KR101899666B1 - 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 골질환 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 골질환 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 골질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 인삼 추출물은 염증을 억제하고, 골밀도 및 골함유량을 증가시키는 효과가 있을 뿐 아니라 뼈의 미세구조가 치밀해지는 효과가 우수하여 골질환 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 세포독성이 일어나지 않으며, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에서도 안정한 효과가 있다.

Description

인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 골질환 예방 및 치료용 조성물{Composition for the prevention and treatment of bone diseases containing ginseng extract}
본 발명은 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 골질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
골(bone)은 근육과 연합되어 있는 석회화된 결체조직으로서 표면은 두껍고 단단한 석회화 조직으로 신체균형을 이루는 지주역할을 하며 장기를 보호한다. 골의 안쪽은 골수조직으로 칼슘대사의 중심이 되는 부위이다. 골은 콜라겐(collagen), 오스테오칼신(osteocalcin), 오스테오넥틴(osteonectin) 등 유기질(organic substance)과 칼슘, 인, 불소 등의 무기질(inorganic substance) 및 수분으로 구성되어 있다. 생체에서는 항상 골형성(bone formation)과 골흡수(bone resorption)가 일어나고 있다. 골형성은 소량의 부갑상선 호르몬이나 안드로겐, 에스트로겐, 불소, 인 등에 의하여 촉진되며, 골흡수는 물리적 감압, 무중력상태, 다량의 부갑상선 호르몬, 부신피질 스테로이드 등에 의하여 촉진된다. 따라서 골대사에는 이들 사이의 균형(balance)이 중요하다. 그러므로 골의 항상성은 파골 세포(osteoclast)에 의한 골 흡수(bone resoprtion)와 조골세포(osteoblast)에 의한 골 형성(bone formation)의 대등한 작용에 의한 리모델링 과정(bone remodeling)이 지속적으로 조절되어 유지된다.
관절염은 관절에 염증 및 통증이 발생되는 질환으로서, 주요하게 골관절염(Osteoarthritis, degenerative arthritis) 및 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis)으로 나눌 수 있다. 골관절염은 퇴행성관절염으로 불리기도 하는데, 특정한 기질적인 원인 없이 주로 노년에 따른 만성적으로 진행되어 관절구조의 변형으로 보행 장애 등의 운동 장애를 수반하게 된다. 즉, 국소 관절에 점진적인 관절연골의 소실 및 그와 관련된 2차적인 변화와 증상을 동반하는 질환으로 성인에서 관절통의 가장 흔한 원인이며 보행 및 일상생활 동작에 제한 등이 유발되는 것이다 (Choi and Oh, 2006). 특히, 관절연골(cartilage)의 점진적인 손상이나 퇴행성 변화로 인해 관절을 이루는 뼈와 인대 등에 손상이 일어나서 염증과 통증이 발생된다. 골관절염이 진행될 때 TNF-α, IL-1β 등의 염증성 사이토카인의 생성이 증가하고 콜라게네이즈(collagenase),스트로멜라이신(stromelysin) 등과 같은 matrix metalloproteinases(MMPs)의 분비가 증가되어 관절연골의 파괴가 이루어지게 된다. 또한 MMPs는 IL-1, TNF-α 등을 유도시키게 되는데 이로 인하여 근육, 건, 인대 등과 같은 조직에도 영향을 끼쳐 심한 통증을 일으킨다. 류마티스 관절염은 다발성 관절염을 특징으로 하는 염증성 질환으로서, 자가 면역현상이 주요 기전으로 알려져 있다. 관절 활막(synovial membrane) 조직에 염증이 발생되면서 대식세포, 수상세포 및 T 림프구, B 림프구 등이 활막 조직으로 이동하고, 그 결과 관절액이 증가하여 관절부종을 동반한 통증이 나타나게 된다. 즉, 류마티스 관절염은 관절을 침범하는 만성 전신성 염증성질환으로 병리학적으로 활막의 비후 및 염증세포 침윤과이로 인한 관절의 파괴를 특징으로 한다. 초기에는 면역반응에 의해 T림프구가 활성화되고 이로 인해 염증 반응이 시작되는 것으로 생각되지만, 질환이 진행하고 말기로 갈수록 T림프구의 영향력은 감소하고 활막세포의 비정상적 증식 및 활성화로 인해 나타나는 연골 파괴 분해효소 및 골 파괴인자의 활성화로 인해 관절 파괴가 지속적으로 나타나게 된다(Firestein GS, 1996., Firestein GS and Zvaifler NJ, 2002). 이러한 염증이 지속되면서 염증성 활막조직의 과다형성(hyperplasia)되어 뼈와 연골을 파괴하여 관절 구조가 변형되고 운동 장애가 발생된다. 특히, 류마티스 관절염 환자에 있어서 염증성 사이토카인이 활막 섬유세포와 연골세포에서 콜라겐 분해효소 및 중성 프로테아제(protease)를 생산하고, 생산된 이들 효소들은 콜라겐과 프로테오글라이칸(proteoglycan)을 파괴하여 관절연골을 파괴시키는 것으로 알려졌다. 결국, 관절염이 발생되면 관절 염증과 염증으로 인한 열감 및 부종, 관절 통증이 발생되고, 이러한 관절염의 증상이 지속되면서 결국 연골과 골조직이 파괴되어 관절구조의 변형 및 운동 장애를 유발하게 되는 것이다.
최근 이들 질환의 치료에 있어서, 염증이 동반된 골관절염 경우에는 항염제를 진통제나 비약물요법 보다 우선적으로 또는 병합으로 사용한다. 그러나, 항염제의 부작용은 발진과 같은 과민반응, 복부 통증, 소화성 궤양, 소화기 출혈, 신기능, 간기능, 골수기능 및 혈소판 응집 장애, 노인에서의 중추신경장애 등이 대표적이다(Park., 2003). 만성 염증성 질환으로서 류마티스 관절염의 가장 특이한 요인으로서 국소적으로나 전신적으로도 인터루킨(IL)-1, IL-6, 그리고 종양괴사인자(TNF), RANKL(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand) 등사이토카인과prosta-glandin E2(PGE2) 등 염증성 물질이 증가하며 이들은 다시 파골세포를 자극하며, 더욱이 이 질환을 치료하기 위하여 사용되는 다량의 당질코르티코이드, 메토트렉세이트, tacrolimus, 사이크로스포린, 사이크로포스파마이드 등의 면역억제제나, 제산제 등에 의해 전신적인 골다공증이 더욱 조장 될 수도 있다. 최근에 이르러 새로운 치료제의 개발로 보다 효율적인 관리가 가능해 졌지만 비용, 부작용 등의 문제점을 갖고 있다. 따라서 관절파괴에 대한 새로운 병인의 규명과 이를 표적으로 한 새로운 치료제의 개발이 절실한 실정이다.
또한, 파골 세포의 지나친 활성이나 조골세포 활성의 저하는 리모델링과정의 불균형을 초래하여, 골다공증(osteoporosis)과 같은 성인 골격계 질환을 유도한다. 이러한 불균형을 해소하기 위해서 일반적으로 파골 세포의 지나친 활성을 억제하거나, 조골세포의 활성을 촉진시키거나, 또는 파골 세포의 활성을 억제하고 조골세포의 활성을 촉진하는 방법이 사용되고 있으며, 이들은 골다공증의 치료에 대한 효과적인 치료적 접근 방법으로 인지되고 있다.
파골세포는 조혈모세포의 단핵구로부터 유래되는 세포로서, 마우스의 RAW264.7 단핵구 세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor κB(RANK) ligand)에 의해 융합하여 다핵 파골세포(multinucleated osteoclasts)로 분화된다(참조: Boyle WJ. et al., 2003). 이러한 분화 과정은 세포 외부의 RANKL이 RANK에 결합하여 미토겐 활성 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinase, MAPK)의 활성을 촉진하고, 이는 NF-κB라는 전사 인자가 핵 내로 들어가서 파골세포 분화와 관련된 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), MMP-9(matrix metalloproteinase-9), c-Src 티로신 키나아제(tyrosine kinase) 등의 발현을 증가시킴으로써 가능한데, 이러한 과정으로 형성된 다핵 파골세포는 무기질 골(mineralized bone)을 흡수할 수 있다. 따라서 RANKL에 의해 활성화되는 신호전달 경로의 차단은 골다공증을 비롯한 골 질환의 치료를 위한 치료적 접근 방법 중의 하나로 인지되고 있다. 조골세포는 간엽줄기세포에서 기원하여 형성되는데 조골세포의 분화에 의한 칼슘 형성과 같은 무기질화는 골의 세기를 유지시켜 줄 뿐만 아니라, 신체 전체의 칼슘 및 호르몬 대사의 항상성에도 매우 중요한 기능을 하고 있다. 조골세포의 분화에 의한 칼슘 형성은 비타민 D 및 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone) 등에 의해 조절되며, 조골세포의 분화에 의한 골 형성은 세포내에서 뼈 형태형성 단백질(bone morphogenetic protein; BMP), Wnt, MAP 키나아제, 칼시뉴린-칼모듈린 키나아제(calcineurin-calmodulin kinase), NF-κB, AP-1 등의 다양한 신호전달 체계의 상호작용(cross-talk)에 의해 조골세포의 분화와 관련된 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase; ALP)가 초기 분화단계에서 합성된 후, 무기질화와 관련된 오스테오폰틴(osteopontin), 오스테오칼신(osteocalcin), 타입 I 콜라겐 등이 합성됨으로써 이루어진다고 알려져 있다. 이와 같은 조골세포를 활성시키기 위한 촉진제는 일반적으로 환자에게 장기 투여하여야 하기 때문에 독성이 적고 경구투여가 가능한 것이 바람직하며, 독성이 없는 조골세포 활성 약제 및 기능성 식품의 개발이 요구되고 있다.
근래에는 부작용을 최소하기 위하여 독성이 적고, 일상생활에서 식용으로 섭취 가능한 식품과 약용식물 등 천연물 소재를 이용하여 골 손실의 최소화와 더불어 골 형성을 촉진시킬 수 있는 골질환 예방 또는 치료 물질 개발에 대한 응용 연구가 다양하게 시도되고 있는 실정이다.
한국 등록특허 제10-1627705호 한국 공개특허 제10-2015-0010205호
이에 본 발명자들은 골질환 예방 또는 치료 효과가 있는 새로운 천연물 소재를 찾던 중 인삼 추출물에 염증을 억제하고, 골밀도 및 골함유량 증가 효과 및 골의 미세구조가 치밀해지는 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 (a) 인삼을 세척하고 건조하는 단계;(b) 건조된 인삼을 가공하는 단계; (c) 상기 (b)단계에서 가공처리된 인삼을 추출하는 단계; 및 (d) 인삼 추출물을 농축하는 단계를 포함하는, 인삼 추출물 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
나아가 본 발명은 상기 방법으로 제조된 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 인삼을 세척하고 건조하는 단계;(b) 건조된 인삼을 가공하는 단계; (c) 상기 (b)단계에서 가공처리된 인삼을 추출하는 단계; 및 (d) 인삼 추출물을 농축하는 단계를 포함하는, 인삼 추출물 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b)단계의 가공은 100 ~ 140℃의 온도에서 0.5 ~ 3kgf/㎠ 압력으로 10분 ~ 40분간 처리할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (c)단계의 추출은 물, 에탄올, 메탄올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하고, 80 ~ 95℃의 온도에서 2 ~ 3시간 동안 추출할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (d)단계의 농축은 40 ~ 50℃의 온도에서 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 인삼 추출물은 염증을 제거 또는 억제하고, 조골세포 분화 활성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 인삼 추출물은 일산화질소(NO) 생성을 억제시키고, 알칼리성 인산가수분해효소(ALP) 생성을 활성화시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 골 질환은 골다공증, 파세트 골질환, 구루병, 골연화증, 신부전 환자의 신성골이영양증, 류머티스성 골질환, 퇴행성 골질환, 뼈전이성 병소(bone metastatic lesion), 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환 및 염증성 뼈 흡수질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
나아가 본 발명은 상기 방법으로 제조된 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 인삼 추출물은 염증을 억제하고, 골밀도 및 골함유량을 증가시키는 효과가 있을 뿐 아니라 뼈의 미세구조가 치밀해지는 효과가 우수하여 골질환 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 세포독성이 일어나지 않으며, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에서도 안정한 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 건조인삼 및 가공인삼 추출물의 제조방법 도식화(A)와 그 추출물의 이미지(B)이다.
도 2는 본 발명에 따른 건조인삼 및 가공인삼 추출물의 진세노사이드 표준물질(A)과 함량을 나타낸 그래프(B)이다.
도 3은 본 발명에 따른 뼈건강 예방 또는 치료용 조성물의 MTT assay를 통한 세포 독성 평가를 나타낸 그래프이며 삽입 박스는 세포독성 농도를 나타냈다.
도 4는 본 발명에 따른 뼈건강 예방 또는 치료용 조성물의 MTT assay와 Nitric oxide assay를 통한 세포 독성 평가(A) 및 일산화질소(NO) 생성(B)을 나타낸 그래프이며 삽입 박스는 세포독성 농도를 나타냈다.
도 5는 본 발명에 따른 뼈건강 예방 또는 치료용 조성물의 ALP 염색(A)와 MTT assay를 통한 세포 독성 평가(B) 및 ALP assay를 통한 알칼리성 인산가수분해효소 활성도(C)를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 뼈건강 예방 또는 치료용 조성물의 Alizarin res-S assay를 통한 석회화 결절 형성을 나타낸 그래프이다.
골관절염은 국소 관절에 점진적인 관절연골의 소실 및 그와 관련된 2차적인 변화와 증상을 동반하는 질환으로 성인에서 관절통의 가장 흔한 원인이며 보행 및 일상생활 동작에 제한 등을 일으킨다. 이러한, 관절염환자들에서 골다공증의 위험인자들을 살펴보면, 관절염환자들은 대개 고령의 여성들이며, 질환 자체나 약제들에 의해 생식샘기능저하증을 보이며 조기폐경(45세 이하), 난소기능 부전, 1년 이상 장기적인 이차성무월경증 등이 나타난다. 류마티스관절염을 앓고 있는 남자들에게서도 테스토스테론과 항체형성호르몬이 감소되었다는 보고가 있다. 그 중에서도 가장 문제가 되는 류마티스 관절염에서는 잘 알려져 있듯이 염증에 의한 골감소가 전신과 국소적으로 동시에 일어나서 전신적인 골다공증과 함께 관절주위 골파괴가 심하다.
관절염 환자의 치료 목표는 크게 세 가지로 나눌 수 있다. 첫째는 통증을 최소화하는 것이고, 둘째는 관절의 파괴를 막아 장기적으로 관절 변형과 장애를 최소화하는 것이고, 셋째는 환자에게 부담이 적으면서 효과가 좋은 약물을 환자 개개인에게 맞추어 적절히 이용하는 것이다. 현재 사용되고 있는 치료제로서는 일차적으로 비스테로이드 항염제(Non-steroidal anti-inflammatory drug, NSAID가 사용되고 있으며, 한의학적인 실험 연구로 한약, 약침, 침구치료 등을 이용하여 진통 및 항염증 효과를 입증하고 있다.
한편, 인삼(Panax ginseng C.A Meyer,PG)은 면역기능 강화, 항암, 성기능 강화 등을 비롯한 골다공증 예방효과에 이르기까지 다양한 효과를 가지며, 대부분의 연구가 사포닌 계의 진세노사이드(ginsenoside)를 중심으로 이루어지고 있다. 이들 중 특정 진세노사이드가 AMPK와 BMP-2 신호전달 경로의 활성을 통하여 활발한 조골세포로 분화를 유도하여 골 형성 증가의 효과를 가진다고 알려졌다.
본 발명은 단순히 인삼 내 포함되어 있는 진세노사이드의 효과를 확인한 것이 아니라 골질환 예방 또는 치료 효과가 극대화될 수 있는 인삼 가공방법을 개발하였다는 점에 특징이 있다.
본 발명의 인삼 추출물 제조방법은 다음과 같다.
(a) 인삼을 세척하고 건조하는 단계;
인삼의 동체를 증류수로 세척한 후 0.5㎝의 길이로 절단한 뒤 40℃, 3일 동안 열풍건조기에서 건조한다.
(b) 건조된 인삼을 가공하는 단계;
건조된 인삼을 가압증기멸균기를 이용하여 100 ~ 140℃의 온도에서 0.5 ~ 3kgf/㎠ 압력으로 10분 ~ 40분간 처리할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니지만 가장 바람직하게는 121℃, 1.05 kgf/㎠조건에서 15분 또는 30분 처리할 수 있다. 이때 30분 이상의 가공처리할 경우, 홍삼의 제조법과 유사할 수 있다.
(c) 상기 (b)단계에서 가공처리된 인삼을 추출하는 단계;
가공처리된 인삼은 물, 에탄올, 메탄올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하고, 80 ~ 95℃의 온도에서 2 ~ 3시간 동안 추출할 수 있다. 바람직하게는 물 또는 에탄올 수용액을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 에탄올을 추출용매로 사용할 수 있다. 그리고 추출용매로서 에탄올 수용액은 에탄올 농도가 60% ~ 80%이 되도록 에탄올 수용액을 제조하여 사용하는 것이 추출 효과 면에서 유리하다.
그리고 인삼 및 추출용매를 100 g : 800 ~ 1,200 ㎖ 부피비로, 바람직하게는 100 g : 900 ~ 1,100 ㎖부피비로, 더욱 바람직하게는 100 g : 1,000 ㎖ 부피비로 혼합하여 혼합물을 제조할 수 있고, 상기 추출용매가 800 ㎖ 부피비 미만이면 인삼과 추출용매의 혼합이 불완전하게 되어 유효성분의 추출이 충분하지 않을 수 있고, 1,200 ㎖ 부피비를 초과하면 일정 온도를 유지하며 추출을 하는 방법에 문제가 있을 수 있다.
(d) 인삼 추출물을 농축하는 단계;
인삼 추출물을 냉각 및 여과한 후 농축할 수 있다. 본 발명에서 감압농축은 40℃ ~ 60℃ 하에서, 바람직하게는 40℃ ~ 50℃하에서 수행하는 것이 좋은데, 40℃ 미만에서 감압농축을 수행하면 농축의 시간이 장시간이 될 수 있는 문제가 있을 수 있고, 60℃를 초과하면 유효 성분의 변성이 있을 수 있는 문제가 있을 수 있다.
본 발명의 방법으로 제조된 인삼 추출물은 진세노사이드 Re, Rg1, Rb1, Rc, Rg3 등의 성분으로서, 더욱 바람직하게는 진세노사이드 Re의 성분을 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 방법으로 제조된 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 “골 질환”은 골다공증, 파세트 골질환, 구루병, 골연화증, 신부전 환자의 신성골이영양증, 류머티스성 골질환, 퇴행성 골질환, 뼈전이성 병소(bone metastatic lesion), 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환 및 염증성 뼈 흡수질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 엑기스제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 상기 조성물은 1일 0.0001 내지 1 g/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 200 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
"건강기능식품"이란 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분(기능성원료)을 사용하여 제조한 것으로, 인체의 정상적인 기능을 유지하거나 생리기능 활성화를 통하여 건강을 유지하고 개선하는 식품을 의미한다.
상기 인삼 추출물은 염증을 억제하고 조골세포 분화 활성을 증가시키는 효능을 갖는 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 골 질환은 골다공증, 파세트 골질환, 구루병, 골연화증, 신부전 환자의 신성골이영양증, 류머티스성 골질환, 퇴행성 골질환, 뼈전이성 병소(bone metastatic lesion), 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환 및 염증성 뼈 흡수질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 준비예 >
홍삼, 건조인삼 및 가공인삼 시료 준비
4년근 홍삼은 정관장에서 구입하여 동체를 일정간격(길이 0.5 cm)으로 절단하였다. 인삼은 한국생약협회(Korea Medicine Herbal Association)에서 구입한 것으로, 증류수로 깨끗이 세척하고, 뇌두가 제거된 4년근 인삼 동체를 일정간격(길이 0.5 cm)으로 절단하여 건조기에서 40℃, 2일 동안 열풍건조하여 수분기를 제거하였다. 건조된 인삼을 25g을 기준으로 121℃, 1.05 kgf/㎠에서 15분 또는 30분 동안 가공처리하였다.
< 실시예 1>
건조인삼 물( 열수 ) 추출물 제조방법
준비예에서 제조한 건조인삼 시료를 초음파 세척기(Branson, MO, USA)를 이용하여 불순물을 제거한 후 추출용매로서 물을 건조인삼의 중량 10배 부피로 첨가하였다.
다음으로, 이를 85℃에서 2시간씩 3번 환류 추출한 후 실온(24℃ ~ 25℃)에서 냉각한 뒤 필터페이퍼(Filter paper, No. 4)를 이용하여 여과하고, 회전 감압농축기(Rotavapor RII, Buchi, Switzerland)로 60℃ 이하에서 감압농축한 후 추출물을 동결 건조하여 분말 형태로 초저온 냉동고(-80℃)에 보관하였다. 이상의 방법으로 추출한 시료를 건조인삼 물(열수) 추출물로 사용하였다.
< 실시예 2>
건조인삼 에탄올 추출물 제조방법
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 건조인삼 및 가공인삼 추출물을 제조하되, 추출용매로서, 물 대신 70% 농도의 에탄올 수용액을 사용하였다. 이상의 방법으로 추출한 시료를 건조인삼 에탄올 추출물로 사용하였다.
< 실시예 3>
가공인삼15 물( 열수 ) 추출물 제조방법
준비예에서 제조한 15분 동안 가공처리된 가공인삼 시료를 초음파 세척기(Branson, MO, USA)를 이용하여 불순물을 제거한 후 추출용매로서 물을 15분 동안 가공처리된 가공인삼의 중량 10배 부피로 첨가하였다.
다음으로, 이를 85℃에서 2시간씩 3번 환류 추출한 후 실온(24℃ ~ 25℃)에서 냉각한 뒤 필터페이퍼(Filter paper, No. 4)를 이용하여 여과하고, 회전 감압농축기(Rotavapor RII, Buchi, Switzerland)로 60℃ 이하에서 감압농축한 후 추출물을 동결 건조하여 분말 형태로 초저온 냉동고에 보관하였다. 이상의 방법으로 추출한 시료를 가공인삼15 물(열수) 추출물로 사용하였다.
< 실시예 4>
가공인삼15 에탄올 추출물 제조방법
상기 실시예 3과 동일한 방법으로 가공인삼 추출물을 제조하되, 추출용매로서, 물 대신 70% 농도의 에탄올 수용액을 사용하였다. 이상의 방법으로 추출한 시료를 가공인삼15 에탄올 추출물로 사용하였다.
< 실시예 5>
가공인삼30 물( 열수 ) 추출물 제조방법
준비예에서 제조한 30분 동안 가공처리된 가공인삼 시료를 초음파 세척기(Branson, MO, USA)를 이용하여 불순물을 제거한 후 추출용매로서 물을 30분 동안 가공처리된 가공인삼의 중량 10배 부피로 첨가하였다.
다음으로, 이를 85℃에서 2시간씩 3번 환류 추출한 후 실온(24℃ ~ 25℃)에서 냉각한 뒤 필터페이퍼(Filter paper, No. 4)를 이용하여 여과하고, 회전 감압농축기(Rotavapor RII, Buchi, Switzerland)로 60℃ 이하에서 감압농축한 후 추출물을 동결 건조하여 분말 형태로 초저온 냉동고(-80℃)에 보관하였다. 이상의 방법으로 추출한 시료를 가공인삼30 물(열수) 추출물로 사용하였다.
< 실시예 6>
가공인삼30 에탄올 추출물 제조방법
상기 실시예 5와 동일한 방법으로 가공인삼 추출물을 제조하되, 추출용매로서, 물 대신 70% 농도의 에탄올 수용액을 사용하였다. 이상의 방법으로 추출한 시료를 가공인삼30 에탄올 추출물로 사용하였다.
상기 모든 제조과정을 도 1에 도시하였다.
하기 실험예 1 ~ 6의 모든 실험군은 3개 이상 수행하였으며 정량적 결과는 본 연구에 대한 실험결과는 통계분석 SAS 8.2를 이용하여 ANOVA(Analysis of variation) 검정을 실시한 후 Duncan's Multiple Range Test(DMRT)의 다중범위검정과 two-tailed Student’s t-test로 p < 0.05 수준에서 유의성을 검증하였고, 대조군에 대한 백분율로 평균 ± 표준편차로 나타냈다.
< 실험예 1>
사포닌 함량 측정
상기 실시예에서 추출한 건조인삼과 가공인삼의 열수 추출물 및 에탄올 추출물의 사포닌 함량을 알아보기 위하여 HPLC를 이용하여 분석하였다. 이때 컬럼은 μBondapakTM C18 Column(10 μm, 3.9 × 300 mm, Waters)을, 검출기는 Jasco UV detector(203nm)를 사용하였다. 이동상으로는 물(A)과 acetonitrile(B)의 gradient system을 사용하였으며 B를 기준으로 20%(0분), 20%(5분), 33%(40분), 80%(60분), 80%(75분), 20%(80분), 20%(90분)이었다. 이동상 유속은 분당 1.0 mL이었으며 시료주입량은 20 μL, 분석온도는 35℃이었다. 대조군으로 4년근 홍삼을 이용하였다.
실시예 1 ~ 6를 각각 서로 비교해 보면, 홍삼 물 추출물(RG-D)과 홍삼 에탄올 추출물(RG-E)에서 높은 함량을 보이는 Rg3의 경우, 건조인삼 물 추출물(dPG-D)과 건조인삼 에탄올 추출물(dPG-E) 및 15분 처리 가공인삼 물 추출물(pPG15-D)에서는 검출되지 않은 반면, 30분 처리 가공인삼 물 추출물(pPG30-D), 15분 처리 가공인삼 에탄올 추출물(pPG15-E), 30분 처리 가공인삼 에탄올 추출물(pPG30-E)에서 현저히 적은양이 검출되어 본 발명의 30분 처리 가공인삼은 홍삼과 다른 시료임을 제시하고 있다.
진세노사이드 Re의 경우, 모든 물 추출물 시료에서 검출되지 않은 반면 모든 에탄올 추출물에서는 검출되었다. 특히, 30분 처리 가공인삼 에탄올 추출물(pPG30-E)에서 현저하게 증가된 함량을 보임을 알 수 있었다(표 1 및 도 2 참조).
Figure 112016119861243-pat00001
< 실험예 2>
마우스 대식세포 생존율 평가
상기 실시예 1~ 6의 냉동 건조 추출물 각각을 DPBS(Dulbecco's, phosphate buffered saline, Daegu, Korea)에 하기 표 2와 같은 농도로 희석하여 염증 억제 평가용 조성물을 각각 제조한 후, 하기 표2와 같은 방법으로 마우스 대식세포의 생존율을 측정하였다.
Figure 112016119861243-pat00002
(1) 마우스 대식세포 배양
마우스 대식 세포주 RAW264.7 세포는 ATCC(American Type Culture Collection; Rockville, MD, USA)로부터 구입하였으며, RAW264.7 세포는 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco-BRL사)와 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, 100 U/㎖, 100 ㎍/㎖, Gibco-BRL사)이 포함된 DMEM 배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Bremen, Germany)에 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 첨가하여 5% CO2,37℃배양기(incubator)에서 계대 배양하였다.
(2) 세포 생존율 측정
상기 표 2의 농도를 갖는 추출물 각각의 RAW264.7 세포에 대한 생존 및 간접적 독성평가를 위하여 MTT assay를 시행하였다.
96-well plate에 1×104cells/well농도로 분주하여 DMEM에 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신의 조건으로 24시간 동안 안정화시켰다. 다음으로, 상기 표 2의 농도를 갖도록 실시예 1 ~ 6의 추출물로 제조한 조성물로 처리하였다. 그리고, 각 추출물을 처리하지 않은 군을 대조군으로 설정하였다. 배양 24시간 후 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) 용액 2 ㎎을 첨가하여 5% CO2, 37℃배양기에서 2시간 동안 반응시킨 뒤 생성된 포마잔 결정(formazan crystals)을 DMSO(dimetyl sulfoxide)로 용해하였다. 그리고, 이를 ELISA reader(BIO-RAD 450, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 확인하였다. 그 결과를 하기 표 3 및 도 3에 나타내었다.
Figure 112016119861243-pat00003
상기 표 3의 세포생존율 측정 결과를 살펴보면, 실시예 1은 250 ㎍/㎖, 실시예 2는 100 ㎍/㎖, 실시예 3은 250 ㎍/㎖, 실시예 4는 100 ㎍/㎖, 실시예 5는 100 ㎍/㎖, 그리고 실시예 6의 경우 1,000 ㎍/㎖에서 세포안정성 수준의 적정농도를 보였다.
< 실험예 3>
염증 억제 평가
(1) 세포 생존율 측정
마우스 대식세포의 염증유도 후 세포 증식율을 평가하기 위하여 96-well plate에 1×104cells/well농도로 분주하여 DMEM에 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신의 조건으로 24시간 동안 안정화시킨 뒤, 각각의 시료(25, 50, 100, 250, 500 ㎍/㎖)와 지질다당체(lipopolyssccharide, LPS) 1 ㎍/㎖을 동시 처리하였다.
배양 24시간 후 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) 용액 2 ㎎을 첨가하여 5% CO2, 37℃배양기에서 2시간 동안 반응시킨 뒤 생성된 포마잔 결정(formazan crystals)을 DMSO(dimetyl sulfoxide)로 용해하였다. 그리고, 이를 ELISA reader(BIO-RAD 450, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 확인하였다. 각 추출물 및 LPS를 처리하지 않은 군을 음성대조군으로, LPS 단독 처리군을 양성대조군으로 설정하였다. 그 결과를 하기 표 4 및 도 4에 나타내었다.
Figure 112016119861243-pat00004
상기 표 4 및 도 4-A에서 LPS와 각각의 시료를 동시처리 후 세포생존율 측정 결과를 살펴보면, 30분동안 가공처리된 가공인삼30 에탄올 추출물(실시예 6)의 250㎍/㎖ 농도에서 LPS 단독처리군에 비하여 23 ~ 33%의 가장 높은 세포 증식율을 보임을 알 수 있었다.
(2) 일산화질소(nitric oxide, NO) 생성량 측정
LPS에 의하여 염증 유도 후 염증 억제 활성을 평가하기 위하여 NO의 정량은 Griess reagent법을 이용하여 정량하였다.
RAW264.7 세포를 96-well plate에 5×104cells/well농도로 분주하여 DMEM에 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신의 조건으로 24시간 동안 안정화시킨 뒤, 각각의 시료(10, 25, 50, 100, 75, 100, 150, 250, 500 ㎍/㎖)와 지질다당체(lipopolyssccharide, LPS) 1 ㎍/㎖을 동시 처리하였다.
24시간 배양한 후 새로운 96 well plate에 배양액의 상층액 80 ㎕와 Griess reagent(1% sulphanilamide와 0.1% naphthylethylendiamide를 포함한 5%(v/v) phosphoric acid) 80 ㎕를 분주하여 실온에서 10분간 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. Standard NO(sodium nitrite)에 대한 표준곡선의 r2 값은 0.99 이상이었다. 각 추출물 및 LPS를 처리하지 않은 군을 음성대조군으로, LPS 단독 처리군을 양성대조군으로 설정하였다. 그 결과를 하기 표 5 및 도 4에 나타내었다.
Figure 112016119861243-pat00005
상기 표 5 및 도 4-B의 그래프를 살펴보면, 마우스 대식 세포주 RAW264.7 세포를 이용하여 LPS에 의해 생성된 일산화질소는 15분 동안 가공처리된 가공인삼15 에탄올 추출물(실시예 4)의 75 ㎍/㎖ 농도와 100 ㎍/㎖에서 LPS 단독처리군에 비하여 25 ~ 46% 억제되었고, 특히, 30분동안 가공처리된 가공인삼30 에탄올 추출물(실시예 6)의 50 ~ 250 ㎍/㎖ 농도에서 LPS 단독처리군에 비하여 8 ~ 82%가 억제되어 가장 뚜렷한 일산화질소 생성 억제를 보였음을 확인할 수 있었다.
< 실험예 4>
조골세포 생존율 평가
상기 실시예 1 ~ 2와 5 ~ 6의 냉동 건조 추출물 각각을 DPBS(Dulbecco's, phosphate buffered saline, Daegu, Korea)에 하기 표 5와 같은 농도로 희석하여 조골세포 분화 활성 평가용 조성물을 각각 제조한 후, 하기와 같은 방법으로 인간유래 조골세포의 생존율을 측정하였다.
Figure 112016119861243-pat00006
1) 인간유래 조골세포 배양
인간유래 조골세포 MG63 세포는 ATCC(American Type Culture Collection; Rockville, MD, USA)로부터 구입하였으며, 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco-BRL사)와 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, 100 U/㎖, 100 ㎍/㎖, Gibco-BRL사)이 포함된 DMEM 배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Bremen, Germany)에 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 첨가하여 5% CO2,37℃배양기(incubator)에서 계대 배양하였다.
(2) 세포 생존율 측정
본 발명에 따른 조성물의 조골세포에 대한 생존 및 간접적 독성평가를 위하여 MG63 세포를 96-well plate(1×104 cells/well)에 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 첨가된 DMEM 배지에 분주하여 24 시간 동안 세포를 안정시켰다.
동일한 배지에 조골세포 분화제를 첨가하였고, 본 발명에 따른 실시예 1 ~6의 추출물을 상기 표4의 농도로 처리한 후 5 % CO2, 37℃ 배양기(incubator)에서 배양 24시간 후 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) 용액 2 ㎎을 첨가하여 5% CO2, 37℃배양기에서 2시간 동안 반응시킨 뒤 생성된 포마잔 결정(formazan crystals)을 DMSO(dimetyl sulfoxide)로 용해하였다. 그리고, 이를 ELISA reader(BIO-RAD 450, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 확인하였다. 조골세포 분화제 단독 처리군을 대조군으로 설정하였다.
그 결과를 하기 표 7 및 도 5에 나타내었다. 이때, 상기 조골세포 분화제(osteoblast stimulate reagents, OS)는 10 mM/L beta-Glycerophosphate disodium salt hydrate, 50 ㎍/㎖ mM ascorbic acid, and 100 nM/L dexamethasone을 포함한다.
Figure 112016119861243-pat00007
상기 표 7 및 도 5-B에서 조골세포 분화제와 각각의 시료를 동시처리 후 세포생존율 측정 결과를 살펴보면, 실시예 1과 2는 1000 ㎍/㎖, 실시예 5와 6은 500 ㎍/㎖, 에서 세포안정성 수준의 적정농도를 보였다.
< 실험예 5>
조골세포 분화 활성 평가
(1) 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase , ALP) 활성측정 및 염색
배양된 MG-63 세포를 6-well plate(5×104 cells/ml)에 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 첨가된 DMEM 배지에 분주하여 24 시간 동안 세포를 안정시켰다. 분화 유도 배지로 교환하고, 각각의 시료를 250 ㎍/㎖ 농도로 처리를 하였다. 2일마다 배지를 교체하였고, 7일 동안 배양한 뒤 배양액을 제거한 후 증류수로 세척한 다음 0.1% Triton X-100을 200 ㎕씩 첨가하여 4℃에서 1시간 용해한 후 13000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 취하였다.
용해된 세포의 상층액 100㎕와 20 mM/L Tris-HCl buffer containing 1 mM/L MgCl 반응용액으로 제조된 15 mM/L p-nitrophenylphosphate(p-NPP) 100 ㎕를 혼합하여 37℃ 배양기에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 0.9 N NaOH을 넣어 반응을 정지시킨 다음, 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, BCA assay 방법을 이용하여 단백질량을 보정하여 최종 ALP 활성도를 측정하였다.
또한, 상기와 동일한 방법으로 96-well plate(8×103 cells/well)에서 7일간 골분화 유도하였다. 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후 10% formalin으로 실온에서 10분간 고정한 다음 SigmaTM BCIP/NBT로 37℃ 배양기에서 1시간 반응시켰다. 증류수로 세척한 후 ALP 반응 이미지를 촬영하였다. 그 결과를 하기 표 8 및 도 6에 나타내었다.
Figure 112016119861243-pat00008
상기 표 8 및 도 5-B에서 조골세포 분화제와 각각의 시료를 250 ㎍/㎖ 농도로 동시에 처리하고, 7일간 분화 유도한 후 알칼리성 인산가수분해효소 측정 결과를 살펴보면, 모든 조골세포 분화 유도제를 처리한 군에서 비처리군에 비하여 높은 활성을 나타냈다. 그러나, 실시예 2, 5, 6의 조골세포 분화제 비처리군 역시 조골세포 분화제 단독처리군에 비하여 유의하게 증가된 활성을 보였다. 특히, 30분간 가공처리된 가공인삼30 에탄올추출물(실시예 6)의 경우, 조골세포 분화제 단독처리군에 비하여 가장 높은 활성(70 ~ 100% 증가)을 보였고, 분화제 비처리군에 비하여 처리군이 25 ~ 39% 증가된 활성을 보였다.
( 2)석회화 결절 형성 측정
MG63 세포로부터 분화된 조골세포의 석회화결절형성은 alizarin red-sulfate (AR-S)를 이용하여 측정하였다. 24-well plate(8×103 cells/well)에 10 % FBS와 1 % 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 첨가된 혈청 DMEM 배지에 분주하여 24 시간 동안 세포를 안정시켰다.
조골세포 유도 분화제 및 각각의 시료 100, 250, 500 ㎍/㎖의 농도로 동시 처리한 후 21일 동안 배양하였다. 매 2일마다 배지를 교체하였다. 배양 21일 후 배지를 제거하고 증류수로 세척한 후, ice-cold 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 4℃에서 30분간 세포를 고정하고, 40 mM AR-S staining 용액으로 실온에서 10분 동안 염색하였다. 증류수로 수세하고 난 뒤 10%(w/v) cetylpyridinium chloride / 10 mM sodium phosphate(pH 7.0)로 15분간 반응시켜 염색제를 용해한 후 용액을 ELISA reader를 이용하여 562 nm에서 흡광도를 확인하였고, 그 결과를 하기 도 6에 나타내었다.
하기 도 6에 따르면, 알리자린 레드(alizarin red)에 염색된 석회화 결절을 용해하여 흡광도를 측정한 결과 모든 각각의 시료(실시예 1 ~ 2, 5 ~ 6)는 조골세포 분화 유도제 비처리군에 비하여 처리군에서 유의하게 높게 형성되었다. 특히, 30분간 가공처리된 가공인삼30 에탄올추출물(실시예 6)의 조골세포 분화 유도제 처리군의 250 ㎍/㎖ 농도에서 조골세포 분화 유도제 단독 처리군에 비하여 51 ~ 91% 증가되어 가장 높은 석회화 결절 형성을 보였다.
따라서, 조골세포 분화활성의 증가는 모든 인삼 추출물이 포함된 처리군에서 뚜렷하게 나타나는 것을 확인할 수 있었고, 특히 가공인삼 에탄올 추출물에 현저하게 증가되었음 확인할 수 있었다. 이는 인삼의 사포닌계 진세노사이드 성분이 영향을 미쳤을 것으로 사료된다.
상기 실시예 및 실험예를 통하여, 본 발명이 제시하는 방법으로 추출한 건조인삼 및 가공인삼 추출물을 뼈 건강 예방 및 개선용 약학적, 기능성식품의 조성물로 제공할 수 있다. 실시예에 따른 건조인삼 및 가공인삼 추출물을 포함하는 조성물은 조골 세포의 분화 활성을 효과적으로 증가시키며, 특히 가공인삼30 에탄올 추출물의 경우 항염의 효과가 우수하여 염증을 동반한 골질환 예방 또는 개선에 효과적이며, 따라서 뼈 건강 예방 또는 개선용 식품 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (9)

  1. (a) 인삼을 세척하고 건조하는 단계;
    (b) 건조된 인삼을 121℃의 온도에서 1.05kgf/㎠ 압력으로 30분간 가공하는 단계;
    (c) 상기 (b)단계에서 가공처리된 인삼을 에탄올 수용액을 용매로 추출하는 단계; 및
    (d) 인삼 추출물을 농축하는 단계를 포함하는, 인삼 추출물 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (c)단계의 추출은 80 ~ 95℃의 온도에서 2 ~ 3시간 동안 추출하는 것을 특징으로 하는, 인삼 추출물 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (d)단계의 농축은 40 ~ 50℃의 온도에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 인삼 추출물 제조방법.
  5. 제1항의 방법으로 제조된 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증, 골연화증, 류머티스성 골질환 및 치주질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 인삼 추출물은 염증을 제거 또는 억제하고, 조골세포 분화 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 인삼 추출물은 일산화질소(NO) 생성을 억제시키고, 알칼리성 인산가수분해효소(ALP) 생성을 활성화시키는 것을 특징으로 하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 삭제
  9. 제1항의 방법으로 제조된 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증, 골연화증, 류머티스성 골질환 및 치주질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 골 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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