KR101945134B1 - 각막 내피 세포 마커 - Google Patents

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Abstract

각막 내피 세포에 특이적으로 발현하는 분자 마커, 그리고 그것을 이용한 각막 내피 세포의 제조 방법, 각막 내피 세포의 평가 방법 등을 제공하는 것. ZP4, MRGPRX3, GRIP1, GLP1R, HTR1D, 및 CLRN1 로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 분자의 각막 내피 세포 특이적 마커로서의 이용.

Description

각막 내피 세포 마커 {CORNEAL ENDOTHELIAL CELL MARKER}
본 발명은 각막 내피 세포에 특이적으로 발현하는 분자 마커, 이를 이용한 각막 내피 세포의 제조 방법, 및 각막 내피 세포의 평가 방법 등에 관한 것이다.
각막은, 안구의 표면에 위치하는 투명한 조직으로, 표면으로부터 순서대로 각막 상피층, 보먼막, 각막 실질층, 데스메막, 및 각막 내피층이 존재한다. 각막 상피층은, 각막의 가장 바깥측에 있는 층으로, 외부로부터의 먼지나 세균 등으로부터 각막을 보호하는 배리어(barrier)로서 기능한다. 보먼막은, 각막 상피층의 베이스로서 기능하는 것으로 생각된다. 각막 실질층은, 세 개의 층 중에서 가장 두껍고, 각막의 강도를 유지하는 역할을 담당한다. 데스메막은, 각막 실질층의 아래에 있는 얇은 막으로, 각막 실질층과 각막 내피층을 연결하는 기능을 한다. 각막 내피층은, 육각형의 형상을 갖는 각막 내피 세포가 포석상(敷石狀)으로 규칙적으로 배열된 단층의 세포층이고, 배리어 기능 및 펌프 기능으로 인해, 전방(前房)의 수분이 각막 실질에 침투하는 것을 방지함과 동시에 각막의 수분을 전방측으로 배출함으로써 함수율을 일정하게 유지하여, 각막의 투명성을 유지하는 중요한 역할을 담당한다.
유전적 요인이나 외적 요인 등에 의해 각막 내피 세포가 손상되어, 각막 내피 세포수가 현저히 저하되면 상기의 기능이 저해되어, 각막 부종을 초래한다. 중증의 각막 내피 장해에 의해 각막의 투명성을 유지할 수 없게 되어, 수포성 각막증이 발병하면 현저한 시력 저하를 초래한다.
각막 내피 세포는 인간의 생체 내에서는 증식능이 극히 떨어진다. 따라서, 중증의 각막 내피 장해에 대한 근본적 치료로는, 현시점에서는 각막 이식이 가장 유효한 수단이다. 실제로 수포성 각막증은 각막 이식의 적응 질환의 제 1위이다. 종래, 각막 내피 장해에 관해서는, 전층 각막 이식술이 실시되어 왔지만, 만성적인 공여자 부족과 이식 후의 거절 반응이 문제가 되고 있다. 거절 반응을 경감시키기 위해서, 각막 내피를 포함하는 일부 조직만을 질환안(疾患眼)에 이식하는 방법 (Descemet's Stripping Automated Endothelial Keratoplasty ; DSAEK) 이 개발되었지만, DSAEK 역시 공여자 부족의 문제를 극복할 수는 없다. 또한, 각막 내피 세포를 시험관 내에서 증식시켜, 이를 치료에 이용하는 방법도 시도되었으나 (비특허문헌, 특허문헌 1 내지 3), 계대를 반복하면 형질 전환을 일으켜, 기능을 소실해 버린다 (비특허문헌 2).
상기의 문제를 해결하기 위해, 제대혈 유래 간엽계 줄기세포 (비특허문헌 3), 골수 유래 세포 (비특허문헌 4), 홍채 유래 줄기세포 (비특허문헌 5), 각막 실질 유래 줄기세포 (비특허문헌 6), 배아 줄기세포 (비특허문헌 7), 및 유도 다능성 줄기세포 (특허문헌 4) 등으로부터 이식용의 각막 내피 세포를 유도하는 많은 연구가 이루어지고 있다. 그러나, 어떠한 기원의 세포를 사용하더라도, 배양해서 얻은 세포에는, 각막 내피 세포 이외에도 상이한 종류의 세포가 포함된다. 따라서, 이러한 연구에 있어서는 목적 산물인 각막 내피 세포의 단리 및 평가를 목적으로 한, 각막 내피 세포 특이적 마커가 필요 불가결하다.
현재, ZO-1 (비특허문헌 8), Na+-K+-ATPase (비특허문헌 9), 및 N-카드헤린 (비특허문헌 10) 등의 단백질이 각막 내피 세포 마커로서 사용되고 있지만, 이들 단백질은 다른 많은 세포에서 비특이적으로 발현하고 있다 (비특허문헌 11 내지 13). 따라서, 이들 단백질을 이용한 각막 내피 세포의 단리는, 특히, 각막 내피 세포로의 분화 유도에 사용되는 줄기세포가 여러 가지 세포로의 다분화능을 갖는 것을 고려하면, 충족된 결과를 기대할 수 없다.
WO 2006/092894 A1 WO 2011/096593 A1 WO 2013/012087 A1 WO 2013/051722 A1
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상기와 같은 배경하에서, 본 발명은, 각막 내피 세포에 특이적으로 발현하는 분자 마커, 이를 이용한 각막 내피 세포의 제조 방법, 및 각막 내피 세포의 평가 방법 등의 응용 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 연구를 거듭하여, 각막 내피 세포에서 발현하는 유전자를 망라하여 커버하는 데이터베이스로부터, 각막 내피 세포에서의 발현 수준이 높고, 세포막 단백질을 코딩하면서, 다른 조직에서의 발현 수준이 낮은 것을 선발하였다. 그리고, 본 발명자들은, 이들 유전자의 각막 내피 세포 및 다른 조직에서의 발현을 확인하고, 각막 내피 세포에 있어서 특이적으로 발현하고 있는 유전자를 알아내었다. 또한, 본 발명자들은, 이러한 유전자가 코딩하는 단백질을 표적으로 인간 각막 절편을 면역 염색하여, 각막 내피에 특이적으로 발현하는 것을 확인하였다. 이러한 연구결과에 따라, 하기에 대표되는 발명이 제공된다.
항 1.
각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단으로부터, ZP4, MRGPRX3, GRIP1, GLP1R, HTR1D, 및 CLRN1 으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상을 발현하고 있는 세포를 분취(sorting)하는 공정을 포함하는, 각막 내피 세포의 제조 방법.
항 2.
제 1 항에 있어서, 각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단이 줄기세포를 분화 유도하여 얻어지는, 방법.
항 3.
제 1 항에 있어서, 각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단이 각막 내피 세포를 배양하여 얻어지는, 방법.
항 4.
제 1항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 분취하는 공정이, ZP4, MRGPRX3, GRIP1, GLP1R, HTR1D, 및 CLRN1 로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 특이적으로 인식하는 항체를 각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단에 결합시키는 것을 포함하는, 방법.
항 5.
ZP4, MRGPRX3, GRIP1, GLP1R, HTR1D, 및 CLRN1 로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 발현을 지표로 하여 각막 내피 세포를 평가하는 방법.
항 6.
ZP4, MRGPRX3, GRIP1, GLP1R, HTR1D, 및 CLRN1 로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상으로 구성된 각막 내피 세포 검출용 마커.
항 7.
ZP4, MRGPRX3, GRIP1, GLP1R, HTR1D, 및 CLRN1 로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 특이적으로 인식하는 물질을 포함하는, 각막 내피 세포 검출용 키트.
각막 내피 세포에 특이적으로 발현하는 분자 마커의 제공으로 인해, 각막 내피 세포를 특이적으로 검출할 수 있다. 또한, 상기 분자 마커의 발현 산물은 세포 표면 단백질이기 때문에, 세포가 살아있는 상태에서 식별 및/또는 분취(sorting) 할 수 있다. 따라서, 각막 내피 세포를 살아있는 상태에서 효율적으로 제공할 수 있다. 이와 같이 하여 수득한 각막 내피 세포는 이식에 적합하기 때문에, 각막 내피 세포의 이식을 필요로 하는 질환의 치료가 가능할 뿐만 아니라, 각막 이식에 있어서의 공여자 부족의 해소에 도움이 된다. 또한, 상기 분자 마커를 이용함으로써, 배양한 각막 내피 세포가 이식에 적합한 상태인지 제대로 평가할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 각막 내피 세포의 기능 장해에 기인하는 여러 가지 질환의 치료에 유용하다.
도 1 은, 13개의 후보 분자를 코딩하는 유전자의 각막 내피 세포 및 다른 22개 조직에서의 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸다. 각 도면에 있어서, CECs는 각막 내피 세포, A-brain은 성인의 뇌, F-brain은 태아의 뇌, SC는 척수, SG는 침샘, BM은 골수, SM은 골격근, A-liver는 성인의 간장, F-liver은 태아의 간장, SI는 소장을 의미한다. 세로축은, 컨트롤과 비교한 상대 발현량을 나타낸다.
도 2 는, 후보 분자를 코딩하는 유전자의 눈 조직에서의 발현 수준을 정량 PCR로 측정한 결과를 나타낸다. 각 도에 있어서, CECs는 각막 내피 세포, CC는 배양 각막 내피 세포, C. stroma는 각막 실질, C. epi.는 각막 상피, Limbus는 각막윤부(角膜輪部), Iris pig. epi는 홍채 색소 상피 세포, TM은 섬유주대(纖維柱帶), CB는 모양체(毛樣體), RPE/choroid 는 망막 색소 상피/맥락막(脈絡膜), ON은 시신경을 의미한다. 세로축은, 컨트롤과 비교한 상대 발현량을 나타낸다.
도 3 은, 6개의 단백질 (GRIP1, CLRN1, MRGPRX3, ZP4, GLP1R, 및 HTR1D) 에 대해 인간 각막 절편을 면역 염색한 결과를 나타낸다.
도 4 는, 인간 iPS 세포를 각막 내피 세포에 유도한 전후의 ZP4 유전자의 발현 수준을 나타낸다.
1. 각막 내피 세포의 제조 방법
1-1. 각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단
각막 내피 세포를 제조하는 출발 재료가 되는 「각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단」 이란, 각막 내피 세포를 포함하는 세포의 집합체이며, 각막 내피 세포를 포함하는 한, 이의 유래 및 구성은 제한되지 않는다. 예를 들어, 각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단에는, 줄기세포를 인위적으로 분화시켜 수득한 세포 집단, 및 각막으로부터 단리된 각막 내피 세포를 배양하여 수득한 세포 집단이 포함된다. 각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단은, 많은 경우, 각막 내피 세포 이외의 세포를 포함하지만, 각막 내피 세포만으로 구성될 수 있다. 각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단의 유래는, 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 인간이다.
예를 들어, 각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단에 포함되는 각막 내피 세포의 수는, 전체의 1 ％ 이상, 5 ％ 이상, 10 ％ 이상, 20 ％ 이상, 30 ％ 이상, 40 ％ 이상, 50 ％ 이상, 60 ％ 이상, 70 ％ 이상, 또는 80 ％ 이상이다.
각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단을 조제하기 위해서 사용되는 줄기세포는, 시험관 내에서 배양할 수 있으며, 또한 각막 내피 세포로 분화 가능한 세포라면 특별히 제한되지 않고, 공지된 줄기세포 및 향후 개발되는 줄기세포로부터 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 이와 같은 줄기세포로는, 예를 들어, 인공 다능성 줄기세포 (induced pluripotent stem cells ; iPS 세포), 배아 줄기세포 (ES 세포), 태아의 시원 생식 세포(始原生殖細胞) 유래의 다능성 줄기세포 (EG 세포), 정소 유래의 다능성 줄기세포 (GS 세포), 및 각막 내피 세포로 분화 가능한 인체 줄기세포 (조직 줄기세포) 등을 들 수 있다.
iPS 세포는, 임의의 수법으로 얻을 수 있으며, 예를 들어, 특정한 초기화 인자를 DNA 또는 단백질의 형태로 체세포에 도입함으로써 제조할 수 있다. 초기화 인자로는, 예를 들어, Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, 및 Glis1 등을 들 수 있다. 초기화 인자는, 단독으로 사용해도 되고, 임의로 조합하여 사용할 수 있다. 초기화 인자의 조합은, 예를 들어, WO2007/069666, WO2008/118820, WO2009/007852, WO2009/032194, WO2009/058413, 및 WO2009/057831 등에 예시되어 있다. 체세포의 종류는, 특별히 제한되지 않고, 지금까지 iPS 세포의 제조가 확인되고 있는 임의의 세포 및 향후 보고되는 임의의 세포를 포함한다. 일 실시형태에 있어서 바람직한 체세포로는, 예를 들어, 섬유아 세포, 및 백혈구 등을 들 수 있다. 바람직한 체세포의 유래는 인간이다.
ES 세포는, 임의의 수법에 의해 취득할 수 있으며, 예를 들어, 포유류 (바람직하게는, 인간) 의 수정란의 배반포로부터 내부 세포 덩어리를 추출하고, 내부 세포 덩어리를 섬유아 세포의 피더(feeder)상에서 배양하여 수립할 수 있다. 포유 동물은 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 인간이다. 계대 배양에 의한 ES 세포의 유지는, 백혈병 억제 인자 (leukemia inhibitory factor (LIF)), 및/또는 염기성 섬유아 세포 성장 인자 (basic fibroblast growth factor (bFGF)) 등의 물질을 첨가한 배양액을 사용하여 실시할 수 있다. ES 세포의 선택은, 예를 들어, OCT-3/4, NANOG, ECAD 등의 유전자 마커의 발현을 지표로 하여 실시할 수 있다.
EG 세포는, 태생기의 시원 생식 세포로부터 수립되는, ES 세포와 동일한 다능성을 갖는 세포이며, LIF, bFGF, 및 줄기세포 인자 (stem cell factor) 등의 물질의 존재하에서 시원 생식 세포를 배양함으로써 수립할 수 있다 (Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70 : 841-847 ; J. L. Resnick et al. (1992), Nature, 359 : 550-551).
GS 세포는, 정소 유래의 다능성 줄기세포이며, 정자 형성을 위한 기원이 되는 세포이다. 이 세포는, ES 세포와 동일하게, 여러 가지 계열의 세포로 분화 유도가 가능하다. 신경교 세포계 유래 신경 영양 인자 (glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))를 포함하는 배양액으로 자기 복제가 가능하고, ES 세포와 동일한 배양 조건하에서 계대를 반복함으로써, 정자 줄기세포를 얻을 수 있다 (M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69 : 612-616).
각막 내피 세포로 분화할 수 있는 체성 줄기세포로는, 예를 들어, 각막 실질에서 유래하는 신경제(神經堤) 줄기세포 (COPs), 간엽계 줄기세포 (mesenchymal stem cells), 및 피부 유래 다능성 전구 세포 (skin-derived precursors : SKPs) 등을 들 수 있다. 바람직하게는 COPs 및 SKPs 이다. COPs는, 예를 들어, 각막으로부터 상피 및 내피를 제거한 후, 각막 실질을 콜라게나제로 처리하고, EGF, FGF2, B27 서플리먼트, 및 LIF를 첨가한 DMEM/F12 배지에서 분리한 세포를 배양함으로써 조제할 수 있다. SKPs는, 예를 들어 Nat Cell Biol., 2001 vol.3, 778-784 에 기재된 방법에 따라 조제할 수 있다.
일 실시형태에 있어서 바람직한 줄기세포는, iPS 세포이다. 다른 실시형태에 있어서 바람직한 줄기세포는, 신경제 줄기세포이며, 보다 바람직하게는 iPS 세포 유래의 신경제 줄기세포 및 각막 실질 유래의 신경제 줄기세포이다. 신경제 줄기세포란, 자기 복제능과 다분화능을 갖는 다능성의 줄기세포이며, 척추 동물의 발생 과정에서는, 신경관의 배측으로부터 체내로 이동하여 여러 가지 조직의 형성에 기여하는 것이 알려져 있다. iPS 세포로부터의 신경제 줄기세포의 유도는 당분야에서 알려져 있는 수법에 따라, 혹은 그에 준한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어 Nature Protocols, 2010 vol.5, No.4, 688-701에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다. 신경제 줄기세포를 사용함으로써 효율적으로 각막 내피 세포로의 분화 유도가 가능하다.
상기 서술하는 줄기세포를 각막 내피 세포로 분화 유도시키는 방법은, 특별히 제한되지 않고, 공지된 수법 및 향후 개발되는 수법을 사용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 특허문헌 4에 개시된 방법에 따라 분화 유도시킬 수 있다. 구체적으로는, 줄기세포를 줄기세포의 배양에 적합한 배지 (예를 들어, MEM 배지) 에 GSK3 저해제, 레티노산, TGFb2, 인슐린 및 ROCK 저해제로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 분화 유도 인자를 첨가한 배지에서, 30 내지 40 ℃, 1 내지 10 ％ CO2 의 조건하, 수 일 내지 1 개월 반 정도 배양함으로써 각막 내피 세포로 분화시킬 수 있다. 분화 유도 인자는, 바람직하게는 GSK3 저해제 및 레티노산을 포함하고, 보다 바람직하게는 GSK3 저해제, 레티노산, 및 ROCK 저해제를 포함하고, 더욱 바람직하게는, GSK3 저해제, 레티노산, ROCK 저해제, 및 인슐린을 포함한다.
이와 같이 하여 줄기세포로부터 각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단을 수득할 수 있다. 수득한 각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단은, 바로 각막 내피 세포의 분취에 제공할 수 있으며, 일정 기간 계대 배양을 반복한 후에 각막 내피 세포의 분취에 제공할 수 있다.
각막으로부터 단리된 각막 내피 세포를 배양하여 각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단을 얻는 수단은, 특별히 제한되지 않고, 공지된 방법 및 향후 개발되는 방법을 적절히 선택하여 실시할 수 있다. 예를 들어, WO2014/104366에 개시된 방법에 따라 실시할 수 있다. 구체적으로는, 데스메막은, 인간 각막 내피 세포를 데스메막에 부착시킨 인간 각막 강막 조직으로부터 제거하고, 세절(細切)하고, 콜라게나제를 약 0.2％ 함유하는 배지 중에서 5％ CO2, 37℃ 의 조건으로 1 내지 3시간 배양한다. 배지에는 15％ 소태아 혈청 (FCS) 및 2 ng/㎖의 염기성 섬유아 세포 증식 인자(bFGF)를 함유하는 DME 배지를 사용할 수 있다. 그 후, 원심 세정에 의해 섬유아 세포 등을 제거하고, 트립신 소화를 실시함으로써 펠릿상의 각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단(초대 배양 세포)을 얻을 수 있다.
상기와 같이 하여 수득한 각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단은, 추가로 동물 세포의 배양에 일반적으로 사용되는 D-MEM, MEM 등의 기초 배지 중에서 배양할 수 있다. 배지에 함유된 글루코스 농도는, 바람직하게는 2.0 g/ℓ 이하이고, 보다 바람직하게는 0.1 내지 1.0 g/ℓ이다. 배지에는, 성장 인자로서, 줄기세포 증식 인자(HGF), 상피 성장 인자(EGF), 재조합 EGF(rEGF), 및/또는 섬유아 세포 증식 인자(FGF) 등을 첨가하는 것이 바람직하다. 이들 인자는 1 종만을 단독으로 사용할 수 있으며, 복수를 적절히 조합하여 배지에 첨가할 수 있다. 배지 중의 성장 인자의 농도는, 통상 1 내지 100 ng/㎖, 바람직하게는 2 내지 5 ng/㎖이다. 효율적으로 각막 내피 세포를 배양하는 관점에서, 배지에는, 아스코르빈산2-인산 등의 아스코르빈산 유도체를 5 내지 1,000 ㎍/㎖ 배합하는 것이 바람직하다.
각막 내피 세포의 배양은, 마트리겔, 콜라겐 등의 매트릭스로 코팅한 배양 용기 (예를 들어, 디쉬, 페트리디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로 웰 플레이트, 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백 등)를 사용하여 부착 배양에 의해 실시할 수 있다. 배양 온도는, 통상 35 내지 38℃이고, 바람직하게는 37℃이다. 습윤 조건은, 통상 90 내지 100% 습윤, 바람직하게는 100％ 습윤이다. CO2 농도는, 통상 5 내지 15％, 바람직하게는 10％이다. 따라서, 이와 같은 조건을 유지할 수 있는 인큐베이터 내에서 배양하는 것이 바람직하다. 배양 기간은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 세포가 밀집(콘플루언트)이 되는 단계(정상 상태)까지 (예를 들어, 1 내지 5일) 실시할 수 있다.
세포가 콘플루언트에 이른 시점에서 필요에 따라 추가로 계대 배양할 수 있다. 예를 들어, 콘플루언트 상태의 세포를 PBS로 세정 후, 트립신/EDTA 로 분산시키고, 원심하여, 상기와 동일한 배지를 포함하는 배양 용기에, 500 내지 60,000 세포/㎠ 의 세포 밀도가 되도록 파종하여, 상기의 배양 조건에서 배양할 수 있다. 또한, 세포가 콘플루언트에 이른 시점에서 동일한 계대 조작을 반복할 수 있다. 이와 같이 하여 계대 배양 세포인 각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단을 얻을 수 있다.
1-2. 분자 마커를 지표로 한 각막 내피 세포의 분취
각막 내피 세포에는, ZP4, MRGPRX3, GRIP1, GLP1R, HTR1D, CLRN1, SCNN1D, PKD1, CNTN6, NSF, CNTN3, PPIP5K1 및 PCDHB7이 특이적으로 발현한다. 따라서, 이들 분자에서 선택되는 적어도 1 종의 발현을 지표로 하여 각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 각막 내피 세포를 분취해서 각막 내피 세포를 제조할 수 있다. 또한, 본 명세서에서는, ZP4, MRGPRX3, GRIP1, GLP1R, HTR1D, CLRN1, SCNN1D, PKD1, CNTN6, NSF, CNTN3, PPIP5K1 및 PCDHB7을 분자 마커라고도 칭한다.
ZP4는, 난모 세포를 둘러싸는 세포외 매트릭스인 투명대를 구성하는 당단백질의 하나를 코딩하는 유전자이다 (Hartmann JF, et al., (1972), Proc Natl Acad Sci USA, 69 : 2767-2769). 이의 대부분은 세포 외에 존재하지만, 카르복실 말단은 세포막 관통 도메인이다 (Gupta SK, et al. (2012), Cell Tissue Res, 349 : 665-678).
MRGPRX3은, Mas 관련 G 단백질 공액 수용체의 하나를 코딩하는 유전자이며, 감각 신경에 있어서 통각의 제어에 관여하는 것이 시사되어 있다 (Lembo PM, et al. (2002), Nat Neurosci 5 : 201-209).
GRIP1은, AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate)형 글루타민산 수용체의 세포 내 도메인 카르복실 말단에 결합하는 단백질을 코딩하는 유전자이며, 시냅스 또는 뇌에 발현하는 것이 보고되어 있다 (Dong H, et al., (1999), J Neurosci, 19 : 6930-6941).
GLP1R은, 췌장의 β 세포로부터의 인슐린 분비를 촉진시키는 인크레틴의 하나인, 글루카곤형 펩티드-1(Glucagon-like peptide-1)의 수용체를 코딩하는 유전자이다 (Orskov C, (1992), Diabetologia, 35 : 701-711). 따라서, GLP1R은 췌장에서 발현하는 것이 보고되었다 (Tornehave D, et al., (2008), J Histochem Cytochem, 56 : 841-851).
HTR1D는, 세로토닌 수용체의 하나를 코딩하는 유전자이며, 두개골 안면 조직의 신경 섬유에 발현하며, 편두통의 발증에 관여하는 것이 시사되고 있다 (Harriott AM, et al., (2008), Cephalalgia, 28 : 933-944).
CLRN1은, 내이(內耳) 장해 및 망막 색소 변성증을 초래하는 Usher 증후군 typeIIIa의 원인 유전자의 하나로서 보고되어 있다 (Kremer H, et al., (2006), Hum Mol Genet 15 Spec No 2 : p.262-270). CLRN1은 내이의 유모 세포 및 망막의 신경교 세포에 발현하며, 내이 유모 세포의 발생·분화에 중요한 역할을 담당하는 것으로 생각되고 있지만 (Geller SF, et al., (2009), PLoS Genet 5 : e1000607), 상세한 기능은 밝혀지지 않았다.
SCNN1D는, 상피형 Na 채널(ENaC)의 δ 서브 유닛을 코딩하는 유전자이다. 뇌 또는 심장, 호흡기, 신장 등에서 발현하는 것이 보고되어 있다 (Ji HL et al., (2012), Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303 : 1013-1026).
PKD1은, 폴리시스틴-1을 코딩하는 유전자이며, 상염색체 우성 다발성 낭포신의 원인 유전자의 하나로서 보고되어 있다 (Gabow PA, (1993) N Engl J Med. 329 : 332-342). 따라서 신장에서 고발현된다. 폴리시스틴-1은 요세관 상피 세포의 분화에 관여하는 것이 시사되고 있다 (Boletta A et al., (2003) Trends Cell Biol.13 : 484-492).
CNTN6은, 콘택틴 6 을 코딩하는 유전자이다. 콘택틴 6 은 면역 글로블린 슈퍼 패밀리의 하나로 세포 접착에 관여하고 있으며, 신경계의 발생 단계에 있어서 시냅스 결합의 형성에 관여하는 것이 시사되고 있다 (http : //www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/27255).
NSF는, N-에틸말레이미드 감수성 인자를 코딩하는 유전자이며, 이 단백질은 SNAP(soluble NSF attachment protein) 및 SNARE(SNAP receptor)와 복합체를 형성하여, 시냅스 소포와 세포막의 융합을 촉진시킨다 (Sollner T et al., (1993) Nature. 362 : 318-324).
CNTN3은, 콘택틴 3을 코딩하는 유전자이지만, 그 구조로부터 콘택틴 6과 동일하게 세포 접착에 관여하는 것이 시사된다. 전두엽, 후두엽, 소뇌 등에서의 발현이 보고되어 있다 (http : //www.uniprot.org/uniprot/Q9P232).
PPIP5K1은, 이노시톨키나제를 코딩하는 유전자이며, 세포 내 시그널 전달에 중요한 역할을 하는 것이 시사되어 있다 (Gokhale NA et al., (2013) Biochem J. 453 : 413-426).
PCDHB7은, 프로토카드헤린 β7을 코딩하는 유전자이다. 특이적 기능은 명확하지 않지만, 신경계에 있어서 세포간 접착에 중요한 역할을 하는 것이 시사되어 있다 (http : //www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/56129).
각막 내피 세포의 지표로서 이용하는 분자 마커는, ZP4, MRGPRX3, GRIP1, GLP1R, HTR1D, CLRN1, SCNN1D, PKD1, CNTN6, NSF, CNTN3, PPIP5K1 및 PCDHB7로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 일 수 있지만, 2 종 이상을 임의로 조합하여 사용할 수 있다. 일 실시형태에 있어서 바람직한 분자 마커는, 발현 산물이 각막 내피 세포의 표면 단백질이고, 또한 각막 내피 세포에서의 발현의 특이성이 높다는 관점에서, ZP4, MRGPRX3, GRIP1, GLP1R, HTR1D, 및 CLRN1이며, 보다 바람직하게는 ZP4, MRGPRX3, GRIP1, GLP1R 및 HTR1D이고, 더욱 바람직하게는 ZP4, MRGPRX3, GRIP1, 및 GLP1R이며, 보다 더욱 바람직하게는 ZP4, MRGPRX3, 및 GRIP1이고, 한층 바람직하게는 ZP4 및 MRGPRX3이며, 특히 바람직하게는 ZP4이다.
SCNN1D, PKD1, CNTN6, NSF, CNTN3, PPIP5K1 및 PCDHB7은, 도 1에 나타내는 바와 같이, 뇌, 척수, 골격근, 또는 간장 등의 다른 조직에서도 발현하고 있는 것으로 생각되지만, 각막 내피 세포를 포함하는 세포군이 유래하는 줄기세포의 종류, 및/또는 각막 내피 세포로 분화시키는 조건 등을 제어하는 것, 혹은 각막 내피 세포를 포함하는 세포군으로서 각막 내피 세포를 배양하여 수득한 세포군을 채용하는 것 등으로 인해, 이들의 조직에서의 발현은 무시할 수 있다. 따라서, 이들 분자 마커도 각막 내피 세포를 분취 또는 검출하기 위해서 유용하다. 이들 분자 마커 중에서도 바람직하게는 SCNN1D, PKD1, CNTN6, NSF, CNTN3, 및 PPIP5K1이고, 보다 바람직하게는 SCNN1D, PKD1, CNTN6, NSF, 및 CNTN3이며, 더욱 바람직하게는 SCNN1D, PKD1, CNTN6, 및 NSF이고, 보다 더욱 바람직하게는 SCNN1D, PKD1, 및 CNTN6이며, 한층 바람직하게는 SCNN1D, 및 PKD1이고, 특히 바람직하게는 SCNN1D이다.
ZP4, MRGPRX3, GRIP1, GLP1R, HTR1D, CLRN1, SCNN1D, PKD1, CNTN6, NSF, CNTN3, PPIP5K1 및 PCDHB7로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 분자 마커의 발현을 지표로 한, 각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단으로부터의 각막 내피 세포의 분취는, 예를 들어, 세포 집단 중에 각막 내피 세포 이외에 당해 적어도 1종의 분자 마커를 발현하는 세포가 포함되어 있지 않은 경우, 당해 적어도 1종의 분자 마커를 발현하고 있는 세포를 분취함으로써 실시할 수 있다. 또한, 세포 집단 중에 각막 내피 세포 이외에도 당해 적어도 1종의 분자 마커를 발현하는 다른 세포가 존재하는 경우, 당해 다른 세포와 비교하여 유의하게 높은 발현을 나타내는 세포를 분취함으로써, 각막 내피 세포를 얻을 수 있다. 지표로 하는 분자 마커는, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 또는 5종 이상을 적절히 조합하여 사용할 수 있다.
분자 마커 발현의 검출은, 임의의 수단을 사용하여 실시할 수 있다. 대표적인 검출 방법으로는, 예를 들어, 상기 1종 이상의 분자 마커를 코딩하는 유전자의 발현을 RT-PCR을 사용하여 측정하는 방법, 및 상기 1종 이상의 분자 마커의 존재를 이에 특이적으로 결합하는 물질을 사용하여 검출하는 방법 등을 들 수 있다. 상기 분자 마커는 모두 각막 내피 세포의 표면 단백질이다. 따라서, 세포가 살아있는 채로 분자 마커의 검출이 가능하다는 관점에서, 분자 마커에 특이적으로 결합하는 물질을 사용하여 검출하는 방법이 바람직하다.
분자 마커에 특이적으로 결합하는 물질의 종류는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 항체, 및 앱타머 등을 들 수 있다. 바람직한 당해 물질은, 항체 혹은 그 단편이다. 항체는, 폴리클로날 및 모노클로날 항체 중 어느 것일 수 있다. 항체의 단편으로는, 예를 들어, Fab 단편, F(ab)2 단편, ScFv 단편 등을 들 수 있다. 2종 이상의 분자 마커의 발현을 이용하여 각막 내피 세포를 검출하는 경우에는, 각각에 특이적으로 결합하는 물질을 조합하여 사용할 수 있다. 일 실시형태에 있어서 분자 마커에 특이적으로 결합하는 물질은, 각막 내피 세포를 포함하는 세포군을 개개의 세포로 뿔뿔이 흩어지게 하기 위한 처리 (예를 들어, 프로테아제에 의한 처리)에 의해 분해되지 않는 성질을 갖는 것이 바람직하다.
분자 마커를 특이적으로 인식하는 항체는, 시판의 것을 사용할 수 있으며, 주지된 기술을 사용하여 제조한 것일 수 있다. 항체의 제조는 주지된 바이며, 예를 들어, 폴리클로날 항체의 경우, 정제한 각 분자 마커 또는 그 부분 펩티드로 비인간 동물을 면역하고, 그 동물의 혈청으로부터 통상적인 방법에 따라 얻을 수 있다. 모노클로날 항체의 경우에는, 면역된 동물로부터 얻은 비장 세포와 골수종 세포를 세포 융합시켜 조제한 하이브리도마로부터 얻을 수 있다.
분자 마커에 특이적으로 결합하는 물질이 결합한 세포의 검출을 용이하게 하기 위해, 당해 물질은, 임의의 표지 물질에 의해 표지되어 있는 것이 바람직하다. 표지 물질로는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 형광 표지, 방사성 표지, 화학 발광 표지, 효소, 비오틴 또는 스트렙토아비딘 등을 들 수 있다. 분자 마커에 특이적으로 결합하는 물질은 간접적으로 표지된 것일 수 있다. 예를 들어, 당해 물질(예를 들어, 항체)에 특이적으로 결합하는 미리 표지한 항체(2 차 항체)를 사용할 수 있다.
분자 마커에 특이적으로 결합하는 물질이 결합한 세포를 식별하고 분취하는 방법은 특별히 제한되지 않고, 공지된 방법 및 향후 개발되는 방법에서 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 세포의 식별/분취 방법은, 사용하는 표지 물질의 종류에 따라 선택할 수 있다. 대표적인 세포의 식별/분취 방법에는, 형광 표지 세포 분취법 (Fluorescence-Activated Cell Sorting : FACS), 자기 세포 분취법 (Magnetic-Activated Cell Sorting : MACS), 및 어피니티 크로마토그래피법 등이 포함된다. 동시에 복수의 분자 마커의 검출이 가능하다는 관점에서, 바람직하게는 형광 표지 세포 분리법 및 자기 세포 분리법이며, 보다 바람직하게는 세포 분취기가 부착된 플로우 사이토미터를 사용한 FACS 이다. FACS의 양식은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 액적(液滴) 하전 방식 및 셀 캡처 방식 중 어느 것일 수 있다. 이와 같이 하여 각막 내피 세포를 순화시킬 수 있다.
상기와 같이, 분자 마커를 지표로 하여, 각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 각막 내피 세포를 분취함으로써, 각막 내피 세포를 얻을 수 있다. 또한, 각막 내피 세포에는, 각막 내피 전구 세포도 포함된다. 상기 방법에 따르면, 각막 내피 세포가 농축된 세포 집단을 얻는 것도 가능하다. 각막 내피 세포가 농축된 세포 집단에 포함되는 각막 내피 세포의 비율은, 세포수 환산으로, 예를 들어, 50％ 이상, 55％ 이상, 60％ 이상, 65％ 이상, 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 또는 99％ 이상이다.
1-3. 각막 내피 세포의 이용
상기 분자 마커를 지표로 하여 수득한 각막 내피 세포는, 각막 내피층의 기능 장해에 기인하는 질환의 치료에 사용할 수 있다. 따라서, 당해 각막 내피 세포를 포함하는, 각막 내피 질환의 치료용 의약 조성물을 제공할 수 있다. 이와 같은 의약 조성물에는, 각막 내피 세포의 유지, 증식, 환부에 대한 투여를 보조하기 위한 각종 성분, 족장(足場) 재료, 및 담체 등을 추가로 포함할 수 있다.
세포의 유지 및/또는 증식을 보조하는 성분으로는, 예를 들어, 탄소원, 질소원, 비타민, 미네랄, 염류, 및 각종 사이토카인 등의 배지 성분을 들 수 있다. 환부에 대한 투여를 보조하는 족장 재료로는, 예를 들어, 콜라겐, 폴리락트산, 히알루론산, 셀룰로오스, 및 이들의 유도체를 들 수 있다. 이들 성분 및 족장 재료는, 2종 이상을 조합할 수도 있다. 의약 조성물은, 주사용수 용액 (예를 들어, 생리 식염수, PBS 등의 생리 완충액, 포도당이나 그 밖의 보조제를 포함하는 등장액) 중에 각막 내피 세포를 포함하는 형태일 수 있다.
상기 분자 마커를 지표로 하여 얻을 수 있는 각막 내피 세포를, 적당한 담체 (예를 들어, 고분자막)상에서 배양함으로써 각막 내피 세포 시트를 제공할 수 있다. 그러한 담체는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 콜라겐, 아테로콜라겐, 알칼리 처리 콜라겐, 젤라틴, 케라틴, 히알루론산, 글리코사미노글리칸 (콘드로이틴황산, 데르마탄황산, 히알루론산, 헤파란황산, 헤파린, 케라탄황산), 프로테오글리칸, 알긴산, 키토산, 폴리아미노산 (폴리락트산), 셀룰로오스 등의 바이오 폴리머, (메타)아크릴아미드 화합물, N- (혹은 N,N-디)알킬 치환 (메타)아크릴아미드 유도체, 비닐에테르 유도체, 또는 이들의 공중합체 등의 온도 응답성 폴리머 등을 들 수 있다. 시트상 외에, 각막 내피 세포는, 필터 여과 등에 의해 농축된 펠릿 (세포 덩어리)의 상태로 사용할 수도 있다.
각막 내피 세포는, 필요에 따라, 보호제 등을 첨가하여, 동결 보존할 수 있다. 보호제로는, 예를 들어, 글리세롤, DMSO(디메틸술폭사이드), 프로필렌글리콜, 아세트아미드 등을 들 수 있다. 또한, 이식편으로서의 안전성을 유지하기 위해서, 각막 내피 세포를 가열 처리 및/또는 방사선 처리 등을 실시 할 수 있다.
각막 내피 세포, 이를 포함하는 의약 조성물, 및 각막 내피 세포 시트를 사용한 치료의 대상이 될 수 있는 질환으로는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 수포성 각막증을 포함하는 각막 내피 기능 부전, 각막 디스트로피, 발달 녹내장, 리이거(Rieger) 기형, 선천성 유전성 각막 내피 디스트로피, 윤부 유피낭종, 강막화(强膜化) 각막, 원추 각막 또는 펠루시드 각막 변성 등의 각막 형상 이상, 각막 반흔, 각막 침윤, 각막 침착, 각막 부종, 각막 궤양, 화학 물질 또는 열에 의한 안외상, 각막염, 각막 변성, 각막 감염증 등의 안질환이나 신경아세포종, 히르쉬스프룽(Hirschsprung) 병, 와덴버그(Waadenburg) 증후군, 국한성 백피증 레클링하우젠(Recklingmhausen) 병을 들 수 있다.
각막 내피 세포의 이식을 필요로 하는 환자 (예를 들어, 상기 질환을 앓는 환자) 에게, 각막 내피 세포 또는 각막 내피 세포 시트를 이식함으로써, 상기 질환을 치료할 수 있다. 따라서, 상기 서술한 방법에 의해 얻어진 각막 내피 세포를, 각막 내피 세포의 이식을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환의 치료 방법이 제공된다.
2. 각막 내피 세포의 평가 방법
상기 서술하는 ZP4, MRGPRX3, GRIP1, GLP1R, HTR1D, CLRN1, SCNN1D, PKD1, CNTN6, NSF, CNTN3, PPIP5K1 및 PCDHB7로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상은, 각막 내피 세포에 특이적으로 발현한다. 따라서, 당해 분자 마커의 발현을 지표로 한 각막 내피 세포의 평가 방법이 제공된다. 예를 들어, 각막 내피 세포라고 생각되는 (또는 추측되는) 피검세포에 대해, 당해 분자 마커의 발현을 측정하여, 특이적인 발현이 확인되었을 경우 (또는, 유의한 발현이 확인되었을 경우)에, 피검세포는 각막 내피 세포인 것으로 평가할 수 있다. 이와 같은 평가 방법에서의 사용에 바람직한 분자 마커는, 상기 1-2에서 기재한 분자 마커와 동일하다.
피검세포로는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 상기 1-1.에 기재한 세포를 각막 내피 세포로의 분화 유도에 적합한 배지 및 조건에서 배양하여 얻어진 세포, 및 각막으로부터 채취한 각막 내피 세포를 배양하여 얻어진 세포를 들 수 있다. 분자 마커의 발현을 측정하는 방법은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 상기 1-2.에 기재한 RT-PCR을 사용한 측정 방법, 및 분자 마커에 특이적으로 결합하는 물질을 사용하여 측정하는 방법 등을 들 수 있다. 이와 같이 하여 피검세포를 평가함으로써, 이를 각막 내피 세포로서 안전하게 이용할 수 있다.
3. 각막 내피 세포 검출용 키트
ZP4, MRGPRX3, GRIP1, GLP1R, HTR1D, CLRN1, SCNN1D, PKD1, CNTN6, NSF, CNTN3, PPIP5K1 및 PCDHB7로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 분자 마커를 특이적으로 인식하는 물질을 포함하는 각막 내피 세포 검출용 키트가 제공된다. 분자 마커를 특이적으로 인식하는 물질이란, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 상기 1-2.에 기재된 항체, 및 앱타머 등을 들 수 있다. 키트에는, 분자 마커를 특이적으로 인식하는 물질 이외에, 각막 내피 세포의 검출에 이용되는 임의의 물질, 용기, 및 설명서 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트에는, 상기 서술하는 분자 마커를 특이적으로 인식하는 물질을 표지하는 표지 물질을 포함할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명에 대해 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 제한되는 것은 아니다.
1. 후보 분자의 동정
Chen et al.에 의해 보고된 RNA-seq 데이터 (GSE41616, Chen, et al., (2013), Hum Mol Genet 22 : 1271-1279)는 유전자 발현 정보 데이터베이스 (Gene Expression Omnibus：GEO)로부터 입수하여, 인간 생체 내의 각막 내피 세포에서 발현되는 유전자의 정보로 사용되었다. 이 데이터에는, 3 개체의 성인 공여자 (31세, 56세, 64세) 유래의 각막 내피 세포, 및 2 개체의 태아 공여자 (16∼18주) 유래의 각막 내피 세포에서 발현하는 RNA의 데이터가 포함되어 있다. 데이터의 신뢰성을 확인하기 위해, 각막 상피 세포 특이적 마커인 KRT3 및 KRT12에 대해 당해 데이터를 조사한 결과, 56세의 성인 공여자 유래의 데이터에서 이들의 발현 수준이 높은 것이 확인되었다. 따라서, 이들 개체 유래의 시료에는, 각막 상피 세포가 혼재되어 있던 것으로 생각되었기 때문에, 나머지 4 개체에서 유래하는 데이터만을 사용하여 이하의 해석을 실시하였다.
RNA-seq 리드를, TopHat(버젼 1.4.1)을 사용하여 인간 레퍼런스 게놈 (hg19) 으로 얼라인먼트하고, 그 결과를 사용하여, Cufflinks 패키지 (버젼 2.1.1) 에 의해 전사 산물 모델을 구축하였다 (Trapnell, et al., (2012), Nat. Protoc.7 : 562-578). Cufflinks를 사용하여, 유전자 발현량을 FPKM(Fragments Per Kilobase of exon per Million mapped fragments : FPKM)으로 하여 정량화하고, 각막 내피 세포에서 10 FPKM 이상 발현하고 있는 유전자를 선택하였다. 그 결과, 10,627의 유전자가 선택되었다. 다음으로, 이들 유전자를, 하기의 표 1에서 나타내는 GO 용어(term)를 사용하여, 세포막 단백질을 코딩하는 유전자까지 좁혀갔다. 그 결과, 표 1에 나타내는 바와 같이, 1494개의 유전자까지 좁힐 수 있었다. 이 중, 1075개의 유전자는 성인 및 태아 모두의 각막 내피 세포에서 발현하고, 225개의 유전자는 성인의 각막 내피 세포에서만 발현하고, 194개의 유전자는 태아의 각막 내피 세포에서만 발현한다.
Figure 112017027967407-pct00001
마지막으로, FANTOM5 (Functional Annotation of the Ma㎜alian Genome 5) 의 데이터베이스를 사용하여, 5개 이상의 조직 또는 세포종에서 10 TPM (tags per million) 이상 발현하고 있는 유전자를 배제하였다. 이 결과, 후보 분자를 코딩하는 유전자는, 하기의 표 2 에 나타내는 13의 유전자까지 좁혀졌다.
Figure 112017027967407-pct00002
2. 후보 분자의 눈 조직 및 전신 조직에 있어서의 RNA 발현량
상기 1에서 좁힌 13개의 유전자의 각막 내피 세포 및 전신 조직에서의 발현량을 확인하기 위해, 성인 인간 각막 내피 세포 및 22개의 조직에 있어서의 각 유전자의 RNA 발현량을 정량 PCR에 의해 계측하였다. 구체적인 순서는 후술한다. 그 결과, 도 1에 나타내는 바와 같이, 모든 유전자가 데이터 해석 결과에 준거하여, 각막 내피 세포에서 발현하고 있는 것이 확인되었다. 그 중에서도 ZP4, MRGPRX3, GRIP1, GLP1R, HTR1D, CLRN1은, 각막 내피 세포에서의 발현량이 다른 조직에서의 발현량과 비교하여 가장 높아, 다른 한정된 조직에서밖에 발현하지 않음이 확인되었다.
다음으로, 이들 6개의 유전자에 대해, 눈 조직 간의 발현량을 정량 PCR에 의해 계측하였다. 눈 조직에는, 2 개체의 성인 공여자로부터 얻은 4개의 안구를 사용하였다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 모든 유전자에 대해 각막 내피 세포에서의 고발현이 확인되었다. 각막 실질은 각막 내피층에 인접해 있고, 각막 내피 세포와 동일하게 두부 신경제에서 유래하기 때문에, 각막 실질에서 발현하고 있지 않은 것 또는 발현량이 낮은 것은, 각막 내피 세포의 마커로서 중요한 특징의 하나라고 생각된다. CLRN1은, 각막 실질에서 약간의 발현을 하였지만, 다른 5개의 유전자의 발현은 관찰되지 않았다. 따라서, 이들 모든 분자는, 각막 내피 세포에 특이적 마커로서 유용하다.
각막 내피 세포로부터의 RNA 추출은 다음의 순서로 실시하였다. 또한, 인간 샘플은 모두 헬싱키 선언을 준수하여 취급하였다. 인간 공여자 유래의 연구용 강각막편 및 전체 안구는 Sight Life (워싱턴주 시애틀) 로부터 입수하였다. 강각막편은 Optisol-GS (Bausch & Lomb, 뉴욕주 로체스터) 에 침지시켜 4℃에서 보존하고, 사후 4일 이내에 사용하였다. 공여자의 연령은 58세였다. 강각막편을 인산 완충 생리 식염수(PBS)로 3회 세정한 후, 섭자(攝子)를 사용하여 각막 내피 및 데스메막을 슈발베선을 따라 박리하였다. 박리한 각막 내피로부터 Qiagen miRNeasy Mini Kit (QIAGEN Inc.)를 사용하여 RNA를 추출하였다.
배양 각막 내피 세포로부터의 RNA추출은 다음의 순서로 실시하였다. 4 개체의 공여자 유래의 4 개의 안구로부터 강각막편을 취득하였다. 공여자의 연령은 14세 내지 25세였다. 각막 내피 및 데스메막은 상기 서술한 바와 같이 단리하였다. 단리 조직을, 1.2 U/㎖ dispase II (합동 주정 주식회사) 및 1％ Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti ; Invitrogen/Gibco)을 첨가한 둘베코 변법 이글 배지 (DMEM ; Invitrogen)에서 37℃에서 1시간 배양하고, 각막 내피 세포를 데스메막으로부터 단리하였다. 단리한 각막 내피 세포를 천천히 원심분리하여 회수하고, 50 U/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 10％ 소태아 혈청 (ICN Biomedicals, Inc., 오하이오주 오로라) 및 2 ng/㎖ 염기성 섬유아 세포 성장 인자 (bFGF ; invitrogen)를 첨가한 DMEM 배지로 현탁시킨 후, 세포 부착 시약 (FNC 코팅 믹스 ; Athena ES, 메릴랜드주 볼티모어)으로 코팅한 배양 접시에 파종하고, 5％ CO2 가습 분위기하, 37℃에서 배양하였다. 그 후, Isogen RNA 추출 키트를 사용하여 RNA를 추출하였다. 또한, RNA 추출에 사용된 세포는 모두 제 1 대 계대 세포였다.
인간 눈조직으로부터의 RNA 추출은 다음의 순서로 실시하였다. 2 개체의 공여자 유래의 4개 안구는 습윤 용기 내에서 4℃로 보존하고, 사후 5일 이내에 사용하였다. 공여자의 연령은 75세 및 79세였다. 먼저, 강각막편을 제조하고, 모양체, 홍채 및 수정체를 전안부로부터 단리하고, 홍채 실질과 홍채 색소 상피 세포를 단리하였다. 각막 내피 및 데스메막은 상기 서술한 방법으로 박리하고, 섬유주대를 단리하였다. 또한, 강각막편으로부터 결막을 절제하고, 8.0 ㎜ 직경의 트레파인을 사용하여 분리한 각막 중앙부 및 윤부를 Dispase I (합동 주정 주식회사, 도쿄) 로 4℃ 에서 하룻밤 처리하고, 각막 상피 및 윤부 상피를 실질로부터 단리하였다. 또한, 후안부로부터 섭자를 사용하여 신경 망막을 박리한 후, 망막 색소 상피 세포 (RPE) 와 맥락막을 한 덩어리로 적출하고, 마지막으로 시신경을 단리하였다. 이들 단리한 조직은 모두 ISOGEN RNA 추출 키트를 사용하여 RNA를 추출하였다.
안구 조직 이외의 인간 전신 조직 유래의 RNA 샘플은 인간 total RNA master panel II (#636643 ; Clontech, 캘리포니아주 마운틴뷰)를 구입하였다. 이것에는, 신장 RNA 및 췌장 RNA는 포함되어 있지 않기 때문에, 별도로 Human Kidney Total RNA (#AM7976 ; Ambion, 텍사스주 오스틴) 및 Human Pancreas Total RNA (＃AM7954 ; Ambion) 를 구입하였다.
역전사 정량 폴리메라아제 연쇄 반응 (RT-qPCR) 은 다음의 순서로 실시하였다. SuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, 캘리포니아주 칼즈배드) 을 사용하여 각 RNA로부터 cDNA를 역전사하고, 정량적 리얼타임 PCR (95℃ 30초 후, 95℃ 5초, 60℃ 30초, 72℃ 30초를 45 사이클) 에 의해 cDNA를 정량하였다. SYBR Pre-mix Dimer Eraser (다카라 바이오 주식회사, 닛폰, 시가) 를 사용하고, 내부 컨트롤에는 β-액틴 (ACTB) 을 사용하였다. 사용한 프라이머의 리스트를 하기의 표 3에 나타낸다.
Figure 112017027967407-pct00003
3. 각막 조직 내의 각막 내피 세포의 염색
상기 6개의 유전자에 대해, 단백질 레벨에서의 발현을 확인하기 위해서, 인간 공여자 유래의 각막 조직편을 하기의 표 4에 나타내는 항체를 사용하여 면역 염색을 실시하였다. 그 결과, 도 3에 나타내는 바와 같이, 어느 단백질을 표적으로 하여 염색했을 경우에도 각막 내피층이 강하게 염색되었다. 특히, 항 ZP4 항체, 항 GLP 항체, 및 항 HTR1D 항체의 3종에 대해서는, 각막 내피층만이 특이적으로 염색되었다. GRIP1, CLRN1, 및 MRGPRX3에 대해서는, 각막 실질도 염색되었지만, 이의 형광 강도는, 각막 내피 세포의 것과 비교하여 분명히 낮기 때문에, 이 유의한 발현 수준의 차이에 기초하여, 각막 내피 세포를 각막 실질과 구별하는 것은 가능하다. 이와 같이, 상기 6개의 유전자 및 그것이 코딩하는 단백질이 각막 내피 세포를 특이적으로 인식하는 마커로서 유용하다는 것이 나타났다.
Figure 112017027967407-pct00004
상기의 면역 염색은, 다음의 순서로 실시하였다. 강각막편은 사후 11일 이내에 사용하였다. 공여자의 연령은 27세였다. 강각막편을 OCT 콤파운드로 포매 (包埋)하고, 동결 절편을 미크로톰-크라이오스탯 (HM560, Thermo Fisher Scientific Inc., 독일, 발도르프) 을 사용하여 10 ㎛로 절단하였다. 실온에서 30분간 건조시킨 후, 조직 절편을 Tris 완충 생리 식염수 (TBS ; 다카라 바이오 주식회사) 로 3회 세정하고, 5％ 당나귀 혈청 및 0.3％ Triton X-100 이 들어간 TBS 와 함께 1시간 인큐베이트하여, 비특이적 반응을 저해하였다. 이어서 각 절편을 표 4에 예시한 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이트하였다. 계속해서 절편을 TBS로 추가로 3회 세정하고, 각 Alexa Fluor 488 결합 2차 항체 (Life Technologies) 의 200배 희석액 및 Hoechst 33342 (#B2261, Sigma-Aldrich) 의 100배 희석액과 함께 실온에서 2시간 인큐베이트하였다. 절편은 형광 현미경 (Axio Observer D1 ; Carl Zeiss Jena Gmbh, 독일, 예나) 을 사용하여 관찰하였다.
4. 인간 iPS 세포로부터의 유도 각막 내피 세포에 있어서의 ZP4의 발현
다능성 줄기세포인 인간 iPS 세포 (쿄토 대학 iPS 세포 연구소로부터 제공) 로부터 각막 내피 세포를 유도한 결과, 도 4에 나타내는 바와 같이, 유도에 의해 ZP4의 발현이 상승하는 것이 확인되었다. ZP4 유전자의 발현은, RT-PCR로 측정하였다. 각막 내피 세포 및 전구 세포에 특이적으로 ZP4가 발현하고 있으므로, 이 결과는, ZP4가 각막 내피 세포의 제조 및 각막 내피 세포의 평가에 유용한 마커인 것을 증명하고 있다.
SEQUENCE LISTING <110> OSAKA UNIVERSITY <120> Corneal endothelial cell marker <130> IPA170226-JP <150> JP 2014-180985 <151> 2014-09-05 <160> 28 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> human <400> 1 acagagcctc gcctttgc 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> human <400> 2 gcggcgatat catcatcc 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 3 atgtggacaa gaagcagcac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 4 ggagttttgg caacttcgac 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 5 cctattggcc ctcgattttc 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> human <400> 6 ggctagtggt cccaatgata ag 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 7 aagacaccca catggaaacg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 8 ccagcgtctc tgtcttctcc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 9 tggagctgct acacaacacc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 10 gagcaggtct ccaccatcag 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> human <400> 11 aaacaggccc tcagggga 18 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 12 gacaggtcac cacacaggat 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 13 ttctgagtcg gaaggcaaag 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> human <400> 14 cggacagata ctgtgcttct tg 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> human <400> 15 ctttccctac gtcaagtgag tg 22 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> human <400> 16 gctgctgtgc atggaatc 18 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 17 aatgcagtac gggcttttcc 20 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> human <400> 18 gctcactggg attgctttg 19 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 19 ggaggtcttc accactggac 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 20 acccaagact gggatggttg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 21 gcagaaatgg cgagaatacc 20 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> human <400> 22 ttcatcgaag gtccggttg 19 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> human <400> 23 ccatggaaac agttgatcct g 21 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> human <400> 24 gctgttgctg ggttctttg 19 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 25 attttgtgcg gtcgctctac 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 26 tccccattac ttccggtatc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 27 catgcgtttc ttccactgag 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 28 catcggcact gcaaatactg 20

Claims (12)

  1. 각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단으로부터, ZP4를 발현하고 있는 세포를 분취(sorting)하는 공정을 포함하는, 각막 내피 세포의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단이 줄기세포를 분화 유도하여 얻어지는, 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단이 각막 내피 세포를 배양하여 얻어지는, 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    분취하는 공정이, ZP4를 특이적으로 인식하는 항체를 각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단에 결합시키는 것을 포함하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 ZP4를 발현하고 있는 세포는 MRGPRX3, GRIP1, GLP1R, HTR1D, 및 CLRN1로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상을 더 발현하고 있는 것인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 분취하는 공정이 MRGPRX3, GRIP1, GLP1R, HTR1D, 및 CLRN1 로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상을 특이적으로 인식하는 항체를 각막 내피 세포를 포함하는 세포 집단에 결합시키는 것을 포함하는, 방법.
  7. ZP4의 발현을 지표로 하여 각막 내피 세포를 평가하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 추가로 MRGPRX3, GRIP1, GLP1R, HTR1D, 및 CLRN1로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 발현을 추가로 지표로 하는, 방법.
  9. ZP4를 특이적으로 인식하는 물질을 포함하는, 각막 내피 세포 검출용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 MRGPRX3, GRIP1, GLP1R, HTR1D, 및 CLRN1로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상을 특이적으로 인식하는 물질을 더 포함하는, 조성물.
  11. ZP4를 특이적으로 인식하는 물질을 포함하는, 각막 내피 세포 검출용 키트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 키트는 MRGPRX3, GRIP1, GLP1R, HTR1D, 및 CLRN1로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상을 특이적으로 인식하는 물질을 더 포함하는, 키트.
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