KR101903657B1 - 예쁜 꼬마선충을 이용한 항노화 효과를 갖는 프로바이오틱스 박테리아의 선발방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 예쁜 꼬마선충(Caenorhabditis elegans)을 이용한 항노화 효과를 갖는 프로바이오틱 박테리아(probiotic bacteria)의 선발방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 수명연장 효능을 나타내는 프로바이오틱 박테리아를 선발하는데 있어서 새로운 실험동물인 예쁜 꼬마선충을 이용하여 매우 신속하고 간편하게 생체 내(in vivo)에서 항노화 효과를 갖는 프로바이오틱 박테리아를 선발하는 방법, 상기 선발방법으로부터 선발된 항노화 효과를 갖는 프로바이오틱 박테리아를 유효성분으로 포함하는 항노화용 건강기능식품을 제공한다.

Description

예쁜 꼬마선충을 이용한 항노화 효과를 갖는 프로바이오틱스 박테리아의 선발방법{A method for screening probiotics having antiaging activity using Caenorhabditis elegans}

본 발명은 예쁜 꼬마선충(Caenorhabditis elegans)을 이용한 항노화 효과를 갖는 프로바이오틱 박테리아(probiotic bacteria)의 선발방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 수명연장 효능을 나타내는 프로바이오틱 박테리아를 선발하는데 있어서 새로운 실험동물인 예쁜 꼬마선충을 이용하여 매우 신속하고 간편하게 생체 내(in vivo)에서 항노화 효과를 갖는 프로바이오틱 박테리아를 선발하는 방법 및 상기 선발방법으로부터 선발된 항노화 효과를 갖는 프로바이오틱 박테리아를 유효성분으로 포함하는 항노화용 건강기능식품을 제공한다.

한국 전통 식품은 건강을 증진시키는 것으로 여겨져 왔으며, 몇몇 발효 산물은 항발암성과 항산화 활성을 나타내는 것으로 알려져 왔다. 전형적으로, 한국 전통 식품은 곰팡이, 세균, 효모를 포함한 미생물의 다양한 군집체와 관련이 있다. 특히, 바실러스(Bacillus) 종은 한국 전통 식품의 발효 과정에서 주요한 역할을 한다. 바실러스 종은 호기성 또는 통성혐기성 대사를 하며, 카탈라아제를 생성하고, 토양, 먼지, 수생환경 등에서 흔하게 분포하는 가장 잘 특징지어진 그람 양성, 내생포자 형성 세균이다. 게다가, 바실러스 섭틸리스(B. subtilis)와 바실러스 리체니포미스(B. licheniformis)는 많은 병원균에 대해 저항성을 나타내고 무독성인 특징을 갖는 ‘일반적으로 안전하다고 볼 수 있는(generally recognized as safe; GRAS)’ 대표품종을 포함한다. 또한, 이 박테리아들은 박테리오신을 포함한 항미생물 물질의 중요한 생산자로 여겨진다. 그러나 바실러스 종의 다양한 건강증진 효과에도 불구하고 중요성과 산업적 가치는 과소평가 되어 왔으며, 적은 수의 음식과 관련된 적용연구들만이 보고되어 왔다. 그러므로 잠재적 프로바이오틱스로서 바실러스 종의 광범위한 사용은 건강상의 이익을 확고히 설립하기 위해 더 많은 과학적 증명을 필요로 할 것이다.

이를 위해 본 발명자들은 한국 전통식품에서 분리한 바실러스 종의 잠재적인 프로바이오틱 활성에 주력해왔다. 또한 본 발명자들은 이전 연구에서 그람 양성 병원균에 대한 특징적 항균 활성을 갖는 잠재적 건강 증진 바실러스 종의 상등액을 검증하였다(J. Microbiol. Biotechnol. 2014, 24, 1105-1108).

프로바이오틱 박테리아는 적절한 양으로 섭취 시 인간의 건강에 유익한 효과를 미치는 살아있는 미생물이다. 프로바이오틱스는 장내 미생물 균총(microbiota), 면역조절, 수명연장에서 긍정적인 조절을 포함하는 유익하고 다양한 건강증진 효과를 갖는다. 이 특징들 중에서도, 프로바이오틱스의 항노화 효과는 수명연장과 건강증진 능력을 갖는 락토바실리(lactobacilli)를 포함한 많은 양의 발효유를 소비하는 불가리아 농부인 메치니코프(Metchnikoff)에 의해 처음 제시되었다. 하지만 현재까지 프로바이오틱스의 항노화 영향에 대한 연구는 숙주의 수명을 결정하기 위한 적절한 실험 모델 선정에 대한 어려움 때문에 부족한 실정이다.

예쁜 꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 생체 내(in vivo) 모델 시스템으로서 작은 크기와 투명한 몸체 때문에 중요한 숙주 모델 생물이 될 수 있다. 이 동물은 윤리적 문제가 없고, 유지비용이 저렴하며 균주선발을 위한 시간과 노동력을 줄일 수 있는 장점을 갖는다. 또한 식이와 수명의 관련성은 박테리아 먹이원의 변경과 관련한 예쁜 꼬마선충(C. elegans)의 수명 평가에서 중요한 고려사항이며, 몇몇 연구는 락토바실리(lactobacilli)와 비피더스균(bifidobacteria)이 선충의 수명연장과 숙주 방어기작을 변경하는 것을 증명하였다.

노화와 숙주의 수명에 관하여 예쁜 꼬마선충(C. elegans)과 박테리아의 상호작용은 복잡하고 많은 요소와 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 이 중 신경전달 물질인 세로토닌은 예쁜 꼬마선충(C. elegans)에서 박테리아 먹이원을 통한 중요한 신호경로로서 오랫동안 제시되어 왔다. 예쁜 꼬마선충(C. elegans)에서 세로토닌 촉진 반응의 통합적 특징은 다양한 내분비물질과 먹이 인식의 결합이다. 세로토닌과 도파민 신호경로는 다양한 포유류와 예쁜 꼬마선충(C. elegans)에서 음식과 관련되는 행동들과 생리작용을 조절한다. 또한, 세로토닌은 다양한 생물학적 과정과 행동을 조절하는 용량 의존적인(dose-sensitive) 신경전달물질이다. 그러나 세로토닌 신호경로의 어떤 기작이 예쁜 꼬마선충(C. elegans)의 면역 반응에서 기능을 나타내는지에 대한 연구는 미흡한 실정이다.

현재까지 제시되어 온 프로바이오틱스의 임상과 동물 연구 결과들은 일관성이 부족하며, 프로바이오틱스의 기능을 결정하데 관여하는 박테리아의 요인과 이 유익한 효과들의 기작 또한 명확하지 않다.

이에, 본 발명자들은 한국 전통 식품에서 분리한 잠재적 항노화 기능성을 갖는 다양한 바실러스 리체니포미스(B. licheniformis)종을 평가하고, 세로토닌 신호경로와 관련한 프로바이오틱 GRAS 종(GRAS strain) 매개 항노화 효과의 근본적인 기작을 측정하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 예쁜 꼬마선충(C. elegans)을 이용한 항노화 효과를 갖는 프로바이오틱 박테리아의 선발방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 선발된 프로바이오틱 박테리아를 유효성분으로 포함하는 항노화용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위해 본 발명은 예쁜 꼬마선충(Caenorhabditis elegans)을 이용한 항노화 효과를 갖는 프로바이오틱 박테리아의 선발방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 선발방법은 (a) 프로바이오틱 박테리아에 예쁜 꼬마선충(Caenorhabditis elegans)을 노출시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 노출시킨 예쁜 꼬마선충을 대장균 생균배지에 옮기는 단계; 및 (c) 예쁜 꼬마선충이 옮겨진 각 배지를 배양한 후 생존율을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계의 프로바이오틱 박테리아는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 종일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계의 예쁜 꼬마선충은 4기 유충단계(Larvae 4 stage; L4 stage)로 동조화(age synchronized worm)된 것일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 선발된 프로바이오틱 박테리아를 유효성분으로 포함하는 항노화용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 선발된 프로바이오틱 박테리아는 세로토닌 신호경로를 매개로 이용하는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 항노화용 건강기능식품은 주류, 빵류, 김치, 젓갈, 고추장, 된장, 간장, 청국장, 치즈, 버터 및 요구르트로 이루어진 군에서 선택되는 발효식품일 수 있다.

본 발명의 예쁜 꼬마선충을 이용한 항노화 효과를 갖는 프로바이오틱 박테리아의 선발방법은 저투자-고효율 생체대체모델인 예쁜 꼬마선충-프로바이오틱스 모델을 제공하며, 상기 선발방법으로 세로토닌 신호경로를 매개로하는 항노화 기능성 프로바이오틱스를 신속하게 생체 내(in vivo)에서 선발할 수 있다.

나아가, 상기 선발방법으로 선발된 프로바이오틱 박테리아는 식품에 첨가하여 항노화용 건강기능식품을 제조하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 예쁜 꼬마선충을 이용하여 선발된 6종의 프로바이오틱 박테리아(B. licheniformis)의 후각 선호도를 나타내는 것이다.
도 2는 본 발명에서 선발된 6종의 프로바이오틱 박테리아(B. licheniformis)에 노출시킨 예쁜 꼬마선충의 생존율을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 예쁜 꼬마선충을 이용하여 선발된 바실러스 리체니포미스(B. licheniformis) 141 균주가 세로토닌 신호경로에 관여하는 유전자를 조절하는 것을 qRT-PCR 분석을 통해 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에서 선발된 바실러스 리체니포미스(B. licheniformis) 141 균주에 의한 예쁜 꼬마선충의 생존율에서 tph-1, bas-1, mod-1, ser -1 유전자들의 영향을 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

상술한 바와 같이, 고령화 시대가 진행됨에 따라 항노화에 대한 관심이 증대되면서 직접적으로 생체 내(in vivo) 모델을 이용하여 항노화 효능을 갖는 프로바이오틱스를 선발하고 그 기작을 규명하려고 하는 연구가 시도되고 있으나, 생체 내(in vivo) 실험의 경우 시간, 노동력, 비용이 많이 요구되며 최근 동물윤리에 대한 관심이 증가하면서 마우스 동물실험을 대체할만한 새로운 생체대체 모델 기술의 필요성이 증가하고 있어 항노화 기능성 프로바이오틱 박테리아를 생체 내(in vivo)에서 간편하고 신속하게 선발할 수 있는 기술이 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 한국 전통 식품으로부터 분리한 잠재적 프로바이오틱 박테리아에 노출시킨 예쁜 꼬마선충 생체대체모델을 이용하여 항노화 효과를 나타내는 박테리아를 선발하는 방법을 제공함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였으며, 본 발명에서 선발한 항노화 기능성 프로바이오틱 박테리아의 노출 여부에 따라 흔히 ‘행복호르몬’으로 알려져 있는 신경전달물질인 세로토닌과 예쁜 꼬마선충의 수명과의 연관성을 확인하여 항노화 효과의 기작을 밝히고자 하였다. 본 발명의 항노화 효과를 갖는 프로바이오틱 박테리아의 선발방법은 저투자-고효율 생체대체모델인 예쁜 꼬마선충-프로바이오틱스 모델을 이용하여 생체 내(in vivo)에서 대규모로 신속하게 박테리아를 선발할 수 있도록 한다.

본 발명은 예쁜 꼬마선충(Caenorhabditis elegans)을 이용한 항노화 효과를 갖는 프로바이오틱 박테리아의 선발방법을 제공한다.

상기 선발방법은 (a) 프로바이오틱 박테리아에 예쁜 꼬마선충(Caenorhabditis elegans)을 노출시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 노출시킨 예쁜 꼬마선충을 대장균 생균배지에 옮기는 단계; 및 (c) 예쁜 꼬마선충이 옮겨진 각 배지를 배양한 후 생존율을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, 예쁜 꼬마선충의 표준 먹이로 사용되는 OP50과 한국전통식품에서 분리한 바실러스 리체니포미스에 대한 예쁜 꼬마선충의 후각 선호도를 측정하기 위해, 예쁜 꼬마선충을 두 박테리아와 같은 거리에 놓이도록 중앙에 위치시키고 2시간 동안 자유롭게 움직이게 한 후 각각의 박테리아 배지에 존재하는 선충을 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 바실러스 리체니포미스와 OP50의 균주에 대한 예쁜 꼬마선충의 선호도에는 유의적인 차이가 없었으며, 또한 예쁜 꼬마선충의 이동, 바디 크기, 브루드 크기(brood size)를 측정한 결과 평가된 모든 기준에 대하여 OP50과 바실러스 리체니포미스(B. licheniformis) 플레이트 사이의 어떠한 차이도 확인할 수 없었다.

이를 통해, 바실러스 리체니포미스는 비병원성 박테리아로, 예쁜 꼬마선충에 대해 좋은 영양원이라는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 선발방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 프로바이오틱 박테리아는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 종일 수 있다.

상기 선발방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 예쁜 꼬마선충은 4기 유충단계(Larvae 4 stage; L4 stage)로 동조화(age synchronized worm)된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, 상기 예쁜 꼬마선충의 후각 선호도 측정으로 선발된 6종의 바실러스 리체니포미스(바실러스 리체니포미스 141, 143, 144, 147, 155 및 156 균주)를 예쁜 꼬마선충에 노출시킴으로써, 본 발명의 항노화 효과를 갖는 프로바이오틱 박테리아 선발방법을 수행하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 선충의 장에서 OP50 대조군과 비교하여 선충의 수명을 약 45% 정도 현저하게 연장하는 바실러스 리체니포미스(B. licheniformis)의 잠재적 프로바이오틱 GRAS 균주 4종(바실러스 리체니포미스 141, 143, 147 및 156 균주)을 동정하였으며, 이들 중 141 균주의 수명 연장 효과가 가장 좋다는 것을 확인하였다.

이를 통해 예쁜 꼬마선충의 수명 연장은 GRAS 바실리로의 조정(conditioning)을 통한 균주 특이적(strain-specific)인 것이며, 바실러스 리체니포미스(B. licheniformis)의 특정 균주의 조정이 예쁜 꼬마선충의 수명을 개선시킨다는 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 항노화 효과를 갖는 프로바이오틱 박테리아의 선발방법에 있어서, (c) 단계에서 측정된 예쁜 꼬마선충의 생존율이 대조 박테리아에 노출시킨 예쁜 꼬마선충의 생존율보다 높은 경우, 항노화 효과를 갖는 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, 선충의 프로바이오틱 GRAS 균주인 바실러스 리체니포미스 먹이원(feeding)에 대한 반응으로, 노화의 기능적 마커로서 신경전달물질 세로토닌 신호경로의 주요 인자인 thp -1, bas-1, mod-1, ser -1, 및 ser -7을 포함하는 유전자 발현을 평가하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 4가지 세로토닌-관련 유전자의 발현 수준이 선충의 나이가 듦에 따라 OP50을 공급한 선충에서 현저하게 감소하였다. OP50으로 일반식이 공급한 선충과는 대조적으로, 141 균주로 조정하는 것은 tph-1, bas-1, mod-1, ser -1, 및 ser -7 유전자의 전사에 강력하게 영향을 미쳤다. 특히, bas-1과 ser -7의 억제된 전사 수준은 OP50과 비교하여 141 균주에 의해 극적으로 회복되었다.

종합하면, 이러한 결과들은 프로바이오틱 GRAS 141 균주로 조정하는 것이 노화에 대한 선충 반응과 관련된 세로토닌 신호경로 유전자의 전사를 특이적으로 자극한다는 것을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 방법으로 선발된 프로바이오틱 박테리아는 세로토닌 신호경로 유전자인 tph-1, bas-1, mod-1, ser -1, 및 ser -7의 전사를 특이적으로 자극함으로써 세로토닌 신호경로를 매개로 하여 항노화 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 선발된 프로바이오틱 박테리아를 유효성분으로 포함하는 항노화용 건강기능식품을 제공한다.

상기 선발된 프로바이오틱 박테리아는 세로토닌 신호경로를 매개로 이용하는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)일 수 있다.

항노화 효과를 목적으로, 본 발명의 상기 프로바이오틱 박테리아 건조 분말 또는 프로바이오틱 박테리아 배양액이 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 프로바이오틱 박테리아 건조 분말 또는 프로바이오틱 박테리아 배양액의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 프로바이오틱 박테리아 건조 분말 또는 프로바이오틱 박테리아 배양액을 포함하는 것 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 상기 프로바이오틱 박테리아 건조 분말 또는 프로바이오틱 박테리아 배양액은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 상기 균주 건조 분말 또는 균주 배양액은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 상기 프로바이오틱 박테리아 건조 분말 또는 프로바이오틱 박테리아 배양액 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 항노화 효과를 갖는 건강기능식품은 유제품, 발효식품, 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 알코올, 음료 및 비타민 복합제로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 발효식품일 수 있다.

상기 발효식품은 유산균이나 효소 등의 미생물을 한 가지 또는 둘 이상 첨가하고 상기 미생물의 발효 작용을 이용하여 만든 식품을 의미하며, 상세하게는 식품 기재에 발표식품용 종균을 첨가하고 숙성시켜 제조하는 식품을 의미한다. 상기 발효식품으로는 주류, 빵류, 김치, 젓갈, 고추장, 된장, 간장, 청국장, 치즈, 버터, 요구르트 등 비살균 개방형 발효식품 모두를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, “식품첨가물”로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 “식품첨가물공전”에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.

이하 첨부된 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 도면과 하기 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

사용균주

바실러스 리체니포미스(B. licheniformis) 종은 전라북도 순창의 된장, 청국장, 고추장 및 간장에서 분리된 것으로, 순창군 발효미생물산업진흥원으로부터 제공받았다. 모든 바실러스 종들은 30℃, 24시간 동안 Luria-Bertani (LB) broth (BD Biosciences, Sparks, MD, USA)에서 200rpm으로 진탕 배양되었다. 선충의 표준 먹이로 사용된 대장균(Escherichia coli strain OP50)은 37℃, 24시간 동안 LB broth에서 225rpm으로 진탕 배양되었다.

식품과 제약 산업에서 광범위하게 이용되며 장내 높게 부착하는 프로바이오틱스로 가장 잘 알려진 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus strain) GG는 37, 24시간동안 De Man, Rogosa, and Sharpe (MRS) broth에서 배양되었다. 장기 보관을 위해 배양액은 저온보호물질(cryoprotectant)내 15% 글리세롤과 함께 -80℃에서 유지 되었다. 모든 균주는 실험 전 2회 계대배양되었다.

예쁜 꼬마선충 먹이를 위한 생균 배지를 준비하기 위해, 세균을 13,000rpm에서 1분 동안 원심분리하고, 멸균한 M9 버퍼(M9 buffer)를 사용하여 2회 세척 후, 13,000rpm에서 1분 동안 원심분리하여 상등액을 완전히 제거하였다. 다음으로 세균을 M9 버퍼에서 μL당 2.5mg (wet weight)의 최종 농도로 조정하였다. 바실러스 리체니포미스(B. licheniformis)종들의 열비활성화를 위해 배양액을 멸균된 M9 버퍼에 세척하고 100℃에서 30분 동안 노출시킨 후 다시 M9 버퍼에 세척 후 NGM 플레이트에 분주하여 생균배지와 같은 방법으로 제조하였다.

예쁜 꼬마선충(C. elegans) 배양

본 실험에 사용한 예쁜 꼬마선충(C. elegans) N2 브리스톨 야생형과 돌연변이 균주 CF512 fer-15(b26)II;fem-1(hc17)IV (fer-15;fem-1 worms), ser-1(ok345)X, tph-1(mg280) , bas-1(ad446) , mod-1(ok103) V 종들은 Caenorhabditis Genetics Center(CGC, St. Paul, MN, USA)에서 제공받아 사용하였다. 특히 fer-15;fem-1 종은 25℃에서 번식하지 않기 때문에 killing assay 실험에 적합하다.

선충의 배양을 위해 5배 농축한 E. coli OP50 배양액을 대략 500 mg이 되도록 Nematode Growth Media(NGM) 플레이트에 균일하게 분주하고 건조시킨 후 예쁜 꼬마선충(C. elegans)을 옮기고 15℃에서 약 4일간 배양하였다. 개체의 밀도가 높은 플레이트를 M9 버퍼를 이용하여 알과 성충 등을 모아 3,500 rpm에서 1분간 원심분리 후 상등액을 제거하였다. 차아염소산나트륨(Sodium hypochlorite)과 5 N NaOH 혼합액을 가하여 약 3분간 흔들어주며 알과 성충을 분리하였고, M9 버퍼를 이용하여 3번 세척하였다. 이 과정을 통해 분리한 알을 25℃에서 하룻밤 동안 로테이션(rotation)하여 부화시켜 L1 단계까지 성장시킨 후, 5배 농축한 E. coli OP50을 분주한 NGM 플레이트에 옮겨, 2일 후 L4 단계가 되도록 동조화(age synchronized worm)시켰다.

박테리아 선호도 측정

박테리아를 M9 버퍼에 현탁하고 각각 20μL를 60mm NGM 한천(agar) 배지에 분주하고 20℃에서 건조시켰다. 예쁜 꼬마선충(C. elegans)을 M9 버퍼로 3회 세척하고 40마리를 먹이원이 되는 두 박테리아와 같은 거리에 놓이도록 배지의 중앙에 옮겼다. 2시간 동안 자유롭게 움직일 수 있도록 한 후, 각각의 박테리아 배지 내에 존재하는 선충을 측정하였다. 박테리아 배지 바깥쪽에 존재하는 선충은 측정되지 않았으며, 연구는 3회 반복으로 수행되었다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 바실러스 리체니포미스와 OP50의 균주에 대한 예쁜 꼬마선충의 선호도에는 유의적인 차이가 없었다.

또한, OP50 또는 바실러스 리체니포미스(B. licheniformis) 플레이트에서 예쁜 꼬마선충의 이동, 바디 크기, 브루드 크기(brood size)를 측정한 결과, 평가된 모든 기준에 대하여 OP50과 바실러스 리체니포미스(B. licheniformis) 플레이트 사이의 어떠한 차이도 확인할 수 없었다(데이터 미도시).

특정 먹이원에 노출하는 것은 먹이의 다음 소비를 변경함으로써 먹이 섭취의 패턴을 형성하는데 중요한 역할을 한다. 따라서, 이러한 결과들은 바실러스 리체니포미스가 비병원성 박테리아로 예쁜 꼬마선충에 대해 좋은 영양원이라는 것을 나타낸다.

예쁜 꼬마선충 수명 측정

예쁜 꼬마 선충에서 바실러스 균주의 수명연장 효과를 연구하기 위해, 유약성충(young adult worms)을 6 종의 서로 다른 바실러스 균주 중 하나를 함유하는 플레이트에 노출시켰다. 예쁜 꼬마선충 fer-15;fem-1 돌연변이체를 위한 일반식이 박테리아인 OP50를 대조군으로 사용하였다.

먼저, 35mm 직경의 NGM 한천 배지위에 20μL 로 농축된 세균을 각각 분주하고 건조시킨 후, L4/유약성충 단계의 N2 야생형, fer-15;fem-1, tph-1, bas-1, mod-1, 또는 ser-1 선충을 옮겼다. 각각의 수명을 측정하기 위해 균주 당 90마리의 선충을 3 배지에 옮겨 연구를 수행하였다(1 배지 당 30마리). 배지를 25℃에서 배양하며 살아있는 선충의 수를 매일 측정하였다. 선충은 죽은 사체를 제외하기 위해 번식 기간 동안 매일, 이후 3일에 한 번씩 새로운 배지로 옮겨 주었다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 OP50 대조군과 비교하여 선충의 수명을 약 45% 정도 현저하게 연장하는 바실러스 리체니포미스(B. licheniformis)의 잠재적 프로바이오틱 GRAS 균주 4종을 선충의 장에서 동정하였다.

상기 테스트된 바실러스 균주들 중, 141 균주가 예쁜 꼬마선충의 수명을 연장하는데 있어서 가장 높은 활성을 나타냈다(OP50을 공급한 유충과 비교하여 p = 0.0095). 또한, N2 야생형 선충에서 141 균주의 수명연장 효과를 확인하였다(OP50을 공급한 유충과 비교하여 141 균주-조정(conditioned) 선충에 대해 p < 0.05)(도 4A).

이러한 결과는 상기 선별된 바실러스 리체니포미스가 생체 내(in vivo)에서 예쁜 꼬마선충의 수명연장에 현저한 영향을 미친다는 것을 나타낸다.

또한, GRAS 바실러스 종과 유사한 바실러스 섭틸리스(B. subtilis) ATCC 6633을 예쁜 꼬마선충 수명연장 어세이(assay)에 사용하였다. 이전의 보고에 따르면, 바실러스 섭틸리스(B. subtilis)가 공급된 토양에서 자란 유충은 OP50 또는 다른 박테리아 종을 공급하여 자란 유충보다 더 긴 수명을 나타낸다.

도 2에서 확인되는 바와 같이, 바실러스 섭틸리스(B. subtilis) ATCC 6633은 놀랍게도 예쁜 꼬마선충의 수명에 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과와 일치하여, 바실러스 리체니포미스 144 및 155 균주는 바실러스 리체니포미스 141, 143, 147 및 156 균주와 비교하여 선충의 수명에 영향을 미치지 않았다. 따라서, 예쁜 꼬마선충의 수명 연장은 GRAS 바실리로의 조정(conditioning)을 통한 균주 특이적(strain-specific)인 것으로 여겨진다. 이러한 결과는 바실러스 리체니포미스(B. licheniformis)의 특정 균주의 조정이 예쁜 꼬마선충의 수명을 개선시킨다는 것을 나타낸다.

실시간 중합효소연쇄반응 정량검사 (Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction; qRT-PCR)

신경신호경로는 예쁜 꼬마선충의 수명 연장과 관련이 있으며, 특히 세로토닌이 tph-1(트립토판 하이드록실라아제를 코딩), bas-1(세로토닌- 및 도파민-합성 방향족 아미노산 데카르복실라아제를 코딩), mod-1(세로토닌-통로 클로라이드 채널; serotonin-gated chloride channel을 코딩), 및 ser-1(세로토닌 수용체 코딩)을 포함하는 세로토닌 신호경로에 대한 변이체의 분석을 통해 대규모로 정립된 행동 조절에 역할을 하는 것으로 보고되었다. 명백하게, 세로토닌 수준은 예쁜 꼬마선충이 나이가 들수록 현저하게 감소하고, 예쁜 꼬마선충의 식이가 적어도 부분적으로 높은 세로토닌 수준을 지속함으로써 나이든 유충의 건강한 행동(healty behaviors)에 영향을 미친다. 더욱이, 최근 연구에서는, 면역 반응이 없을 때에도 위장관에서 박테리아가 중추신경계와 소통하는 것으로 보고되었다.

이에 본 발명자들은, 장관면역이 예쁜 꼬마선충과 연관된 특이적 면역인자인 신경전달물질 세로토닌을 상승조절하는 프로바이오틱 바실러스 리체니포미스(B. licheniformis)로 조정된 후 더욱 효율적일 것이라는 가정하고, 선충의 프로바이오틱 GRAS 균주인 바실러스 리체니포미스 섭식(feeding)에 대한 반응으로, 노화의 기능적 마커로서 신경전달물질 세로토닌 신호경로의 주요 인자인 thp-1, bas-1, mod-1, ser-1, 및 ser-7을 포함하는 유전자 발현을 평가하였다.

구체적으로, 바실러스 리체니포미스(B. lucheniformis) 수명연장 인자가 세로토닌 신호경로와 관련이 있는지 결정하기 위해, 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)을 이용하여 141 균주에 하루 동안(어린 선충) 노출시키거나, 6, 9 또는 12일 동안(나이 든 선충) 노출시킨 예쁜 꼬마선충에서 상기 유전자들의 전사를 조사하였다(도 3).

선충의 총 RNA 는 TRIzol reagent(Invitrogen)를 사용하여 신속하게 분리되었고, RNase-free DNase(Qiagen)와 함께 on-column DNase digestion step을 포함한 RNeasy Mini Kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)을 사용하여 정제되었다. 총 RNA의 품질은 Agilent 2100 bioanalyzer를 사용하여 평가되었고, 분석에 앞서 -80℃에 보관되었다.

총 RNA의 50ng은 SuperScript Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 qRT-PCR 분석을 위해 사용되었다. qRT-PCR 은 StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 수행되었다. 아래와 같이 기재된 프라이머들은 Primer3Input Software (v0.4.0)를 사용하여 설계되었다. 상대적 유전자 발현량은 2^-△Ct 방법을 이용하여 산출되었다.

조절 유전자인 snb-1 (forward 5'-CCGGATAAGACCATCTTGACG-3' 및 reverse 5'-GACGACTTCATCAACCTGAGC-3')은 유전자 발현 자료를 정상화하기 위해 사용되었다. 시료의 유전자형을 확인하기 위해 프라이머는 다음과 같이 사용되었다: tph-1 (forward 5'-AAGAGGCCCAGCAGAAACTC-3' 및 reverse 5'-ATGGAACGGGAGTTGTTGAG-3'), bas-1 (forward 5'- GGCTGCTGAATTCTCCAAGT-3' 및 reverse 5'-CTTCTCATTATCCGCGTTGG-3'), mod-1 (forward 5'-GAAGCAACGGGTATGCAA-3' 및 reverse 5'-CCGTTTCGATGAAGTGATCC-3'), ser-1 (forward 5'-AAGAGCCAGTCGCCAGAAC-3' 및 reverse 5'-GTGGTTGATGCCTCTGTCGT-3'), ser-7 (forward 5'-TGCTAGCACTGTGGTTAGGC-3' 및 reverse 5'-GTAGCACAGCGACAAGCAAG-3').

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 4가지 세로토닌-관련 유전자의 발현 수준은 선충이 나이 듦에 따라 OP50을 공급한 선충에서 현저하게 감소하였다. OP50으로 일반식이 공급한 선충과는 대조적으로, 141 균주로 조정하는 것은 tph-1, bas-1, mod-1, ser-1, 및 ser-7 유전자의 전사에 강력하게 영향을 미쳤다. 특히, bas-1과 ser-7의 억제된 전사 수준은 OP50과 비교하여 141 균주에 의해 극적으로 회복되었다.

종합하면, 이러한 결과들은 프로바이오틱 GRAS 141 균주로 조정하는 것이 노화에 대한 선충 반응과 관련된 세로토닌 신호경로 유전자의 전사를 특이적으로 자극한다는 것을 나타낸다.

상기의 결과는 TPH-1, BAS-1, MOD-1, 및 SER-1 신호경로가 141 균주로 조정하는 것을 통해 항노화 및 면역자극과 연관되어 있다는 가정을 뒷받침한다. 이러한 가정을 추가로 조사하기 위해, 기능상실 변이체 또는 N2 야생형 유충으로 킬링 어세이(killing assay)를 수행하여 141 균주로 조정한 후 TPH-1, BAS-1, MOD-1, 및 SER-1 신호경로가 예쁜 꼬마선충과 직접적으로 연관이 있다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 도 3의 qRT-PCR 결과와 일치한다. 구체적으로, tph-1, bas-1, mod-1, 또는 ser-1이 결여된 유충은 141 균주로 조정하더라도 여전히 노화에 민감했다(도 4B, 4C, 4D 및 4E).

정반대로, 141 균주는 tph-1, bas-1, mod-1, 또는 ser-1 유전자가 삭제된 유충의 수명에 영향을 미치지 않았으나, N2 야생형은 141 균주를 공급함에 따라 현저하게 연장된 수명을 나타냈다(p < 0.0001)(도 4).

종합하면, 이러한 결과들은 세로토닌 신호경로가 프로바이오틱 GRAS 141 균주와 관련하여 예쁜 꼬마선충의 수명을 결정하는데 중요한 역할을 한다는 것을 나타내며, 바실러스 리체니포미스 141 균주에 노출시킨 후 세로토닌-관련 신호경로의 전사조절이 노화를 포함한 다양한 행동을 변경할 수 있는 특이적 신호를 장 환경에서 제공한다는 것을 나타낸다(도 3 및 4).

평균수명 증가로 인한 고령화 현상에 따라 다양한 근원에서 건강증진을 위한 항노화 기능성 프로바이오틱스 균주를 선발하는 노력이 계속되고 있지만 현재까지 예쁜 꼬마선충을 이용하여 선발된 항노화 효과를 갖는 기능성 프로바이오틱스 균주를 산업에 적용한 예는 없었다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명은 수명연장 효과를 갖는 항노화용 건강기능식품, 특히 유제품 생산을 위한 프로바이오틱스 균주 선발기술을 포함하여 식품 및 유가공산업의 전 분야에 적용이 가능할 것으로 판단되며, 본 발명의 내용에 따라 바실러스 리체니포미스(B. licheniformis) 매개 세로토닌 신호경로는 잠재적 치료 표적으로, 노화 관련 건강 문제들을 예방하기 위한 의료 산업의 기초적 이용 자료로서 가치가 있다.

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> A method for screening probiotics having antiaging activity using Caenorhabditis elegans <130> 1060314 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> snb-1 forward primer <400> 1 ccggataaga ccatcttgac g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> snb-1 reverse primer <400> 2 gacgacttca tcaacctgag c 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tph-1 forward primer <400> 3 aagaggccca gcagaaactc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tph-1 reverse primer <400> 4 atggaacggg agttgttgag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bas-1 forward primer <400> 5 ggctgctgaa ttctccaagt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bas-1 reverse primer <400> 6 cttctcatta tccgcgttgg 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mod-1 forward primer <400> 7 gaagcaacgg gtatgcaa 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mod-1 reverse primer <400> 8 ccgtttcgat gaagtgatcc 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ser-1 forward primer <400> 9 aagagccagt cgccagaac 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ser-1 reverse primer <400> 10 gtggttgatg cctctgtcgt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ser-7 forward primer <400> 11 tgctagcact gtggttaggc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ser-7 reverse primer <400> 12 gtagcacagc gacaagcaag 20

Claims (7)

1. (a) 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)를 포함하는 배지에 4기 유충 단계(Larvae 4 stage; L4 stage)로 동조화된(age synchronized worm) 예쁜 꼬마선충(Caenorhabditis elegans)을 노출시키는 단계;
   (b) 대장균을 포함하는 배지에 4기 유충 단계로 동조화된 예쁜 꼬마선충을 노출시키는 단계;
   (c) 상기 (a) 단계 및 (b) 단계의 예쁜 꼬마선충의 수명을 측정하는 단계; 및
   (d) 상기 (a) 단계의 예쁜 꼬마선충의 수명이 상기 (b) 단계의 예쁜 꼬마선충의 수명보다 45% 이상 연장된 경우, 항노화 효과를 갖는 프로바이오틱 박테리아(probiotic bacteria)로 선발하는 단계;를 포함하며,
   상기 항노화 효과를 갖는 것으로 선발된 프로바이오틱 박테리아는 tph-1, bas-1, mod-1, ser-1 및 ser-7 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 것인, 예쁜 꼬마선충(Caenorhabditis elegans)을 이용한 항노화 효과를 갖는 프로바이오틱 박테리아(probiotic bacteria)의 선발방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항의 방법으로 선발된 프로바이오틱 박테리아를 유효성분으로 포함하는 항노화용 건강기능식품으로, 상기 선발된 프로바이오틱 박테리아는 tph-1, bas-1, mod-1, ser-1 및 ser-7 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시킴으로써 세로토닌 신호경로를 매개로 하여 항노화 효과를 나타내는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)인 것인, 항노화용 건강기능식품.
6. 삭제
7. 제5항에 있어서, 상기 항노화용 건강기능식품은 주류, 빵류, 김치, 젓갈, 고추장, 된장, 간장, 청국장, 치즈, 버터 및 요구르트로 이루어진 군에서 선택되는 발효식품인 것을 특징으로 하는 건강기능식품.

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