KR100825863B1 - 예쁜꼬마선충을 이용한 항균 화합물의 스크리닝 방법 - Google Patents

예쁜꼬마선충을 이용한 항균 화합물의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)을 이용한 항균성 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 항균 후보 물질을 첨가하여 배양한 병원성 대장균을 먹이로 하여 예쁜꼬마선충을 배양한 후 측정한 예쁜꼬마선충의 생존율을 지표로 항균성 물질을 신속하고 간단하게 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
예쁜꼬마선충, 항균성 물질, 병원성 대장균, 스크리닝 방법

Description

예쁜꼬마선충을 이용한 항균 화합물의 스크리닝 방법 {A method for screening antibacterial compound using Caenorhabditis elegans}
도 1은 대장균 접종 후 예쁜꼬마선충의 생존율을 나타내는 그래프로서, 비병원성 대장균인 OP50 섭취군의 생존율(◆), 병원성 대장균인 O-157:H7 ATCC 43894 섭취군의 생존율(■), 병원성 대장균인 O-157:H7 ATCC 43888 섭취군의 생존율(▲), 및 병원성 세균인 살모넬라 티피무리움(S. Typhimurium) ATCC 13311 섭취군의 생존율(×)이고,
도 2는 녹색형광단백질(GFP: Green Fluorescent Protein)을 발현하도록 형질전환된 대장균을 섭취한 예쁜꼬마선충의 장내사진으로, 비병원성 대장균인 OP50 섭취군의 장내사진(A), 병원성 대장균인 O-157:H7 ATCC 43888 섭취군의 장내사진(B), 및 병원성 대장균인 O-157:H7 ATCC 43894 섭취군의 장내사진(C)이고,
도 3은 대장균 또는/및 항균물질의 섭취 후 예쁜꼬마선충의 생존율을 나타낸 그래프로서, 비병원성 대장균인 OP50 섭취군의 생존율(◆), 병원성 대장균인 O-157:H7 ATCC 43894 섭취군의 생존율(■), 및 병원성 대장균인 O-157:H7 ATCC 43894 및 EGCG 섭취군의 생존율(▲)이다.
본 발명은 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)을 이용한 항균 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 항균 후보 물질을 첨가하여 배양한 병원성 대장균을 먹이로 하여 예쁜꼬마선충을 배양한 후 측정한 예쁜꼬마선충의 생존율을 지표로 항균성 물질을 신속하고 간단하게 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
대장균 혈청형 O-157:H7은 출혈성 대장염, 용혈성 요독증 및 혈전성 혈소판 감소성 자반증 등의 심각한 질병을 야기한다. 대장균 O-157:H7에 감염되는 인구가 증가되고 있으며, 인간 감염의 주요 원인이 감염된 음식, 물, 가축과의 직접 접촉 및 사람 대 사람에 의한 전염에 의한 것임이 밝혀져있다.
인체에 질병을 일으키는 병원균에 대한 항균 화합물의 탐색은 예전부터 활발히 진행되어져 왔다. 일반적으로 인체 세포주를 대상으로 시험관 내에서 약제의 활성(세포독성)을 조사한 후, 활성이 있는 화합물을 대상으로 실험동물을 사용하여 화합물의 독성 및 효능을 조사하여, 독성이 없고, 활성이 우수한 화합물질을 대상으로 최종적으로 임상실험을 실시하는 것이 일반적이다 (Skehan P 등, J. Natl . Cancer Inst. 82(13): 1107-12, 1990). 상기 실험동물로는 랫트 및 마우스 모델이 인체 대체 모델로써 각광을 받아왔다. 하지만 상기의 동물 모델들은 윤리적 및 비용적인 문제로 인하여 사용에 있어 제한을 받아왔다. 최근에 병원균의 감염에 대한 모델로서 크기가 작으면서 윤리적인 문제를 피할 수 있는 동물모델이 주목받고 있으며, 그중의 하나가 예쁜꼬마선충을 사용한 모델이다.
예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 흙에서도 자유롭게 사는 선충의 일종으로, 성체의 길이가 약 1㎜이고 자웅동체이지만 웅체도 존재한다. 70년대에 실험모델로 이용되기 시작한 이래, 발생 단계가 비교적 단순할 뿐만 아니라 수정란에서 성체에 이르기까지 세포분열 양상이 각 개체마다 동일하고, 투명한 몸체를 지녀 그 과정을 현미경으로 모두 관찰할 수 있으며, 수명주기가 빠르고, 배양하기 쉬우며, 또한 냉동보관이 가능하여 조작 용이성이 뛰어나 널리 이용되고 있으며, 99년 게놈 프로젝트가 완료되어 6개의 염색체 지도와 염기서열로의 접근이 용이하다는 장점이 있다.
예쁜꼬마선충을 살모넬라의 모델 숙주로서 이용한 연구가 소수의 팀들에 의해 진행되고 있지만 (Labrousse A 등, Curr . Biol . 10(23): 1543-5, 2000), 항균물질의 탐색을 위한 시스템으로 사용한 예는 국내외적으로 전무하다.
이에, 본 발명자들은 병원성 세균을 섭취하였을 때 예쁜꼬마선충이 정상보다 빨리 사멸하는 점에 착안하여, 항균 화합물을 첨가하여 배양한 상기 세균을 예쁜꼬마선충의 먹이로 제공한 결과, 예쁜꼬마선충의 생존율이 증가하는 것을 확인함으로 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 예쁜꼬마선충을 이용한 항균 화합물의 신속하고 간단한 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적의 달성을 위하여, 본 발명은 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)을 이용하여 항균성 물질을 스크리닝하는 방법으로서, 병원성 대장균에 스크리닝하고자 하는 대상 물질을 첨가하여 배양하는 제1 단계; 상기 제1 단계에서 배양한 병원성 대장균과 예쁜꼬마선충을 함께 배양하는 제2 단계; 및 상기 제2 단계에서 배양한 예쁜꼬마선충의 생존율을 측정하는 제3 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항균성 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본원에서 정의되는 병원성 대장균은, 바람직하게는 대장균(Escherichia coli) O-157:H7이다.
상기의 방법에 따라, 본 발명자들은 공지된 항균화합물인 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)를 첨가하여 배양한 병원성 대장균 O-157:H7 ATCC 43894을 예쁜꼬마선충의 먹이로 제공하였을 때, 예쁜꼬마선충의 생존율이 증가하는 것을 확인하였다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
(1) 예쁜꼬마선충 및 세균 배양
선충유전센터 (Caenorhabditis Genetic Center, CGC, USA)에서 정상의 예쁜꼬마선충인 N2를 입수하여 NGM 고체배지 (염화나트륨 3g/L, 아가 17g/L, 박토 펩톤 25g/L, 1M 황산마그네슘 1㎖/L, 1M 인산칼륨 25㎖/L, 1M 염화칼슘 1㎖/L, pH6.0)에 비병원성 대장균 OP50 균주를 도말한 것을 먹이로 공급하며 25℃에서 배양하였다. 비병원성 대장균 OP50과 병원성 대장균 O-157:H7 ATCC 43888, O-157:H7 ATCC 43894 및 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) ATCC 13311은 American Type Culture Collection(USA)에서 분양받아 LB배양액 (Luria-bertani broth; 트립톤 10g/L, 효모추출물 5g/L, 염화나트륨 10g/L)을 이용하여 37℃에서 배양하였다.
(2) 병원성 세균 감염에 의한 예쁜꼬마선충의 생존율 변화
상기 실시예(1)에서 준비한 예쁜꼬마선충에게 비병원성 대장균 OP50과 병원성 대장균 O-157:H7 ATCC 43888, O-157:H7 ATCC 43894 및 살모넬라 티피무리움 ATCC 13311를 먹이로 제공하고 14일 동안 배양하며 생존율을 관찰하여 도 1에 나타내었다. LB배양액에서 하룻밤 키운 비병원성 대장균 OP50과 병원성 대장균 O-157:H7 ATCC 43888, O-157:H7 ATCC 43894 및 살모넬라 티피무리움 ATCC 13311을 계수하여 각각 같은 수(1×109)의 세균을 NGM 배지에 도말하였다. 이때, 예쁜꼬마선충의 개체간의 차이를 줄이기 위해 한 모체에서 나온 알로부터 선충을 회수하여 세균들이 도말된 NGM 배지 위에 옮기고 25℃에서 배양하면서 매일 현미경을 통해 살아 있는 선충의 개수를 계수하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 비병원성 OP50에 감염된 예쁜꼬마선충에 비해 병원성 세균에 감염된 예쁜꼬마선충들은 낮은 생존율을 나타냄을 확인할 수 있다.
상기의 낮은 생존율이 상기 세균의 감염에 의한 것인지 확인하기 위해서, 비병원성 대장균 OP50과 병원성 대장균 O-157:H7 ATCC 43888 및 O-157:H7 ATCC 43894를 일렉트로포레이터(electroporator)를 이용하여 녹색형광단백질 (GFP, green fluorescence protein)을 발현하는 플라스미드로 형질전환시킨 뒤 GFP가 발현되는지를 확인하고, GFP 유전자로 형질전환된 비병원성 대장균 OP50과 병원성 대장균 O-157:H7 ATCC 43888 및 O-157:H7 ATCC 43894을 예쁜꼬마선충의 먹이로 제공하고, 48시간 후에 형광 현미경(TE2000-U, NIKON, JAPAN)으로 관찰하였으며(400 배 배율), 촬영하여 하기 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 형광단백질의 발현양상으로 병원성 및 비병원성 대장균 모두가 장내에 서식하고 있음을 확인할 수 있다. 그러나, 도 1의 생존율로 미루어 볼 때, 대장균 O-157:H7 ATCC 43888 및 O-157:H7 ATCC 43894가 예쁜꼬마선충을 급격하게 사멸시킬 수 있는 병원성 세균임을 확인할 수 있고, 따라서 예쁜꼬마선충은 상기 세균들의 병원성을 확인할 수 있는 모델임을 알 수 있다.
(3) 항균성 물질 처리 및 예쁜꼬마선충의 생존율 측정
비병원성 대장균 OP50과 병원성 대장균 O157:H7 ATCC 43894 각각을 녹차 유래의 화합물인 EGCG(Epigallocatechin gallate, E4143, SIGMA, USA)를 첨가해서 배 양하였다. LB 배지에 최종농도 100 ㎍/ml가 되도록 EGCG를 첨가하고 비병원성 및 병원성 대장균을 첨가하고 하룻밤 배양한 뒤 계수하고, 같은 수(1×109)의 상기 대장균을 100 ㎍의 EGCG를 도말해 놓은 NGM 배지위에 각각 올려놓았다. 이러한 NGM 배지위에 예쁜꼬마선충을 옮겨서 배양하며 예쁜꼬마선충의 생존율을 측정하여 예쁜꼬마선충의 생존율을 측정하여 하기 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 비병원성 대장균 OP50 섭취군은 EGCG의 첨가에 대해 생존율이 거의 영향을 받지 않았다. 하지만 병원성 대장균 O157:H7 ATCC 43894 섭취군은 EGCG의 첨가에 의해 예쁜꼬마선충의 생존율이 급격히 증가한 것으로 나타났다. 상기의 결과로, EGCG는 병원성 세균 O157:H7 ATCC 43894의 병원성을 감소시키는 항균화합물임을 확인할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 탐색방법은 항균 후보 물질을 첨가하여 배양한 병원성 대장균을 예쁜꼬마선충에 섭취시켜 배양하여 측정한 예쁜꼬마선충의 생존율을 지표로 항균성 물질을 신속하고 간단하게 탐색하는데 이용될 수 있다.

Claims (2)

  1. 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)을 이용하여 항균성 물질을 스크리닝하는 방법으로서,
    병원성 대장균에 스크리닝하고자 하는 대상 물질을 첨가하여 배양하는 제1 단계;
    상기 제1 단계에서 배양한 병원성 대장균과 예쁜꼬마선충을 함께 배양하는 제2 단계; 및
    상기 제2 단계에서 배양한 예쁜꼬마선충의 생존율을 측정하는 제3 단계를 포함하며,
    상기 병원성 대장균은 대장균 O-157:H7인 것을 특징으로 하는 항균성 물질의 스크리닝 방법.
  2. 삭제
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