KR101995622B1 - Adk 단백질을 유효성분으로 포함하는 카바페넴 내성 그람음성균에 대한 항균용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유래의 ADK(Adenylate Kinase) 단백질을 유효성분으로 포함하는 카바페넴 내성 그람음성균에 대한 항균용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 마이코박테리움 튜버큘로시스 유래의 ADK 단백질은 카바페넴 내성 그람음성균에 대해 우수한 항균 활성을 가지고 있어, 항균용 조성물로 다양한 분야에서 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유래의 ADK(Adenylate Kinase) 단백질을 유효성분으로 포함하는 카바페넴 내성 그람음성균에 대한 항균용 조성물에 관한 것이다.
항균제란 통상적으로 항미생물제를 총칭하는 것으로, 특히 세균에 대한 항균작용을 하는 물질, 상세하게는 세균이 세포벽이나 단백질 등을 합성하는 시스템을 저해시킴으로써 뛰어난 항균작용을 하는 물질 또는 이러한 물질로부터 제조된 것을 의미한다. 항균제의 성분은 주로 곰팡이로부터 추출된 것이 주를 이루었으며, 오늘날 세균 감염에 의한 질병 등을 치료하기 위해 많이 사용되고 있다.
20세기 플레밍에 의한 페니실린 항균제의 발견을 시작으로, 세균의 감염으로 야기되는 질병으로부터 벗어나기 위하여 수없이 많은 항균제, 항생제가 개발되었다. 이러한 항균제는 우리의 삶에 있어 필수적인 위치를 차지하고 있으며, 의약품으로서 사용될 뿐만 아니라, 식품 및 화장품 보존제로 사용되는 등 그 응용 분야가 광범위하다. 그러나 화학합성 물질을 이용한 항균제의 경우, 이에 대해 내성을 가지는 세균들이 점차 증가하고 있는 실정이며, 이에 따라 그 사용에 점차 제한되고 있다.
항균제 내성세균이란 특정 항균제에 내성을 보여 약효가 듣지 않는 세균을 말한다. 예를 들어, 상기한 페니실린의 약효가 전혀 듣지 않는 페니실린 내성 황색포도상구균이 이에 해당된다. 이 외에도, 1961년 최초로 학계에 보고되었으며, 그 후로 전 세계적으로 주요 병원성 감염균이 되고 있는 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 및 1988년 유럽에서 처음으로 발견된 반코마이신에 내성을 보이는 장구균(vancomycin resistant enterococcus, VRE)이 알려져있으며, 1990년 후반에는 일본, 미국, 프랑스, 한국에서 보고된 반코마이신에 내성을 보이는 황색포도상구균(vancomycin intermediate-resistant staphylococcus aureus, VISA)이 보고되었다. 또한, 인체 감염의 가장 흔한 원인균인 황색포도상구균의 마지막 치료제로 알려진 반코마이신에 고도의 내성을 보이는 포도상구균(vancomycin-resistant staphylococcus aureus, VRSA)이 2002년 미국 질병 통제국(Centers for Disease Control)에서 세계 최초로 보고됨으로써 소위 슈퍼 박테리아의 확산 가능성이 매우 커지고 있다.
한편, 항생제 분야에서 가장 중요하게 인식되고 있는 베타 락탐계 항생제에는 페니실린으로 통용되는 페남(penam), 세파로스포린으로 통용되는 세펨(cefem). 페넴(penem) 및 카바페넴(carbapenem)의 구조를 갖는 항생제가 포함된다. 이중 카바페넴 항생제에는 이미페넴, 파니페넴, 메로페넴, 어타페넴 등이 제품화되어 사용되고 있다.
이에, 본 발명자는 새로운 항균제를 개발하기 위해 노력한 결과, 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유래의 ADK(Adenylate Kinase, Adenosine Kinase) 단백질이 카바페넴 내성 그람음성균에 대해 우수한 항균 활성을 보임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 ADK 단백질을 유효성분으로 포함하는 카바페넴 내성 그람음성균에 대한 항균용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ADK 단백질을 유효성분으로 포함하는 카바페넴 내성 그람음성균에 의해 유발되는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ADK 단백질을 유효성분으로 포함하는 카바페넴 내성 그람음성균에 대한 항균용 조성물, 의약외품, 식품 첨가제, 또는 사료첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 ADK 단백질을 유효성분으로 포함하는 카바페넴 내성 그람음성균에 의해 유발되는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유래의 ADK 단백질은 카바페넴 내성 그람음성균에 대해 우수한 항균 활성을 가지고 있어, 항균용 조성물로 다양한 분야에서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 재조합 ADK 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 ADK 단백질을 유효성분으로 포함하는 카바페넴 내성 그람음성균에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, "항균" 또는 "항균활성"이란, 세균이나 곰팡이와 같은 미생물에 대해 저항하는 성질을 의미하며, 보다 상세하게는 항생물질 등이 세균의 성장 또는 증식을 억제하는 특성을 의미한다.
본 발명에 있어서, "항균용 조성물"은 세균이나 곰팡이와 같은 미생물의 생육을 저해하는 활성을 가진 조성물로서, 항균 효과가 요구되는 다양한 분야에 사용되는 모든 형태가 포함될 수 있으며, 예를 들어, 의약품, 의약외품, 식품 첨가제 또는 사료 첨가제 등의 형태일 수 있다. 구체적으로, 의약에 있어서는 항생제나 오염방지제와 같은 목적으로, 식품에 있어서는 방부나 항균목적으로, 농업에 있어서는 항균, 살균, 소독의 목적으로, 화장품이나 생활용품에는 비듬억제용, 무좀방지용, 겨드랑이 채취억제용, 항여드름용 등 미생물과 직접 연관된 제품에 사용되거나 청소용 세정제나 식기세척용 세정제 등에 방부나 항균 또는 살균 목적으로 사용될 수 있으며, 이러한 목적으로만 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 ADK 단백질은 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)로부터 유래한 것으로, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 암호화될 수 있고, 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 암호화되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.
본 발명의 ADK 단백질에는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. ADK 단백질의 변이체란 ADK 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 ADK 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성 (Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).
본 발명의 ADK 단백질은 서열번호 2의 염기서열로 암호화될 수 있으며, 상기 뉴클레오티드와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명에 있어서, “그람음성균(gram negative bacteria)”은 그람염색법으로 염색했을 때 붉은색으로 염색되는 세균을 의미하는 것으로, 일반적으로 색소 저항력이 강하고, 계면활성제 내성이 강하다. 본 발명의 그람음성균에는 엔도톡신(endotoxin)을 보유한 모든 종류의 그람음성균이 포함되며, 예를 들어, 에스케리아(Escherichia) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 아시네토박터(Acinetobacter) 속, 살모넬라(Salmonella) 속, 크렙시엘라(Klebsiella) 속, 나이세리아(Neisseria) 속, 엔테로박터(Enterobacter) 속, 시겔라(Shigella) 속, 모락셀라(Moraxella) 속, 헬리코박터(Helicobacter) 속, 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 속, 브델로비브리오(Bdellovibrio) 속, 레지오넬라(Legionella) 속 균주 등이 포함되며, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 그람음성균에는 대장균(Escherichia coli), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis), 슈도모나스 퍼투시노제나(Pseudomanas pertucinogena), 슈도모나스 스투트제리(Pseudomanas stutzeri), 슈도모나스 시린개(Pseudomanas syringae), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 아시네토박터 류오피이(Acinetobacter lwoffii), 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus), 아시네토박터 헤모리티쿠스(Acinetobacter haemolyticus), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 살모넬라 봉고리(Salmonella bongori), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum), 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum), 살모넬라 엠반다카(Salmonella mbandaka), 살모넬라 콜레라에슐스(Salmonella choleraesuls), 살모넬라 톰슨(Salmonella thompson), 살모넬라 인팜티스(Salmonella infamtis), 살모넬라 더비(Salmonella derby), 크렙시엘라 뉴모이아(Klebsiella pneumonia), 크렙시엘라 그라눌로마티스(Klebsiella granulomatis), 크렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 크렙시엘라 테리게나(Klebsiella terrigena), 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닌자이티디스(Neisseria meningitidis), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 시겔라 보이디(Shigella boydii), 시겔라 디센테리아에(Shigella dysenteriae), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 시겔라 손네이(Shigella sonnei), 모락셀라 카타할리스(Moraxella catarrhalis), 모락셀라 라쿠나타(Moraxella lacunata), 모락셀라 보비스(Moraxella bovis), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 헬리코박터 헤일마니(Helicobacter heilmannii), 헬리코박터 펠리스(Helicobacter felis), 헬리코박터 무스틸레(Helicobacter mustelae), 헬리코박터 페넬리에(Helicobacter fenelliae), 헬리코박터 라피니(Helicobacter rappini), 헬리코박터 헤파티쿠스(Helicobacter hepaticus), 헬리코박터 빌리스(Helicobacter bilis), 헬리코박터 풀로룸(Helicobacter pullorum), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 스테노트로포모나스 나이트리트리더센스(Stenotrophomonas nitritireducens), 브델로비브리오 박테리오보러스(Bdellovibrio bacteriovorus), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 레지오넬라 아니사(Legionalla anisa), 레지오넬라 비르밍하멘시스(Legionalla birminghamensis), 레지오넬라 보제마니(Legionalla bozemanii), 레지오넬라 신신나티엔시스(Legionalla cincinnatiensis), 레지오넬라 두모피(Legionalla dumoffii), 레지오넬라 필레이(Legionalla feeleii), 레지오넬라 고르마니(Legionalla gormanii), 레지오넬라 하케리애(Legionalla hackeliae), 레지오넬라 이스라엘렌시스(Legionalla israelensis), 레지오넬라 조르다니스(Legionalla jordanis), 레지오넬라 란신젠시스(Legionalla lansingensis), 레지오넬라 롱베아채(Legionalla longbeachae), 레지오넬라 마세아체르니(Legionalla maceachernii), 레지오넬라 믹다데이(Legionalla micdadei), 레지오넬라 오크리드젠시스(Legionalla oakridgensis), 레지오넬라 사인텔렌시(Legionalla sainthelensi), 레지오넬라 툭소넨시스(Legionalla tucsonensis), 레지오넬라 와드스워티(Legionalla wadsworthii) 등이 포함되며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “카바페넴(carbapenem)”은 베타-락탐계 항생제의 일종으로 하기 화학식 1과 같은 구조를 가지고 있다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서, R1 및 R2는 독립적으로 H, C1-C10의 알킬, 또는 히드록시기로 치환된 C1-C10의 알킬이고,
R3는 H, -O-R4 또는 -S-R4이며,
여기서 R4는 N-치환 또는 C-치환된 아민 또는 피롤리딘이다.
예를 들어, 카바페넴 항생제에는 이미페넴(imipenem), 메로페넴(meropenem), 어타페넴(ertapenem), 도리페넴(doripenem), 파니페넴/베타미프론(panipenem/betamipron), 비아페넴(biapenem), 라주페넴(razupenem), 테비페넴(tebipenem), 레나페넴(lenapenem), 토모페넴(tomopenem) 등이 포함되며, 이에 제한되지 않는다.
대표적인 카바페넴 항생제인 이미페넴, 파니페넴, 메로페넴, 어타페넴 및 도리페넴의 구조를 하기 화학식 2 내지 6에 각각 나타내었다.
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
본 발명에 따른 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유래의 ADK 단백질은 카바페넴 내성 그람음성균에 대해 우수한 항균 활성을 가지고 있어, 항균용 조성물로 다양한 분야에서, 즉, 의약외품, 식품첨가제 또는 사료 첨가제 등으로 유용하게 활용될 수 있다.
따라서 본 발명은 ADK 단백질을 유효성분으로 포함하는 카바페넴 내성 그람음성균에 대한 항균용 의약외품, 항균용 식품 첨가제 또는 항균용 사료 첨가제를 제공한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 ADK 단백질을 유효성분으로 포함하는 카바페넴 내성 그람음성균에 의해 유발되는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.
본 발명의 ADK 단백질은 카바페넴 내성 그람음성균에 대해 선택적으로 우수한 항균 활성을 나타내므로, 이를 포함하는 조성물은 카바페넴 내성 그람음성균에 의해 발생하는 감염성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, "감염성 질환"은 바이러스, 세균, 곰팡이, 기생충과 같이 질병을 일으키는 병원체가 동물이나 인간에게 전파, 침입하여 일으킨 질환을 의미하며, 본 발명의 목적상 카바페넴 내성 그람음성균에 의해 유발되는 모든 감염성 질환을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 감염성 질환에는 카바페넴 내성 그람음성균에 의해 유발되는 호흡기 질환, 소화기 질환, 염증성 질환 등이 포함되고, 구체적으로 폐렴, 복막염, 뇌막염, 창상감염, 골관절염, 담낭염, 요로감염증, 뇌수막염, 심내막염, 심근염, 심외막염, 관절염, 인구염, 임질, 세균성 이질, 장염, 결막염, 위염, 중이염, 방광염, 림프관염, 패혈증 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 감염성 질환을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 감염성 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 경구 또는 비경구의 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 약학적 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 1일 0.001 내지 1000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 그러나 경구 투여 시, 단백질은 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 ADK 단백질 외에 항균 활성을 갖는 공지의 물질을 하나 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서, 식품 조성물은 바람직하게는 건강기능식품의 형태일 수 있다.
본 발명에 있어서, “건강기능식품”이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.
상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량 % 이하, 바람직하게는 10 중량 % 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 재조합
ADK(Rv0733)의
클로닝
마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) H37Rv의 게놈 DNA(ATCC 27294)를 주형으로 이용하여, PCR을 통해 ADK(Rv0733) 부위를 증폭하였다 (프라이머: 5'-CATATGAGAGTTTTGTTGCTGGGACCG-3'(서열번호 3) 및 5'- AAGCTTCTTTCCCAGAGCCCGCAACGC-3'(서열번호 4)). 분리된 PCR 산물을 NdeI 및 HindIII 효소로 절단하고, 발현벡터인 pET22b 벡터에 삽입하였다. ADK 유전자가 삽입된 pET22b 벡터로 형질 전환시킨 E. coli BL21을 LB 배지에서 (100 μg/ml 앰피실린 포함) 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 그 후, 1 mM의 이소프로필-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 첨가한 후 6시간 동안 배양하고, 용해 완충액 (lysis buffer, 1M DTT, 리소자임, PMSF 포함)으로 세포를 녹였다. 재조합 단백질은 니켈-니트릴로트리아세트산(Ni-NTA, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 아가로즈를 이용하여 제조사의 방법에 준하여 정제하였다. 최종적으로 정제한 재조합 ADK 단백질을 SDS-PAGE로 분석하여 확인하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
실시예
2.
카바페넴
내성 그람음성균의 확인
고려대학교 감염내과 환자의 혈액에서 아시네토박터 바우마니 KUMC.2014.90 및 KUMC.2014.91균주를 분리하였다. 상기 균주의 항생제 내성을 확인하기 위하여, 1차적으로 자동화기기인 VITEK II 시스템을 이용하였으며, 그 결과 카바페넴 계열 항생제인 이미페뎀, 메로페넴, 어타페넴 등에 대해 모두 내성을 가지고 있음을 확인하였다(결과값 R>32을 확인). 2차적으로, 액체배지 미량희석법을 통해 상기 균주의 카바페넴 계열 항생제인 이미페뎀 및 메로페넴에 대한 내성을 재 확인하였다(결과값 128 μg/ml 초과를 확인).
실험예
1.
ADK
단백질의
카바페넴
내성 그람음성균에 대한 항균 활성 검증
실시예 1에서 수득한 재조합 ADK 단백질의 상기 실시예 2에서 수득한 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니(KUMC.2014.90 및 KUMC.2014.91균주)에 대한 항균 활성을 검증하기 위하여, 종래 공지된 방법에 따라 Rezazurin assay를 수행하여 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) 균주에 대한 최소억제농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 및 최소살균농도(minimum bactericidal concentration, MBC)를 측정하였다. 대조군으로는 정상 균주인 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)를 이용하였다. 실험 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 항생제 및 ADK 단백질을 처리하지 않은 웰에서의 결과값을 100%로 하여 50% 및 80% 억제 농도를 계산한 결과, 항생제들(Ampicillin, Rukasyn, Cravit, Prepenem)은 정상 균주인 아시네토박터 바우마니의 성장은 저해하지만 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니(KUMC.2014.90 및 KUMC.2014.91균주)의 성장을 저해하지 못함을 확인하였다. 반면, ADK 단백질은 정상 균주인 아시네토박터 바우마니 뿐만 아니라 두 종류의 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니(KUMC.2014.90 및 KUMC.2014.91균주)의 성장을 현저하게 저해함을 확인하였다.
이상의 실험 결과를 통하여, 본 발명에 따른 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유래의 ADK 단백질은 카바페넴 내성 그람음성균에 대해 우수한 항균 활성을 가지고 있음을 확인하였다.
이하 본 발명의 약학적 조성물 및 식품 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예
1. 약학적 조성물의 제조
1-1.
산제의
제조
ADK 단백질 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
1-2. 정제의 제조
ADK 단백질 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
1-3. 캡슐제의 제조
ADK 단백질 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제제예
2. 식품 조성물의 제조
2-1. 건강식품의 제조
ADK 단백질 100 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 g
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 g
비타민 C 10 mg
비오틴 10 g
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 g
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
<110> Konkuk University Glocal Industry-Academic Collaboration Foundation
<120> Anti-bacterial composition comprising ADK against
carbapenem-resistance gram-negative bacteria
<130> 1.11P-1
<150> KR 10-2015-0047360
<151> 2015-04-03
<160> 4
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 182
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 1
Met Arg Val Leu Leu Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly Lys Gly Thr Gln
1 5 10 15
Ala Val Lys Leu Ala Glu Lys Leu Gly Ile Pro Gln Ile Ser Thr Gly
20 25 30
Glu Leu Phe Arg Arg Asn Ile Glu Glu Gly Thr Lys Leu Gly Val Glu
35 40 45
Ala Lys Arg Tyr Leu Asp Ala Gly Asp Leu Val Pro Ser Asp Leu Thr
50 55 60
Asn Glu Leu Val Asp Asp Arg Leu Asn Asn Pro Asp Ala Ala Asn Gly
65 70 75 80
Phe Ile Leu Asp Gly Tyr Pro Arg Ser Val Glu Gln Ala Lys Ala Leu
85 90 95
His Glu Met Leu Glu Arg Arg Gly Thr Asp Ile Asp Ala Val Leu Glu
100 105 110
Phe Arg Val Ser Glu Glu Val Leu Leu Glu Arg Leu Lys Gly Arg Gly
115 120 125
Arg Ala Asp Asp Thr Asp Asp Val Ile Leu Asn Arg Met Lys Val Tyr
130 135 140
Arg Asp Glu Thr Ala Pro Leu Leu Glu Tyr Tyr Arg Asp Gln Leu Lys
145 150 155 160
Thr Val Asp Ala Val Gly Thr Met Asp Glu Val Phe Ala Arg Ala Leu
165 170 175
Arg Ala Leu Gly Lys ***
180
<210> 2
<211> 546
<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 2
gtgagagttt tgttgctggg accgcccggg gcgggcaagg ggacgcaggc ggtgaagctg 60
gccgagaagc tcgggatccc gcagatctcc accggcgaac tcttccggcg caacatcgaa 120
gagggcacca agctcggcgt ggaagccaaa cgctacttgg atgccggtga cttggtgccg 180
tccgacttga ccaatgaact cgtcgacgac cggctgaaca atccggacgc ggccaacgga 240
ttcatcttgg atggctatcc acgctcggtc gagcaggcca aggcgcttca cgagatgctc 300
gaacgccggg ggaccgacat cgacgcggtg ctggagtttc gtgtgtccga ggaggtgttg 360
ttggagcgac tcaaggggcg tggccgcgcc gacgacaccg acgacgtcat cctcaaccgg 420
atgaaggtct accgcgacga gaccgcgccg ctgctggagt actaccgcga ccaattgaag 480
accgtcgacg ccgtcggcac catggacgag gtgttcgccc gtgcgttgcg ggctctggga 540
aagtag 546
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F Primer
<400> 3
catatgagag ttttgttgct gggaccg 27
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R Primer
<400> 4
aagcttcttt cccagagccc gcaacgc 27
Claims (9)
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 ADK(Adenylate Kinase) 단백질을 유효성분으로 포함하는 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumanni) 그람음성균에 대한 항균용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 ADK 단백질은 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유래인 것을 특징으로 하는, 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumanni) 그람음성균에 대한 항균용 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 ADK 단백질은 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 인코딩되는 것을 특징으로 하는, 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumanni) 그람음성균에 대한 항균용 조성물.
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 ADK(Adenylate Kinase) 단백질을 유효성분으로 포함하는 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumanni) 그람음성균에 대한 항균용 의약외품.
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 ADK(Adenylate Kinase) 단백질을 유효성분으로 포함하는 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumanni) 그람음성균에 대한 항균용 식품 첨가제.
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 ADK(Adenylate Kinase) 단백질을 유효성분으로 포함하는 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumanni) 그람음성균에 대한 항균용 사료 첨가제.
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 ADK(Adenylate Kinase) 단백질을 유효성분으로 포함하는 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumanni) 그람음성균에 의해 유발되는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 ADK(Adenylate Kinase) 단백질을 유효성분으로 포함하는 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumanni) 그람음성균에 의해 유발되는 감염성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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