KR101937442B1 - 암 치료용 예측 바이오마커 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 암에 걸린 환자가 특정 치료에 반응할지 여부를 식별하는 것에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 치료제 TLR-9 아고니스트에 대한 반응자를 식별하는 방법 및 수단에 관한 것이다.

Description

암 치료용 예측 바이오마커{PREDICTIVE BIOMARKER FOR CANCER THERAPY}
본 발명은 일반적으로 암 환자들이 특정 치료에 대해 반응할 것인지 여부에 대해 암 환자를 식별하는 것에 관한 것이다. 보다 상세히 본 발명은 DNA 구조체를 면역 활성화하는 것을 포함하는 치료에 대해서뿐만 아니라 상기 구조체로 치료를 시작하기 전에 잠재적 응답자로서 개별적으로 특성화된 암 환자를 치료도록 의도된 DNA 구조체에 대한 응답자를 식별하기 위한 방법 및 DNA 구조체에 관한 것이다.
바이오마커는 혈액이나 다른 체액에서, 조직에서 또는 예를 들어 암과 같은 컨디션이나 질병의 유무의 신호를 보내는 세포 상에 리셉터로서 발견되는 물질이다. 바이오마커는 예측, 진단 및 약력학적 바이오마커로 분화될 수 있다.
예측 바이오마커는 환자가 특정 치료에 대해 반응하거나 이로부터 이득을 얻게 되는지 그 가능성을 평가하는데 사용된다. 예후 바이오마커는 누구를 치료할지 또는 얼마나 공격적으로 치료할지에 대한 결정을 가이드하기 위해 이들의 공격적 잠재력과 관련된 종양의 분류를 가능케 한다. 약력학적 바이오마커는 종양에 미치는 약물의 단기 치료 효과를 측정하며, 새로운 항암 약물의 임상 개발 중에 투여량 선택을 가이드하는데 사용될 수 있다.
목표로 하는 치료는 암이 성장 또는 확산으로부터 멈추도록 분자 수준에서 작동하는 치료이다. 이러한 치료는 보통 매우 공격적인 약물의 사용과 관련되기 때문에, 불필요한 접근을 회피하기 위해, 환자가 목표로 하는 치료에 반응하거나 반응하지 않는지 예측이 가능한 도구를 필요로 한다.
치료가 점점 더 표적 특이적으로 되는 사실과 관련하여, 바이오마커의 역할이 증가될 것이다. 이들은 치료적 접근을 개인의 요구에 맞추고 개인에 맞추어진 종양학에 대한 길을 여는데 도움이 될 것이다. 심지어 특정 치료에 대한 반응자를 무반응자로부터 구별하는 가능성은 환자가 불필요한 치료를 받게 되는 것을 예방하는데 도움이 될 것이다.
일반적으로 알려지고 잘 입증된 암 치료는 화학요법이다. 화학요법의 한 주요 결점은 심각한 부작용을 일으키는 매우 공격적인 약제의 사용이다. 이러한 부작용을 최소화하기 위해 예를 들어, 면역 활성제와 화학요법을 함께 사용하는 것과 같이 화학치료제의 투여량을 최소화하는 많은 시도들이 착수되어 왔다. 한 접근법은 면역 활성화 DNA의 사용이다.
소위 비메틸화된 CG 서열은 면역 시스템을 매우 효과적으로 활성화시키는 것으로 나타났다(Krieg AM, Yi AK, Matson S, Waldschmidt TJ, Bishop GA, Teasdale R, Koretzky GA, Klinman DM; CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation; Nature 1995 Apr 6 374:6522 546-9). 이러한 서열은 박테리아로부터 유래한다. EP 1 196 178에는 부분적으로 자가 상보적 서열을 갖는 공유결합적으로 폐쇄된 환형 DNA가 개시되어 있으며, 이는 비메틸화된 CG 모티프를 포함하는 양 말단에 단일 스트랜드 루프를 갖는 이중 스트랜드 스템을 함유하는 DNA 구조체를 형성한다.
암성 질병을 치료하기 위한 EP 1 196 178의 아령형 DNA 구조체와 화학치료제의 조합은 EP 1 776 124에 지시된바 있다. 환자들은 EP 1 196 178의 구조체로 치료되고, 그리고 후속적으로 화학요법을 받았다. 이는 개시된 조합에 의해 화학치료제의 양이 감소될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나 이 문헌에는 환자가 이러한 병용 요법의 적용에 반응할지 여부를 식별하기 위한 도구에 대한 정보가 전혀 개시되어 있지 않다.
본 발명의 목적은 암 환자가 면역 활성화 DNA를 이용한 치료에 반응할지 여부를 예측하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 이러한 면역 활성화 DNA 자체를 제공하는 것이며, 이는 상기 방법에 사용될 수 있는 것으로, 즉, 치료 시작 전에 반응자로서 식별된 환자를 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 활성화된 내추럴 킬러 T(NKT) 세포의 빈도를 측정함으로써 암 또는 자가면역 질병에 걸린 환자가 TLR-9 아고니스트를 이용한 치료에 반응할지 또는 반응하는지 여부를 예측하거나 모니터하는 방법을 제공한다. 활성화된 NKT 세포의 면역표현형 검사를 위해 분화 클러스터 또는 지정 클러스터(CD) 분자 CD3+/CD56+/CD69+를 검출하는 것이 바람직하다. 환자가 TLR-9 아고니스트를 이용한 치료에 반응할지 여부에 대한 가능성을 평가하기 위해 전체 NKT 세포 집단의 활성화된 NKT 세포의 비율이 또한 측정될 수 있다.
TLR-9 아고니스트는 적어도 하나의 서열 모티프 N1N2CGN3N4를 포함하며, 여기서 N1N2 및 N3N4는 A, C, T 및 G의 어느 조합이며, 그리고 C는 디옥시시티딘, G는 디옥시구아노신, A는 디옥시아데노신이며 T는 디옥시티미딘인, DNA 구조체가 의도된다.
TLR-9 아고니스트를 이용한 치료에 대한 반응자는 전체 NKT 세포 집단의 적어도 3%의 활성화 NKT 세포의 빈도를 가질 것이다.
비-DNA 약물을 이용한 유도 치료가 사전에 형성될 수 있는 것으로 의도된다. 이러한 치료는 혈관형성 억제제 또는 항체의 사용을 수반하거나 수반하지 않는 화학요법을 포함한다.
본 발명의 다른 목적은 환자가 증강된 수준의 활성화된 NKT 세포를 갖는 것을 특징으로 하는 암 치료 방법에 사용하는 TLR-9 아고니스트를 제공하는 것이다.
사용된 TLR-9 아고니스트는 적어도 하나의 서열 모티프 N1N2CGN3N4를 포함하며, 여기서 N1N2 및 N3N4는 A, C, T 및 G의 어느 조합이며, 그리고 C는 디옥시시티딘, G는 디옥시구아노신, A는 디옥시아데노신이며 T는 디옥시티미딘인, 적어도 하나의 DNA 구조체를 포함하는 것으로 의도된다. 상기 아고니스트는 또한 N1N2가 GT, GG, GA, AT 또는 AA를 포함하는 그룹으로부터 선택된 하나의 엘리먼트이며, N3N4는 CT 또는 TT를 포함하는 그룹으로부터 선택된 하나의 엘리먼트인 것으로 더 특징지어질 수 있다.
상기 아고니스트는 단일 또는 이중 스트랜드 DNA를 포함하는 선형 개방 사슬 DNA 구조체, 또는 단일 스트랜드 루프를 갖는 적어도 하나의 말단을 포함하는 선형 이중 스트랜드 DNA 구조체인 DNA를 포함할 수 있다. 선형 이중 스트랜드의 말단을 보호하기 위해 루프를 이용하는 대신, 적어도 하나의 L-DNA 뉴클레오타이드가 DNA 이중 스트랜드의 일부로서 사용될 수 있다.
서열 모티프 N1N2CGN3N4는 DNA 서열의 단일 스트랜드 및/또는 이중 스트랜드 부위 내에 위치할 것이다. 또한 DNA TLR-9 아고니스트의 적어도 하나의 뉴클레오타이드는 카르복실, 아민, 아미드, 알디민, 케탈, 아세탈, 에스테르, 에테르, 디설피드, 티올 및 알데히드기를 포함하는 그룹으로부터 선택된 작용기로 변형되는 것이 의도된다.
DNA 구조체를 포함하는 아고니스트는 펩타이드, 단백질, 탄수화물, 항체, 지질, 미셀, 소포, 합성 분자, 폴리머, 마이크로 프로젝틸, 금속 입자, 나노입자, 또는 고형 상을 포함하는 그룹으로부터 선택된 화합물과 연결될 수 있다.
DNA 구조체를 포함하는 아고니스트는 약학 조성물의 일부가 될 수 있으며, 상기 약학 조성물은 백신일 수 있는 것으로 의도된다.
본 발명의 다른 목적은 암 또는 자가 면역 질병에 걸린 환자가 TLR-9 아고니스트를 이용한 치료에 반응할지 또는 반응하는지 여부를 예측하거나 모니터하기 위한 키트를 제공하는 것이며, 이는 전체 NKT 세포 집단의 활성화된 NKT 세포의 빈도를 검출 및 정량하는 수단들을 포함한다.
상기 키트에 있어서 TLR-9 아고니스트는 적어도 하나의 서열 모티프 N1N2CGN3N4를 포함하는 DNA 구조체를 포함하며, 여기서 N1N2 및 N3N4는 A, C, T 및 G의 어느 조합이며, 그리고 C는 디옥시시티딘, G는 디옥시구아노신, A는 디옥시아데노신이며 T는 디옥시티미딘인 것으로 의도된다.
도 1: 활성화된 NKT 세포에 대한 실제 환자에서의 ROC 곡선
도 2: 활성화된 NKT 세포에 대한 민감성 및 특이성
도 3: a: 실제 및 플라시보에 대한 바이오마커 양성 환자에서 카플란 메이어 플롯; b: 실제 및 플라시보 도구(arm) 모두에서 바이오마커 음성 환자에 대한 카플란 메이어 플롯
도 4: a: 실제 도구에서 바이오마커 양성 환자 대 바이오마커 음성 환자의 카플란 메이어 플롯; b: 바이오마커 양성 및 음성 환자에 대한 플라시보 그룹의 카플란-메이어 플롯
본 발명의 의미 내에서 MGN1703은 이중 스트랜드 스템 및 비메틸화된 CG 모티프를 갖는 단일 말단 루프를 가지며, 공유결합적으로 폐쇄된 부분적으로 자가 상보적인 DNA 사슬의 DNA 구조체를 지칭한다.
본 발명의 개시내용에 따른 "스템(stem)"은 동일한 DNA 분자 내에서 염기 쌍 형성함으로써(이는 그 다음 부분적으로 자가 상보적으로 됨) 또는 다른 DNA 분자 내에서 염기 쌍 형성함으로써(이는 부분적으로 또는 완전히 상보적으로 됨) 형성된 DNA 이중 스트랜드로서 이해될 것이다. 분자 내 염기 쌍 형성은 동일한 분자 내에서의 염기 쌍 형성을 가리키며, 다른 DNA 분자들 간의 염기 쌍 형성은 분자 간 염기 쌍 형성이라 한다.
본 발명의 개시내용의 의미 내에서, "루프(loop)"는 스템 구조의 말단 내에 또는 말단에 쌍이 형성되지 않은 단일 스트랜드 부위로서 이해될 것이다. "헤어핀(hairpin)"은 스템과 루프의 독특한 조합이며, 이는 동일한 DNA 분자의 두 자가 상보적 부위가 하이브리드되어 쌍이 형성되지 않은 루프를 갖는 스템을 형성할 경우에 발생된다.
"아령형(dumbbell-shape)"은 스템 부위 측면의 양 말단에 헤어핀을 갖는 선형 DNA 구조체를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 개시내용의 문맥에서 "선형 DNA 구조체(linear DNA construct)"는 단일 및/또는 이중 스트랜드 DNA를 포함하는 선형 개방-사슬 DNA 구조체 또는 이중 스트랜드 DNA 스템의 양 말단에 단일 스트랜드 루프를 포함하는 선형의 아령형 DNA 구조체를 나타낸다.
본 발명에 따른 면역조절은 면역자극 및 면역억제를 지칭한다. 면역자극은 우선적으로 증식, 이동, 분화되거나 또는 어느 다른 형태로 활성적으로 되기 위해서 면역 시스템의 작동체 세포가 자극되는 것을 의미한다. 예를 들어, 일반적으로 헬퍼 T-세포로부터 동시 자극 신호가 요구되는 면역자극 DNA 분자에 의해 B 세포 증식이 동시 자극 신호 없이 유도될 수 있다.
다른 한편, 면역억제는 면역 시스템의 활성화 또는 효능을 감소시키는 것으로 이해될 것이다. 면역억제는 예를 들어, 이식된 장기의 거부를 억제하기 위해, 골수 이식 후 이식편대 숙주병(graft-versus-host disease)을 치료하기 위해, 또는 예를 들어, 류마티스성 관절염 또는 크론병과 같은 자가면역 질병의 치료를 위해 일반적으로 의도적으로 유도된다.
이러한 정황에서, 면역조절은 또한 아직 분화나 성숙하고 있는 면역 반응에 영향을 미침으로써, 또는 확립된 면역 반응의 특성을 조절함으로써 면역 반응의 성질이나 특성에 영향을 미치는 것을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "예방접종(vaccination)"은 질병에 대한 면역성을 생성하기 위한 항원 물질(백신)의 투여를 지칭한다. 백신은 바이러스, 균류, 원생 기생충, 박테리아의 병원체뿐만 아니라 알레르기 및 천식 그리고 종양의 병원체에 의한 감염의 영향을 억제하거나 완화할 수 있다. 백신은 전형적으로 면역 반응을 증가시키기 위해 사용되는 예를 들어 면역자극 핵산과 같은 하나 이상의 보조제를 함유한다. 예방접종은 일반적으로 감염 및 다른 질병을 예방하는 가장 효과적이고 비용-효율적인 방법인 것으로 간주된다.
투여되는 물질은 예를 들어, 살아있으나 약화된 형태의 병원체(박테리아 또는 바이러스), 사멸되거나 불활성화된 형태의 이러한 병원체, 단백질, 항원을 암호화하는 핵산과 같은 정제된 물질이나 또는 종양 세포나 수지상 세포와 같은 세포일 수 있다. 특히, DNA 예방접종이 최근에 개발되었다. DNA 예방접종은 항원을 암호화하는 DNA를 인간이나 동물 세포에 삽입함으로써 작동한다. 발현된 단백질을 인지하는 면역 시스템의 일부 세포들은 이러한 단백질들에 대한 그리고 이들을 발현하는 세포들에 대한 공격을 보호할 것이다. DNA 백신의 한 이점은 이것들을 생산 및 보관하기에 매우 용이하다는 것이다. 또한 DNA 백신은 보다 광범위한 범위의 면역 반응 타입들을 유도하는 능력을 포함하여 통상적인 백신에 비해 다수의 이점을 갖는다.
예방접종은 항원에 노출시 예방접종된 건강한 개체에서 항원에 대한 면역성을 형성하는 예방적 접근법으로서 사용될 수 있다. 변형적으로, 치료적 예방접종은 항원에 대해 개체의 면역 시스템을 가이드함으로써 예방접종된 병에 걸린 개체의 향상된 면역 시스템 반응을 일으킬 수 있다. 예방 또는 치료 예방접종 모두가 인간뿐만 아니라 동물에 적용될 수 있다.
용어 "암(cancer)"은 치료 또는 예방하고자 하는 암 질병 또는 종양을 포함하며, 이에 한정하는 것은 아니나 포유류 암종, 흑색종, 피부 종양, 림프종, 백혈병, 결장암종, 위암종, 췌장암종, 결장암, 소장암을 포함하는 위장관 종양, 난소암종, 자궁경부암종, 폐암, 전립선암, 신장세포암종 및/또는 간 전이를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
본 명세서에 따른 자가면역 질병은 류마티스성 관절염, 크론병, 전신성 루프스(SLE), 자가면역 갑상선염, 하시모토씨 갑상선염, 다발성 경화증, 그레이브스병, 중증 근무력증(myasthenia gravis), 셀리악병(celiac disease) 및 에디슨병(Addison's disease)을 포함한다.
단일 스트랜드 말단 루프에서 비메틸화된 CG 서열을 갖는 면역 활성화 아령형 DNA 구조체를 이용한 실험 중에, 특정 세포 타입의 면역 활성화 및 작동인자 경로의 상승된 빈도가 상기 DNA 구조체를 이용한 성공적인 치료와 관련된 것으로 드러났다.
척추동물에서, 소위 "톨형(Toll-like) 리셉터" (TLR)는 선척적 면역 시스템의 일부이다. TLRs은 이들이 단백질, 지질 구조, 당류 구조, 및 특성 핵산과 같은 고 보존 병원체-관련 분자 패턴을 검출하는 경우에 보호적인 면역 반응을 유도하는 특수화된 면역 리셉터의 한 패밀리이다. TLR-3, TLR-4, TLR-7, TLR-8 및 TLR-9를 포함하는 여러 TLR들에 대한 합성 아고니스트는 일반적으로 종양의 존재하에서 면역 시스템을 활성화시키고자 암 치료를 위해 개발되어 왔거나 개발되고 있다. TLR-9는 비메틸화된 CG-함유 DNA 서열의 존재를 인지하며, 이는 전형적으로 박테리아에서 발견되나 인간 게놈 DNA에서는 사실상 결코 발견되지 않는다. 따라서, 비메틸화된 CG-함유 DNA 서열은 인공 TLR-9 아고니스트로서 고안되어 왔다. 이러한 비메틸화된 CG-함유 DNA 구조체의 효과는 이의 TLR-9과의 상호작용에 따라 달라지며, DNA-단백질 상호작용은 DNA 및 단백질 모두의 형태에 따라 달라진다. 실험 데이터는 놀랍게도 아령형 DNA 분자가 면역 반응의 유도에 적절함을 입증한다.
암 환자가 TLR-9 아고니스트의 적용에 반응할지 여부를 예측하기 위한 도구를 식별하기 위해, 단일 스트랜드 말단 루프에 비메틸화된 CG 모티프를 갖는 아령형 DNA 구조체가 사용되었다.
혈관 내피세포 성장인자 A를 저해하는 인간 모노클로날 항체를 이용하거나 이용하지 않은 표준 제1선의 병용 치료로 4.5-6개월간 이전에 치료받았던 전이성 대장암에 걸린 총 46명의 환자들이 시험을 위해 선택되었다. 약 1-6주의 무치료 인터벌 후에, 환자들의 무작위화가 수행되어, 32명의 환자들이 투여량 당 60mg의 상기 DNA 구조체 MGN1703을 받았으며, 14명의 환자들은 피하 주사에 의해 매주 2회 각 환자는 플라시보를 받았다.
치료 12주 후에, 모든 환자들은 종양-진행에 대해 검사받았다. 종양 진행의 유무에 기초하여, 환자들을 두 그룹으로 나누고, "PFS 그룹"이라 명시하였다. 종양이 진행되지 않은 환자들을 무진행 환자라 명시하고, "PFS1"이라 라벨링하였으며, 한편 종양 진행이 된 환자들을 "PFS0"이라 라벨링하였다. 분명히, 종양 진행의 부재(PFS1)는 치료에 대한 가능한 반응을 나타내며, 한편 종양 성장(PFS2)은 반응의 부재를 나타낸다. 치료는 각 환자에 대해 종양 진행이 발견될 때까지 계속되었다.
표 1에 그 결과를 요약하였다. 거의 모든 무진행 환자들이 상기 DNA 구조체를 받았음이 명확하다.
환자들의 지정
치료 도구
 그룹 지정
PFS0 PFS1 총
MGN1703 19 13 32
플라시보 13 1 14
총 32 14 46
MGN1703 또는 플라시보의 첫 척용 전에(기준선에서), 모든 환자들의 혈액 시료를 수집하였다. 예를 들어, 전체 PBMC 집단의 일부, 및 활성화 및 비활성화 부분모집단의 관계와 같이 하기 면역변수들의 분포를 검출하였다. 12주 후에 각 PFS 그룹 지정과 기준선에서 모든 면역변수들의 상관성을 조사하였다. 하기 면역변수들이 측정되었다: 단핵구, 활성화 단핵구 1, 활성화 단핵구 2, B-세포, 활성화 B-세포, T-세포, 활성화 T-세포, 내추럴 킬러(NK)-세포, 활성화 NK-세포, NKT-세포, 활성화 NKT-세포, 형질 세포양 수지상 세포(pDCs), 활성화 pDCs, 골수 수지상 세포(mDCs), 및 활성화 mDCs. 표 2에 세포 타입, CDs 및 측정 빈도의 컨텍스트를 요약하였다.
세포 타입, CDs 및 측정 빈도의 관계
세포 타입 식별 결과 퍼센트로서 빈도
단핵구 CD14+ 모두 PBMCs
활성화 단핵구 1 CD14+ / CD86+ 모두 단핵구
활성화 단핵구 2 CD14+ / CD169+ 모두 단핵구
B-세포 CD19+ 모두 PBMCs
활성화 B-세포 CD19+ / CD86+ 모두 B-세포
T-세포 CD3+ / CD56 모두 PBMCs
활성화 T-세포 CD3+ / CD56- / CD69+ 모두 T-세포
내추럴 킬러(NK)-세포 CD3- / CD56+ 모두 PBMCs
활성화 NK-세포 CD3- / CD56+ / CD69+ 모두 내추럴 킬러 세포
NKT-세포 CD3+ / CD56+ 모두 PBMCs
활성화 NKT-세포 CD3+ / CD56+ / CD69+ 모두 NKT 세포
형질 세포양 수지상 세포(pDCs) Lin1- / CD123+ / HLA-DR+ 모두 PBMCs
활성화 pDCs Lin1- / CD123+ / HLA-DR+ / CD40+ 모두 pDCs
골수 수지상 세포(mDCs) Lin1- / CD11c+ / HLA-DR+ 모두 PBMCs
활성화 mDCs Lin1- / CD11c+ / HLA-DR+ / CD86+ 모두 mDCs
면역변수들 중 하나가 적절한 바이오마커로 제공될 수 있는지 평가하기 위해, 소위 콕스(Cox) 회귀를 각 면역변수에 대해 산출하였다. 콕스 회귀는 위험 함수의 어떠한 고려없이 파라미터(들)의 영향을 평가하는 것을 가능케 한다. 이러한 산출로부터 결과적으로 얻어진 위험율은 1 미만이어야 하며, 0.05 미만인 유의 P 값과 관련되어야 한다. 그렇지 않으면 관찰된 결과는 적용된 TLR-9 아고니스트와 관련되지 않을 수 있다. 이러한 기준은 약 0.933의 위험율 및 0.0309의 p 값을 갖는 활성화 NKT 세포에만 적용하였다.
놀랍게도, 활성화된 NKT 세포의 퍼센트는 실제 그룹에서 치료 성공을 예측하는데 사용될 수 있다. 활성화된 NKT 세포의 퍼센트와 PFS 그룹 사이의 관계는 실제 그룹에서 진보되고 잘 확립된 통계학적 분석을 이용하여 조사되었다.
리시버 작동 특징(ROC) 곡선, 또는 간단히 ROC 곡선은 이의 판별 역치가 변함에 따라 바이너리 분류 시스템의 성능을 보여준다. ROC 곡선은 다양한 역치 설정에서 양성 외의 참양성의 부분 대 음성 외의 거짓 양성의 부분을 도시함으로써 생성된다. 참양성은 또한 민감도로서 표기되며, 거짓 양성은 1 마이너스 특이성 또는 참 음성율이다.
ROC 분석은 의학, 방사선학, 생물통계학 및 기타 분야에서 수십년간 사용되었으며, 기계 학습 및 데이터 수집 조사에 점진적으로 사용이 증가되고 있다. 바이오마커에서, 잠재적 바이오마커가 임상적 유효성을 가질 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 즉, 예측 목적으로 사용될 수 있다. 성공적인 진단 시험 또는 바이오마커는 사선을 넘는 굽은 곡선을 형성할 것이며, 한편 성공적이지 못한 시험은 사선 또는 그 아래를 하회하는 곡선이 반영될 것이다. 따라서, ROC 곡선은 진단 시험이 성공적인지 아니면 그렇지 못한 것인지에 대한 정보를 제공한다.
활성화된 NKT 세포에 있어서 실제 환자에서 ROC 곡선이 수립되었다(도 1). 곡선 아래의 면적은 0.71인 것으로 측정되었으며, 이는 바이오마커의 신뢰도의 분명한 표지이다. 시험의 판독을 위해 최적 컷-오프 값을 결정하는데 사용될 수 있는 유덴-인덱스는 3.08% 활성화 NKT 세포에서 최적 컷-오프를 나타낸다. 도 2는 활성화된 NKT 세포 대 민감성 및 특이성을 나타낸다.
모든 환자들은 이제 이들의 활성화된 NKT 세포의 수준에 따라 달라지는 그룹으로 분류되었다. 3.08% 활성화 NKT 세포들의 컷-오프 이상의 세포 수준을 갖는 환자들은 바이오마커 양성으로 지정되고, 상기 컷-오프 미만의 수준을 갖는 환자들은 바이오마커 음성으로 지정되었다.
도 3a는 실제 및 플라시보에 대해 바이오마커 양성 환자들에서의 카플란 메이어 플롯을 나타낸다(실선: MGN1703으로 처리된 환자들; 점선: 플라시보로 처리된 환자들). 바이오마커 양성 그룹 내에서 생존 가능성은 놀랍게도 TLR-9 아고니스트의 적용과 관련되는 것이 명백하다.
도 3b는 실제 및 플라시보 도구 모두에서 바이오마커 음성 환자에 대한 카플란 메이어 곡선을 나타낸다. 무진행 생존 시간이 바이오마커 양성 실제 환자에 비해 이러한 실제 그룹 내에서 분명히 더 짧다는 것이 명백하다(도 3a와 비교).
도 4a는 단지 실제 치료 도구로부터 바이오마커 양성 환자들 대 바이오마커 음성 환자들의 카플란 메이어 플롯을 나타낸다(실선: 바이오마커 양성 환자들; 점선: 바이오마커 음성 환자들). 분명히, 바이오마커 양성 환자들은 양 그룹이 실제 치료제 MGN1703을 받은 경우에도 바이오마커 음성 환자들에 비해 생존 가능성에 있어서 현저한 이점을 갖는다.
도 4b는 바이오마커 양성 및 음성 환자에 대한 플라시보 그룹의 카플란-메이어 플롯을 나타낸다(실선: 바이오마커 양성 환자들; 점선: 바이오마커 음성 환자들). 양 그룹은 플라시보로만 처리된 것과 다소 동일한 무진행 생존을 보이는 것이 명백하다. 분명히, 상기 바이오마커는 환자가 TLR-9 아고니스트 처리에 반응하는 자인지 아닌지 평가하기에 적절하다. 더욱이, 플라시보 그룹은 바이오마커가 환자의 전체적인 건강 상태에 의한 효과와 관련이 없음을 보여준다.
본 발명은 TLR-9 아고니스트, 특히 비메틸화된 CG 모티프를 함유하는 단일 스트랜드 말단 루프를 포함하는 이중 스트랜드 스템을 갖는 공유결합적으로 폐쇄된 부분적으로 자가 상보적인 DNA 사슬을 이용한 암 치료에 대해 반응하는 자를 예측하는 바이오마커를 제공한다. 기준선에서 활성화된 NKT 세포들(CD3+/CD56+/Cd69+)의 빈도 측정은 환자가 상기 DNA 구조체를 이용한 치료에 대하여 반응하는 자인지 아닌지 그 가능성을 평가할 수 있도록 한다. 중요하게도, 플라시보 도구에서, 반응자-유사 특징을 갖는 환자들은 비-반응자들이 하였던 것과 동일한 방식으로 행동하며, 바이오마커 양성 실제 환자의 연장된 무진행 생존 시간은, 실제로 보다 나은 전체적인 건강이나 어떠한 비특이적 효과에 의한 것이 아니라, 선택된 치료에 대한 바이오마커의 적용 가능성에 기인한 것으로 나타난다.
재료 및 방법
시료 취급
FACS를 위한 전혈(10mL)을 Streck Cyto-Chex® BCT 튜브에 수집하였다. 샘플링 후 2시간 내에 혈액 시료를 분석 실험실로 수송하였다. 확립된 프로토콜에 따라, 시료들을 실온에 보관하였다. 형질 세포양 수지상 세포(pDC), 골수 수지상 세포(mDC), 단핵구, 내추럴 킬러(NK) 세포, NKT 세포, B 세포, T 세포 및 다른 세포 집단들의 빈도 및 활성화 상태를 평가하였다.
분석 방법
확립된 원리에 따라 형광 활성 세포 분리(FACS)를 수행하였다. 전혈 시료는 형광표지된 항체로 염색되고 인큐베이션되었다. 면역 세포들의 표현형 분석은 FACScalibur(Becton Dickinson) 플로우 사이토미터로 수행되었다. 각 분석된 세포 집단들의 빈도는 환자들의 각 시료에 대해 기록되었다.
특정 세포 집단의 활성화에 대한 인간 PBMC의 분석
형질 세포양 수지상 세포(pDC)의 CD40 발현
세포들은 하기 조합의 모노클로날 항체들로 염색되었다:
안티-리니지(anti-lineage) 마커-FITC, (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56에 대한 항체들을 함유하는 항체 칵테일); 안티-CD123-PE; 안티-HLA-DR-PerCP; 안티-CD40-APC; PDC는 리니지 음성, HLA-DR 양성, CD123 양성 세포로서 게이팅되었다. PDC 집단 내에서 CD40이 활성화 마커로 사용되었다.
활성화 마커 CD69를 이용한 NK-, NK-T 및 T 세포의 활성화
세포들은 하기 조합의 모노클로날 항체들로 염색되었다: 안티-CD3-FITC; 안티 CD56-PE; 안티 CD69-APC
NK 세포들은 CD3 음성, CD56 양성 세포로서 게이팅되었다.
NK-T 세포들은 CD3 양성, CD56 양성 세포로서 게이팅되었다.
T 세포들은 CD3 양성, CD56 음성으로 게이팅되었다.
CD69는 3가지 모든 집단에 대한 활성화 마커로 사용되었다.
골수 수지상 세포(MDC)의 CD86 발현:
세포들은 하기 조합의 모노클로날 항체들로 염색되었다: 안티-리니지(anti-lineage) 마커-FITC, (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56에 대한 항체들을 함유하는 항체 칵테일); 안티-CD11c-PE; 안티-HLA-DR-PerCP; 안티-CD86-APC.
MDC는 리니지 음성, HLA-DR 양성, CD11c 양성 세포로서 게이팅되었다.
MDC 집단 내에서 CD86이 활성화 마커로 사용되었다.
B 세포 및 단핵구의 CD86 발현; 단핵구의 CD169 발현
세포들은 하기 조합의 모노클로날 항체들로 염색되었다: 안티 CD14-FITC; 안티 CD169-PE; 안티 CD19-PerCP; 안티 CD86-APC
B 세포는 CD19 양성 세포로서 게이팅되었다. B 세포 집단 내에 CD86이 활성화 마커로서 사용되었다.
단핵구는 CD14 양성 세포로서 게이팅되었다. 단핵구 집단 내에 CD86 및 CD169가 활성화 마커로서 사용되었다.

Claims (17)

  1. 활성화된 내추럴 킬러 T(NKT) 세포의 빈도를 측정함으로써 암에 걸린 환자가 TLR-9 아고니스트를 이용한 치료에 반응할지 또는 반응하는지 여부를 예측하거나 모니터하는 방법으로서, 여기서 TLR-9 아고니스트는 적어도 하나의 서열 모티프 N1N2CGN3N4를 포함하는 DNA 구조체이며, 여기서 N1N2 및 N3N4는 A, C, T 및 G의 어느 조합이며, 그리고 C는 디옥시시티딘, G는 디옥시구아노신, A는 디옥시아데노신이며 T는 디옥시티미딘인, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    전체 NKT 세포 집단의 활성화된 NKT 세포의 비율이 측정되는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    TLR-9 아고니스트를 이용한 치료에 대한 반응자는 전체 NKT 세포 집단의 적어도 3%의 활성화된 NKT 세포의 빈도를 갖는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    비-DNA 약물을 이용한 유도 치료가 사전에 수행된 방법.
  5. 환자가 증강된 수준의 활성화된 NKT 세포를 갖는 것을 특징으로 하는 암 치료 방법에 사용하는 TLR-9 아고니스트로서, 적어도 하나의 서열 모티프 N1N2CGN3N4를 포함하며, 여기서 N1N2 및 N3N4는 A, C, T 및 G의 어느 조합이며, 그리고 C는 디옥시시티딘, G는 디옥시구아노신, A는 디옥시아데노신이며 T는 디옥시티미딘인, 적어도 하나의 DNA 구조체를 포함하는 아고니스트.
  6. 제5항에 있어서,
    N1N2는 GT, GG, GA, AT 또는 AA를 포함하는 그룹으로부터 선택된 하나의 엘리먼트이며, N3N4는 CT 또는 TT를 포함하는 그룹으로부터 선택된 하나의 엘리먼트인 아고니스트.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 DNA는 단일 또는 이중 스트랜드 DNA를 포함하는 선형 개방 사슬 DNA 구조체, 또는 단일 스트랜드 루프를 갖는 적어도 하나의 말단을 포함하는 선형 이중 스트랜드 DNA 구조체인 아고니스트.
  8. 제5항에 있어서,
    서열 모티프 N1N2CGN3N4는 상기 DNA 구조체의 단일 스트랜드 및 이중 스트랜드 부위 중 적어도 하나 내에 위치하는 아고니스트.
  9. 제5항에 있어서,
    적어도 하나의 L-DNA 뉴클레오타이드를 포함하는 아고니스트.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 뉴클레오타이드는 카르복실, 아민, 아미드, 알디민, 케탈, 아세탈, 에스테르, 에테르, 디설피드, 티올 및 알데히드기를 포함하는 그룹으로부터 선택된 작용기로 변형되는 아고니스트.
  11. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 DNA 구조체는 펩타이드, 단백질, 탄수화물, 항체, 지질, 미셀, 소포, 합성 분자, 폴리머, 마이크로 프로젝틸, 금속 입자, 나노입자, 또는 고형 상을 포함하는 그룹으로부터 선택된 화합물과 연결되는 아고니스트.
  12. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 DNA 구조체는 약학 조성물의 일부인 아고니스트.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 백신인 아고니스트.
  14. 전체 NKT 세포 집단의 활성화된 NKT 세포의 빈도를 검출 및 정량하는 수단들을 포함하며, 암에 걸린 환자가 TLR-9 아고니스트를 이용한 치료에 반응할지 또는 반응하는지 여부를 예측하거나 모니터하기 위한 키트로서, 여기서 상기 TLR-9 아고니스트는 적어도 하나의 서열 모티프 N1N2CGN3N4를 포함하는 DNA 구조체를 포함하며, 여기서 N1N2 및 N3N4는 A, C, T 및 G의 어느 조합이며, 그리고 C는 디옥시시티딘, G는 디옥시구아노신, A는 디옥시아데노신이며 T는 디옥시티미딘인 키트.
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