KR101918939B1 - 황칠나무 부정근 분획추출물을 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 황칠나무 부정근 분획추출물을 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 조직배양한 황칠나무 부정근을 용매로 추출한 후 분획용매로써 에틸아세테이트와 물을 각각 사용하여 분획한 분획추출물을 혼합하여 제조되는 황칠나무 부정근의 분획 복합물을 유효성분으로 함유하여 피부 장벽강화 효과, 피부 보습 효과 및 피부 주름개선 효과가 우수한 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명 피부 개선용 화장료 조성물은 특히 블루라이트에 의한 손상을 개선하고 보호하는 탁월한 효과를 나타낸다.

Description

황칠나무 부정근 분획추출물을 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition containing fractions of dendropanax morbifera adventitious root extract}

본 발명은 황칠나무 부정근 분획추출물을 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 조직배양한 황칠나무 부정근을 용매로 추출한 후 분획용매로써 에틸아세테이트와 물을 각각 사용하여 분획한 분획추출물을 혼합하여 제조되는 황칠나무 부정근의 분획 복합물을 유효성분으로 함유하여 피부 장벽강화 효과, 피부 보습 효과 및 피부 주름개선 효과가 우수한 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

노화란 세월이 지나감에 따라 신체의 구조와 기능이 점진적으로 저하되고 질병과 사망에 대한 감수성이 급격히 증가하면서 쇠약해지는 과정으로 신체에 생리적 변화가 발생하여 신체 전반적으로 현저한 퇴화현상이 나타나게 되는 것을 말한다. 이 중에서 우리가 가장 쉽게 느낄 수 있는 것이 피부 노화로 이는 당뇨병, 심장병, 동맥경화, 치매, 암 등에 못지않게 중요한 것으로 인식이 되고 있으며, 개인차가 있지만 피부노화는 대개 20대 초반을 전후해서 시작되어 나이가 많아지면서 증가하는 것으로 나타난다.

피부노화는 유전적, 환경적 등의 다양한 요인에 의해 영향을 받는데 크게 두 종류로 나눌 수 있다. 하나는 내인성 노화(intrinsic aging)로 이는 자연노화로써 유전정보에 따라 시간이 지나면서 일어나는 노화현상이며, 다른 하나는 외인성 노화(extrinsic aging)로 광노화(photoaging)라고도 하며, 외부환경 요인, 그 중에서도 햇빛에 존재하는 자외선에 의해 일어나는 노화 현상을 말한다.

최근에는 자외선 이외의 다른 파장의 빛 즉, 블루라이트가 피부에 미치는 유해성에 대해 연구되어지고 있다. 블루라이트(Blue light, 청색광)는 380 ~ 500nm 파장의 빛으로 사람이 볼 수 있는 가시광선, 즉, 망막까지 도달하는 빛 중에서 가장 파장이 짧고 강한 에너지를 갖고 있는 빛을 의미하며, 특히 블루라이트 영역대 중에서 380 ~ 430nm 영역을 바이올렛 라이트(Violet light)로 구분하기도 한다. 관련 논문(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 280, No. 22, Issue of June 3, pp.21061-21066, 2005 "Blue Light Induces Mitochondrial DNA Damage and Free Radical Production in Epithelial Cell")에 따르면, 블루 라이트가 상피 세포의 미토콘드리아 DNA를 손상시키고 활성산소(ROS)를 생성하여, 세포 기능장애, 세포 노화 및 종양 발생을 야기한다고 보고되었다.

또한 그 외의 논문(Journal of Investigative Dermatology (2010) 130, 259 ~ 269 "Blue-Light Irradiation Regulates Proliferation and Differentiation in Human Skin Cells")에서는 412 ~ 453nm 파장의 빛이 각질형성세포(Keratinocytes)와 피부유래 내피세포(Skin-derived endothelial cell)의 증식 및 분화를 규제한다고 보고된 바 있으며, 그 외의 또 다른 논문(PLoS One. 2013 Sep 17;8(9)e73678 "Violet Light Down-Regulates the Expression of Specific Differentiation Markers through Rhodopsin in Normal Human Epidermal Keratinocytes")에서는 블루 라이트 영역대 중에서 바이올렛 라이트(410nm)가 피부의 각질형성세포(Keratinocytes)에서 발현되는 광수용체 중 로돕신의 mRNA를 과발현시켜, CREB(cAMP responsive elementbinding protein)의 인산화를 감소시키고, 특정 각질 세포의 분화 마커인 Keratin-10(K10)과 Keratin-1(K1)의 mRNA 발현 수준을 감소시키게 되어, 인간의 각질형성세포(Keratinocytes)의 분화를 감소시키며, 손상된 피부장벽의 회복을 지연시킨다는 것이 보고된 바 있다.

황칠나무는 높이 15m에 달하고 어린 가지는 녹색이며 털이 없다. 잎은 어긋나고 달걀모양 또는 타원형이다. 또한 잎 가장자리가 밋밋하지만 어린 나무에서는 3~5개로 갈라지고 톱니가 있다. 꽃은 6월에 연한 황록색으로 피고 양성화이며 산형꽃차례에 달린다. 꽃줄기는 길이 3~5cm 이고 작은 꽃줄기는 길이 5~10mm이다. 꽃받침은 5개로 갈라지고 꽃잎과 수술은 5개씩이며 화반에 꿀샘이 있다. 암술머리는 5개로 갈라지고 핵과는 타원형이며 10월에 흑색으로 성숙하고 암술대가 남아 있다. 나무껍질에 상처를 내면 노란 액체가 나오는데 이것을 황칠이라고 하며 가구의 도료로 사용하였다.

종래 황칠나무 추출물은 MMP-1 생성 억제효과, 자외선 유도에 의한 MMP-1 생성 억제효과, 콜라겐 합성 증진 효과, 자외선조사에 의한 세포독성완화효과, 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제 효과 및 피부 주름개선 효과가 있어 각종 기능성 화장료로 사용되어 왔다. 대한민국 공개특허 10-2011-0078527 "황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물"에는 '황칠나무의 잎, 줄기, 가지, 껍질 또는 뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선 및 피부자극완화용 화장료 조성물'이 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 10-2018-0017276 "황칠나무 발효 추출물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물"에는 '황칠나무 수액 또는 황칠나무 잎의 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 미백용 화장료 조성물'이 개시되어 있다.

본 발명자들은 조직배양한 황칠나무의 부정근의 피부개선활성에 대하여 연구하였으며, 그 결과 황칠나무 부정근을 특정 용매로 분획추출하여 얻은 분획추출물을 혼합하여 제조되는 황칠나무 부정근의 분획복합물이 종래의 황칠나무 추출물에 비하여 피부자극이 없으면서도 피부개선활성이 우수하며, 특히 청색광에 의한 피부노화를 방지하는 효과가 우수하다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 조직배양한 황칠나무 부정근의 분획추출물을 유효성분으로 함유하여 우수한 항산화, 피부재생, 보습 및 주름개선활성을 가지는 피부개선용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면 조직배양한 황칠나무 부정근을 용매로 추출한 후 분획용매로써 각각 에틸아세테이트와 물을 사용하여 분획한 분획추출물을 혼합하여 제조되는 황칠나무 부정근의 분획 복합물을 유효성분으로 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물이 제공된다.

이때 상기 황칠나무 부정근의 분획 복합물은 황칠나무의 에틸아세테이트 분획물과 물의 분획물을 2~3:1의 중량비율로 혼합하여 이루어지는 것임을 특징으로 한다.

더욱 바람직하게는 상기 화장료 조성물은 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 나트륨 및 아연으로 이루어지는 미네랄 복합물을 유효성분으로 더욱 포함하는 것임을 특징으로 한다.

이때, 유효성분인 황칠나무 부정근의 분획 복합물과 미네랄 복합물은 1:10의 비율로 혼합되어 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~15 중량% 함유되는 것이 바람직하다.

상기 유효성분인 황칠나무 부정근의 분획 복합물과 미네랄 복합물은 사이클로덱스트린으로 안정화시켜 사용되는 것이 더욱 바람직하다.

상기 화장료 조성물은 청색광(blue light)으로 인한 피부노화의 방지용임을 특징으로 한다. 상기 화장료 조성물은 항산화, 피부 세포보호 및 재생, 피부 주름개선, 피부장벽 개선 또는 피부 보습용임을 특징으로 한다.

본 발명의 황칠나무 부정근 분획 복합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 우수한 피부재생, 피부장벽강화, 보습 및 주름방지와 같은 항노화 효과를 나타내며, 특히 블루라이트에 의한 피부노화를 방지하는 효과가 우수하다.

도 1은 황칠나무 부정근의 용매 분획물별 총 페놀성 화합물의 함량을 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 복합물의 SOD 활성을 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합물을 10% FBS 배지에 처리하고 450nm 파장의 블루라이트를 조사한 직후와 48시간 배양 후의 셀 사진이다.
도 4, 5는 본 발명의 실시예에 따른 복합물의 피부장벽 강화 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 복합물의 MMP-1 발현억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 복합물의 콜라겐 발현 효과를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

본 발명에서는 조직배양한 황칠나무 부정근을 사용한다. 일반적으로 부정근(Adventitious root)은 생물반응기 배양을 통한 바이오매스(biomass) 생산 시 연속적인 증식과 안정적인 공급이 가능한 배양재료이다. 이와 관련하여 "황칠나무의 부정근 유도 및 기내증식조건"(배기화 외, 2009 : 식물생명공학회지 제36권 제2호)에는 황칠나무의 유식물체를 이용하여 각각의 부위에 따른 최적의 부정근 유도조건을 조사하고, 유도된 부정근을 이용하여 옥신의 종류와 IBA의 농도에 따른 부정근의 유도양상을 확인한 결과가 개시되어 있다.

또한 대한민국공개특허 10-2011-0064362 "황칠나무 부정근의 대량생산 방법"에는 '황칠나무 종자를 멸균하여 무균화하는 단계; 1/3 MS배지위에 치상하여 상기 무균화된 황칠나무 종자의 발아를 유도하는 단계; 발아된 황칠나무의 잎 부위를 IBA(Indole-3-butyric acid)가 첨가된 MS 배지위에 치상하여 1차 부정근을 유도하는 단계; 상기 유도된 1차 부정근을 IBA와 슈크로스가 첨가된 MS 액체배지를 이용하여 2차 부정근을 유도하고, 이를 배양하는 단계; 를 포함하여 구성된 황칠나무 부정근 대량 생산방법이 개시되어 있다.

본 발명에 따르면 조직배양한 황칠나무 부정근을 용매로 추출한 후 분획용매로써 각각 에틸아세테이트와 물을 사용하여 분획한 분획추출물을 혼합하여 제조되는 황칠나무 부정근의 분획 복합물을 유효성분으로 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물이 제공된다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 먼저, 조직배양하여 수득한 황칠나무 부정근을 용매로 추출한다. 이때, 상기 용매로는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있고, 바람직하게는 에탄올일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 추출에 있어서 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 가열 추출, 초음파 추출, 냉각 추출 등의 다양한 추출법을 이용하여 추출할 수 있으며, 유효성분이 파괴되지 않고, 활성이 높은 추출물을 얻을 수 있다는 점에서 환류 냉각 추출이 더욱 바람직하다.

이어서 상기 황칠나무 부정근의 용매추출물을 분획 용매를 사용하여 분획물을 제조한다. 본 발명에서는 분획용매로써 헥산, 클로로폼, 에틸아세테이트 및 물을 이용하여 분획물을 제조하였으며, 다시 이들을 다양한 비율로 혼합하여 분획 복합물을 제조함으로써 그 활성을 평가하였다. 그 결과 황칠나무 부정근의 에틸아세테이트 분획추출물과 물의 분획추출물을 혼합하여 제조되는 분획 복합물에서 가장 우수한 피부 개선효과, 특히 청색광 조사에 따른 세포독성의 완화효과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명에 따르면, 바람직하게는 상기 황칠나무 부정근의 분획 복합물은 황칠나무의 에틸아세테이트 분획물과 물의 분획물을 2~3:1의 중량비율로 혼합하여 이루어진다.

또한, 더욱 바람직하게는 상기 화장료 조성물은 유효성분으로서의 상기 황칠나무 부정근의 분획 복합물과 함께, 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 나트륨 및 아연으로 이루어지는 미네랄 복합물을 유효성분으로 더욱 포함하는 것임을 특징으로 한다. 이때, 유효성분인 황칠나무 부정근의 분획 복합물과 미네랄 복합물은 1:10의 비율로 혼합되어 함유되는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 미네랄 복합물은 칼슘 5.0ppm, 마그네슘 1.0ppm , 칼륨 0.5ppm , 나트륨 5.0ppm 및 아연 2.0ppm을 함유한 미네랄 복합물을 사용한다. 미네랄 복합물을 함께 사용하는 경우 상승작용에 의하여 더욱 우수한 항산화효과, 피부장벽강화효과, 피부주름개선효과, 피부재생효과 및 피부보습효과를 나타내었다.

이때, 유효성분으로서의 상기 황칠나무 부정근의 분획 복합물과 미네랄 복합물은 사이클로덱스트린으로 안정화시켜 사용되는 것이 더욱 바람직하다.

상기 화장료 조성물은 특히 청색광(blue light)으로 인한 피부노화의 방지에 우수한 효과를 나타내므로 청색광으로 인한 피부노화방지용으로 사용될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 항산화, 피부 세포보호 및 재생, 피부 주름개선, 피부장벽 개선 또는 피부 보습용으로 사용될 수 있다.

상기 황칠나무 부정근의 분획복합물과 미네랄 복합물은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~30중량% 함유되며, 더욱 바람직하게는 0.001~15중량% 함유된다.

본 발명의 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 화장품 이외에도 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 및 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 및 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 화장료 조성물의 제형은 제한되지는 않으나 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나의 제형으로 적용되어질 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 시험예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니다.

참조예 1: 조직배양한 황칠나무 부정근의 준비

본 발명에 사용된 황칠나무 부정근은 제주식물자원연구소에서 구입한 황칠나무 2년근으로부터 부정근을 유도하여 사용하였다. 상기 부정근은, 성장조절인자(growth regulator)인 인돌부틸산(IBA)과 탄소원인 당(sucrose) 및 비타민류가 함유되어 있는 Murashige & Skoog medium(MS medium, Duchefa, Netherland)을 사용하는 배양방법(한국등록특허 제0842420호 참조)에 기재된 방법으로 조직배양하여 대량증식한 것으로, 사용 전에 건조시켜 사용하였다.

제조예 1~4: 황칠나무 부정근 분획추출물의 제조

건조된 황칠나무 부정근 100g을 75%(v/v)의 에탄올 2L를 첨가하여 60℃에서 2시간 2회 반복 환류 냉각 추출하여 여과한 후, 이를 감압 농축하였다. 하기 표 1의 분획용매를 사용하여 분획추출물을 제조하였다. 먼저 황칠나무 부정근의 에탄올 추출물을 n-헥산과 물을 1:1 비율로 분획깔때기에 넣고 n-헥산층과 물층으로 분획하였고, 물층을 다시 클로로포름과 1:1 비율로 분획 깔때기에 넣고 클로로포름과 물층을 분획하였다. 이 과정과 동일하게 에틸아세테이트를 추가하여 물층과 분획을 실시한 후 농축하여 동결건조기로 동결 건조하였다.

구분	분획 용매
제조예 1	n-헥산
제조예 2	클로로포름
제조예 3	에틸아세테이트
제조예 4	물

시험예 1: 총 페놀성 화합물 함량 측정

고등식물에서 발견되는 천연 항산화 물질 중 가장 많은 부분을 차지하는 것이 페놀 화합물이다. 무기페놀(inorganic phenol)은 독성이 강한 물질이나 페놀분자의 환상구조에 치환기로서 수산기(-OH)가 더해짐에 따라 독성이 저하되고 항산화 활성 및 라디칼 소거 활성 등이 증가하게 된다고 알려져 있다. 황칠나무 부정근의 용매 분획물별 총 페놀성 화합물의 함량을 Folin-Denis 방법으로 측정하였다. 시료 용액(1 mg/mL) 100 μL와 증류수 900 μL를 혼합하고, Folin-Ciocalteau's phenol reagent 100 μL를 가하여 잘 섞은 후 5분간 상온에서 반응시켰다. 여기에 20% Na2CO3 300 μL를 가하여 혼합한 다음 증류수를 가하여 2 mL로 조정하였다. 이 용액을 상온에서 2시간 동안 방치한 후 760 nm에서 흡광도를 측정하였고 gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 이용한 검량선과 비교하여 총페놀 함량을 mg gallic acid equivalents(GAE)/g으로 나타내었다.

그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 알 수 있듯이 황칠나무 부정근 용매별 분획물의 총 페놀성 화합물의 함량은 에틸아세테이트 분획물과 물 분획물에서 높았으며, 에틸아세테이트 분획물에서 가장 높았다.

제조예 5~9: 황칠나무 부정근 분획 복합물의 제조

황칠나무 부정근 추출물의 에틸아세테이트 분획물과 물 분획물을 하기 표 2의 중량비율로 혼합하여 황칠나무 부정근의 분획 복합물을 제조하였다.

구분	혼합 비율
	EA 분획물	물 분획물
제조예 5	1	1
제조예 6	2	1
제조예 7	3	1
제조예 8	5	1
제조예 9	1	2
제조예 10	1	3
제조예 11	1	5

디메틸설폭사이드에 희석하여 제조한 희석용액을 실험에 사용하였다.

시험예 2: 시료의 세포독성 확인 시험

상기 제조예에서 제조된 황칠나무 부정근의 분획 추출물 시료 처리에 의한 피부 세포의 세포독성을 확인하였다. 사람 유래 섬유아세포 2×10⁵ cells/well 의 농도로 96 well plate에 배양하고 10% FBS를 함유하는 IMDM 배지 0.2㎖를 공급한 후 24시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 여기에 DMSO에 녹인 시료용액을 처리 한 다음 24시간 동안 배양하였다. 이후, 세포의 생존력을 알아보기 위하여 MTT assay를 수행하였다. MTT assay는 배양한 세포에 MTT 용액 0.1㎖을 가한 후, 4시간 동안 배양한 다음 배지는 제거하고 DMSO 0.5㎖를 넣어 형성된 포마잔을 ELISA를 사용하여 570㎚에서 흡광도를 측정하였다. 하기 식에 의해 세포생존율(%)을 측정하였으며, 세포의 생존에 영향을 미치지 않는 시료의 농도를 결정하였다. 황칠나무 부정근의 75%(v/v) 에탄올 추출물을 비교예로 하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

세포 생존율(%) = [(St-Bo/(Bt-Bo)] × 100

Bo : 세포배양 배지만을 발색 반응한 웰의 570nm 흡광도

Bt : 시료를 처리하지 않고 발색 반응한 웰의 570nm 흡광도

St : 시료를 처리하고 발색 반응한 웰의 570nm 흡광도

구분	100% 세포 생존 농도(%)
제조예 3	0.05
제조예 4	0.05
제조예 5	0.10
제조예 6	0.50
제조예 7	0.50
제조예 8	0.10
제조예 9	0.10
제조예 10	0.10
제조예 11	0.05
비교예 1	0.005

상기 표 3에서 알 수 있듯이 황칠나무 부정근 추출물의 에틸아세테이트 분획물과 물 분획물이 혼합된 제조예들은 각각의 분획물이나 황칠나무 부정근의 에탄올 추출물에 비하여 세포독성이 낮았다. 그 중에서도 제조예 6과 7의 시료에서 100% 세포생존농도가 0.50%로 세포 독성이 낮아 상대적으로 피부 자극 유발 가능성이 낮고 안전한 것으로 확인되었다.

시험예 3: DPPH 라디칼 소거활성 측정

DPPH법은α,α-디페닐-β-피크릴하이드라질(α,α-diphenyl-β-pycrylhydrazyl) 라디칼의 소거 특성을 이용한 것으로 가장 널리 이용되는 항산화활성 측정 방법 중 하나이며, DPPH는 안정한 라디칼로 시스테인(cysteine) 및글루타치온(glutathione)과 같은 함유황 아미노산과 아스코르브산, 토코페롤, 하이드로퀴논(hydroquinone), 피로갈롤(pyrogallol), 페닐렌디아민(phenylenediamine) 및 아미노페놀(aminophenol)과 같은 방향족 아민 (aromatic amine) 등에 의해서 환원되어 짙은 자색이 탈색되므로 수소공여능 및 유리기 소거작용을 특정하는데 널리 이용되고 있다. 상기 제조예에서 제조된 황칠나무 부정근의 분획물과 그 복합물을 이용하여 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였다. 대조예로 Ascorbic acid를 비교예로 황칠나무 부정근의 에탄올 추출물을 사용하였다.

구분	처리 농도 (%)	항산화 효과(%)
제조예 3	0.10	88.7
제조예 4	0.10	83.0
제조예 5	0.10	89.1
제조예 6	0.10	92.4
제조예 7	0.10	91.6
제조예 8	0.10	86.5
제조예 9	0.10	82.2
제조예 10	0.10	80.1
제조예 11	0.10	74.8
비교예 1	0.10	68.7
Ascorbic acid	0.05	96.1

상기 표 4에서 확인되는 바와 같이 황칠나무 부정근 추출물의 에틸아세테이트 분획물과 물 분획물이 혼합된 분획복합물은 황칠나무 부정근 에탄올 추출물에 비하여 우수한 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었으며, 그 중에서도 제조예 6, 7의 시료에서 DPPH 라디칼 소거능이 가장 높게 나타났다.

시험예 4: 블루라이트 조사에 의한 세포독성완화 효과

사람 유래 섬유아세포 2×10⁵ cells/well의 농도로 96 well plate에 배양하고 10% FBS를 함유하는 IMDM 배지 0.2㎖를 공급한 후 24시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 여기에 DMSO에 녹인 시료용액을 처리 한 다음 450nm의 블루라이트를 120분간 조사한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후, 세포의 생존력을 알아보기 위하여 MTT assay를 수행하였다. MTT assay는 배양한 세포에 MTT 용액 0.1㎖을 가한 후 4시간 동안 배양한 다음 배지는 제거하고 DMSO 0.5㎖를 넣어 형성된 포마잔을 ELISA를 사용하여 570㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 Ascorbic acid를 사용하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

시료농도 (㎍/㎖)	세포 생존율(%)
	0	50	100	500	1000
제조예 3	39.7	43.2	52.5	61.7	74.8
제조예 4	39.7	42.5	51.1	59.9	71.4
제조예 5	39.7	43.8	52.3	62.4	75.7
제조예 6	39.7	46.4	57.7	68.0	79.6
제조예 7	39.7	45.0	55.9	64.3	77.2
제조예 8	39.7	43.3	52.0	60.5	76.0
제조예 9	39.7	44.6	53.8	60.8	75.5
제조예 10	39.7	41.8	50.6	58.2	71.9
제조예 11	39.7	41.2	48.9	55.4	68.8
비교예 1	39.7	40.4	44.7	51.6	62.3
Ascorbic acid	39.7	51.4	62.6	73.8	83.8

상기 표 5에서 확인되는 바와 같이, 황칠나무 부정근 추출물의 에틸아세테이트 분획물과 물 분획물이 혼합된 제조예의 복합물 시료에서 블루라이트(청색광)로 인한 세포독성 완화에 대한 우수한 효과를 나타내었다. 그 중에서도 황칠나무 부정근 추출물의 에틸아세테이트 분획물과 물 분획물이 2:1로 혼합된 제조예 6의 복합물에서 가장 우수한 세포독성 완화 효과를 나타냈다.

실시예 1~4: 황칠나무 부정근 추출물의 분획 복합물과 미네랄 복합물을 혼합한 생장보호복합물 제조

가장 우수한 효과를 나타내는 상기 제조예 6의 분획 복합물에 미네랄 복합물을 하기 표 6과 같은 비율로 혼합하여 복합물(생장 보호 복합물)을 제조하였다. 상기 복합물을 부틸렌글라이콜에 용해시킨 후, 사이클로덱스트린(γ-CD)을 첨가하여 안정화시켜 실험에 사용하였다.

구분	혼합 비율(중량비)
	제조예 6	미네랄 복합물*
실시예 1	1	1
실시예 2	1	2
실시예 3	1	5
실시예 4	1	10
비교예 2	1	-
비교예 3	-	1
*칼슘 5.0ppm, 마그네슘 1.0ppm , 칼륨 0.5ppm , 나트륨 5.0ppm 및 아연 2.0ppm을 함유한 미네랄 복합물

시험예 5: SOD 활성 효과

항산화 효과를 측정하는 방법으로 SOD(Superoxide dismutase) 활성 측정 시험을 하기와 같이 수행하였다.

상기 실시예 및 비교예에서 제조된 복합물의 SOD(Superoxide dismutase) 활성을 측정하였다. HaCaT 세포를 6 well plate에 1×10⁶cells/well의 농도로 분주하여 배양한 후, FBS가 첨가되지 않은 배지로 교체하여 18시간 starvation 시키고, 24시간 동안 배양하였다. HaCaT 세포에 각 시료 0.5(w/v%)씩 처리 한 다음 450nm의 블루라이트를 120분간 조사한 후, 48시간 동안 배양하였다. 이후 세포는 RT-PCR을 이용하여 SOD 발현량을 조사하였다. 대조군으로 Ascorbic acid 50ppm을 사용하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 확인되는 바와 같이, 황칠나무 부정근 추출물의 분획 복합물에 미네랄 복합물을 함께 포함하는 실시예 1~4의 복합물에서 비교예 2, 3에 비하여 더욱 우수한 SOD 활성 효과를 나타냈다. 이는 청색광에 의한 피부노화의 방지효과를 나타내는 것이다. 실시예 4에서 가장 우수한 SOD 활성 효과를 나타내었다.

시험예 6: 생장 보호 복합물 처리 세포 생장 효과

상기 실시예 4의 생장 보호 복합물을 처리한 후 세포의 생장을 관찰하였다. HaCaT 세포를 6 well plate에 1×10⁶cells/well의 농도로 분주하여 배양한 후, 10% FBS가 첨가된 배지로 교체하여 18시간 starvation 시키고, 24시간 동안 배양하였다. HaCaT 세포에 시료 0.5(w/v%)씩 처리 한 다음 450nm의 블루라이트를 120분간 조사한 후, 48시간 동안 배양하였다.

도 3의 (a)는 실시예 4의 생장 보호 복합물을 10% FBS 배지에 처리하고 450nm 파장의 블루라이트를 조사한 직후의 셀 사진이고, (b)는 실시예 4의 생장 보호 복합물을 10% FBS 배지에 처리하고 450nm 파장의 블루라이트를 조사한 후 48시간 배양한 후의 셀 사진이다.

도 3에서 확인되는 바와 같이 블루라이트에 의해 생장이 억제된 세포에 실시예 4의 생장 복합물에 의해 생장이 촉진됨을 확인하였다.

시험예 7: 피부장벽 관련 인자 활성 효과

상기 실시예 및 비교예에서 제조된 복합물의 피부장벽 강화 효과를 확인하기 위해 관련 인자 filaggrin과 loricrin 활성을 측정하였다. HaCaT 세포를 6 well plate에 1×10⁶cells/well의 농도로 분주하여 배양한 후, FBS가 첨가되지 않은 배지로 교체하여 18시간 starvation 시키고, 24시간 동안 배양하였다. HaCaT 세포에 각 시료 0.5(w/v%)씩 처리 한 다음 450nm의 블루라이트를 120분간 조사한 후, 48시간 동안 배양하였다. 이후 배양된 세포에서 RNA를 추출하여 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 filaggrin 및 loricrin 발현량을 조사하였다. 대조군으로 Retinoic acid 50ppm을 사용하였다.

도 4, 5에서 확인되는 바와 같이, 황칠나무 부정근 추출물의 분획 복합물에 미네랄 복합물을 함께 포함하는 실시예 1~4의 복합물에서 비교예 2, 3에 비하여 더욱 우수한 피부장벽 강화 효과를 나타냈다.

시험예 8: MMP-1 생성 억제 효과 시험

섬유아세포(Human Dermal fibroblasts adult)를 10% LSGS가 첨가된 Medium 106 배지를 이용하여 1×10⁶ cell/well로 조절한 후, 12 웰 플레이트(well plate)에 접종하고 18시간 동안 배양하였다. 배양 후, 실시예 및 비교예 각각의 시료를 0.5(w/v%)씩 처리하고, 450nm의 블루라이트를 120분간 조사한 후, 48시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에서 RNA를 추출하여 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 MMP-1의 발현율을 확인하였다. 대조군으로는 아데노신(Adenosine) 50ppm을 사용하였다. MMP-1 발현율을 하기 수학식에 의하여 산출하였다.

MMP-1 발현율(%)=(시료 MMP-1 발현량/ 양성 대조군 MMP-1 발현량) × 100

산출된 MMP-1 발현율을 도 6에 나타내었다. 도 6에서 확인되는 바와 같이, 황칠나무 부정근 추출물의 분획 복합물에 미네랄 복합물을 함께 포함하는 실시예 1~4의 복합물에서 비교예 2, 3에 비하여 더욱 우수한 MMP-1 발현 억제효과를 나타내었으며, 실시예 4의 시료에서 가장 우수한 MMP-1 발현 억제 효과를 나타냈다.

시험예 9: 콜라겐 발현 증가 평가

섬유아세포(Human Dermal fibroblasts adult)를 10% LSGS가 첨가된 Medium 106 배지를 이용하여 1×10⁶ cell/well로 조절한 후, 12 웰 플레이트(well plate)에 접종하고 18시간 동안 배양하였다. 배양 후, 실시예 및 비교예 각각의 시료를 0.5(w/v%)씩 처리하고, 450nm의 블루라이트를 120분간 조사한 후, 48시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에서 RNA를 추출하여 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 콜라겐(Collagen)의 발현 증가율을 확인하였다. 콜라겐 발현 증가율을 하기 수학식에 의하여 산출하였다.

콜라겐 발현율(%)=(시료의 콜라겐 발현량/양성대조군 콜라겐 발현량)×100

산출된 콜라겐의 발현율을 도 7에 나타내었다. 대조군으로는 아데노신(Adenosine) 50ppm을 사용하였다.

도 7에서 확인되는 바와 같이, 황칠나무 부정근 추출물의 분획 복합물과 미네랄 복합물을 함께 포함하는 실시예 1~4의 복합물에서 더욱 우수한 콜라겐 발현율을 나타내었으며, 특히 실시예 4에서 가장 우수한 콜라겐 생성 촉진 효과를 나타내었다.

시험예 10: 피부세포 재생 효과

피부 재생 효과를 확인하기 위해 wound healing assay를 수행하였다. 각질형성세포(HACAT)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1×10⁶ cell/well로 조절한 후, 6 웰 플레이트(well plate)에 접종하고 18시간 동안 배양하였다. 6 웰 플레이트(well plate)에 가득 자란 세포에 스크래치를 내어 세포의 일부분을 플레이트 바닥에서 떨어지게 한 다음, 실시예 및 비교예 각각의 시료를 0.5(w/v%)씩 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 세포가 재생된 정도를 확인하였고, 세포재생율을 하기 수학식에 의하여 산출하였다. 대조군으로는 덱사메타손(Dexamethason)을 사용하였다.

세포재생율(%) = (시료 세포 재생율/대조군 세포 재생율) × 100

산출된 세포재생율을 하기 표 7에 나타내었다.

구분	처리농도(w/v%)	세포재생율(%)
실시예 1	0.5	83.4
실시예 2	0.5	86.3
실시예 3	0.5	89.9
실시예 4	0.5	92.2
비교예 2	0.5	79.5
비교예 3	0.5	64.7
덱사메타손(Dexamethason)	0.5	83.1

상기 표 7에서 확인되는 바와 같이, 황칠나무 부정근 추출물의 분획 복합물과 미네랄 복합물을 함께 포함하는 실시예 1~4의 복합물에서 더욱 우수한 세포 재생효과를 나타내었다.

실시예 5: 생장 보호 복합물을 함유하는 크림 제조

상기 실시예 4의 복합물을 포함한 크림을 하기 표 8의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성 분	함량(중량%)
	대조예 1	실시예 5
생장보호복합물(실시예 4)	-	2.0
친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
스테아릴알콜	2.2	2.2
스테아린산	1.5	1.5
밀납	1.0	1.0
폴리솔베이트 60	1.5	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6	0.6
정화식물유	1.0	1.0
스쿠알란	3.0	3.0
광물유	5.0	5.0
트리옥타노인	5.0	5.0
디메치콘	1.0	1.0
소듐마그네슘실리케이트	0.1	0.1
글리세린	5.0	5.0
베타인	3.0	3.0
트리에탄올아민	1.0	1.0
소듐히아루로네이트	4.0	4.0
방부제, 향, 색소	미량	미량
정제수	잔량	잔량
합계	100	100

시험예 11: 피부 장벽기능 회복 효과

실험은 사람의 상박에 태핑 스티리핑 방법(Taping stripping Method)을 이용하여 피부의 장벽을 손상시킨 후, 표피 수분 손실량(TEWL,transdermal water loss)을 servomed사(스웨덴) evaporimeter EP1으로 측정하여 4.0g/㎡/h에 도달하면, 상기 실시예 5에서 제조한, 본 발명의 생장 보호 복합물을 포함한 크림을 각각을 5 ㎠ 면적에 도포한 후, 표피 수분 손실량을 2시간, 4시간, 6시간, 8시간 경과 후에 측정하여 감소하는 정도를 평가함으로써 장벽기능이 회복되는 정도를 평가하였다. 결과는 초기 손상된 장벽 상태에서의 표피 수분 손실량을 기준(100%)으로 하여 시간에 따른 변화를 비교한 후, 하기 표 9에 나타내었다.

시료	0시간	2시간	4시간	6시간	8시간
대조예 1	84	66	53	49	46
실시예 5	81	48	32	28	26

상기 표 9의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명 생장 보호 복합물을 함유하는 크림 조성물은 이를 함유하지 않은 대조예 1에 비해 우수한 피부 장벽기능 회복을 보였다.

시험예 12: 피부 보습 개선 효과 확인

피부 보습에 대한 임상시험으로 피부 수분 측정기(Corneometer, Courage+Khazaka, GmbH, Germany)를 이용하여 피부전도도를 측정함으로써 피부 보습력을 평가하였다. 피부 수분 측정은 실내온도 20 내지 25 ℃, 상대습도 40 내지 55%로 유지시킨 항온항습 조건 하에서 실시예 5와 대조예 1의 화장료를 10명의 피검자 얼굴을 반으로 나누어 한쪽에는 실시예의 제품을 다른 한쪽에는 비교예의 제품을 도포하면서 2회/1일) 사용 전 및 2주후의 수분 함유량을 측정하였다. 보습력을 하기 표 10에 나타내었다.

구분	초기(D0) 평균	2주(D14) 평균	수분 증가량(%)
대조예 1	32	36	13
실시예 5	33	45	36

상기 표 10에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 생장 보호 복합물을 함유한 실시예 5에서 높은 보습효과를 나타내었다.

실시예 6: 유연 화장수

본 발명의 생장 보호 복합물(실시예 4)을 포함한 유연 화장수를 하기의 표 11의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분(중량%)	실시예 6
생장보호복합물(실시예 4)	2.0
1,3-부틸렌 글리콜	5.2
올레일알코올	1.5
에탄올	3.2
폴리솔베이트 20	3.2
벤조페논-9	2.0
카르복실비닐폴리머	1.0
글리세린	3.5
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

실시예 7: 영양 화장수(밀크로션)

본 발명의 생장 보호 복합물(실시예 4)을 포함한 영양 화장수를 하기의 표 12의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분(중량%)	실시예 6
실시예 4	2.0
글리세린	5.1
프로필렌글리콜	4.2
토코페릴아세테이트	3.0
유동파라핀	4.6
트리에탄올아민	1.0
스쿠알란	3.1
마카다미아너트오일	2.5
폴리솔베이트 20	1.6
솔비탄세스퀴롤레이트	1.6
프로필파라벤	0.6
카르복실비닐폴리머	1.5
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

Claims (7)

1. 조직배양한 황칠나무 부정근을 용매로 추출한 후 분획용매로써 각각 에틸아세테이트와 물을 사용하여 분획한 분획추출물을 혼합하여 제조되는 황칠나무 부정근의 분획 복합물; 및 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 나트륨 및 아연으로 이루어지는 미네랄 복합물을 유효성분으로 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물에 있어서,
   상기 황칠나무 부정근의 분획 복합물은 에틸아세테이트 분획물과 물의 분획물을 2~3:1의 중량비율로 혼합하여 이루어지고,
   유효성분인 상기 황칠나무 부정근의 분획 복합물과 미네랄 복합물은 1:10의 중량비율로 혼합되어 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001 ~ 15 중량% 함유되는 것임을 특징으로 하는 항산화용, 피부 세포 보호 및 재생용, 피부 주름 개선용, 피부 장벽 개선용 또는 피부 보습용 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 유효성분인 황칠나무 부정근의 분획 복합물과 미네랄 복합물은 사이클로덱스트린으로 안정화된 것임을 특징으로 하는 항산화용, 피부 세포 보호 및 재생용, 피부 주름 개선용, 피부 장벽 개선용 또는 피부 보습용 화장료 조성물.
6. 삭제
7. 삭제

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