemplificado para uma concentração de 1mg/mL em 10mM de citrato e pH tamponado 4, 5, 6 ou 7. As amostras formuladas são incubadas por quatro semanas a 4°C, 25°C ou 40°C em um estudo de degradação acelerada. Alterações no perfil de carga do anticorpo, refletindo as alterações químicas, são avaliadas usando focali- zação isoelétrica capilar (cIEF) de acordo com procedimentos padrão.

[0063] Após procedimentos substancialmente como descritos aci ma, o anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 demonstra os resultados de estabilidade química apresentados na Tabela 10. Tabela 10. Resumo da alteração em % do pico principal em quatro semanas, em relação a amostras incubadas a 4°C, medida por cIEF e % de agregados de HMW medida por SEC.

[0064] Os resultados providos na Tabela 10 demonstram que após 4 semanas de armazenamento a 40°C, o anticorpo de tau exemplificado do Exemplo 1 tem uma porcentagem de redução de pico principal de apenas 1,1 ponto percentual quando formulado a pH 5, e uma redução de apenas 0,3 ponto percentual quando formulado a pH 6 (um pH comum usado na formulação de anticorpo). Além disso, análise de espectrome- tria de massa demonstra apenas degradação mínima observada após 4 semanas de armazenamento a 40°C (~1,5% de desamidação de LCDR1 com menos de 5% de degradação em todas as sequências de CDR), indicando que o anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 tem estabilidade química suficiente para facilitar o desenvolvimento de formulações de solução com vida útil adequada.

[0065] Para fins de comparação, a estabilidade física e química de um construto de anticorpo MC-1 humanizado (tendo a combinação de estrutura: 5-51 cadeia pesada, A27 cadeia leve) é realizada por incubação do anticorpo por 2 semanas a 40°C a pH 8. O construto de anticorpo MC-1 humanizado mostrou significante degradação química incluindo 12% de desamidação de LCDR1, 5% de desamidação e 10% de isomerização em HCDR3 e 3% de oxidação em estrutura de HC.

[0066] A afinidade de ligação, após um estudo de degradação ace lerada de quatro semanas do anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1, é avaliada por formulação do anticorpo monoclonal exemplificado em uma concentração de 1 mg/mL em 10mM de citrato e pH tamponado 4 ou 6. As amostras formuladas são incubadas por quatro semanas a 4°C ou 40°C em um estudo de degradação acelerada. Após incubação, a afinidade de ligação do anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 a rTau (15 ng/mL) revestido em placas de 96 cavidades é determinada por ELISA direto após o procedimento de ELISA substancialmente como descrito acima. Os resultados do estudo de afinidade de ligação descrito acima, realizado em duplicata, são providos na Tabela 11. Tabela 11. Comparação de EC50 após um estudo de degradação acelerada.

[0067] A Tabela 11 demonstra que a afinidade de ligação do anti- corpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 para baixas con-centrações de rTau permaneceu similar para amostras após uma degradação acelerada de quatro semanas, em comparação a amostras de controle incubadas a 4°C. Sequências SEQ ID NO: 1 - LC de anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRSSQSLVHSNQNTYLHWYQQK- PGQAPRLLIYKVDNRFSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFA- VYYCSQSTLVPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAS- VVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS- LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 2 - HC de anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFSNYWIEWVR- QMPGKGLEWMGEILPGSDSIKYEKNFKGQVTISADKSISTAY- LQWSSLKASDTAMYYCARRGNYVDDWGQGTLVTVSSASTKG- PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL- TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNT- KVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG SEQ ID NO: 3 - LCDR1 de anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 RSSQSLVHSNQNTYLH SEQ ID NO: 4 - LCDR2 de anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 YKVDNRFS SEQ ID NO: 5 - LCDR3 de anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 SQSTLVPLT SEQ ID NO: 6 - HCDR1 de anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 KGSGYTFSNYWIE SEQ ID NO: 7 - HCDR2 de anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 EILPGSDSIKYEKNFKG SEQ ID NO: 8 - HCDR3 de anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 ARRGNYVDD SEQ ID NO: 9 - LCVR de anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRSSQSLVHSNQNTYLHWYQQK- PGQAPRLLIYKVDNRFSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFA- VYYCSQSTLVPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 10 - HCVR de anticorpo monoclonal de tau exemplificado do Exemplo 1 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFSNYWIEWVR- QMPGKGLEWMGEILPGSDSIKYEKNFKGQVTISADKSISTAY- LQWSSLKASDTAMYYCARRGNYVDDWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 11 - Sequência de nucleotídeo Codificando a LC Exemplificada (SEQ ID NO: 1) gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccac- cctctcctgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatcagaacacctatttacattgg- taccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctataaagttgacaaccgatttt- ctggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagca- gactggagcctgaagattttgcagtgtattactgttctcaaagtacactggttccgctcacg- ttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggaccgtggctgcaccatctgtcttcatctt- cccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataac- ttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaac- tcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcac- cctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccat- cagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgc SEQ ID NO: 12 - Sequência de Nucleotídeo Codificando a HC Exemplificada (SEQ ID NO: 2) gaggtgcagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaga- tctcctgtaagggttctggctacacattcagtaactactggatagagtgggtgcgccagatg- cccgggaaaggcctggagtggatgggggagattttacctggaagtgatagtattaag- tacgaaaagaatttcaagggccaggtcaccatctcagccgacaagtccatcagcaccgcc- tacctgcagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgccatgtattactgtgcgagaagggg- gaactacgtggacgactggggccagggcaccctggtcaccgtctcctcagcttctac- caagggcccatcggtcttcccgctagcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccg- ccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcagg- cgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccct- cagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctacacctgcaacgta- gatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatg- cccaccctgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaac- ccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgag- ccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatg- ccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcac- cgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagg- cctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccaca- ggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctg- cctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccg- gagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacag- caggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatg- catgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggt SEQ ID NO: 13 - Sequência de Aminoácido de Tau Humana de Comprimento Total MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGL- KESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGA- PGKQAAAQPHTEIPEGTTAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVT- QARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANA- TRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDR SGYSSPGSPGTPGSRSRTPS- LPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGS- TENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHV- PGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFK- DRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEI- VYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSAS- LAKQGL

Claims (7)

1. Anticorpo monoclonal, que se liga à tau humana, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia leve (LCVR) e uma região variável de cadeia pesada (HCVR), em que a sequência de aminoácido da LCVR é dada pela SEQ ID NO: 9 e a sequência de aminoácido da HCVR é dada pela SEQ ID NO: 10.

2. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia leve (LC) e uma cadeia pesada (HC), em que a sequência de aminoácido da LC é dada pela SEQ ID NO: 1 e a sequência de aminoácido da HC é dada pela SEQ ID NO: 2.

3. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo monoclonal, como definido na reivindicação 1 ou 2, e um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceutica- mente aceitáveis.

4. Uso de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal, como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para o tratamento de doença de Alzheimer, Paralisia Supranuclear Progressiva ou doença de Pick, em um paciente em necessidade do mesmo.

5. Uso de uma composição farmacêutica, como definida na reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para o tratamento de doença de Alzheimer, Paralisia Supranuclear Progressiva ou doença de Pick, em um paciente em necessidade do mesmo.

6. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia.

7. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de uma doença selecionada a partir do grupo que consiste em doença de Alzheimer, Paralisia Supranuclear Progressiva e doença de Pick.