KR101900407B1

KR101900407B1 - 안티-폴루션 효과를 가지는 화장품 조성물

Info

Publication number: KR101900407B1
Application number: KR1020160129189A
Authority: KR
Inventors: 강은미
Original assignee: 주식회사 야다
Priority date: 2016-10-06
Filing date: 2016-10-06
Publication date: 2018-09-20
Also published as: KR20180038280A

Abstract

본 발명은 베타-글루칸, 지모의 뿌리줄기 추출물 및 소듐폴리글루타메이트를 유효성분으로 포함하여 황사와 미세먼지에 의해 유발된 염증 등의 피부 트러블을 완화시키는 안티-폴루션효과를 가진 화장품 조성물에 제공한다.

Description

안티-폴루션 효과를 가지는 화장품 조성물{Cosmetic composition having effect of anti-pollution}

본 발명은 황사와 미세먼지와 같은 대기의 유해 요인에 의해 유발된 염증 등의 피부 트러블을 방지하고 완화시키는 안티-폴루션효과를 가지는 화장품 조성물에 관한 것이다.

피부에서의 염증반응(inflammatory response)은 물리적 자극이나 화학 물질, 세균 등에 의해 피부손상이 유발될때 이를 방어하기 위한 작용으로서 시작되며, 이에 대한 반응으로 keratinocyte(각질형성세포) 또는 Langerhans cell(랑게스한스 세포)에서는 다양한 종류의 cytokine을 내보냄으로써 염증반응이 시작되는데, 인터루킨-8(Interleukin-8;IL-8), 인터루킨-6(Interleukin-6;IL-6), 인터루킨-1(Interleukin-1;IL-1), 종양 괴사인자-α(Tumor necrosis factor-α; TNF-α) 등이 대표적이며, 이들로 인해 활성화된 대식세포(macrophage)는 일산화질소(nitricoxide;NO)나 프로스타글란딘 (prostaglandin) E2 (PGE2)를 과도하게 생성하여 염증 과정을 더욱 심화시킨다.

미세먼지는 입자크기 10㎛ 이하인 먼지를 통칭하고 PM10(Partic㎕ate Matter 10)으로 약칭하며, 2.5㎛이하의 초미세먼지인 PM2.5(Partic㎕ate Matter 2.5)로 구분된다. 주로 화석연료를 연소할 때 발생하며, 석탄의존도가 70%인 중국발 미세먼지가 상당부분을 차지한다. 또한, 황사는 중국이나 몽골 등 아시아 대륙의 중심부에 있는 사막과 황토 지대의 작은 모래나 황토 또는 먼지가 하늘에 떠다니다가 상층 바람을 타고 멀리 날아가 떨어지는 현상을 말하며 장거리 이동성 대기오염물질로 제주도까지 이동이 가능하다.

산업국가 질병의 약 25 ~ 33%가 환경 위해 요인에 의해 발생하며, 유럽에서는 오염된 공기로 연간 약 31만 명이 조기에 사망하는 것으로 추정되고 있으며, 미국 암학회에서는 초미세먼지가 m³ 당 10㎍ 증가할 경우 전체 사망률은 7% 증가한다는 연구결과가 발표되었다. 2013년 환경부의 공동연구 결과(Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132(2), 2013, 495-498)에 따르면, 미세먼지 또는 대기오염물질의 농도가 상승할 시 피부염의 증상이 더욱 악화되는 것으로 나타났다.

미세먼지(PM10)가 1㎍/m³증가할 때마다 피부염의 증상이 평균 0.4% 증가하였고, 대기오염물질 중 하나인 총 휘발성유기화합물(TVOC)과 벤젠이 0.1ppb씩 증가할수록 증상이 각각 평균 2.59%, 2.74% 증가하였다. 또한 황사가 발생하면 흙먼지가 대기를 황갈색으로 오염시켜 대기의 먼지 양이 평균 4배나 증가하여, 피부가 쉽게 지치고 생기를 잃기 쉽다. 또한 황사 먼지는 일반 먼지보다 입자가 작아 피부 모공 속에 깊숙이 들어가 피부 트러블을 일으킬 수 있으며, 피부 건조증, 자극성 피부염, 알레르기 피부염, 여드름, 기미, 주근깨 등 각종 증상을 더욱 악화시킨다. 따라서, 황사와 미세먼지에 의해 유발된 피부염 발생은 증가할 것으로 판단되며, 황사와 미세먼지에 의해 유발된 피부 염증 반응을 완화할 수 있는 소재에 대한 필요성은 증가될 것이다.

피부 염증을 치료하기 위하여, 스테로이드제가 주로 이용되고 있지만 장기간 투여 시 피부의 위축이나 성장 지연 가능성 등 여러 가지 부작용을 일으키고 있어 최근에는 비-스테로이드제의 사용이 증가하고 있다. 그러나 비-스테로이드제 역시 홍반, 가려움 등의 증상과 면역력 약화 등의 부작용을 나타내고 있어 피부염의 원천적 치료가 어려운 실정이다. 따라서, 안전성이 입증된 천연물 유래 소재로부터 치료효과가 높고 부작용이 적은 새로운 물질을 찾고자 하는 연구가 많이 이루어지고 있다. 대표적으로 마가목 추출물(등록특허 10-0563548), 오배자 추출물(등록특허 10-1309172), 스피루리나 추출물(공개특허 10-2009-0079468), 해방풍 추출물(등록특허 10-0919852) 등이 있으나, 황사와 미세먼지에 의해 유발되는 염증 등의 피부트러블을 완화해주는 효과를 가진 추출물은 개발되지 않았다.

따라서, 안전성이 입증된 천연물 유래 소재로부터 치료효과가 높고 부작용이 적은 새로운 물질의 필요성이 증가하고 있으나, 아직 황사와 미세먼지에 의해 유발되는 염증 등의 피부 트러블을 완화해주는 효과를 가진 천연물 유래 소재에 관한 연구결과는 아직 필요한 실정이다.

1. 대한민국 등록특허 제10-0563548호 2. 대한민국 등록특허 제10-1309172호 3. 대한민국 공개특허 제10-2009-0079468호 4. 대한민국 등록특허 제10-0919852호

따라서, 본 발명의 해결하려는 과제는 황사와 미세먼지와 같은 대기의 유해 요인으로부터 유발되는 피부 염증 등의 피부 트러블을 방지하고 완화해주는 안티-폴루션 효과를 보이는 화장품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은,

베타-글루칸, 지모의 뿌리줄기 추출물 및 소듐폴리글루타메이트를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 안티-폴루션(anti-pollution) 효과를 가지는 화장품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 안티-폴루션(anti-pollution) 효과를 가지는 화장품 조성물에 있어서, 상기 추출물의 추출 용매는 에탄올인 것이 바람직하며, 각각의 유효 성분 총 조성물의 중량 대비 0.001 내지 30 중량% 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 안티-폴루션(anti-pollution) 효과를 가지는 화장품 조성물은 건조한 생강나무 잎의 에탄올 추출물을 총 조성물의 중량 대비 0.0001 내지 30 중량% 더 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 화장품 조성물은 황사 및 미세먼지의 의해 유발되는 피부 염증 등의 피부 트러블을 억제하는 효과가 명백하여 안티-폴루션(anti-pollution) 화장품으로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1, 2, 3은 본 발명에 따른 조성물과 PM1648a를 농도별로 혼합한 혼합물의 DPPH radical 소거능을 측정한 그래프이다(양성 대조군으로는 Ascorbic acid를 사용).
도 4는 Raw264.7 cells에서의 본 발명에 따른 조성물의 세포 독성을 측정한 그래프이다.
도 5는 HaCaT cells에서의 본 발명에 따른 조성물의 세포 독성을 측정한 그래프이다.
도 6은 Raw264.7 cell에 PM1648a를 농도별로 처리하여 PGE2 발현정도를 측정한 그래프이다.
도 7은 LPS로 자극한 Raw264.7 cells에서의 PGE2 생성 억제 활성을 측정한 그래프이다.
도 8은 PM1648a로 자극한 Raw264.7 cells에서의 PGE2 생성 억제 활성을 측정한 그래프이다.
도 9는 PM1648로 자극한 HaCaT cell에서의 PGE2 생성 억제 활성을 측정한 그래프이다(** : 0.167%).
도 10은 PM1648a로 자극한 Raw264.7 cells에서의 ROS 생성 억제 활성을 측정한 그래프이다.
도 11은 LPS로 자극한 Raw264.7 cells에서의 ROS 생성 억제 활성을 측정한 그래프이다.
도 12는 PM1648로 자극한 HaCaT cell에서의 ROS 생성 억제 활성을 측정한 그래프이다.
도 13은 PM1648a로 자극한 HaCaT cells에서의 XRE luciferase activity 측정 결과 그래프이다.

이하 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 설명하기로 한다.

본 발명은 베타-글루칸(β-glucan), 지모의 뿌리줄기 추출물 및 소듐폴리글루타메이트(Sodium Polyglutamate)를 유효성분으로 포함하는 대기의 유해환경으로부터 유발되는 피부 염증 등의 피부 트러블을 완화시키는 안티-폴루션(anti-pollution)용 화장품 조성물을 제공한다.

추가적으로 본 발명에 따른 안티-폴루션(anti-pollution) 효과를 가지는 화장품 조성물은 건조한 생강나무 잎의 에탄올 추출물을 더 포함훌 수 있다.

상기 다당류의 일종인 베타-글루칸은 효모의 세포벽, 버섯류, 곡류 등에 존재하는 물질이다. 미국의 루이스 필레머(Louis Pillemer) 박사가 효모의 세포벽에서 1941년 발견하여 자이모산(Zymosan)이라 명명하였고, 1960년대 초 미국의 니콜라스 딜루지오(Nicholas Diluzio) 박사가 효모 세포벽에서 추출한 고분자 다당을 베타-글루칸이라 명명하였다. 면역증강작용을 보이는 베타-글루칸은 포도당 중합체로서 포도당 단위체가 1, 3위치에 β-글리코시드 결합을 기본 구조로 가지며, 포도당이 결합하는 위치에 따라 구조 및 물리 화학적 성질이 변화되며, 암세포를 직접 공격하지 않고 비특이적 면역반응으로 인간의 정상 세포의 면역기능을 활성화시켜 암세포의 증식과 재발을 억제하고 대식세포(macrophage)를 활성화시켜 암세포가 있는 체내로 들어가 여러 가지 사이토카인(Cytokine)의 분비를 촉진하여 면역세포인 T세포와 B세포의 면역기능을 활성화시켜 준다. 이 외에도 베타-글루칸은 혈당강하 및 혈중 콜레스테롤 감소 효과가 우수하며, 지질대사를 개선하여 체지방 형성과 축적을 억제함으로써 항 비만효과를 가지는 것으로 보고되고 있다.

상기 지모는 학명이 Anemarrhena asphodeloides로서 중국이 원산지이고, 뿌리줄기는 굵고 옆으로 뻗으며 끝에서 잎이 뭉쳐나며, 잎은 줄 모양이고 길이가 20∼70cm이며 끝이 실처럼 가늘고 밑 부분이 서로 안기어 줄기를 감싸며 가장자리가 밋밋하고 잎맥은 나란히맥이다. 특히 뿌리줄기에는 약의 성분으로 쓸 수 있는 아스포닌·살사포케닌 등이 들어 있으며, 한방에서는 뿌리줄기를 약재로 쓰는데, 해열제로 사용하고, 만성기관지염·당뇨병 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서는 지모 중에서 약용으로 사용되는 뿌리줄기 부분을 이용하여 추출물을 제조하여 사용하는데, 추출 용매는 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매를 사용할 수 있으며, 상기 저급알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있고, 보다 구체적으로 에탄올일 수 있다.

또한 추출 방법으로는 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출, 초임계 추출 등 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상적인 방법을 특별한 제한 없이 이용할 수 있다.

상기 소듐폴리글루타메이트는 정량할 때 L-소듐글루타메이트(C₅H₈NNaO₄ㆍH₂O ： 187.13) 99.0% 이상을 함유하는 것을 의미하며, 착향제, 피부컨디셔닝제(기타), 헤어컨디셔닝제로 사용되고 있다.

상기 생강나무는 학명이 Lindera obtusiloba Blume var. obtusiloba로서 녹나무과에 속하며, 키는 3~4m 내외이고, 잎은 길이가 5~15㎝, 폭은 4~13㎝로 어긋나며 난형 또는 난상 원형, 꽃은 황색으로 가지를 따라 잎보다 먼저 달리고, 열매는 9~10월경에 지름이 0.7~0.8㎝로 둥글게 달리고, 녹색에서 황색 또는 홍색으로 변하며 흑색으로 익는 암수 딴그루의 전국의 야산에서 자라는 낙엽활엽관목이다. 생강나무의 잎은 자라면 심장 모양을 하고 있으며, 줄기를 따보면 식용하는 생강과 같은 향이 나며, 잎과 꽃에서도 그 향이 강하게 난다.

본 발명에서는 생강나무의 잎을 건조한 후에 에탄올을 추출 용매로 하여 제조한 추출물을 사용하며, 에탄올 추출법은 본 발명이 속하는 기술 분야에 널리 알려진 통상적인 방법을 특별한 제한 없이 사용 가능하다.

본 발명에서의 화장품 조성물은 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 일 예로 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

이와 같은 화장품 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 구체적으로 고점도 유화제형, 저점도 유화제형 및 가용화 제형으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 제조하고자 하는 제형에 따라 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 화장품 조성물 배합 성분을 포함할 수 있다. 일 예로 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 선로션, 선크림, 메이크업 베이스, 비비크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징 워터, 팩, 스틱상 제품, 밤(Balm) 타입 제품, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

제조하고자 하는 제형에 따라 추가로 수상성분, 유상성분, 계면활성제, 보습제, 저급알콜, 점증제, 킬레이트제, 방부제, 향료 등을 선택하여 배합 첨가할 수 있다.

본 발명에 따른 화장품 조성물은 각각의 유효성분을 조성물 중량 대비 0.001 내지 30 중량%로 포함하는데, 총 조성물 중량 대비 0.001 중량% 미만인 경우에는 피부 염증 등의 피부 트러블 완화를 통한 안티-폴루션 효과가 나타나지 않으며, 30 중량%를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하고, 제형의 안정성에 문제가 있으며, 경제적이지 않다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 본 발명에 따른 조성물의 제조방법

지모(Anemarrhena asphodeloides)의 뿌리 줄기 5kg을 95% 에탄올 12.5리터로 추출하고 얻은 농축물에 정제수 125리터로 2회 세척하여 침전물을 회수하고 여기에 에탄올을 넣어 가용부를 얻은 후 감압농축 건고시켜 갈색가루 20.6g을 얻었다.

상기 얻은 지모 뿌리 줄기 추출물에 치마 버섯에서 추출한 베타-글루칸과 소듐폴리글루타메이트를 혼합하여 본 발명에 따른 조성물을 완성하였으며, 이들의 혼합 중량비는 지모 뿌리 줄기 추출물인 2일 때 베타-글루칸과 소듐폴리글루타메이트를 각각 1로 하였다.

시험예 1. 항산화 효과 시험

1-1. 자유라디칼소거력 ( DPPH 측정)

●측정 방법

1. 측정해야 할 시료를 농도별로 희석하여 샘플을 준비한다.

2. 준비된 샘플 160㎕와 0.4mM DPPH 40㎕ (sigma, USA)를 96well plate (SPL, Korea)에 분주한 후 혼합한다.

3. incubation (실온, 30min)

4. 517nm에서 microplate reader기 (ASYS, UK)로 흡광도를 측정한다.

5. 계산한 공식

저해율 (%) = 1 - (시료첨가군의 흡광도/시료무첨가군의 흡광도) X 100

●측정 결과

본 발명에 따른 조성물과 PM1648a (obtained from NIST; Gaithersburg, MD, USA)농도별의 혼합물에 대하여 DPPH radical 소거능을 측정하여 그 결과를 도 1, 도 2 및 도 3으로 나타냈으며, 대조군으로는 Ascorbic acid를 사용하였다.

첨부된 도 1, 도 2 및 도 3을 보면 대조군으로 사용된 Ascorbic acid에 미치지는 못하였으나 상당한 수준의 DPPH 라티컬 소거능을 확인할 수 있었다.

시험예 2. PGE2 생성 억제를 통한 항염증 효과 확인 시험

2-1. 세포 배양

Murine macrophage cell line 인 Raw 264.7 cell과 Human keratinocyte cell line인 HaCaT cell을 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank)으로부터 구입하였으며, 1% antibiotic (Gibco, USA)과 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, USA)이 함유된 DMEM 배지(hyclone, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator(Thermo, USA)에서 배양하였으며, 2일에 한번씩 계대 배양을 실시하였다.

2-2. 세포 독성 측정 ( LDH assay)

●측정 방법

1. Raw264.7cell을 48well plate (nunc, USA)에 1x10⁵cells/well로 접종한다.

(한 well당 media volume은 250㎕)

2. incubation (18hrs, 37℃, 5% CO₂ incubator (Thermo, USA))

3. Raw 264.7 cell에 처리할 샘플을 준비한다.

4. 18시간 동안 배양한 Raw264.7 cell의 각 well의 media를 제거하고 PBS (sigma, USA) 로 washing. (250㎕/well, 2 times).

5. 준비한 샘플을 Raw264.7 cell의 각 well에 처리한다.

6. incubation (24hrs, 37℃, 5% CO₂ incubator(Thermo, USA))

7. Sampling 하기 45분 전에 Maximum LDH Release Control의 값을 확인하기 위해 N.C의 well에 1X lysis buffer (Promega, USA)를 처리하여 incubation 한다. (45min, 37℃, 5% CO₂ incubator)

8. 상등액 sampling (죽은 cell이 많을수록 상등액에 LDH가 많이 포함되어있다.): 각 well의 상등액을 1.5mL micro-tube(Axygen, UK)에 옮겨준 후 원심분리기(hanil, Korea) 로 원심분리 한다. (3000rpm, 5min))

9. sampling한 sample 50㎕와 reconstituted substrate mix 50㎕ (promega, USA)를 96well plate (SPL, Korea)에서 혼합하여 준다. (background 값을 위해 c㎕ture media도 함께 측정)

10. incubation (30min, room temperature)

11. stop solution 50㎕ (promega, USA)씩 넣어준다.

12. 490nm에서 microplate reader기 (ASYS, UK)로 흡광도를 측정한다.

●측정 결과

Raw264.7 cell에 본 발명에 조성물을 농도별로 처리하여 세포독성(LDH release)을 확인하여 그 결과를 도 4에 나타냈다. Control은 media(DMEM)만 처리한 군이고, 본 발명에 따른 조성물의 농도는 0.0125%부터 2%까지 처리하여 세포독성을 확인하였다. 첨부된 도 4의 결과를 보면 유의할 수준의 세포 독성이 거의 나타나지 않았다.

2-3. 세포 독성 측정 ( MTT assay)

●측정 방법

1. cell을 96well plate (nunc, USA)에 cell을 접종한다. (한 well당 media volume은 100㎕)

- HaCaT : 1x10⁴cells/well

2. incubation (18hrs, 37℃, 5% CO₂ incubator (Thermo, USA))

3. cell에 처리할 시료를 준비한다.

4. 각 well의 배양액을 제거하고 PBS (sigma, USA)로 washing한다.

(100㎕/well, 2 times)

5. 준비한 샘플을 cell의 각 well에 처리한다.

6. incubation (24hrs, 37℃, 5% CO₂ incubator (Thermo, USA))

7. 각 well에 MTT (2mg/ml) (sigma, USA) 용액을 50㎕씩 넣어준다.

8. incubation (암조건, 4hrs, 37℃, 5% CO₂ incubator (Thermo, USA))

9. 상등액을 제거한 후 PBS (sigma, USA)로 washing한다. (100㎕, 2 times)

10. DMSO (sigma, USA)를 100㎕씩 넣어 침전물(미토콘드리아에 의해 환원된 MTT formazan)을 완전히 용해시킨다.

11. 540nm에서 microplate reader기 (ASYS, UK)로 흡광도를 측정한다.

●측정 결과

HaCaT cell에 본 발명에 조성물을 농도별로 처리하여 세포독성(LDH release)을 확인하여 그 결과를 도 5에 나타냈다. Control은 media(DMEM)만 처리한 군이고, 본 발명에 따른 조성물의 농도는 0.0125%부터 2%까지 처리하여 세포독성을 확인하였다. 첨부된 도 5의 결과를 보면 유의할 수준의 세포 독성이 거의 나타나지 않았다.

2-4. PGE2 발현 억제 확인

●측정 방법

1. 48well plate (nunc, USA)에 cell을 접종한다. (한 well당 media volume은 250㎕)

- Raw264.7 : 1x10⁵cells/well

- HaCaT : 5x10⁴cells/well

2. incubation (18hrs, 37℃, 5% CO₂ incubator (Thermo, USA))

3. Raw 264.7 cell에 처리할 시료를 준비한다.

4. 18시간 동안 배양한 Raw264.7 cell의 각 well의 media를 제거하고 PBS (sigma, USA) 로 washing. (250㎕/well, 2 times)

5. 준비한 샘플을 Raw264.7 cell의 각 well에 처리한다.

6. incubation (24hrs, 37℃, 5% CO₂ incubator(Thermo, USA))

7. 상등액 sampling (LPS에 의해 자극된 Raw264.7 cell이 생성한 PGE₂가 상등액 안에 있다.) 각 well의 상등액을 1.5mL micro-tube(Axygen, UK)에 옮겨준 후 원심분리기(hanil, Korea) 로 원심분리 한다. (3000rpm, 5min))

8. 얻어진 상층액을 PGE2 ELISA assay kit (R&D system, USA)를 이용하여 PGE2 함량을 측정한다. (모든 시료는 정량 전까지 냉동보관 (-20℃) 한다.)

●측정 결과

1. Raw264.7 cell에 PM1648a를 농도별로 처리하여 PGE2 발현정도를 확인하여 그 결과를 도 6에 나타냈으며, 도 6을 보면 PM1648a 농도 12.5㎍/㎖에서 최대 발현을 보인 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 미세 먼지, 미세 물질 등의 자극에 의해 세포에서 PGE2 발현이 증가되는 것을 알 수 있었으며, 본 발명에 따른 조성물이 PGE2 발현을 억제할 수 있다면 안티-폴루션 효과가 입증되는 것으로 볼 수 있다.

2. 본 발명에 따른 조성물의 효과를 입증하기 위하여, Raw264.7 cell에 본 발명에 따른 조성물 농도별로 LPS 1㎍/㎖와 동시에 처리하여 PGE2 생성률을 확인하였으며, 그 결과를 도 7에 나타냈다. 도 7을 보면 Raw264.7 cell에 LPS로 자극(염증 유도)을 유도하고 본 발명에 따른 조성물을 농도별로 처리하였을 때, 농도가 높아질수록 PGE2 생성이 감소하다가 일정농도인 0.05% 이상 농도에서는 생성 억제율이 유지되고 있음을 확인하였다.

3. 본 발명에 따른 조성물의 효과를 입증하기 위하여, Raw264.7 cell에 본 발명에 따른 조성물을 농도별로 PM1648a 12.5㎍/㎖와 동시에 처리하여 PGE2 생성률을 확인하였으며, 그 결과를 도 8에 나타냈다. 도 8을 보면 Raw264.7 cell에 PM1648a 12.5㎍/㎖ 농도로 자극(염증 유도)을 유도하고 본 발명에 따른 조성물을 농도별로 처리하였을 때, LPS로 자극을 주었을 때와 달리 본 발명에 따른 조성물 농도가 0.05% 이하에서는 PGE2 생성이 감소하는 경향을 보였으며, 본 발명에 따른 조성물 0.1% 이상에서는 PEG2 생성이 더 촉진되고 있음을 확인하였다.

4. 본 발명에 따른 조성물의 효과를 입증하기 위하여, HaCaT cell에 본 발명에 따른 조성물을 농도별로 PM1648a 12.5㎍/㎖와 동시에 처리하여 PGE2 생성률을 확인하였으며, 그 결과를 도 9에 나타냈다. 도 9를 보면 HaCaT cellRaw264.7 cell에 PM1648a 12.5㎍/ml 농도로 자극(염증 유도)을 유도하고 본 발명에 따른 조성물을 농도별로 처리하였을 때, Raw264.7 cell에 자극을 주었을 때와 유사한 패턴을 보였으며, 본 발명에 따른 조성물 농도가 0.05% 이하에서는 PGE2 생성이 감소하는 경향을 보였으며, complex 0.00625% 에서는 　가장 높은 PEG2 생성 억제를 보였다.

실험예 3. ROS 생성 억제 효과 확인 시험

3-1. 세포 배양

3-2. ROS 측정 ( DCF -DA assay )

●측정 방법

1. 96well plate (SPL, Korea)에 cell을 접종한다(한 well당 media volume은 100㎕).

- Raw264.7 : 5x10⁴cells/well

- HaCaT : 1x10⁴cells/well

2. incubation (18hrs, 37℃, 5% CO₂ incubator (Thermo, USA))

3. cell에 처리할 시료를 준비한다.

4. 각 well의 배양액을 제거하고 PBS (sigma, USA)로 washing한다(100㎕/well, 2 times).

5. 준비한 샘플을 cell의 각 well에 처리한다.

6. incubation (24hrs, 37℃, 5% CO₂ incubator (Thermo, USA))

7. 각 well의 배양액을 제거하고 PBS (sigma, USA)로 washing한다(100㎕/well, 2 times).

8. 각 well에 10 uM DCF-DA (Thermo fisher scientific , USA)를 넣어준다(100㎕/well).

9. incubation (90 min, 37℃, 5% CO₂ incubator (Thermo, USA))

10. Flourescence reader기 (Molec㎕ar DEVICES, USA)를 이용해 excitation 485nm, emission 530 nm에서 형광강도를 측정한다.

●측정 결과

1. Raw 264.7 cell에 200㎍/ml PM1648a로 처리한 결과를 도시한 도 10을 보면, 본 발명에 따른 조성물을 농도별로 PM1648a와 동시에 처리했을 때 농도 의존적으로 ROS 생성을 억제하는 것을 확인할 수 있었으며, 지모 추출물 농도 0.2%에서 억제 효과가 명확하게 나타남을 알 수 있었다.

2. Raw 264.7 cell에 1㎍/ml LPS로 처리한 결과를 도시한 도 11을 보면 본 발명에 따른 조성물의 농도별로 LPS와 동시에 처리하였을 때 ROS 생성이 지모 추출물의 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

3. HaCaT cell에 12.5㎍/ml PM1648a로 처리한 결과를 도시한 도 12 보면 본 발명에 따른 조성물의 농도별로 PM1648a와 동시에 처리했을 때 0.00625%의 저 농도에서부터 ROS 생성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 4. XRE promoter activity 측정에 따른 anti-pollution 효과 시험

4-1. 측정 원리

luciferase assay는 특정 gene의 promoter 부분을 luciferase가 있는 vector에 ligation 시켜서 그 promoter가 활성화 되면 발광되는 원리로 사용된다. 즉 promoter 활성화 여부에 대한 확인을 위해 luciferase assay를 한다. 따라서 promoter의 특정 gene에 따라 (IFN-γ, NFκB, Progesterone, TGFβ, Vitamin D 등) 선택적으로 반응하여 유전자의 조절이나 기능연구 등으로 사용한다.

본 실시예에서는 Xenobiotic XRE(중금속 및 기타 미량원소를 포함하는 미세먼지)과 반응하는 XRE promoter luciferase gene을 사용하였다. XRE는 AhR signaling pathway를 통해 측정되는 reporter gene이다. AhR은 보통 세포질 내에서 활성화되지 않은 상태에서 Chaperone과 결합되어 있다. PM과 같은 외부 물질의 자극에 의해서 AhR은 Chaperone과 분리되고 ARNT (AhR nuclear translocator)와 결합하여 핵으로 이동하고 XRE promoter를 활성화 시켜 Xenobiotic metabolizing enzymes (CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, NQ01, ALHD3A1, ㎍T1A2, GSTA1) 발현을 유도하여 생체 내 독성 반응에 영향을 미친다.

HaCaT cell에 XRE promoter luciferase gene을 transfection 한 후 PM1648a와 지모추출물을 동시에 처리하였다. PM1648a로 자극된 cell은 AhR signaling pathway를 통해 XRE promoter가 활성화 되고 luciferase가 발현되면서 cell이 발광하게 된다. 본 발명에 따른 조성물이 AhR signaling pathway를 차단하는 효과를 확인하기 위해 이 실험을 수행하였다. 본 발명에 따른 조성물의 처리 농도가 높을수록 luciferase의 발현으로 발광되는 정도가 약해진다면 이는 Anti-Pollution 효과가 있는 것으로 확인될 수 있다.

4-2. 세포 배양

Human keratinocyte cell line인 HaCaT cell을 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank)으로부터 구입하였으며, 1% antibiotic (Gibco, USA)과 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, USA)이 함유된 DMEM 배지(hyclone, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator(Thermo, USA)에서 배양하였으며, 2일에 한번씩 계대 배양을 실시하였다.

4-3. XRE luciferase activity assay

●측정 방법

- Cell transfection

1. 6 well plate (nunc, USA)에 cell을 접종한다(한 well 당 media volume은 2ml).

- HaCaT : 3x10⁵cells/well

2. incubation (18hrs, 37℃, 5% CO₂ incubator (Thermo, USA))

3. XRE luciferase DNA 1.8 ㎍ (Qiagen, USA)을 α-MEM (gibco, USA) 50㎕에 희석한다(한 well 당 1.2㎍/50㎕).

4. Transfection reagent (Qiagen, USA) 4.5 ㎕를 α-MEM (gibco, USA) 50㎕에 희석한다. (한 well 당 4.5㎕/50㎕))

5. DNA 1.2㎍/50㎕와 Transfection reagent 54.5 ㎕의 희석액을 혼합한다.

6. incubation (20 min, RT)

7. 6 well plate (nunc, USA)의 각 well을 PBS (sigma, USA)로 washing 한다(1ml/well, 2 times).

8. 각 well에 α-MEM (gibco, USA)을 1ml/well로 분주한다.

9. 각 well에 준비된 mixture를 처리한다.

10. incubation ( 6hrs, 37℃, 5% CO₂ incubator (Thermo, USA))

11. 각 well의 상등액을 제거한 후 PBS (sigma, USA)로 washing한다(1ml/well, 2 times).

12. Trypsin-EDTA (gibco, USA)를 처리하여 cell을 떼어낸 후

13. cell을 DMEM (hyclone, USA)으로 희석하여 96 well plate (nunc, USA)에 접종한다.

- HaCaT : 3x10⁴cells/well

14. incubation (18hrs, 37℃, 5% CO₂ incubator (Thermo, USA))

- XRE luciferase 측정

1. cell에 처리할 시료를 준비한다.

2. 96 well plate(SPL, Korea)의 각 well의 배양액을 제거한 후 PBS (sigma, USA)로 washing 한다(100㎕/well, 2 times).

3. 준비한 샘플을 각 well에 처리한다.

4. incubation (24hrs, 37℃, 5% CO₂ incubator (Thermo, USA))

5. 각 well의 배양액을 제거하고 PBS(sigma, USA)로 washing한다(100㎕/well, 2 times).

6. 1X Passive Lysis Buffer (promega, USA)로 처리한다.

7. incubation (15 min, RT)

8. 각 well의 상등액을 새로운 1.5ml tube (Axygen, UK)에 옮긴다.

9. 원심분리기 (hanil, Korea)로 원심분리 한다(12000 rpm, 15 min, 4 ℃).

10. 96 well plate (SPL, Korea)에 상등액 50㎕와 Luciferase Assay Reagent 50㎕ (promega, USA)를 실온에서 90분 동안 반응한 후 Luminescence 측정기 (Molec㎕ar DEVICES, USA)로 565 nm 에서 Firefly luminescence를 측정한다.

11. Stop & Glo Reagent 50㎕ (promega, USA)를 추가 반응 하여 실온에서 90 분 동안 반응한 후 Luminescence 측정기 (Molec㎕ar DEVICES, USA)로 480 nm 에서 Renilla luminescence를 측정한다.

●측정 결과

HaCaT cell에 PM1648a 12.5㎍/ml로 자극하여 본 발명에 따른 조성물 농도별 XRE luciferase activity를 분석하여(XRE luciferase reporter gene plasmid (Qiagen, #CCS-2015L) 1.8 ㎍/ml) 그 결과를 도 13 에 나타냈다.

도 13을 보면 본 발명에 따른 조성물로 처리하지 대조군의 활성을 100으로 보았을 때 본 발명에 따른 조성물의 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 0.05%에서 약 70% 감소하는 것으로 나타났다.

실시예 2: 본 발명에 따른 조성물의 제조방법

건조한 생강나무의 잎 5kg을 95% 에탄올 12.5리터로 추출하고 얻은 농축물에 정제수 125리터로 2회 세척하여 침전물을 회수하고 여기에 에탄올을 넣어 가용부를 얻은 후 감압농축 건고시켜 17.5g의 분말을 제조한 다음 이 생강나무 잎 추출물을 베타-글루칸과 동일 중량비율로 실시예 1의 조성물에 포함시켜 실시예 2의 조성물을 제조하였다.

시험예 5. XRE promoter activity 측정에 따른 anti-pollution 효과 시험

실시예 2의 본 발명에 따른 조성물을 이용하여 시험예 4와 동일한 방법으로 측정하였으며, 그 결과는 본 발명에 따른 조성물로 처리하지 대조군의 활성을 100으로 보았을 때 본 발명에 따른 조성물의 농도 0.05%에서 약 75% 감소하는 것을 알 수 있었다.

이상에서와 같은 결과 알 수 있듯이 본 발명에 따른 화장품 조성물이 미세먼지와 같은 오염원으로부터 피부를 보호하는 Anti-Pollution 효과가 있음은 명백하다.

Claims

베타-글루칸, 지모의 뿌리줄기 추출물 및 소듐폴리글루타메이트를 유효성분으로 0.00312중량% ~ 0.05중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 미세먼지에 의한 피부 염증을 완화하는 안티-폴루션(anti-pollution) 효과를 가지는 화장품 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물의 추출 용매가 에탄올인 것을 특징으로 하는 안티-폴루션(anti-pollution) 효과를 가지는 화장품 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 건조한 생강나무 잎의 에탄올 추출물을 총 조성물의 중량 대비 0.0001 내지 30 중량% 더 포함하는 것을 특징으로 하는 안티-폴루션(anti-pollution) 효과를 가지는 화장품 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 미세먼지에 의한 피부 염증을 완화하는 안티-폴루션(anti-pollution) 효과가 XRE promoter가 활성화되는 AhR signaling pathway를 차단하여 Xenobiotic metabolizing enzymes의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 안티-폴루션(anti-pollution) 효과를 가지는 화장품 조성물.
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