KR101992176B1

KR101992176B1 - 브라제인의 대량 생산 방법

Info

Publication number: KR101992176B1
Application number: KR1020170122383A
Authority: KR
Inventors: 공광훈; 김명철; 김현수
Original assignee: 주식회사 바이오스위트
Priority date: 2016-09-23
Filing date: 2017-09-22
Publication date: 2019-06-25
Also published as: KR20180033098A; WO2018056747A1

Abstract

본 발명은 산업적 규모에서 브라제인의 대량 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 유당 발효 효모인 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)에서 브라제인의 발현 시 최적 배양 조건을 확립한 것으로, 정제공정을 단순화시킴과 동시에 기존 실험실 규모의 브라제인 대량 생산과는 달리 실제 공장 등의 산업적 규모에서 브라제인을 대량 생산할 수 있다.

Description

브라제인의 대량 생산 방법{Mass production method of brazzein}

본 발명은 산업적 규모에 적합한 브라제인의 대량 생산 방법에 관한 것이다.

지난 10년간, 지나친 당 섭취는 당의 고칼로리 특성 때문에 많은 성인 질환 및 다른 관련 질병을 일으켰다. 가공 식품에서 당의 사용을 줄이거나 당을 더 적은 칼로리의 다른 감미 분자로 대체하여 당의 흡수를 줄이기 위해 많은 노력을 해왔다. 따라서, 당 대체 시장은 지속적인 성장이 기대된다. "Research and Markets (연구와 시장)"의 보고에 따르면, 전세계 당 대체 시장은 2014년에 115억 3,860만 달러 규모로 2019년까지 143억 5천 5백만 달러에 이를 것으로 기대되며, 동일 기간 연평균 성장률은 4.5%이다. 당 대체물은 스테비아 (stevia), 솔비톨 (sorbitol), 타가토스 (tagatose), 아스파탐 (aspartame), 사카린 (saccharin), 수크라로스 (sucralose), 자일리톨 (xylitol), 단백질, 및 다른 감미 분자를 포함한다.

당의 대체물 중, 감미 단백질은 상업적 용도로 연구되어 왔다. 지금까지 다음의 여덟 가지 단백질이 감미 특성을 가지는 것으로 확인되었으나 질적인 면에서 약간의 차이가 있다: 브라제인, 커르큘린/네오큘린 (curculin/neoculin), 난백 리소자임, 마빈린 (mabinlin), 모넬린 (monellin), 펜타딘 (pentadin), 및 타우마틴 (thaumatin). 단백질을 당 대체물로 사용하는데 있어 가장 큰 문제는 단백질이 가혹한 pH 및 온도 환경에 취약하다는 것이며, 이로 인해 식품 산업에 응용하는데 있어 한계가 있다. 상기 여덟 가지 단백질 중 브라제인은 가장 당과 유사한 맛을 내고 이례적으로 우수한 열안정성을 나타내므로 식품 산업에서 가장 유망하고 매력적인 당 대체제로 알려져 있다.

브라제인의 상업적 응용을 결정하는 주요인은 얼마나 효율적이고 경제적으로 이를 생산할 수 있는가에 있다. 천연에서 브라제인을 추출하는 것은 어렵기 때문에, 상업적 응용에 충분한 양의 브라제인을 생물공학적으로 생산하기 위해 다수의 발현계가 도입되었다. 브라제인의 이종 생산은 외래 숙주인 Escherichia coli, Lactococcus lactis, Pichia pastoris, 옥수수 (maize), 및 형질전환 생쥐의 젖에서 이루어졌다. 이러한 발현계는 낮은 발현량을 나타내거나 복잡한 정제 단계 및/또는 대량 생산에 부적합한 화학물질을 수반한다. 브라제인을 다량 생산하기 위해, 재조합 브라제인을 Kluyveromyces lactis에서 발현시켰으며, 이는 그라스 (GRAS), 즉 일반적으로 안전하다고 간주되는(generally regarded as safe) 물질로, 다양한 탄소원을 사용할 수 있는 것으로 알려져 있다. K . lactis는 통상의 발효당 (포도당, 갈락토오스, 수크로오스, 및 락토오스)뿐 아니라 글리세롤, 젖산 (lactate) 또는 에탄올 같은 탄소원을 사용할 수 있다. 이러한 특징 때문에 K. lactis은 성장을 위한 숙주에 영양소를 공급하기 위해 저렴한 탄소원을 사용할 수 있으므로 산업적 규모의 생산에 있어 유리한 선택이 된다.

본 발명자들에 의해 선출원된 특허문헌 1과 2와 같은 브라제인 대량 생산방법의 경우에는, 2 리터 실험실 규모에서 가능하며, 산업적 규모에 적용하기에는 배양 배지의 가격이 비싸 원가상승의 주요인이 되며, 발현 시 목적단백질인 브라제인 외에도 다른 단백질이 발현되어 그것들과 분리하기 위하여 카르복시메틸 셀룰로오스 양이온 교환 수지 컬럼과 같은 복잡한 정제공정을 거치는 문제점이 있다.

국내 공개특허 제2011-0097043호 국내 등록 특허 제1536683호

이에, 본 발명자들은 실제 공장에서 브라제인을 대량 생산할 수 있도록 산업적 규모에 적합한 브라제인 대량 생산방법을 위해 pH, 온도 조건 및 유도제 첨가 시기를 세포 성장 및 브라제인 발현(생산) 단계에 맞게 최적화하면서 최적 배지 조건을 확립하여 더욱 간단한 정제 단계를 통해 브라제인을 더 효율적이고 경제적으로 생산할 수 있는 대량 생산방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 산업적 규모에 적합한 브라제인 대량 생산방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 브라제인의 발현을 위하여 GRAS로 인증된 비병원생 미생물인 효모 클루이베로마이세스 락티스를 발현을 위한 숙주로 하여, 세포 성장 및 브라제인 발현을 위해 최적 배양 조건 및 배지 조성을 확립한 브라제인의 대량 생산방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 브라제인 대량 생산방법의 일 구현예로서, 브라제인 유전자를 포함하는 브라제인 발현용 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)를 숙주로 하고, pH 5.5 내지 pH 6.5, 온도 28 ℃ 내지 32 ℃에서 배양하는 단계(제 1 배양 단계, 세포 성장 단계)를 포함할 수 있다.

상기 제 1 배양(세포 성장) 단계는 15 시간 내지 25시간 동안 실시하는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 탄소 원, 질소 원, 인 원 및 황 원이 6~8: 1 : 1.5~3 : 0.001~0.01의 중량비율로 포함되는 배지에서 세포를 성장(증식)시킬 수 있다.

즉, 본 발명은 탄소 원, 질소 원, 인 원 및 황 원을 6~8: 1 : 1.5~3 : 0.001~0.01의 중량비율을 가지는 브라제인 생산을 위한 세포 성장용 배지를 포함할 수 있다.

상기 탄소 원은 글루코오스, 글리세롤, 갈락토오스 등일 수 있으며, 보다 바람직하기로는 글루코오스가 적합하다.

상기 질소 원은 질산암모늄, 황산암모늄, 염화암모늄 등일 수 있으며, 보다 바람직하기로는 질산암모늄이 적합하다.

상기 인 원은 인산칼륨 버퍼, 인산나트륨 버퍼 등일 수 있으며, 보다 바람직하기로는 인산칼륨 버퍼가 적합하다.

상기 황 원은 황산나트륨, 황산암모늄 등일 수 있으며, 보다 바람직하기로는 황산나트륨이 적합하다.

본 발명에서 사용된 용어 '비율'은 중량 비율을 의미한다.

본 발명의 브라제인은 N-말단에 추가 아미노산 서열이 존재할 경우, 그 단맛이 현저하게 감소한다. 따라서, 효모 알파-메이팅 신호서열의 완벽한 절단 여부가 그 단맛을 결정하는데 매우 중요한 역할을 한다. 만일 사카로마이세스 세레비지애 유래의 알파-메이팅 신호서열을 사용하여 브라제인을 생산하게 되면, 브라제인이 야생형으로 존재하지 못하고, N-말단에 추가 아미노산 서열을 갖게 되어 브라제인의 단맛 증대에 악영향을 미칠 수 있다.

이에, 본 발명자들은 효모 알파-메이팅 신호서열로서 적합한 신호서열을 조사한 결과, 본 발명에서 숙주로 사용하고 있는 GRAS 유래 비병원성 균주인 클루이베로마이세스 락티스 유래의 신호서열을 사용하게 되면 본 발명에서 최종 분비 배출된 단백질의 N-말단 서열에서 신호서열이 모두 잘려나가 100% 모두 야생형 브라제인 부타입 아미노산 서열로만 존재함을 확인하였다.

상기 브라제인 유전자는 야생형 브라제인 유전자 또는 브라제인 변이체 유전자일 수 있다.

본 발명에 있어서, 브라제인 유전자는 브라제인 주타입, 부타입, 변이체 모두의 유전자를 모두 포함할 수 있다.

브라제인 변이체 유전자는 브라제인 부타입의 1차 내지 4차로 변이한 변이체의 유전자를 의미하며, 구체적으로 국내 등록 특허 제 981087호, 국내 등록 특허 제 108340호, 국내 등록 특허 제1416892호, 국내 등록 특허 제1416892호, 또는 국내 등록 특허 제1416892호에 개시된 유전자일 수 있다.

아울러, 상기 재조합 발현벡터에는 브라제인 유전자 외에 작동 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 "재조합 발현벡터"란 숙주세포에서 목적 단백질 발현(expression) 또는 목적 RNA를 전사(transcription)할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다.

상기 '작동 유전자'란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, '작동 가능하게 연결된다(operably linked)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 작동 유전자로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 효모 LAC 프로모터, GAL 프로모터(Rosaura Rodicio et al., Microbiology 152 (2006), 2635-2649), KlADH4 프로모터(Michele Saliola et al., Appl Environ Microbiol. 1999 January; 65(1): 53-60), 말타아제/말토오스 퍼메아제 바이-디렉션널 프로모터(미국 특허 제6,596,513호), PGK1 프로모터(V. Melvydas et al., BIOLOGIJA, 4:1-4, 2006) 등이 있다. 이외에도 미국 특허 제227,326호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 프로모터는 LAC4 프로모터를 사용할 수 있다.

본 발명에서 브라제인 발현을 위한 재조합 발현벡터로는 특허문헌 1에 개시되어 있는 바와 같이 pKLAC2-브라제인일 수 있으며, 보다 바람직하게는 pKLAC2-브라제인(WT-minor type), pKLAC2-브라제인(H30R), pKLAC2-브라제인(E35D), pKLAC2-브라제인(E40A), pKLAC2-브라제인(H30R_E35D), pKLAC2-브라제인(H30R_E40A), pKLAC2-브라제인(E35D_E40A), pKLAC2-브라제인(H30R_E35D_E40A), pKLAC2-브라제인(H30R_E35D_E40A_E52K)일 수 있다.

상기 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)는 상기 재조합 발현벡터로 통상의 형질전환 방법에 따라 형질전환되고, 이때 형질전환은 핵산을 숙주세포에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격 유전자 전달법(electroporation), 초산화 리튬(LiCH₃COO)법, 염화 리튬(LiCl)법, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 운반 DNA 융합법(Carrier-DNA mediated fusion) 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은

브라제인 유전자를 포함하는 브라제인 발현용 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)를 숙주로 하고, pH 5.5 내지 pH 6.5, 온도 28 ℃ 내지 32 ℃에서 배양하는 단계(제 1 배양 단계, 세포 성장 단계); 및

pH 6.0 내지 pH 7.0, 온도 21 ℃ 내지 25 ℃에서 배양하는 단계(제 2 배양 단계, 브라제인 발현 단계);

를 포함하는 산업적 규모에 적합한 브라제인의 대량 생산방법을 포함한다.

상기 제 1 배양 단계(세포 성장 단계)는 전술한 세포 성장 단계의 내용과 동일하다.

본 발명에 따른 브라제인 대량 생산방법의 일 구현예로서, 상기 제 2 배양 단계는 탄소 원과 질소 원이 2.5~3.5:1의 중량비율로 포함된 배지에서 배양하여 브라제인을 발현시키는 것을 포함한다.

즉, 본 발명은 탄소원과 질소원이 2.5~3.5:1의 중량비율로 포함된 브라제인 생산을 위한 발현용 배지를 포함할 수 있다.

또한, 상기 탄소 원은 글루코오스, 락토오스, 글루코오스와 갈락토오스가 5~15:1의 중량비율로 혼합된 혼합물을 포함할 수 있다.

상기 질소 원은 질산암모늄, 염화암모늄, 질산나트륨 등일 수 있으며, 보다 바람직하기로는 질산암모늄이 적합하다.

상기 제 2 배양 단계(브라제인 발현)의 배양은 70 시간 내지 100시간 동안 수행할 수 있다.

또한, 상기 제 2 배양 단계 배양 시작 시 단백질 유도를 위한 유도제로 갈락토오스를 OD₆₀₀=1 일 때 첨가할 수 있다.

본 발명은 기존 실험실 스케일의 브라제인 대량 생산방법에서 크로마토그래피 과정과 같은 복잡한 정제 과정을 거치지 않고 한외여과법과 투석법의 간단한 정제공정만으로도 산업적 규모에서 브라제인을 대량 생산할 수 있다.

본 발명에서는 이전에 본 발명자들에 의해 확정된 K. lactis 브라제인 발현계를 사용하고, 화학적 규명 배지를 최적화시키고 대량 생산을 위해 배양 조건을 최적화하여 산업적 규모에서 브라제인 대량 생산이 가능하도록 하였다.

특히, 본 발명에 따른 배양 조건 최적화를 통하여 브라제인 생산 원료비를 약 10배 절감할 수 있으며, 발현된 목적단백질 브라제인의 외에 다른 단백질의 발현이 거의 없기 때문에 비싼 가격의 양이온 교환 수지 컬럼을 사용할 필요도 없으며, 정제 공정이 간단해 짐에 따라 산업적 규모에 적용 시 생산 단가를 크게 낮출 수 있다.

도 1은 YPD 배지를 사용하여 30 ℃, 상이한 pH 조건에서 K. lactis의 최대 세포 밀도 및 비증식율(specific growth rate)를 나타낸 것으로, 세포 성장 단계에서의 최적 pH를 확인할 수 있다.
도 2는 상이한 pH 조건에서 브라제인 발현을 SDS-PAGE(a) 및 밀도계측 분석(b)으로 확인한 것이다.
도 3은 YPD 배지를 사용하여 pH 6, 상이한 온도 조건에서 K. lactis의 최대 세포 밀도 및 비증식율(specific growth rate)를 나타낸 것으로, 세포 성장 단계에서의 최적 온도를 확인할 수 있다.
도 4는 상이한 pH 및 온도 조건에서 브라제인 발현을 SDS-PAGE(a) 및 밀도계측 분석(b)으로 확인한 것이다.
도 5는 상이한 탄소원을 사용한 K. lactis의 최대 세포 밀도 및 비증식율을 나타낸 것이다.
도 6은 상이한 질소원을 사용한 K. lactis의 최대 세포 밀도 및 비증식율을 나타낸 것이다.
도 7은 상이한 C/N 비율을 사용한 K. lactis의 최대 세포 밀도 및 비증식율을 나타낸 것이다.
도 8은 상이한 N/P 비율을 사용한 K. lactis의 최대 세포 밀도 및 비증식율을 나타낸 것이다.
도 9는 상이한 P/S 비율을 사용한 K. lactis의 최대 세포 밀도 및 비증식율을 나타낸 것이다.
도 10은 배양 시간에 대하여, 갈락토오스 생성 배지를 사용하여 브라제인 발현을 SDS-PAGE(a) 및 밀도계측 분석(b)으로 확인한 것이다.
도 11은 다양한 탄소원 및 글루코오스/갈락토오스 비율을 사용한 브라제인 발현을 SDS-PAGE(a) 및 밀도계측 분석(b)으로 확인한 것이다.
도 12는 상이한 C/N 비율에서 브라제인 발현을 SDS-PAGE 및 밀도계측 분석을 이용하여 넓은 범위의 C/N 비율(a)에서 확인한 것과 세세한 범위의 C/N 비율(b)에서 추가적으로 확인한 것이다.
도 13은 브라제인 발현의 유도제로 사용되는 갈락토오스의 첨가 시간에 따른 브라제인 발현을 SDS-PAGE 및 밀도계측 분석으로 확인한 것이다.
도 14는 최적화된 화학적 규명 배지와 복합 배지에서 브라제인의 발현 순도를 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 15는 본 발명의 브라제인 대량 생산방법에 따라, 화학적 규명 배지를 온도, pH, 유도제 첨가 시기에 대해 최적화한 생산 배지(optimized)에서 생산된 브라제인 발현양과 최적화가 되지 않은 화학적 규명 배지(none)에서의 브라제인 발현양을 SDS-PAGE(a) 및 밀도계측 분석(b)으로 확인한 것이다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

[실시예]

1.1. 스케일-업(scaling up)을 위한 화학적 규명 배지

적합한 배양 배지의 사용은 항상 세포 성장 및 다양한 세포 대사산물의 생산 또는 이종 단백질 발현을 위한 필수 요소였다. 사용된 물질에 따라, 배양 배지는 화학적으로 규명 (합성, 규명) 또는 규명되지 않을 (천연, 복합) 수 있다. 규명된 배지는 정확한 조성을 가진 순수 화학물질로 구성되나, 복합 배지는 조성에 대한 정확한 지식 없이 천연 원료에서 유래된 성분의 혼합물이다. 대다수 성분의 조성은 알려져 있으나 하나 또는 두 개의 복합 영양소가 규명되지 않은 반 (semi)-규명 배지 역시 사용되었다. 그러나, 반-규명 배지는 화학적으로 비규명된 물질을 함유하기 때문에 엄격하게는 복합 배지로 분류된다.

복합 배지 또는 비규명 배지는 일반적으로 실험실용 또는 목적 분자를 생산이 상기 배지의 사용에 의해 엄격히 영향을 받지 않거나 제한되지 않는 상업용으로 사용된다. 복합 배지는 다양한 비타민, 아미노산, 미네랄, 및 거대분자 전구체를 포함하는 세포 성장에 필요한 모든 영양소를 포함하고 있기 때문에 일부 상황에서 바람직하게 사용될 수 있다. 그러나, 복합 배지의 사용은 성능 또는 생산성의 군간 (lot-to-lot) 변동을 초래할 수 있다. 특히, 단백질 또는 다당류와 같은 생물학적 산물의 생산성은 규명되지 않은 배지를 사용한 경우 변동될 수 있다. 또한, 다양한 화합물은 미생물을 목적 산물의 생산을 방해하는 다양한 대사 경로로 유도한다. 그러므로, 화학적 규명 배지는 복합 배지의 한계를 극복하기 위해 사용된다.

화학적 규명 배지는 복합 배지에 비해 많은 장점을 가진다. 화학적 규명 배지의 화학적 조성은 최소한의 복잡한 상호작용으로 체계적으로 첨가 또는 제거될 수 있으므로, 기초적인 대사 연구를 위해 사용되어 왔다. 더욱, 규명된 배지의 스케일-업 절차는 복합 배지보다 문제성이 적다.

따라서, 세심한 화학적 규명 배지 설계 및 최적화는 생산 비용을 감소시킬 뿐 아니라 원하는 산물을 높은 수득률로 높은 일관성을 가지고 확보할 것이다. 이에 따라, 효모인 K. lactis 내 브라제인의 생산은 높은 수득률 및 스케일-업을 목적으로 한 체계적인 접근법을 통해 화학적 규명 배지를 사용하여 최적화되었다. 규명 배지의 주요 조성은 성장 및 생산 단계 모두를 위해 최적화된 탄소, 질소, 인 및 황의 비율을 결정하여 검토하였다.

2. 브라제인의 대량 생산을 위한 배양 조건 최적화

2.1. 물질 및 방법

2.1.1. 물질 및 장치

본 실험에서 사용된 감미 단백질 브라제인 (pE1M-브라제인 형태에서 N-말단 메티오닌이 결핍된 des-pE1M-브라제인)은 이전 연구에서 설명된 바와 같이 Kluyveromyces lactis 발현계로 발현되었다[Jo, H. J., Noh, J. S., & Kong, K. H. (2013). Efficient secretory expression of the sweet-tasting protein brazzein in the yeast Kluyveromyces lactis. Protein Expression and Purification , 90(2), 84-89, 특허문헌 1 참조, pKLAC2-브라제인 유전자로 형질전환된 Kluyveromyces lactis]. 화학적 규명 배지를 위해 사용된 모든 화학물질 및 시약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였고 달리 언급되지 않는 한 상업적으로 가장 높은 등급을 사용하였다.

세포 배양용 E-cell 3000 10 L 배양기는 이셀 (Anyang, Korea)에서 공급되었으며, 300L 발효시스템 (바이오트론 (코바이오텍) 제작) 경북바이오산업연구원(Andong, Korea)의 시설을 이용하였다. Supra 22K 모델 고속 원심분리기 및 Smart-R17 미량원심분리기 (micro-centrifuge) 및 세포 채취용 마이크로-12는 Hanil (Seoul, Korea)에서 제공되었다. 세포의 무균 제어를 위한 VB-700H1 클린 벤치 (clean bench)는 Vision Biotech (Incheon, Korea)에서 제공되었다. ORION STAR A211 pH 측정기는 Thermo Scientific (Pittsburgh, PA, USA)로부터 입수하였다. NA-1010 단백질 전기영동 SDS-PAGE 장치는 Nihon EIDO (Tokyo, Japan)로부터 구매하였다. 전자 저울인 Analytical Balance CPA224S model은 Satorious (Goettingen, Germany)에서 공급되었다. KMC-1302L 저온실 (cold chamber)은 Vision Scientific (Daejeon, Korea)로부터 구매하였다. 동결 건조기, TFD5505 모델, 및 냉동 냉장고, DF8503S 초저온 냉장고는 Ilshin (Gyeonggi, Korea)에서 제공되었다. 세포 밀도 결정 및 단백질 정량화를 위한 UV-가시광선 분광 광도계 (spectrophotometer)는 MECASYS (Daejeon, Korea)에서 제공되었다.

2.1.2. 배양 조건 최적화

규명 배지를 사용한 브라제인 대량 생산을 위해, 발효 절차를 두 단계로 나누었다. 발효의 첫 번째 단계는 세포가 성장하는 단계로 단백질 발현을 위한 생물학적 공장들(biological factories)로 여겨질 수 있다. 세포 밀도가 일정 수준에 이르면, 두 번째 단계가 시작되어 목적 단백질이 생산된다. 생산 단계에서는, 단백질 발현을 위해 최적화된 배양 환경의 변화와 함께 유도물질(inducer)이 첨가된다. 즉, 본 배양 단계의 배양과정을 두 단계로 나누어 세포를 증식시키는 단계와 세포가 많이 성장했을 때 목적 단백질인 브라제인을 많이 발현시키는 단계로 나눈다. 본 실험에서는, 성장 및 생산 단계 모두에서 배양 배지를 최적화하여 유가 배양(fed-batch)에 사용할 수 있다. 모든 배양 세트는 10 L와 300 L 규모 배양기에서 실시되었다. OD₆₀₀ = 1은 0.223 g/L의 건조 세포 중량과 일치한다.

2.1.2.1. pH, 온도 및 유도제 첨가 시기 최적화

초기 pH 및 온도 최적화는 복합(complex) 배지를 사용하여 수행되었다. YPGal (리터당: 10 g 효모 추출물, 20 g 펩톤, 20 g 갈락토오스) 배지에서 세포 성장 및 단백질 발현을 검토하였다. 접종원은 YPD (리터당: 10 g 효모 추출물, 20 g 펩톤, 20 g 덱스트로오스) 배지를 사용하여 30 ℃, 200 rpm에서 20 시간 동안 배양하였고, 최대 세포 밀도가 약 OD₆₀₀ = 1가 되도록 분주하였다. pH 최적화는 완충 환경에서 100 mM 인산칼슘 버퍼를 사용하여 다음과 같은 pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 및 7.0로 수행되었다. 세포는 YPGal 배지에서 23 ℃, 200 rpm에서 96 시간 동안 배양되었다. 세포 성장 및 발현을 위한 최적의 pH를 결정하기 위해 성장 곡선 및 브라제인 분비 발현량을 얻었다.

다음과 같은 세포 성장 및 브라제인 발현을 위한 pH 최적화, 최적의 온도가 최적의 pH에서 결정되었다. 접종원은 YPD (리터당: 10 g 효모 추출물, 20 g 펩톤, 20 g 덱스트로오스) 배지를 사용하여 30 ℃에서 20시간 동안 배양하였고, OD₆₀₀ = 1로 분주하였다. 세 가지 온도 (23 ℃, 30 ℃, 및 37 ℃)로 YPGal 배지에 96시간 동안 실험하고 배양하였다. 유사하게, 성장 곡선과 브라제인 분비 발현량을 얻었다.

브라제인 발현을 위한 유도제 첨가 시기의 최적화가 최적의 시간에서 결정되었다. 접종원은 YPD (리터당: 10 g 효모 추출물, 20 g 펩톤, 20 g 덱스트로오스) 배지를 사용하여 30 ℃, 20 시간 동안 배양하였고, OD600 = 1로 분주하였다. 유도제 첨가 시기의 최적화는 브라제인 발현을 위해 OD₆₀₀이 각각 1,10,20이 될 때로 YPD 배지에 유도제인 갈락토오스(리터당: 20g)를 첨가하여 23 ℃, 96시간 동안 배양하였다. 유도제 첨가 시기를 결정할 때에는 세포를 목표 세포 밀도에 도달할 때까지 성장시켜야 하기 때문에 발현배지에도 덱스트로오스를 첨가하며, 이후 산업적 규모의 실험을 진행할 때에도 발현배지에 덱스트로오스와 갈락토오스를 함께 첨가한다. 유사하게, 성장 곡선과 브라제인 분비 발현량을 얻었다.

2.1.2.2. 화학적 규명 배지 설계

2.1.2.2.1. 성장 배지 최적화(제 1 배양 단계 조건 최적화)

화학적 규명 배지를 설계하는 하나의 합리적인 방법은 미생물의 화학적 조성에서 시작된다. 하기 표 1은 흔히 사용되는 미생물의 원소 조성을 보여준다.

화학적 규명 배지의 초기 배지 조성은 다음과 같이 설정되었다 (리터당): 21 g 글루코오스, 3.744 g NH₄NO₃, 0.1 g Na₂SO₄ (무수), 및 미량 금속, 즉, 100 mM 인산칼슘 버퍼(KPB) (pH 6) 내 0.84 g KCl, 0.21 g MgCl₂ (무수), 0.13 g CaCl₂ㆍ2H₂O, 0.22 g FeCl₃ㆍ3H₂O, 0.003 g CuCl₂ㆍ2H₂O, 0.003 g MnCl₂ㆍ2H₂O, 0.000089 g Na₂MoO₄ㆍ2H₂O, 0.001 g ZnCl₂. 화학적 규명 배지의 성분은 실험적 설정에 따라 성분 및 농도를 변화시켜 사용하였다. 상기 2.1.2.1에 나타난 세포 성장에 최적화된 pH 및 온도에 따라, 세포를 pH 6 및 30 ℃에서 성장시켰다.

탄소 및 질소원의 최적의 활용을 먼저 검토하였다. 탄소 및 질소원의 선호도는 미생물에 따라 다르기 때문에, 다섯 가지 다른 탄소원 (글루코오스, 수크로오스, 글리세롤, 갈락토오스 및 락토오스; NH₄Cl 사용) 및 세 가지 다른 질소원 (NH₄Cl, NH₄NO₃ 및 NaNO₃; 바람직한 탄소원 사용)를 비교하였다. 탄소 및 질소원의 선호도를 6.4의 C/N 비율로 조사하였다. 접종원 제조를 위해, YPD 배지에서 24시간 동안 세포를 성장시키고, 그 다음 3000 ×g 및 4 ℃에서 10분 동안 원심 분리하였다. 상등액을 버린 후 펠렛을 멸균된 TDW에 재현탁하고, 최종 세포 밀도가 약 OD₆₀₀ = 1가 되도록 균등하게 분주하였다. 최적의 원소원을 결정하기 위해, 개별 조성에 대한 성장 곡선 및 비성장율(μ)을 얻었다. 탄소원 선호도 실험을 먼저 수행한 다음, 질소원 선호도 실험을 하였다. 비성장율(μ)은 다음과 같이 정의하였다: (lnD₂-lnD₁)/t₂-t₁ 여기에서, D는 세포 밀도를 나타내고 t는 시간을 나타낸다(상기 식은 단위 시간에 따른 효모세포의 밀도를 자연대수 취한 것임).

탄소 및 질소원 선호도를 선택한 후, 최적의 배지 조성을 검토하였다. 1 내지 15 범위의 C/N 비율을 먼저 검사한 후, 원하는 비율에 따라 질산암모늄(N 원) 농도를 변화시켰다. C/N 비율 최적화 후, KPB (P 원)의 농도를 변화시켜 최적의 N/P 비율 (0.1-10)을 조사하였다. 그 다음, 다양한 황산나트륨(S 원) 농도에서 P/S 비율 (100-1500) 최적화를 수행하였다.

Element	Bacteria	Yeast	Fungi
	(Average % dry cell weight)
Carbon	48	48	48
Nitrogen	12.5	7.5	6
	(Average g/100g dry cell weight)
Phosphorous	2.5	1.7	2.5
Sulfur	0.6	0.13	0.3
Potassium	2.8	2.5	1.4
Sodium	0.8	0.06	0.26
Calcium	0.56	0.2	0.75
Iron	0.11	0.26	0.15
Copper	0.02	0.006	-
Manganese	0.006	0.004	-
Molybdenum	-	0.002	-

2.1.2.2.2. 생산 배지 최적화(제 2 배양 단계 조건 최적화)

재조합 단백질의 생산을 위해, 높은 수득률을 위해 적절한 유도 및 자원이 요구된다. 그러므로, 스크리닝 목적으로 LAC4 프로모터를 유도(갈락토오스 및 락토오스)할 수 있는 탄소원을 선택하였다. 또한, LAC4 를 프로모터로 사용하는 K. lactis 발현의 경우 글루코오스/갈락토오스 비율 (1-1000)을 검토하였다. C/N 비율 3에서 초기 스크리닝을 수행하였다. 세포를 최적화된 성장 배지(2.1.2.2.1)에서 16 내지 20시간 동안 성장시킨 후 3000 ×g 및 4 ℃에서 10분간 원심분리하여 채취하였다. 세포를 멸균 TDW로 재현탁한 다음, 접종원을 최종 세포 밀도가 약 OD₆₀₀ = 10가 되도록 균등하게 분주하였다. 세포를 높은 밀도로 분주하여 높은 세포 밀도에서 유도되는 유가 배양과 유사한 환경을 형성하였다. 유도를 위한 최적의 탄소원을 선택한 다음, 최적의 C/N 비율을 조사하였다. 생산배지에 사용한 질소원은 성장배지에서 최적화된 질소원인 질산암모늄을 이용하였다. 단백질 발현은 다수의 질소원을 요구하기 때문에, 조사된 비율(0.1-8)은 성장 배지의 그것보다 상당히 낮았다. 생산 배지의 조성은 탄소 및 질소원 성분을 제외하고 최적화된 성장 배지와 동일하게 하였다. 세포는 상기 2.1.2.1에서 얻은 결과인 브라제인 발현에 최적화된 pH 및 온도에 따라 pH 6.5 및 23 ℃에서 배양하였다.

SDS-PAGE를 사용하여 최적화된 생산 배지(optimized)와 최적화 되지 않은 화학적 규명 배지(none)에서의 브라제인 발현량을 비교 분석하였다. 분비된 브라제인의 발현량을 평가하기 위해 16.5% Tris-tricine 겔을 사용해 변성 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 분자량 마커로는 삼탄당인산 이소메라아제 (26.6 kDa), 미오글로민 (17.0 kDa), α-락트알부민 (14.4 kDa), 아프로티닌 (6.5 kDa), 및 산화된 인슐린 b 사슬 (3.4 kDa)을 함유하는 폴리펩티드 SDS-PAGE 표준 분자량 물질 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하였다. 단백질 염색을 위해 쿠마시 블루 (Coomassie Blue) R-250를 사용하였다. 프로그램 "myImage Analysis v1.1" (Thermo fisher Scientific, USA)을 사용하여 SDS-PAGE 비교 분석을 수행하였다.

2.1.2.2.3. 정제 과정 최적화

일반적으로 단백질 발현에는 복합 배지를 주로 사용한다. 그러나 복합 배지에는 풍부한 영양소가 포함되어 있어 목적 단백질 이외의 여러 단백질의 발현이 일어난다. 그러므로, 다양한 단백질의 발현으로 인해 정제 과정이 복잡해지며, 이로 인한 수율의 감소가 생긴다. 화학적 규명 배지는 세포가 단백질을 발현시키기 위한 최소한의 영양분만을 제공하기 때문에 복합 배지와 비교했을 때 목적 단백질 이외의 단백질이 발현되지 않는 특징이 있다. 복합 배지로 발현시킨 브라제인의 정제 과정은 카르복시메틸셀룰로오스 양이온 교환 수지를 이용하여 일차적으로 브라제인의 정제를 진행하며, 이차적으로 겔 여과 수지를 이용하여 높은 순도의 브라제인을 정제한다. 그러나 화학적 규명 배지로 발현시킨 브라제인은 순도 높은 상태로 발현이 되어 이러한 복잡한 정제 과정이 불필요하다.

상기 최적화한 성장배지(2.1.2.2.1)에서 30 ℃, 200 rpm, 20시간 동안 배양 후, 최적화 된 생산 배지(2.1.2.2.2)에서 23 ℃, 200 rpm, 72시간에서 96시간 사이로 배양하였다.

복합 배지에서 접종원은 YPD (리터당: 10 g 효모 추출물, 20 g 펩톤, 20 g 덱스트로오스)에서 30 ℃, 20시간 동안 배양하였고, OD600 = 1로 분주하였다. 브라제인 발현을 위한 실험은 YPD 배지에 유도제는 갈락토오스를 첨가하여 23 ℃, 200 rpm, 72시간에서 96시간 사이로 배양하였다.

최적화된 생산 배지(2.1.2.2.2.)에서 발현시킨 브라제인과 복합 배지(리터당: 10 g 효모 추출물, 20 g 펩톤, 20 g 덱스트로오스, 20 g 갈락토오스)에서 발현시킨 브라제인의 발현 순도를 SDS-PAGE를 통해 분석하였다. 분비된 브라제인의 발현량을 평가하기 위해 16.5% Tris-tricine 겔을 사용해 변성 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 분자량 마커로는 삼탄당인산 이소메라아제 (26.6 kDa), 미오글로민 (17.0 kDa), α-락트알부민 (14.4 kDa), 아프로티닌 (6.5 kDa), 및 산화된 인슐린 b 사슬 (3.4 kDa)을 함유하는 폴리펩티드 SDS-PAGE 표준 분자량 물질 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하였다. 단백질 염색을 위해 쿠마시 블루 (Coomassie Blue) R-250를 사용하였다. 프로그램 "myImage Analysis v1.1" (Thermo fisher Scientific, USA)을 사용하여 SDS-PAGE 비교 분석을 수행하였다.

2.2. 논의

2.2.1. 최적화된 pH, 온도 및 유도제 첨가 시기 조건

세포 성장(증식)은 도 1에 나타난 것과 같이 24시간 마다 기록하였다. 세포 성장은 pH 환경에 따라 약간 차이가 있으며, 결국 배양 후 96시간에 안정되었다. pH 5에서 세포 성장은 다른 pH 조건과 비교할 때 지연되는 것으로 보였으며, 이는 산성 환경의 낮은 pH 조건에서 물질대사가 낮아지기 때문으로 추정된다. 다른 한편, pH 6은 초기 세포 성장이 가장 빠른 것으로 보이므로 조사된 pH 조건 중에서 성장을 위한 최적의 pH인 것으로 보인다. 분명히, 다른 pH 조건 하에서 비슷한 성장 패턴에도 불구하고 브라제인의 분비 발현에는 상당히 차이가 있었다. 브라제인 발현을 위한 최적의 pH는 pH 6.5으로 확인되었으며, pH 5에서의 발현과 비교할 때 약 4.8-배 높은 발현량을 나타냈다 (도 2). 이러한 이종 단백질 발현을 위한 pH 환경의 중요성과 최적 세포 성장 및 이종 발현 조건이 반드시 일치하는 것은 아님을 암시한다.

브라제인의 분비 발현에 영향을 미치는 것으로 확인된 가장 큰 요소 중 하나는 배양 초기 pH이다. 각각의 조절되지 않은 배양 환경의 pH는 거의 동일하나 브라제인의 최종 수득률에 있어 상당한 차이를 보이기 때문에, 상당한 차이가 생기는 이유는 설명할 수 없었다. 다만, 초기 pH 환경은 이형 생산에서 중요한 요소라 추정되었다. 다른 한편, Moon et al. (1991)에 따르면, 배양 pH는 효소적 공정 및 Bacillus firmus 에서 세포막을 가로지르는 다양한 성분의 전달에 강력하게 영향을 미치는 것으로 보고되었다. 이는 다른 발현계에도 유사하게 적용되나, 자세히 연구되지 않았다. 세포 성장 및 재조합 단백질 생산의 최적의 pH는 다른 세포주 및 원하는 재조합 단백질에 따라 다를 수 있으며 각각에 따라 결정되어야 한다.

본 실험에서는 브라제인의 분비 발현을 위한 최적 온도를 찾기 위해 세 가지의 온도를 조사하였다. 온도 최적화는 pH 5.5 내지 6.5에서 수행되었다. 이러한 결론은 30 ℃에서 세포 성장이 크게 분포되었으며 결과적으로 브라제인의 분비 발현에 영향을 주는 낮은 온도에서 확인된 세포 밀도에 이르지 못한다는 것을 보여준다 (도 3 및 도 4). 23 ℃에서 세포 성장은 30 ℃에서의 배양과 비교할 때 지연되는 것으로 보였으며, 30 ℃는 세포 성장을 위한 최적의 온도로 여겨진다. 그러나, 세포 밀도는 배양 마지막에 점진적으로 평형에 이른다. pH 조건과 유사하게, 온도 조건은 세포 성장뿐 아니라 브라제인 발현에도 영향을 미쳤다. SDS-PAGE 분석에 의하면, 브라제인 발현은 23 ℃에서 배양 시 가장 높으며 각각 30 ℃및 37 ℃에서 약 0.92-배 및 0.075-배 감소하였다.

온도 저하가 발현에 긍정적인 영향을 미치는 이유에 대해서는 불분명하나, 향상된 세포 내 및 세포 외 안정성이 증가된 발현과 연관이 있다는 추측이 이루어졌다. 이러한 결과는 브라제인 수득률이 약 1.08-배 증가하였고, 이는 30 ℃에서 23 ℃로 감소될 때 온도가 미치는 영향을 명확히 보여주었다.

본 실험에서 접종원은 YPD (리터당: 10 g 효모 추출물, 20 g 펩톤, 20 g 덱스트로오스)에서 30 ℃, 20시간 동안 배양하였고, OD600 = 1로 분주하였다. 브라제인 발현을 위한 실험은 YPD 배지에 유도제로 갈락토오스를 첨가하여 23 ℃, 96시간 동안 배양하였다. 최적의 유도제 첨가 시기를 찾기 위해 유도제인 갈락토오스의 첨가 시간을 세 가지로 달리하여 조사하였다. 시기는 OD₆₀₀ 이 1, 10, 20일 때로 수행되었다. 본 실험에 대한 결론은 SDS-PAGE 분석에 의하면 OD₆₀₀ 이 1일 때 갈락토오스를 첨가해 주었을 때가 브라제인의 발현양이 가장 높은 것으로 확인되었으며 각각 OD₆₀₀ 이 10, 20일 때 약 0.86-배 및 0.78-배 감소하였다[도 13].

2.2.2. 최적화된 화학적 규명 배지

2.2.2.1. 최적화된 성장 배지

원소 조성의 비율 최적화 전에, 탄소 및 질소원 선호도를 검토하였다. 도 5는 실험대상 탄소원에 대한 성장 곡선 및 비성장률(μ)을 보여준다. 그 결과를 보면 다섯 가지 화합물 중 글루코오스가 바람직한 탄소원인 반면, 글리세롤이 사용된 경우 세포 성장이 눈에 띠게 지연되었다. 그러나, 글루코오스, 갈락토오스, 락토오스, 및 수크로오스의 활용은 주목할 만한 차이가 있으며, 이는 K. lactis 이 세포 성장을 위해 내재된 유전자와 함께 이러한 탄소원을 활용할 수 있기 때문이다. S. cerevisiae와 달리, K. lactis는 락토오스를 유일한 탄소원으로 활용할 수 있다. 각각 β-갈락토시다아제 및 락토오스 투과효소를 암호화하는 LAC4 및 LAC12 유전자는 K. lactis가 락토오스에서 자랄 수 있게 한다. 이러한 유전자는 번역 수준에서 제어되며 갈락토오스 대사 효소를 암호화하는 GAL 유전자를 공동 조절한다. 이러한 공동 조절은 번역 활성화 물질 KlGal4p (Lac9p), Gal4p의 동족체에 의해 매개되고, 락토오스 흡수 및 β-갈락토시다아제 활성에 의해 활성화된다. 세포 내 갈락토오스는 이러한 LAC/GAL 레귤론(regulon)의 유도물질로 알려져 있다.

LAC12 유전자에 의해 암호화된 락토오스 투과효소는 대사를 위해 세포로의 갈락토오스 및 락토오스의 적극적인 흡수를 매개한다. 락토오스는 락토오스 투과효소를 통해서만 세포로 들어갈 수 있으나, 갈락토오스 역시 촉진 확산에 의해 흡수될 수 있다. 갈락토오스의 높은 세포 내 농도는 빠르게 달성할 수 있고, LAC/GAL 레귤론의 유도물질 또는 에너지원으로 직접적으로 사용될 수 있기 때문에 크게 유리하다. 다른 한편, 락토오스 흡수 시간은 제한된 수의 락토오스 투과효소 때문에 초기에는 갈락토오스 흡수 시간보다 늦을 수 있지만, 결국 장기 배양에서 평형에 이르는 것으로 예상된다. 이러한 이유 때문에, 실험 대상인 발효당의 활용은 현저한 차이를 갖지 않을 수 있다. 글루코오스 배지에서의 비성장율은 약간 높으므로, 글루코오스는 성장을 위한 바람직한 탄소원으로 평가되었다.

K. lactis를 위한 탄소원 선호도 최적화 후, 질소원 선호도를 조사하였다. 비성장율(μ)는 질산암모늄 배지를 사용하였을 때 최대치를 나타내었다 (도 6). 이것은 염화암모늄 배지를 사용했을 때와 유사하지만 질산나트륨 배지를 사용한 경우와는 상당히 다르며, 이는 다른 질소원과 비교할 때 상당한 지연을 보였다. 따라서, 암모늄 이온은 일반적으로 나트륨 이온보다 질소원으로 활용되는 것으로 추정할 수 있다.

성장을 위한 바람직한 탄소 및 질소원을 사용하여, 최적의 원소 조성비를 조사하였다. 최대 비성장율(μ)를 나타내는 C/N 비율을 선택한 다음, N/P, P/S 비율을 최적화하였다. 최적 C/N, N/P, 및 P/S 비율은 각각 7, 0.5 및 400였다 (도 7-9). 이러한 결과에 의해, 최적의 성장 배지의 원소 조성비는 간편함을 위해 C: N: P: S = 7: 1: 2: 0.005로 결정되었다.

도 7은 최적의 C/N 비율이 7이며, 이때 실험 대상 세트 중에서 비성장율은 명백히 최고치였다. 흥미롭게도, 더 높은 질소 비율 (C/N 비율 < 7)을 포함하는 조건 하에, C/N 비율은 7이기 때문에 세포가 더 빨리 성장한 것을 아니었다. 이는 이들 세포에서 성장 포화 역시 탄소 및 질소원의 조성에 의해 영향 받을 수 있음을 의미할 수 있다.

도 8에 나타난 N/P의 결과에 따르면, 인은 이전 C/N 비율의 최적화에서 제한된 시약이었던 것으로 보인다. 추가적인 인이 상기 배지에서 사용되는 경우, 초기 성장속도뿐 아니라 최종 세포 밀도도 크게 증가하였다. 그러나, 세포 포화는 추가적인 인으로 인해 지속적으로 증가하지 않았다. 0.5 이하의 N/P 비율은 성장 속도나 최종 세포 밀도에 있어 어떠한 증가도 나타내지 않았다. 그러므로 N/P 비율이 0.5 인 경우 세포 성장을 위한 최적의 비율인 것으로 여겨졌다. 다른 한편, 황은 배양의 초기 단계에서 세포의 비성장율에 큰 영향을 주지 않았다. 세포를 감소된 황 배지에서 배양했을 때 최종 세포 밀도가 감소된 것을 확인하였다. 따라서, 24시간에 최종 세포 밀도의 감소가 나타나지 않았던 최소 P/S 비율인 400을 최적의 조건으로 선택하였다. 최대 성장 속도가 7인 상기 C/N 비율과 달리, 이들이 지수적 세포 성장을 유지하기 위한 최소량으로 선택되었기 때문에, 과량의 인 및 황은 세포 성장에 영향 없이 상기 배지에 사용될 수 있는 것으로 보였다. 오히려 인 또는 황 원(source)을 사용하기로 결정하였다면, 이는 미생물의 세포 성장 속도에 영향을 미치지 않을 것이다. 그러므로, 황산 암모늄 또는 인산 암모늄과 같은 다른 영양소원은 세포 성장에 영향을 미치지 않고 인 및 황 원소를 과량으로 공급하는데 사용될 수 있다.

2.2.2.2. 최적화된 생산 배지

상기 세포 성장 단계를 거친 후, 최적의 브라제인 발현을 위한 배양 배지를 조사하였다. 도 11은 브라제인을 유도하기 위해 사용된 다른 발효 가능한 탄소원의 발현량을 나타낸다. 갈락토오스, 락토오스, 및 글루코오스/갈락토오스 비율이 10까지인 생산 배지는 유사한 발현량을 나타내는 것으로 확인되었다. 그러나, 글루코오스 생산 배지에서는 브라제인 유도를 위해 갈락토오스가 반드시 직접 또는 간접적으로 (락토오스의 형태로) 제공되어야 하는 어떠한 브라제인 발현도 나타나지 않았다. 발현량이 유사하기 때문에, 비용 효율이 고려되어야만 한다. 갈락토오스만 사용하면 대량 발효에서 많은 비용이 들 수 있다; 그러므로, 락토오스 또는 글루코오스 및 갈락토오스의 비율이 10인 혼합물을 사용하는 것이 더 경제적일 수 있다.

글루코오스/갈락토오스 비율이 10인 유도를 위한 탄소원을 사용하며, 질소원은 질산암모늄을 이용하여 최적의 C/N 비율 (0.1 내지 8 범위)을 결정하였다. 그 결과, C/N 비율이 3인 경우 밀도계측에 의해 분석된 브라제인의 분비 발현이 가장 높은 것으로 확인하였다(도 12). 약 17 kDa인 미확인된 단백질의 과발현은 낮은 C/N 비율에서 확인되었으며, 브라제인 발현이 저하되는 것으로 확인되었다. 그러나, 브라제인 발현의 억제는 더 높은 C/N 비율에서 완화된다. 이러한 결과에 따라, C/N 비율은 목적 단백질의 최대 수득률을 달성하고 다른 원치 않는 단백질의 배지로의 분비를 조절하는데 필수 요소로 고려될 수 있다. 그러므로, 글루코오스/갈락토오스 비율이 10이고 C/N 비율이 3인 생산 배지를 브라제인 발현의 최적 조성으로 결정하였다. 본 섹션에서 얻어진 이러한 결과는 생산 과정에서 지속적인 급여를 위한 유가 배양에서 브라제인의 생산에 적용될 수 있다.

초기에, 배양 시간에 따른 브라제인 발현량을 얻었다. 그 결과 72시간 후 상기에서 최적화한 갈락토오스를 유도제로 하는 화학적으로 규명된 생산 배지를 사용하여 브라제인 발현이 증가되지 않는 것으로 보였다 (도 10).

도 15 에서 최적화된 생산 배지(optimized)에서 생산한 브라제인의 생산량 증가를 나타내었다. 비교 대상은 최적화 되기 전 화학적 규명 배지(none)이다.

2.2.2.3 최적화된 정제과정

최적화된 생산 배지와 복합 배지에서의 브라제인 발현 순도를 SDS-PAGE로 확인한 결과 최적화된 생산 배지의 경우 높은 순도로 브라제인이 발현되는 것을 확인하였다 (도 14). 이는 카르복시메틸 셀룰로오스 양이온 교환 수지 컬럼과 겔 여과 수지 컬럼 등의 복잡한 정제 과정을 생략할 수 있을 것으로 판단되어 복잡한 정제로 인한 브라제인의 수율 감소를 방지할 수 있다. 이는 브라제인의 생산을 산업적 규모의 대량 공정에 적용하였을 때 정제 과정의 최소화를 통한 비용 감소의 이점을 얻을 수 있다. 브라제인과 비슷한 크기를 갖는 다른 단백질이 발현되지 않기 때문에 실험의 사소한 차이로 발현되는 큰 단백질들은 높은 온도에서도 안정성을 가지는 브라제인의 특성을 이용하여 열처리만으로 제거 가능하기 때문에 간단히 높은 순도의 브라제인을 얻을 수 있다.

3. 결론

본 실험에서, 브라제인 대량 생산을 위한 최적의 배양 조건을 검토하였다. 화학적 규명 배지의 pH, 온도, 및 원소 조성을 발효의 성장 및 생산 단계를 위해 최적화하였다. 브라제인이 최적화된 조건을 사용하여 높은 순도로 분비됨을 확인하였다.

Claims

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브라제인 유전자를 포함하는 브라제인 발현용 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)를 숙주로 하고, 탄소원, 질소 원, 인 원 및 황 원이 6~8: 1 : 1.5~3 : 0.001~0.01의 중량비율로 포함되는 배지에서, pH 5.5 내지 pH 6.5, 온도 28 ℃ 내지 32 ℃로 15 시간 내지 25 시간 동안 배양하는 단계(제1 단계); 및
탄소 원과 질소 원이 2.5~3.5:1의 중량비율로 포함되는 배지에서 pH 6.0 내지 pH 7.0, 온도 21 ℃ 내지 25 ℃로 70 시간 내지 100 시간 동안 배양하는 단계(제2 단계)
를 포함하되,
상기 제1단계의 탄소원은 글루코오스이며,
상기 제2단계의 탄소원은 글루코오스와 갈락토오스가 5~15:1의 중량비율로 포함되는,
산업적 규모에 적합한 브라제인의 대량 생산방법.
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제 4 항에 있어서,
상기 제 2 단계에서 OD₆₀₀=1 일 때 유도제로 갈락토오스를 배지에 추가로 첨가하는 브라제인의 대량 생산방법.
제 4 항에 있어서,
상기 제1 단계에서 사용된 질소 원은 질산암모늄이고, 인 원은 인산칼륨 버퍼이며, 황 원은 황산나트륨인 브라제인의 대량 생산방법.
제 4 항에 있어서,
상기 제2 단계에서 사용된 질소 원은 질산암모늄인 브라제인의 대량 생산방법.