KR101983456B1 - Detecting method barley yellow mosaic virus from soil using nested pcr - Google Patents
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Abstract
본 발명은 네스티드 PCR을 이용한 토양 내 보리누른모자이크 바이러스(Barley yellow mosaic virus, BaYMV)의 검출방법에 관한 것으로, 보리 재배 주변 토양 시료에서 RNA를 분리하는 제1단계; 상기 제1단계에서 분리된 RNA를 주형으로 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하는 제2단계; 상기 제2단계에서 합성된 cDNA를 주형으로 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머 조합으로 1차 PCR을 수행하는 제3단계; 상기 1차 PCR 생성물을 주형으로 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머 조합으로 2차 PCR을 수행하는 제4단계; 상기 2차 PCR 생성물로부터 보리누른모자이크 바이러스(BaYMV) 유전자를 확인하는 제5단계로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 네스티드 PCR을 이용한 토양 내 보리누른모자이크 바이러스(BaYMV)의 검출방법은 종래의 방법에 비해 특이성과 감도가 매우 높은 효과적인 검출기술로서, 이 방법으로 미생물에 기생하는 미생물 또는 서식밀도가 극히 낮은 난검출성 병원균의 진단에 활용가능하며, 검역분야에서 토양전염성 미생물의 존재 여부를 정밀하게 진단할 수 있는 유용한 도구로 활용할 수 있는 장점이 있다.The present invention relates to a method for detecting Barley yellow mosaic virus (BaYMV) in soil using nestled PCR, which comprises a first step of isolating RNA from a soil sample surrounding barley cultivation; A second step of synthesizing cDNA using a reverse transcriptase using the RNA isolated in the first step as a template; A third step of performing first PCR using the cDNA synthesized in the second step as a template and primer combinations of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; A fourth step of performing a secondary PCR using the primer combination of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 using the first PCR product as a template; And a fifth step of identifying a barley-mosaic virus (BaYMV) gene from the secondary PCR product.
The method of detecting barley-borne mosaic virus (BaYMV) in soil using nested PCR of the present invention is an effective detection technique with a high specificity and sensitivity, compared with the conventional method. In this method, microorganisms parasitic to the microorganism or the culture density are extremely It can be used for the diagnosis of low egg detection pathogens and it can be used as a useful tool to accurately diagnose the presence of soil infectious microorganisms in quarantine field.
Description
본 발명은 네스티드 PCR을 이용한 토양 내 보리누른모자이크 바이러스의 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 토양에 서식하는 곰팡이 내에 존재하는 보리누른모자이크 바이러스(Barley yellow mosaic virus, BaYMV)를 효과적으로 검출하기 위해 서열번호 1과 2의 프라이머 조합 및 서열번호 3과 4의 프라이머 조합으로 네스티드 PCR(nested polymerase chain reaction)을 이용한 토양 내 보리누른모자이크 바이러스의 검출방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for detecting barley mosaic virus in soil using nestled PCR, and more particularly, to a method for detecting barley yellow mosaic virus (BaYMV) present in a fungus in soil A combination of primers of SEQ ID NOS: 1 and 2, and a primer combination of SEQ ID NOS: 3 and 4, and a method for detecting mosaic virus caused by barley in soil using nested polymerase chain reaction.
보리누른모자이크 바이러스병(Barley yellow mosaic virus, BaYMV)은 1940년 일본에서 최초로 보고되었고 유럽에서 큰 피해를 일으키는 것으로 알려졌으며(Park 등, 2004), 국내에서는 1990년대 발생이 보고되어 남부 보리 재배지를 중심으로 문제시 되었다(Park 등, 2010). 이 바이러스는 토양전염성 바이러스로 활물 기생균 폴리믹사 그라미니스(Polymyxa graminis)에 의해 매개되며(Adams 등, 1986), 감염 시 40 ~ 100%의 수량을 감소시키면서 보리에 심각한 피해를 입히게 된다(Park 등, 2010). Barley yellow mosaic virus (BaYMV) was reported for the first time in Japan in 1940 and has been reported to cause great damage in Europe (Park et al., 2004). In Korea, the occurrence of barley yellow mosaic virus (Park et al., 2010). This virus is a soil-infectious virus that is mediated by the active parasite Polymyxa graminis (Adams et al., 1986), causing a 40 to 100% loss in yield and severe damage to barley (Park et al. , 2010).
상기 BaYMV는 분절게놈으로 구성되어 있고 직경 13nm, 길이 7.3 ~ 7.6kb의 RNA1과 3.5 ~ 3.7kb의 RNA2로 나누어지는데(Li와 Shirako, 2015), RNA구조를 분석한 결과 국내에는 4종의 스트레인(strain)이 존재하는 것으로 보고되고 있다(Park 등, 2007). 이 BaYMV는 폴리믹사 그라미니스(P. graminis) 휴면포자에 존재하며, 휴면포자가 발아한 유주자에 의하여 전파되어 기주체의 세포질로 이동하고 전신감염을 일으켜 병징을 나타낸다(You와 Shirako, 2013).The BaYMV is composed of a segmented genome and is divided into RNA 1 of 13 nm in diameter and 7.3 to 7.6 kb in length and
이러한 BaYMV를 매개하는 폴리믹사 그라미니스(P. graminis)는 인공배양이 되지 않는 활물 기생균으로 토양 중에서 휴면포자 형태로 존재하기 때문에 검출이 어려워서 주로 현미경 검정에 의존하여 왔으나, 최근 PCR(polymerase chain reaction)에 의한 검출과 정량화가 가능해졌다(Cox 등, 2014). P. graminis 유주자를 통해 기주체 조직 내에 도입된 BaYMV와 토양에서 PCR을 이용하여 P. graminis를 검출한 보고는 있으나(Bae 등, 2015; Cox 등, 2014; Ketta 등, 2011), P. graminis 휴면포자에 존재하는 BaYMV를 토양에서 직접 검출한 사례는 아직까지 보고된 적이 없다.Since P. graminis , which is mediated by BaYMV, is an artificial cultivated organism that is not artificially cultivated and is present in the form of dormant spores in soil, it has been depended on microscopic examination because it is difficult to detect. However, PCR (polymerase chain reaction ) (Cox et al., 2014). P. graminis using the BaYMV and PCR in the soil is introduced into the subject tissue through a zoospore group reported the detection of the P. graminis, but (Bae et al., 2015; Cox et al., 2014; etc. Ketta, 2011), P. graminis dormant No cases of direct detection of BaYMV in the spores have been reported.
본 발명은 토양 중에서 BaYMV를 직접 검출한 최초의 보고로서, 토양 내에서 BaYMV의 정밀한 진단으로 보리 바이러스병 발생예찰에 필요한 자료와 바이러스 매개균에 존재하는 바이러스 진단에 유용한 방법을 제시하였다.The present invention is the first report to directly detect BaYMV in soil, and it provides precise diagnosis of BaYMV in soil, and provides data necessary for probing barley virus disease and useful methods for virus diagnosis in viruses.
한편, 최근 병원 미생물의 정확한 진단과 동정에 핵심적인 도구로 PCR이 보편화되고 있는데, 병원 미생물 중 바이러스는 크기가 미세하여 광학현미경으로는 확인할 수 없고 전자현미경으로 확인이 가능하며, 현재까지 치료약제가 개발되어 있지 않은 상태이므로 무엇보다 정확한 조기진단이 병의 방제관리 측면에서 핵심요소라고 할 수 있다. 이와 같은 바이러스의 감염여부와 정확한 동정을 위하여 이용되는 PCR은 핵산의 염기서열 특성을 이용한 기술로 특정 염기서열의 DNA단편을 신속하고 용이하게 증폭할 수 있는 PCR 진단방법이 다양하게 개발되어 광범위하게 이용되고 있다.In recent years, PCR has been widely used as a key tool in the accurate diagnosis and identification of microorganisms in hospitals. Viruses in hospital microorganisms are microscopic in size and can not be confirmed by optical microscopy, and can be confirmed by electron microscopy. Therefore, accurate early diagnosis is a key factor in the management of disease control. The PCR used for the identification and exact identification of such viruses is based on the nucleotide sequence of the nucleic acid, and a variety of PCR diagnosis methods capable of rapidly and easily amplifying a DNA fragment of a specific sequence have been developed and widely used .
본 발명의 검출대상 보리누른모자이크 바이러스는 맥류에 발생하는 토양전염성 바이러스 중의 대표적인 것으로 토양서식 곰팡이인 폴리믹사 그라미니스(Polymyxa graminis)의 유주자에 의해 전파되며, 국내 보리 재배지 전역에서 발생되는 것으로 현재 그 피해가 막심한 실정이다. 그러나 Protein A gold complex를 이용한 면역세포학적 조사에서 P. graminis가 BaYMV를 매개하는 것이 확인되었으나, 영속적인 감염을 일으키는 감염원인 토양에서 BaYMV를 검출한 사례는 현재까지 보고되지 않았다.The detected barley mosaic virus of the present invention is propagated by a host of polymyxa graminis , a soil-type fungus, which is a typical example of a soil infectious virus that occurs in barley, and is present throughout the domestic barley growing area. The damage is serious. However, in immunocytochemical studies using protein A gold complex, P. graminis Although BaYMV mediators have been identified, no case of BaYMV has been reported in infectious soil causing persistent infection.
이 P. graminis는 후막포자 형태로 월동을 하고 이 후막포자 내에 존재하는 BaYMV이 이듬해 봄에 보리에 피해를 입히므로 식물병 방제측면에서 토양의 BaYMV 검출이 중요하다. 바이러스 검출을 위한 단계는 토양 속에 서식하는 P. graminis 후막포자를 파괴시키고 그 속에 존재하는 BaYMV의 RNA를 안정적으로 추출하여 이를 주형으로 cDNA를 합성한 후 PCR을 실시하는 것이다.This P. graminis is wintering in the form of thick spores, and BaYMV in the thick spore damages the barley in the spring of the following year, so BaYMV detection of the soil is important in terms of plant disease control. The step for virus detection is to destroy the P. graminis thick membrane spores in the soil, to stably extract the BaYMV RNA present in the soil, to synthesize the cDNA with the template, and then to perform the PCR.
또한, 토양에는 RNA에 영향을 미치는 물질과 토양의 물리적 조성 등으로 RNA 추출을 방해하여 바이러스 RNA 농도가 극히 낮거나 각종 미생물 유래의 유전자 단편들과 DNA 중합효소 억제물질 등이 PCR을 방해하는 경우가 많아서 PCR 증폭효율이 극히 감소되어 일반적인 PCR 방법으로는 바이러스를 검출하는데 실패하는 수가 많다.In addition, there is a case where the RNA extraction is interrupted by the substances affecting the RNA and the physical composition of the soil, and the viral RNA concentration is extremely low or the gene fragments derived from various microorganisms and the DNA polymerase inhibitor interferes with the PCR The efficiency of PCR amplification is extremely reduced, so that the conventional PCR method fails to detect the virus.
이와 같은 문제점을 해결하기 위해 적용되는 방법이 2단계의 PCR을 실시하는 네스티드 PCR 방법이다. 네스티드 PCR은 핵산 혼성화 반응의 특이성을 높여 일반적인 PCR에서 검출할 수 없는 특정 유전자 단편을 증폭하거나 발현 량이 낮은 RNA를 cDNA로 합성하여 이를 대량 증폭하여 목표 유전자 단편을 정확하게 검출할 수 있는 이점이 있다. 이와 같은 특성으로 인해 네스티드 PCR은 해양생물을 숙주를 삼는 바이러스의 존재를 해저토양에서 검출하거나 식물병을 유발하는 곰팡이 등 미생물의 검출이나 의학분야의 동물 바이러스 검출에 많이 이용되고 있다.To solve this problem, a nested PCR method is used in which a two-step PCR is performed. Nested PCR increases the specificity of the nucleic acid hybridization reaction and amplifies a specific gene fragment that can not be detected by a general PCR, or synthesizes an RNA having a low expression level with cDNA and mass-amplifies it to accurately detect a target gene fragment. Due to these characteristics, nestide PCR is widely used for detection of microorganisms such as fungi or animal viruses in medical fields, which detect the presence of viruses that host marine organisms in undersea soil or cause plant diseases.
본 발명에서는 이와 같이 여러가지 물질들이 복합적으로 혼합되어 있는 토양시료에서 검출이 어려운 특정 바이러스의 유전자 단편을 효과적으로 검출할 수 있는 네스티드 PCR(nested polymerase chain reaction) 방법을 이용하여 종래의 PCR 방법으로 현재까지 검출이 불가능 했던 토양 내의 BaYMV 유전자 단편을 검출하는데 적용하여 본 발명을 완성하였다.In the present invention, by using a nested polymerase chain reaction method capable of effectively detecting a gene fragment of a specific virus that is difficult to detect in a soil sample in which various substances are mixed, And detecting the BaYMV gene fragment in the soil which could not be detected.
본 발명의 목적은 종래의 일반적인 PCR 방법으로 검출할 수 없었던 토양에 서식하는 곰팡이(Polymyxa graminis)의 휴면포자에 존재하는 보리누른모자이크 바이러스(Barley yellow mosaic virus, BaYMV)를 효과적으로 검출하기 위해 염기서열 1과 2의 프라이머 조합으로 1차 PCR을 실시하고 염기서열 3과 4의 프라이머 조합으로 2차 PCR을 실시하는 네스티드 PCR을 이용한 토양 내 보리누른모자이크 바이러스의 검출방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a method for efficiently detecting Barley yellow mosaic virus (BaYMV) present in dormant spores of the fungus ( Polymyxa graminis ) in soil that could not be detected by conventional PCR methods, The present invention also provides a method for detecting mosaic virus caused by barley in soil using nestled PCR, which comprises performing primary PCR using a combination of
본 발명에 의한 네스티드 PCR을 이용한 토양 내 보리누른모자이크 바이러스의 검출방법은, 보리 재배 주변 토양 시료에서 RNA를 분리하는 제1단계; 상기 제1단계에서 분리된 RNA를 주형으로 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하는 제2단계; 상기 제2단계에서 합성된 cDNA를 주형으로 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머 조합으로 1차 PCR을 수행하는 제3단계; 상기 1차 PCR 생성물을 주형으로 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머 조합으로 2차 PCR을 수행하는 제4단계; 상기 2차 PCR 생성물로부터 보리누른모자이크 바이러스(BaYMV) 유전자를 확인하는 제5단계로 이루어지는 것을 특징으로 한다.The method for detecting barley-mosaic virus in soil using nested PCR according to the present invention comprises: a first step of separating RNA from a soil sample surrounding barley cultivation; A second step of synthesizing cDNA using a reverse transcriptase using the RNA isolated in the first step as a template; A third step of performing first PCR using the cDNA synthesized in the second step as a template and primer combinations of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; A fourth step of performing a secondary PCR using the primer combination of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 using the first PCR product as a template; And a fifth step of identifying a barley-mosaic virus (BaYMV) gene from the secondary PCR product.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 제5단계는 PCR 생성물을 전기영동하여 예상 크기를 확인하고 염기서열을 결정하며, 또한 상기 토양 내 보리누른모자이크 바이러스의 검출방법에 사용되는 네스티드 PCR을 위한 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머 조합 및 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머 조합을 포함하는 프라이머 세트를 개시하고 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the fifth step is a method for identifying a predicted size and determining a nucleotide sequence by electrophoresis of a PCR product, and for nested PCR used in a method for detecting barley-pushed mosaic virus in the soil A combination of primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and a combination of primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
본 발명의 네스티드 PCR을 이용한 토양 내 보리누른모자이크 바이러스(BaYMV)의 검출방법은 종래의 방법에 비해 특이성과 감도가 매우 높은 효과적인 검출기술로서, 이 방법으로 미생물에 기생하는 미생물 또는 서식밀도가 극히 낮은 난검출성 병원균의 진단에 활용가능하며, 검역분야에서 토양전염성 미생물의 존재 여부를 정밀하게 진단할 수 있는 유용한 도구로 활용할 수 있는 장점이 있다.The method of detecting barley-borne mosaic virus (BaYMV) in soil using nested PCR of the present invention is an effective detection technique with a high specificity and sensitivity, compared with the conventional method. By this method, microorganisms parasitic to the microorganism or the culture density It can be used for the diagnosis of low egg detection pathogens and it can be used as a useful tool to accurately diagnose the presence of soil infectious microorganisms in quarantine field.
도 1은 네스티드 PCR용 프라이머 세트의 위치 및 1차 PCR 과정과 2차 PCR 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 네스티드 PCR을 실시한 결과를 나타낸 것이다. 그림 A는 1차 PCR 생성물을 전기영동한 결과를 나타낸 것이고, 그림 B는 2차 PCR 생성물을 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.
M열 : 100bp 분자마커
1열 ~ 5 열 : 보리 재배지 토양
6열 ~ 10열 : 벼 재배지 토양
P열 : 양성 대조구(BaYMV 이병 보리 뿌리)
N열 : 음성 대조구(멸균수)FIG. 1 shows the position of a primer set for nested PCR, a first PCR process and a second PCR process.
Figure 2 shows the result of nested PCR. Figure A shows the result of electrophoresis of the first PCR product, and Figure B shows the result of electrophoresis of the second PCR product.
M column: 100bp molecular marker
Columns 1 to 5: Barley field soil
P column: Positive control (BaYMV-infected barley root)
N column: negative control (sterilized water)
이하에서는 본 발명에 의한 네스티드 PCR을 이용한 토양 내 보리누른모자이크 바이러스의 검출방법에 대하여 설명하기로 하되, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 사람이 발명을 용이하게 실시할 수 있을 정도로 예시하기 위한 것이지, 이로 인해 본 발명의 기술적인 사상 및 범주가 한정되는 것을 의미하지는 않는다.Hereinafter, a method of detecting barley-mosaic virus in soil using nested PCR according to the present invention will be described. However, the present invention is not limited to this method, , And this does not mean that the technical idea and scope of the present invention are limited.
본 발명에 따르는 네스티드 PCR을 이용한 토양 내 보리누른모자이크 바이러스의 검출방법은, 보리 재배 주변 토양 시료에서 RNA를 분리하는 제1단계; 상기 제1단계에서 분리된 RNA를 주형으로 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하는 제2단계; 상기 제2단계에서 합성된 cDNA를 주형으로 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머 조합으로 1차 PCR을 수행하는 제3단계; 상기 1차 PCR 생성물을 주형으로 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머 조합으로 2차 PCR을 수행하는 제4단계; 상기 2차 PCR 생성물로부터 보리누른모자이크 바이러스(BaYMV) 유전자를 확인하는 제5단계로 이루어진다.The method for detecting barley mosaic virus in soil using nested PCR according to the present invention comprises: a first step of isolating RNA from a soil sample surrounding barley cultivation; A second step of synthesizing cDNA using a reverse transcriptase using the RNA isolated in the first step as a template; A third step of performing first PCR using the cDNA synthesized in the second step as a template and primer combinations of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; A fourth step of performing a secondary PCR using the primer combination of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 using the first PCR product as a template; And a fifth step of identifying the barley-mosaic virus (BaYMV) gene from the secondary PCR product.
다시 말해, 본 발명은 서열번호 1과 서열번호 2로 표시되는 프라이머 조합 및 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 프라이머 조합을 포함하는 BaYMV의 토양 내 검출이 가능한 진단용 프라이머 세트, 및 이를 이용한 토양서식 곰팡이 내의 BaYMV의 검출방법을 제공하는 것이다.In other words, the present invention provides a diagnostic primer set capable of detecting in soil BaYMV comprising a combination of primers represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and a combination of primers represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, And to provide a method for detecting BaYMV in fungi.
본 발명의 주된 특징은 2차의 PCR을 실시하는데, 이를 위해 토양으로부터 BaYMV의 RNA를 추출하는 제1단계와 RNA를 주형으로 cDNA를 합성하는 역전사 과정을 거쳐 단일가닥 cDNA를 합성하여 이를 주형으로 사용하는 제2단계를 거쳐 서열번호 1과 서열번호 2의 염기서열을 나타내는 프라이머로 1차 PCR을 실시하는 제3단계를 거친다. 다음으로 상기 1차 PCR로부터 생성되는 PCR 생성물을 주형으로 하여 증폭영역 내에 위치하는 프라이머 쌍, 즉 서열번호 3과 서열번호 4의 염기서열을 나타내는 프라이머를 사용하여 2차 PCR을 실시하는 제4단계, 및 상기 2차 PCR로부터 생성되는 PCR 생성물의 염기서열 결정과정을 거쳐 대상 바이러스인 보리누른모자이크 바이러스(BaYMV) 유전자임을 확인하는 제5단계로 이루어진다.The main feature of the present invention is that the second PCR is carried out. For this purpose, a first step of extracting BaYMV RNA from soil, a reverse transcription step of synthesizing cDNA with a template of RNA, a single strand cDNA is synthesized and used as a template A first step of performing a first PCR with a primer showing a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, Next, a fourth step of performing a secondary PCR using a primer pair located in the amplification region, that is, a primer showing a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, using the PCR product generated from the first PCR as a template, And a fifth step of confirming that the gene is a barley-pressed mosaic virus (BaYMV) gene, which is a target virus, through a nucleotide sequence determination process of a PCR product generated from the secondary PCR.
상기 1차 PCR에 사용되는 프라이머 쌍인 염기서열번호 1, 2는 기존에 알려진 BaYMV의 염기서열 정보를 근거로 제작하였으며, 이를 사용하여 BaYMV에 감염된 별도의 보리잎 시료를 대상으로 PCR을 실시하고 예상 크기의 PCR 생성물의 염기서열 분석을 통하여 BaYMV의 유전자 단편 정보를 확보한 후 증폭영역 안에 위치하는 염기서열번호 3과 4를 네스티드 PCR용 프라이머로 사용하였다.
그리고 2차 PCR에서는 1차 PCR로 증폭된 BaYMV의 단편 내부 영역에 위치하는 염기서열 정보를 프라이머로 설계하여 대상 바이러스 유전자와 프라이머의 혼성화 특이성을 강화시켜 대상 바이러스를 효율적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하여 이를 토양시료에 적용하여 현재까지 토양에서 확인되지 않았던 BaYMV 검출에 성공함으로써 본 발명을 완성하였다.In the second PCR, the method of designing the base sequence information located in the internal region of the fragment of BaYMV amplified by the first PCR as a primer to enhance the hybridization specificity of the target viral gene and the primer to efficiently detect the target virus And the present invention is applied to a soil sample, and BaYMV, which has not been confirmed in the soil up to now, has been successfully detected to complete the present invention.
이하에서는 네스티드 PCR을 이용한 토양 내 보리누른모자이크 바이러스의 검출방법에 대하여 본 발명에 의한 사용되는 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머 조합 및 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머 조합을 포함하는 프라이머 세트를 살펴보기로 하되, 당업자가 용이하게 이해하고 실시할 수 있을 정도의 바람직한 실시예를 통하여 본 발명을 설명한다.Hereinafter, a method for detecting mosaic virus in barley in soil using nested PCR is described. A primer combination of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and a combination of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 The present invention will be described with reference to preferred embodiments which are easily understood and practiced by those skilled in the art.
[실시예 1] 프라이머 설계 및 합성 [Example 1] Primer design and synthesis
1차 PCR용 프라이머(서열번호 1번 및 2번)는 NCBI 데이터베이스 Genbank에 등록된 다수의 BaYMV의 coat protein 염기서열 등록정보로부터 공통적인 영역 중 PCR에 적합한 부위를 선택하였고, 2차 PCR에 사용한 프라이머(서열번호 3번 및 4번)는 1차 PCR 생성물의 염기서열 결정을 한 후 염기서열 전장 내부에 존재하는 영역 중 프라이머 조건에 최적화된 부위를 선택하여 아래 [표 1]과 같은 프라이머를 설계하였으며, 바이오니아사(한국)에서 합성되었다([도 1] 참조).Primers for primary PCR (SEQ ID NOs: 1 and 2) were selected from the common region of the coat protein base sequence registration information of a large number of BaYMV registered in the NCBI database Genbank, and primers suitable for PCR were selected. (SEQ ID NOS: 3 and 4), the primer as shown in Table 1 below was designed by selecting the site optimized for the primer condition among the regions existing within the nucleotide sequence after the nucleotide sequence of the first PCR product was determined , And Bioneer (Korea) (see Fig. 1).
[실시예 2] 시료준비 [Example 2] Sample preparation
토양시료는 보리누른모자이크 바이러스(BaYMV)병이 상습적으로 발생하는 보리 재배지의 BaYMV 이병주와 화분에 심은 BaYMV 이병주 잎에서 total RNA를 추출하고 염기서열 1번과 2번 프라이머로 PCR을 실시하여 예상되는 단편의 크기(575 base pair)를 확인한 이병주의 근권 토양 100 ~ 200mg을 채취하여 Easy spin total RNA extraction kit(INtRON, 한국)를 이용하여 total RNA를 추출하였다.The total amount of total RNA extracted from BaYMV, BaYMV, and potted BaYMV leaves of Lee, BaiMV and Barley mosaic virus (BaYMV) (INRRON, Korea), which extracted 100 ~ 200 mg of the cultivated soil from Byeongju Lee, which was confirmed to have a size of 575 base pairs.
[실시예 3] cDNA 합성 [Example 3] cDNA synthesis
실시예 2에서 분리한 total RNA 1㎕를 역전사 효소와 randomized 6N oligomer가 혼합된 TOP script RT Drymix kit(dN6 plus)(Enzynomics, 한국)를 이용하여 50℃에서 1시간 동안 반응시키고 95℃에서 5분간 처리하여 역전사 효소를 불활화시켜 단일 가닥 cDNA합성을 하였다.1 μl of the total RNA isolated in Example 2 was reacted at 50 ° C. for 1 hour with a TOP script RT Drymix kit (dN6 plus) (Enzynomics, Korea) mixed with a reverse transcriptase and a randomized 6N oligomer and incubated at 95 ° C. for 5 minutes And the reverse transcriptase was inactivated to synthesize single strand cDNA.
[실시예 4] 네스티드 PCR에 의한 BaYMV 유전자 검출 [Example 4] BaYMV gene detection by nested PCR
1차 PCR 반응조건은 합성된 cDNA 1㎕, 프라이머 각각 1㎕(10pmol)와 PCR premix(Biofact, 한국)와 멸균수를 혼합, 최종적으로 30㎕로 하여 94℃, 4분간 1회 변성과정을 거친 후 94℃에서 30초, 57℃에서 30초, 72℃에서 1분 조건을 35회 반복시키고 72℃에서 5분간 처리하고 다음 단계까지 4℃에서 유지하는 PCR을 실시하였다. 2차 PCR은 1차 PCR 생성물 1㎕와 PCR premix(Biofact, 한국)와 서열번호 3번 및 4번 프라이머를 혼합하여 94℃, 4분간 1회 변성과정을 거친 후 94℃에서 30초, 57℃에서 30초, 72℃에서 1분 조건을 35회 반복시킨 다음, 72℃에서 5분간 처리하였다([도 1] 참조). 상기 단계를 거쳐 생성된 PCR 생성물을 1% 아가로스 젤(agarose gel)에 전기영동한 후 예상된 크기(372bp)의 유전자 단편이 증폭된 것을 확인하였으며, 추가적으로 염기서열을 분석하고 Genbank에 등록된 BaYMV의 염기서열 정보와 비교를 통하여 검출된 유전자 단편이 보리누른모자이크 바이러스 coat protein 유전자임을 확증하였다.The first PCR reaction conditions were as follows: 1 μl of the synthesized cDNA, 1 μl (10 pmol) of each primer, PCR premix (Biofact, Korea) and sterilized water were mixed and finally 30 μl was subjected to denaturation at 94 ° C for 4 minutes PCR was carried out at 94 ° C for 30 seconds, at 57 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C for 1 minute, followed by 35 cycles of treatment at 72 ° C for 5 minutes and keeping at 4 ° C until the next step. For the second PCR, 1 μl of the first PCR product and PCR primix (Biofact, Korea) were mixed with the primers of SEQ ID NOS: 3 and 4, followed by denaturation at 94 ° C for 4 minutes, followed by 94 ° C for 30 seconds, For 30 seconds and 72 ° C for 1 minute was repeated 35 times and then treated at 72 ° C for 5 minutes (see FIG. 1). The PCR product generated by the above steps was electrophoresed on 1% agarose gel, and the amplified gene fragment of the expected size (372 bp) was amplified. Further, the base sequence was analyzed and BaYMV And that the gene fragment detected was a barley pressed mosaic virus coat protein gene.
<110> Gyeongsanbuk-do Agricultural Research & Extension Services <120> DETECTING METHOD BARLEY YELLOW MOSAIC VIRUS FROM SOIL USING NESTED PCR <130> PJ01004203 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tgcagatggt aactggagcg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gaagttaaca tggtgttata 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgcactcgaa tctgagctaa a 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 catgatcgtg ggacgaagaa a 21 <110> Gyeongsanbuk-do Agricultural Research & Extension Services <120> DETECTING METHOD BARLEY YELLOW MOSAIC VIRUS FROM SOIL USING NESTED PCR <130> PJ01004203 <160> 4 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tgcagatggt aactggagcg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gaagttaaca tggtgttata 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgcactcgaa tctgagctaa a 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 catgatcgtg ggacgaagaa a 21
Claims (3)
상기 제1단계에서 분리된 RNA를 주형으로 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하는 제2단계;
상기 제2단계에서 합성된 cDNA를 주형으로 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머 조합으로 1차 PCR을 수행하는 제3단계;
상기 1차 PCR 생성물을 주형으로 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머 조합으로 2차 PCR을 수행하는 제4단계;
상기 2차 PCR 생성물을 전기영동하여 예상 크기를 확인하고 염기서열을 결정함에 의해 보리누른모자이크 바이러스(BaYMV) 유전자를 확인하는 제5단계;
로 이루어지는 것을 특징으로 하는 네스티드 PCR을 이용한 토양 내 보리누른모자이크 바이러스의 검출방법.A first step of isolating RNA from soil samples surrounding barley cultivation;
A second step of synthesizing cDNA using a reverse transcriptase using the RNA isolated in the first step as a template;
A third step of performing first PCR using the cDNA synthesized in the second step as a template and primer combinations of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2;
A fourth step of performing a secondary PCR using the primer combination of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 using the first PCR product as a template;
A fifth step of detecting the mosaic virus (BaYMV) gene by measuring the expected size of the secondary PCR product by electrophoresis and determining the nucleotide sequence;
And detecting the mosaic virus in the soil using the nested PCR.
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