KR20130060838A - 골다공증 개선 및 예방 효과를 가지는 가공된 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품 - Google Patents

골다공증 개선 및 예방 효과를 가지는 가공된 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품 Download PDF

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김복득
박정일
김진희
이혜진
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Abstract

본 발명은 골다공증 개선 및 예방용 건강기능식품에 관한 것으로, 진세노사이드 Rg3, Rg5, Rk1의 함량의 합이 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd의 함량의 합보다 더 큰 파낙스속 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 것으로, 상세하게는 본 발명의 가공된 인삼 추출물은 RANKL 유도 파골세포 분화 및 골흡수 관련 유전자 발현을 억제하는 효과가 있음을 확인하였고, 계속된 연구에서 RANKL 처리하여 파골세포로 분화시킨 세포에서 가공 인삼인 선삼의 추출물이 TRAP(+) 다핵세포생성 억제 효과를 나타내었으며, 파골세포 관련 인자인TRAP, NFATc1, JNK 등의 유전자 발현을 억제함을 확인하여 골다공증 및 골질환에 유용하게 쓰일 수 있다.

Description

골다공증 개선 및 예방 효과를 가지는 가공된 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품 {Neutraceutical composition comprising the extract of processed Panax genus plant for treating and preventing osteoporosis}
본 발명은 골다공증 개선 및 예방효과를 가지는 가공된 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품에 관한 것이다.
1. Kumamoto H, Ooya K. ExpreASion of parathyroid hormone-related protein (PTHrP), osteoclast differentiation factor (ODF)/receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand (RANKL) and osteoclastogenesis inhibitory factor (OCIF)/osteoprotegerin (OPG) in ameloblastomas. J Oral Pathol Med. 2004 ; 33(1): 46-52.
2. Reddy SV. Regulatory mechanisms operative in osteoclasts. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 2004; 14(4): 255-70.
3. Pang M, Martinez AF, Fernandez I, Balkan W, Troen BR. AP-1 stimulates the cathepsin K promoter in RAW 264.7 cells. Gene. 2007;403(1-2):151-8.
4. Boyce BF, Yamashita T, Yao Z, Zhang Q, Li F, Xing L. Roles for NF-kappaB and c-Fos in osteoclasts. J Bone Miner Metab. 2005; 23 Suppl: 11-5.
5. Khosla S. Minireview: the OPG/RANKL/RANK system. Endocrinology. 2001; 142(12):5050-5.
6. Han SY, Lee NK, Kim KH, Jang IW, Yim M, Kim JH, Lee WJ, Lee SY. Transcriptional induction of cyclooxygenase-2 in osteoclast precursors is involved in RANKL-induced osteoclastogenesis. Blood. 2005;106(4):1240-5.
7. Yamashita M, Otsuka F, Mukai T, Yamanaka R, Otani H, Matsumoto Y, Nakamura E, Takano M, Sada KE, Makino H. Simvastatin inhibits osteoclast differentiation induced by bone morphogenetic protein-2 and RANKL through regulating MAPK, AKT and Src signaling. Regul Pept. 2010 ;162(1-3):99-108
8. Murakami A, Song M, Ohigashi H. Phenethyl isothiocyanate suppresses receptor activator of NF-kappaB ligand (RANKL)-induced osteoclastogenesis by blocking activation of ERK1/2 and p38 MAPK in RAW264.7 macrophages. Biofactors. 2007;30(1):1-11.
9. Choi HJ, Park YR, Nepal M, Choi BY, Cho NP, Choi SH, Heo SR, Kim HS, Yang MS, Soh Y. Inhibition of osteoclastogenic differentiation by Ikarisoside A in RAW 264.7 cells via JNK and NF-kappaB signaling pathways. Eur J Pharmacol. 2010 ;636(1-3):28-35
10. 고려삼의 이해, 고려인삼학회, p 9, 1995; Advances in Ginseng Research, 고려인삼학회, p 127, 1998)
11. 고려인삼의 이해, 고려인삼학회, pp 9-18, 2008).
12. Kim W.Y. et al, Journal of Natural Products, vol.63, pp1702-1704, 2000;
13 Kwon S W, et al., J. Chromatogr. A, 921(2), pp 335-339, 2001;
14. Yong-Sam Keum, Kwang-Kyun Park, Jong-Min Lee, Kyung-soo Chun., Antioxidant and anti-tumor promoting activities of the methanol extract of heat-processed ginseng. J. CancerLetters .150,PP.41-48,2000.
15. Young C. Kim, So R. Kim, George J. Markelonis, Tae H. Oh., Ginsenosides Rb1 and Rg3 Protect Cultured Rat Cortical Cells From Glutamate-Induced Neurodegeneration. J. NeuroscienceRes .53,PP.426-432,1998.
16. Keun Young Jung, Dong seon Kim, Platelet Activating Factor Antagonist Activity of Ginsenosides. Biol . Pharm . Bull .21.PP.79-80,1998.
17. Kim WY, et al., J. Nat . Prod ., 63(12), pp 1702-1704, 2001 ;
18. Kwon SW, et al., J. Chromatogr . A., 921(2), pp 335-339, 2001
19. 대한민국 특허 10-0192678 약효가 증강된 가공인삼제품, 1999
본 발명의 가공된 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 골대사성 질환 치료 및 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.
대사는 골 형성을 담당하는 조골세포와 골 흡수를 담당하는 파골세포의 작용으로 이루어져 있으며, 이들 세포의 기능이 균형을 이루어 항상성을 유지한다. 그러나, 조골세포 활성이 저하되거나 파골세포 활성이 증가되면 골밀도가 감소하여 골다공증이 유발될 수 있다. 골다공증의 유발 요인으로는 여성의 폐경, 갑상선 기능항진, 당뇨병, 스트레스, 흡연 및 운동 부족, 신체적 노화와 glucocorticoid 계열 약물의 복용 등이 알려져 있다(1-3).
파골세포는 대식세포 계열의 전구세포에서 다양한 분화유발인자들에 의해 분화된다(4-5). 특히, 조골세포로부터 분비되는 RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand)은 파골전구세포 및 파골세포 표면에 존재하는 RANK(receptor activator of nuclear factor kappa B)와 결합하여 파골전구세포가 파골세포로의 분화와 활성화를 유발한다(6). 분화한 파골세포는 NF-B, c-Fos, c-jun, AP-1, NFATc1의 활성화와 MAPK, ERK, JNK, p38 활성화 과정, Src, Akt MITF 활성화등을 통하여 TRAP (tartarate resistant acid phosphatase) cathepsin K, calcitonin receptor 등 파골세포 특이 단백질 발현을 촉진한다(7-9).
파낙스(Panax)속 식물은 식물 분류학상 오가피과 (Araliaceae)에 속하는 다년생 숙근초로서 지구상에 십여종이 알려져 있다. 대표적인 종으로 고려인삼 (Panax ginseng), 화기삼 (Panax quinquefolia), 전칠삼 (삼칠, Panax notoginseng), 베트남삼 (Panax vietnamensis), 죽절삼 (Panax japonicus) 등이 있으며, (고려삼의 이해, 고려인삼학회, p 9, 1995; Advances in Ginseng Research, 고려인삼학회, p 127, 1998) 기타 파낙스속 식물로는 파낙스 엘레가티오르 (Panax elegatior), 파낙스 완지아누스 (Panax wangianus), 파낙스 비핀나티푸스 (Panax bipinnatifidus), 파낙스 슈도진생 (Panax pseudoginseng) 등이 있다.
파낙스속 식물 중 가장 유명한 인삼은 예로부터 아시아 지역에서 가장 널리 사용되어온 생약 중의 하나로, 피로회복, 자양강장, 인지기능개선, 기억력증가, 혈액순환개선, 항암, 항당뇨, 성기능개선, 노화방지, 면역력증강, 혈소판 응집억제 등 많은 약리효능이 알려져 있다 (고려인삼의 이해, 고려인삼학회, pp 9-18, 2008).
한편, 파낙스속 식물을 가열 가공 처리하거나 또는 약산으로 처리하면 진세노사이드 구조에서 일부 당과 알콜기가 떨어져나가 약효가 더 강력한 새로운 구조의 진세노사이드, 즉, 진세노사이드 Rg3, Rg5, Rk1, Rk2, Rk3, Rs1, Rs2, Rs3, F4, Rh2, Rh3, Rh4 등이 생성되는 것이 알려져 있다(Kim W.Y. et al, Journal of Natural Products, vol.63, pp1702-1704, 2000; Kwon S W, et al., J. Chromatogr. A, 921(2), pp 335-339, 2001; Park I.H. et. al., Archives of Pharmacal Research, 25, pp.428-432 and 837-841, 2002).
대한민국 등록특허 제192678호 및 미국 등록특허 제5776460호에는 진세노사이드 (Rg3+Rg5+Rk1)의 함량의 합이 (Rb1+Rb2+Rc+Rd)의 함량의 합보다도 더 커진 가공 파낙스속 식물(이하, 선삼이라 함)에 대하여 기술되어 있으며, 상기 선삼은 인삼(Panaxginseng)을 고열 고압으로 처리하여 약효가 강한 Rg3,Rg5,Rk1의 함량을 획기적으로 높인 가공 인삼이다. 선삼의 약효로는 항암작용(14), 뇌기능 개선작용(15), 혈소판 응집능 차단작용(16) 등이 보고되어있다.
그러나, 상기 문헌들의 어디에도 아직까지 가공된 파낙스속 식물 추출물의 골다공증 치료 및 예방 효과에 대해서는 전혀 기재되거나 교시된 바가 없다.
본 발명자들은, 가공 인삼인 선삼의 추출물을 이용하여 RANKL 유도 파골세포 분화 및 골흡수 관련 유전자 발현을 억제하는 작용에 대해서 평가하고자 하였다. 이를 위하여 사람의 RANKL 처리하여 파골세포로 분화시킨 세포에서 가공 인삼인 선삼의 추출물이 TRAP(+) 다핵세포생성 억제 효과를 측정하였으며, 파골세포 관련 인자인 TRAP, NFATc1, JNK 등의 유전자 발현을 가공 인삼인 선삼의 추출물이 억제함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 해결하기 위해 본 발명은 진세노사이드 Rg3, Rk1, Rg5 함량의 합이 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd의 함량의 합보다 더 높도록 약효성분을 증가시킨 가공된 파낙스속 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 골대사성질환 개선 및 예방용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명은 진세노사이드 Rg3, Rk1, Rg5 함량의 합이 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd의 함량의 합보다 더 높도록 약효성분을 증가시킨 가공된 파낙스속 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 및 골질환 개선용 건강기능성식품을 제공한다.
본원에서 정의되는 가공된 파낙스속 식물은, 바람직하게는 고려인삼 (Panax ginseng), 화기삼 (Panax quinquefolia), 전칠삼 (삼칠, Panax notoginseng), 베트남삼 (Panax vietnamensis), 죽절삼 (Panax japonicus), 파낙스 엘레가티오르 (Panax elegatior), 파낙스 완지아누스 (Panax wangianus), 파낙스 비핀나티푸스 (Panax bipinnatifidus), 또는 파낙스 슈도진생 (Panax pseudoginseng)을 인위적으로 가공시킨 식물을 포함하며, 보다 바람직하게는 고온에서 가열처리함으로써 약효가 증강된 가공인삼에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 인삼을 120 내지 180℃의 고온에서 0.5 내지 20시간 동안 가열처리하여 진세노사이드 (Rg3+Rg5)/(Rc+Rd+Rb₁+Rb₂)의 비율이 1.0이상이 되도록 약효성분을 증가시킨 가공인삼을 포함한다.
상기 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는, 물 또는 10 내지 100% 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는, 약 50 내지 90% 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 추출물을 포함한다.
본원에서 정의되는 상기 골 대사성 질환은 골다공증(osteoprosis), 파제트병(paget disease), 치주질환(periodontal disease), 골전이암(metastatic cancer) 또는 류마티스 관절염(rheumatoid arthiritis), 바람직하게는 골다공증을 포함하는 것을 특징으로 한다.
이하 본 발명의 추출물을 수득하는 방법을 보다 상세하게 설명한다.
예를 들어, 파낙스속 식물의 열매, 줄기 또는 뿌리를 각각 세척 및 건조시킨 후, 상기 파낙스속 식물은 120 내지 180℃의 고온에서 0.5 내지 20시간 동안 가열처리한 후에 상기 개개 시료 중량의 약 1배 내지 30배, 바람직하게는 약 5배 내지 15배 (w/v) 부피의 물, C1 내지 C4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매로, 바람직하게는 물 또는 에탄올, 보다 바람직하게는 물 또는 50 내지 90% 에탄올을 추출용매로 하여, 약 70 내지 120℃, 바람직하게는 80 내지 110℃의 반응온도에서 약 1 내지 6시간, 바람직하게는 3 내지 5시간 동안 가열추출법, 초음파 추출법, 환류 추출법 등의 통상적인 추출방법, 바람직하게는 환류 추출법으로 1 내지 10회, 바람직하게는 2 내지 7회 반복 추출하는 제 2단계; 상기 단계에서 수득한 추출액을 여과 및 감압 농축하는 제 3단계를 통하여 본 발명의 가공된 파낙스속 식물 추출물을 수득가능하다.
또한 본 발명은 상기한 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 가공된 파낙스속 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 골대사성질환 개선 및 예방을 위한 건강기능식품을 제공한다.
상기에서 제조된 추출물은 RANKL 유도 파골세포 분화 및 골흡수 관련 유전자 발현을 억제하는 효과가 있음을 확인하였고, 이를 연구에서 RANKL 처리하여 파골세포로 분화시킨 세포에서 가공 인삼인 선삼의 추출물이 TRAP(+) 다핵세포생성 억제 효과를 나타내었으며, 파골세포 관련 인자인 TRAP, NFATc1, JNK 등의 유전자 발현을 억제함을 확인하여 골다공증 및 골질환에 유용하게 쓰일 수 있다.본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 생약 추출물을 0.1 내지 50% 중량으로 포함한다.
그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.
본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.01 내지 95 %, 바람직하게는 1 내지 80 % 중량백분율로 포함한다.
또한, 본 발명은 목적 질환의 예방 및 개선 효과를 목적으로 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.
본 발명의 추출물을 포함하는 건강기능식품은 목적 질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.
또한, 본 발명은 목적 질환의 예방 및 개선 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 시료는 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 시료 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
상기와 같이, 본 발명의 가공된 인삼 추출물은 RANKL 유도 파골세포 분화 및 골흡수 관련 유전자 발현을 억제하는 효과가 있음을 확인하였고, 이를 연구에서 RANKL 처리하여 파골세포로 분화시킨 세포에서 가공 인삼인 선삼의 추출물이 TRAP(+) 다핵세포생성 억제 효과를 나타내었으며, 파골세포 관련 인자인 TTRAP, NFATc1, JNK 등의 유전자 발현을 탁월하게 억제함을 확인하여, 골대사성 질환 개선 및 골질환 예방 및 개선에 유용하게 쓰일 수 있다.
도 1은 본 발명의 가공인삼 추출물 (SG) 농도에 따른 RANKL 처리 RAW264.7 세포로부터 TRAP(+) 다핵세포 형성에 미치는 영향을 나타낸 도이며,
도 2는 본 발명의 가공인삼 추출물 (SG) 농도에 따른 TRAP 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며,
도 3는 본 발명의 가공인삼 추출물 (SG) 농도에 따른 NFATc1 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며,
도 4는 본 발명의 가공인삼 추출물 (SG) 농도에 따른 JNK 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 이는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용은 이에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 가공 인삼 추출물의 제조
김 등의 방법 (Kim WY, et al., J. Nat . Prod ., 63(12), pp 1702-1704, 2001; Kwon SW, et al., J. Chromatogr . A., 921(2), pp 335-339, 2001)에 의하여 특수가공인삼을 제조하였다.
즉, 건조된 인삼(금산 인삼시장)을 잘게 자른 후, 120℃, 15 기압에서 4시간 동안 수증기를 이용하여 가열하였다. 가공된 인삼(이하 선삼이라 함) 1 kg에 80% 에탄올 2 L를 가하고 수욕상에서 4시간 이상 환류 추출하여 얻어진 추출물을 감압 농축한 다음 동결 건조하여 추출분말 약 300 g 을 수득하였다. 실험 시에는 선삼 추출물(이하 SG라 함)을 DMSO(Sigma D-2650)를 이용하여 배지에 녹인 후, pore size 0.45 ㎛의 여과지를 통과시킨 후 사용하였다. 실험에 사용한 선삼 추출물의 (Rg3 + Rg5 + Rk1)/(Rb1 + Rb2 + Rc + Rd)= 6.1 이었다.
실시예 2. 선삼 추출물의 사포닌 함량 분석
실시예 1에서 얻은 본 발명에 따라 제조된 가공인삼에 함유된 인삼사포닌 성분을 다음과 같은 방법에 의해 분석하였다.
40㎖ 용적의 스테인레스 스틸 용기 4개에 각각 백삼 5g과 물 5㎖를 가한 후 밀폐하여 각각 110℃에서 2시간, 120℃에서 2시간 및 3시간 및 130℃에서 2시간 동안 가열하였다. 가열이 끝난 가공인삼, 및 시판품인 백삼 및 홍삼 각 5g 씩을 취하여 메탄올 100㎖씩으로 3회 추출하고 농축시킨 후에 물에 현탁시키고 에테르 100㎖씩으로 3회 추출하였다. 남은 수층을 부탄올 100㎖씩으로 3회 추출한 후에 부탄올 분획을 농축시키고, 수득된 농축물을 메탄올에 용해시켜 HPLC(컬럼: LiChro- sorb NH₂, 이동상: CH₃CN/H₂O/i-PrOH=80/5/15→80/20/15, 검출기: ELSD(Evaporative light scattering detector))로 분석하였다. 측정된 결과는 다음 표 1에 기재된 바와 같다.
사포닌
샘플		 Rb1 Rb2 Rc Rd Rg3 Rg5 (Rg3+Rg5)/
(Rc+Rd+Rb1+Rb2)
120/3시간 10.82 6.91 8.52 7.64 28.01 14.01 1.24
120/2시간 10.46 7.74 10.66 5.58 24.12 11.35 1.03
130/2시간 4.06 3.44 3.98 3.82 21.00 16.17 2.43
110/2시간 19.02 11.55 10.68 8.37 7.02 4.39 0.23
백삼 22.15 3.25 5.86 2.47 0.00 0.00 0.00
홍삼 30.11 9.69 12.45 1.76 1.05 1.05 0.01
상기 표 1에 기재된 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 가열처리하여 수득한 가공인삼은 수삼, 백삼 및 홍삼 등에는 거의 또는 전혀 존재하지 않는 인삼 사포닌인 Rg3 및 Rg5 성분의 함량이 현저히 증가하여 우수한 약효를 나타낸다.
상기한 바와 같은 결과에 따라 인삼에 대한 가열온도의 변화에 따른 사포닌 성분, 특히 진세노사이드 Rg3 및 Rg5의 함량 변화를 더욱 구체적으로 확인하기 위하여 가열을 100℃, 110℃, 120℃, 130℃, 150℃, 160℃, 180℃ 및 200℃에서 2시간씩 행하여 얻어진 인삼들의 Rg3 및 Rg5 함량을 측정하여 가열처리하지 않은 인삼(수삼)에서의 함량과 비교하여 보았다. 그 결과는 다음 표 2에 기재한 바와 같다.
가열온도
(시간)
종류		 비처리
(수삼)		 100
2시간		 110
2시간		 120
2시간		 130
2시간		 150
2시간		 160
2시간		 180
2시간		 200
2시간
Rg3 0.00 0.02 0.08 0.17 0.86 0.44 0.45 0.35 0.23
Rg5 0.00 0.02 0.05 0.08 0.44 0.53 0.56 0.48 0.38
주) 각각의 성분함량은 사용한 수삼의 양에 대한 함량 %로 나타낸 것이다.
상기에서 보는 바와 같이 본 발명에서와 같이 120 내지 180℃에서 가열처리된 가공인삼의 경우에 Rg3 및 Rg5와 같은 진세노사이드의 함량이 비처리 수삼이나 홍삼(100℃ 가열)의 경우에 비해 현저히 증가하였음을 알 수 있다. 실험에 사용한 선삼 추출물의 (Rg3 + Rg5 + Rk1)/(Rb1 + Rb2 + Rc + Rd)= 6.1 이었다.
실험예 1. 세포 배양 및 약물처리
실험에 사용한 RAW 264.7 세포는 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)/10% FBS(fetal bovine serum)/PC-SM 배지를 이용하여 CO2 세포배양기에서 배양하였으며, 세포수는 5x103 cells/well 로 96 well plate를 이용하여 배양하였다. 24시간 배양 후 배양액을 버린 후, 10 % FBS, 50 ng/ml RANKL, 1 ng/ml TGFb 가 첨가된 a-MEM 으로 교환하여 세포를 배양했다. 배양액에 여러 농도의 AS를 첨가해 주었다. 2일에 한번씩 동일한 배지로 교환해 주면서 6일간 배양하였다. 실험군은 (1) RANKL 처리하지 않은 대조군(N) (2) RANKL 유도 대조군(C), (2) RANKL 유도군 + 1/의 실시예1의 본 발명의 가공인삼 추출물 (SG)을 투여한 군(CM 0.1), (3) RANKL 유도군 + 5/의 실시예1의 본 발명의 가공인삼 추출물 (SG)을 투여한 군(CM1)으로 하였다.
실험예 2. 파골세포 생성능 측정
RANKL(receptor activator for nuclear factor B ligand)로 RAW 264.7 cell를 파골세포로 유도한 후, 성숙한 파골세포의 발현 marker로 알려진 TRAP를 염색하여 TRAP-positive한 다핵세포(TRAP(+) MNCs)를 확인하였다. 분화시킨 세포를 PBS로 세포를 2회 세척하고, 3.7% formaldehyde -citrate-acetone 용액으로 10분 고정시키고 증류수로 2회 세척하였다. 2% TRAP fast garnet GBC base 용액과 NaNO3 용액을 같은 비율로 섞어 만든 용액과 5% naphtha AS-BI phosphoric acid, 4% acetic acid, 2% tartaric acid를 포함한 용액을 고정시킨 세포에 처리하고 상온에 30분 이상 방치하였다. 광학현미경으로 관찰하여 핵이 3개 이상인 TRAP-positive 한 다핵세포 (TRAP(+) MNCs)를 계수하여 파골세포의 생성지표로 하였다(15).
실험예 3. 유전자 발현에 대한 영향
상기 실시예 1의 본 발명의 가공인삼 추출물 (SG)의 파골세포 분화 및 증식 관련 인자인 TRAP, NFATc1, JNK 등의 유전자 발현에 대한 영향을 알아보기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.
3-1. 총 RNA 분리
파골세포로 분화한 TRAP(+) 다핵세포에 1 ml 트리졸 용액 (인비트로젠, USA)를 처리하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA에 100 페놀과 100 클로로포름 : 아이소아밀알코올 (24:1)을 넣고 잘 섞은 후 원심분리하는 과정을 2번 반복하여 상층액을 분리한다. 0.5 ml 아이소프로필 알코올을 이용하여 RNA를 침전시킨 후 70% 에탄올로 세척하고 자연 건조시킨다. 알에네이즈 프리워터 (RNAase free water, 프로메가, 미국)에서 RNA를 녹인 후 알에네이즈-프리-디에네이즈 (RNase-free DNase, 프로메가, 미국)를 첨가하고 -70oC에 저장하였다.
3-2. cDNA 제조
상기 실험예 3-1에서 분리한 대조군 및 실험군 각각의 전체 RNA액 (13 ug RNA 함유)에 올리고 dT 1 을 넣은 후 조심스럽게 혼합한 다음, 70oC에서 5분간 배양하였다. 프라이머가 풀리도록 실온에서 약 10분간 방치한 다음, 사스크립트 버퍼 (cyscript buffer), 0.1 M DTT, dUTP 뉴클레오티드, dUTP 시다이-표지된 뉴클레오티드, 사스크립트 역전사효소 (Cyscript reverse transcriptase)를 첨가한 후, 아주 조심스럽게 혼합하였다. 이 후, 42oC에서 90분간 배양한 후, 얼음 상에 방치하였다. 여기에 2.5 M 수산화나트륨을 가한 후 37oC에서 15분간 배양하였으며, 2 M HEPES 버퍼를 가하여 중화시켜 cDNA를 제조하였다.
3-3. Real time RT - PCR
우선 시험관에 정량한 RNA 5 ug, 50 ng/의 랜덤 헥사머 (random hexamer) 3 , 10 mM dNTP 1 를 넣고 DEPC-H2O를 가하여 10 의 RNA/프라이머 혼합물을 만들었다. 실험용 sample을 65℃에서 5분간 배양시킨 후 1분 이상 얼음에 방치하였다. 반응 혼합물로 10배의 RT 버퍼 2 , 25 mM 염화마그네슘 4 , 0.1 M DTT 2 , RNAase(프로메가, 미국) 1 을 섞어 준비하였다. 반응 혼합물을 RNA/프라이머 혼합물에 가하여 섞고 실온에 2분간 방치한 후, SuperScript II RT (프로메가, 미국) 1 (50 units)를 가하고 25oC에 10분간 배양 시켰다. 다시 42oC에서 50분간 배양 시킨 다음, 70oC에서 15분간 가열하여 불활성 시키고 얼음 상에서 식혔다. RNase (프로메가, 미국)1 를 가하고 다시 37oC에서 20분간 배양 시킨 다음, 사용 시까지 -20oC에 보관하였다. 각각의 옵티컬 튜브 (optical tube, 깁코, 미국)에 2배의 사이버 그린믹스 (SYBR Green Mix, 다카라, 일본) 12.5 , cDNA 0.2 , 5 pmol/ 프라이머 쌍 혼합 1 , 11.3 H2O를 넣고, 50oC 2 분 1 사이클, 95oC 10분 1 사이클, 95oC 15초, 60oC 30초, 72oC 30초 40 사이클, 72oC 10분 1 사이클로 증폭시켰다. PCR을 마친 후 튜브를 꺼낸 다음, 반응액 5 ul를 사용하여 3% 아가로스 겔에서 PCR 특이성을 측정했다. SDS 7000 소프트웨어를 사용하여 리얼 타임 PCR (real time PCR) 결과를 분석하였다.
RAW264.7 세포에 RANKL (receptor activator for nuclear factor B ligand) 처리시 TRAP(+) 다핵세포(MNCs) 발현이 증가하여 파골세포 분화가 촉진되었으며, 상기 실시예에서 본 발명의 가공인삼 추출물 (SG)은 0.1 ug/ml, 1 ug/ml, 농도에서 증 RANKL (receptor activator for nuclear factor B ligand) 유도 파골세포 분화를 억제시키는 것으로 나타났다(도 1). TRAP(tartarate resistance Acid Phosphatase), JNK, NFATc1은 RANKL 처리시 발현이 증가하였으며, 상기의 본 발명의 가공인삼 추출물 (SG)은 0.1 ug/ml, 1 ug/ml, 농도에서 증가한 유전자 발현을 현저히 억제함을 확인하였다 (도 2, 도 3 및 도 4 참조). 따라서 본 발명의 가공인삼 추출물 (SG)은 TRAP, NFATc1, JNK 유전자 발현을 억제하는데 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.
통계처리는 스튜던트의 t-검정을 이용해 개별 비교를 하였으며, p값이 0.05 미만일 때 유의한 차이가 있는 것을 판정하였다.
하기에 본 발명의 추출물을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
SG 추출물 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
SG 추출물 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
SG 추출물 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캅셀제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캅셀제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
SG 추출물 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4 ,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
SG 추출물 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

Claims (6)

  1. 진세노사이드 Rg3, Rk1, Rg5 함량의 합이 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd의 함량의 합보다 더 높도록 약효성분을 증가시킨 가공된 파낙스속 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 대사성 질환 개선 및 예방용 건강기능식품.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 파낙스속 식물은 고려인삼 (Panax ginseng), 화기삼 (Panax quinquefolia), 전칠삼 (삼칠, Panax notoginseng), 베트남삼 (Panax vietnamensis), 죽절삼 (Panax japonicus), 파낙스 엘레가티오르 (Panax elegatior), 파낙스 완지아누스 (Panax wangianus), 파낙스 비핀나티푸스 (Panax bipinnatifidus), 또는 파낙스 슈도진생 (Panax pseudoginseng)을 인위적으로 가공시킨 식물을 특징으로 하는 건강기능식품.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 파낙스속 식물은 인삼을 120 내지 180℃의 고온에서 0.5 내지 20시간 동안 가열처리하여 진세노사이드 (Rg3+Rg5)/(Rc+Rd+Rb₁+Rb₂)의 비율이 1.0이상이 되도록 약효성분을 증가시킨 가공인삼임을 특징으로 하는 건강기능식품.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매인 건강기능식품.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 골 대사성 질환은 골다공증(osteoprosis), 파제트병(paget disease), 치주질환(periodontal disease), 골전이암(metastatic cancer) 또는 류마티스 관절염(rheumatoid arthiritis)인 건강기능식품.
  6. 제 5항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 건강기능식품.
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