KR101898977B1 - 페놀계 화합물을 포함하는 염증성 질환 치료용 조성물 - Google Patents

페놀계 화합물을 포함하는 염증성 질환 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 페놀계 화합물 (Phenolic compound)을 포함하는 염증성 질환 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 페놀계 화합물은 염증 유발성 사이토카인 등과 같은 다양한 염증 매개 물질들의 발현 및 활성을 억제시켜 우수한 항염증 효과를 나타냈을 뿐만 아니라, 이에 따른 유효한 치료효과를 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델에서 확인할 수 있었는바, 기존의 염증성 질환의 치료제를 대체할 수 있는 유효 물질로 활용될 수 있을 것이다.

Description

페놀계 화합물을 포함하는 염증성 질환 치료용 조성물 {Composition comprising phenolic compound for treating inflammatory disease}
본 발명은 페놀계 화합물 (Phenolic compound)을 포함하는 염증성 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
염증은 세포 또는 조직이 어떠한 원인에 의해 손상을 받을 경우, 그 반응을 최소화하고 손상된 부위를 원상으로 회복시키려는 일련의 방어 현상으로서, 신경 및 혈관, 림프관, 체액 반응, 세포 반응을 일으켜 결과적으로 통증, 부종, 발적, 발열 등을 일으켜 기능장애를 유발한다. 염증을 유발하는 원인으로 외상, 동상, 화상, 방사능 등에 의한 물리적 요인과 산 (acid)과 같은 화학물질에 의한 화학적 요인 및 항체 반응에 의한 면역학적 요인들이 있으며, 그 외에 혈관이나 호르몬 불균형에 의해서도 발생한다. 외부 자극으로 손상된 세포들은 염증 유발 사이토카인 (Pro-inflammatory cytokine), 케모카인 (Chemokine), 인터루킨 (Interleukine), 인터페론 (Interferon) 등의 다양한 생물학적 매개 물질을 분비하여 혈관 확장이 일어나고, 투과성이 높아짐에 따라 항체, 보체, 혈장 (Plasma), 식균 세포들이 염증 부위로 몰려들게 되며, 이러한 현상이 홍반의 원인이 된다. 염증을 소실시키기 위하여, 염증 관련 생체 반응 및 증상을 감소시키는 작용을 하는 약물, 즉, 항염증제로 이용되고 있는 물질로는 비스테로이드계에 이부프로펜 (Ibuprofen), 인도메타신 (Indomethacin) 등이 있고, 스테로이드계에는 덱사메타손 (Dexamethasone) 등이 있으나, 이들의 부작용으로 인해 그 사용이 제한되고 있는바, 새로운 항염증 제제의 개발이 요구되는 실정이다.
한편, 대표적인 염증성 질환 중 하나인 류마티스 관절염 (Rheumatoid arthritis)은 관절활막 (Synovium)의 염증을 주된 특징으로 하는 전신 질환으로서, 만성 경과를 거쳐 관절의 변형과 장애를 유발하게 된다. 일반적으로 인구의 1%가량에서 발병되며, 여성은 남성의 2.5배에 이르는 유병률을 가진다. 모든 연령대에 발병할 수 있으나, 40대에서 70대 사이의 연령대에 가장 흔하며 연령에 따라 발병률이 증가한다. 류마티스 관절염의 원인은 아직 완전히 알려지지 않은 상태이나, 자가 면역 기전으로 인한 염증 반응으로 이해되고 있으며, 발병에는 유전적 소인과 환경적인 요인이 모두 작용할 것으로 추측되고 있다. 최근 류마티스 관절염의 병인과 활막염 (Synovitis)에 대한 이해가 깊어지면서 이를 바탕으로 한 새로운 치료제들이 활발하게 개발되고 있다.
류마티스 관절염에 의한 관절 침범은 전신의 모든 관절에 모두 적용되나, 특징적으로 손과 발의 관절, 특히 근위지간 관절과 중수(족)지 관절을 침범하여 관절의 종창과 통증을 일으킨다. 발병 후 만성적 경과를 밟게 되며, 치료를 하지 않은 경우, 염증으로 인한 관절의 변형과 파괴로 관절기능의 영구적 손실을 가져오기 때문에 신속한 진단과 적절한 치료가 필수적이다. 류마티스 관절염은 활막의 염증에 기인하기 때문에 활막염은 류마티스 관절염의 가장 중심적인 병리 소견이다. 정상적인 활막은 1-2 층의 얇은 활막 세포 (Synoviocyte)로 덮여있는 조직인데 반해, 류마티스 관절염에서 보이는 활막은 다음과 같은 변화들을 보인다. 활막 세포의 증식, 염증세포의 침윤, 신생 혈관의 생성, 세포 표면의 부착 물질 (Adhesion molecule)의 발현 증가, 다양한 사이토카인과 단백 분해/분해억제 물질의 발현 등이 가장 뚜렷이 관찰되는 변화이다. 활막에 침윤한 염증 세포들은 대개 단핵구들로서 T 세포, B 세포, 대식세포 (Macrophage), 그리고 형질 세포 (Plasma cell) 등의 세포로 이루어져 있다. 활막 세포의 증식과 침윤한 염증 세포로 인해 두꺼워진 활막 중 일부는 인접하는 연골과 골로 국소 침습하는 성질을 띠게 되는데, 이는 류마티스 관절염과 다른 염증성 관절염을 구분 짓는 가장 큰 특징이다. 주변 조직을 파고드는 이러한 활막 조직 덩어리를 "pannus"라 부르고, pannus에 의해 국소적으로 파괴된 골은 흔히 방사선학적 검사에서 특징적인 가장자리, 미란 (Marginal erosion)으로 나타난다. T 세포는 활막의 하층 (Sublining layer)을 침윤하는 염증세포 중 많은 부분을 차지한다. T 세포의 활성화와 활막으로의 이동은 류마티스 관절염의 초기에 일어난다.
류마티스 관절염의 활막에서 발현되는 사이토카인은 주로 대식세포와 활막 세포로부터 분비되며, 주변의 염증세포들을 활성화/유입시키고 활막 세포의 증식을 촉진하여 활막염을 항진 및 지속시킨다. 활막에서 발현되는 여러 가지 사이토카인 중 대식세포에서 생산되는 종양괴사인자-알파 (Tumor necrosis factor-α, TNF-α)와 인터루킨 (Interleukin)은 상위 사이토카인으로서, IL-6, Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), IL-8, 각종 케모카인 (Chemokine) 및 기질 분해효소 (Matrix metalloproteinases, MMP-1, MMP-3)와 같은 하위 염증 매개물의 생성을 유발하여 염증을 증폭시키고, 활막 세포의 증식을 항진시켜 관절의 손상을 일으킨다. 최근 개발되어 사용 중인 TNF-α 차단제가 류마티스 관절염에 높은 효과를 나타냄은 사이토카인이 염증 지속과 활막 증식에 중요한 역할을 함을 시사하고 있다.
최근 10년간, 류마티스 관절염의 치료는 methotrexate를 근간으로 하는 기존의 Disease modifying anti-rheumatic drug 외에 생물학적 제제들의 개발로 눈에 띄는 발전을 이루었다. 그러나 일부의 환자들은 이들 생물학적 제제의 사용에도 불구하고, 불완전한 반응을 보이거나 전혀 반응을 보이지 않는 경우도 있었으며, 이는 질병 기전에 중심적인 역할을 하는 세포나 매개물이 개개의 환자마다 차이가 있음을 시사한다. 따라서, 활막 세포에서 생리활성 물질의 생산 및 유리를 효과적으로 조절할 수 있는 약물에 대해 연구가 활발히 진행되고 있으나 (한국 공개특허 10-2015-0087552), 아직은 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 염증성 질환의 치료제로 개발 가능성이 있는 신규 물질을 발굴하고자 예의 연구한 결과, 염증 유발성 사이토카인 등 다양한 염증 매개 물질들의 발현 및 활성을 억제시키고, 이에 따른 유효한 항염증 효과를 나타내는 페놀계 화합물을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 페놀계 화합물의 신규한 용도를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하며,
[화학식 1]
Figure 112017035204691-pat00001
상기 화학식 1에서,
R1은 수소, 하이드록시 또는 C1-C5 알콕시를 나타내고;
R2는 수소, 하이드록시, 또는 C1-C5 알킬를 나타내고;
R3 및 R4는 독립적으로 수소, 하이드록시, 또는 C1-C5 알콕시를 나타내고; 및
R5는 C1-C5 알킬, C1-C5 알킬알콜, C1-C5 알킬카르복시, 또는 C1-C5 알킬알데하이드를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 염증성 질환은 아토피, 건선, 피부염, 알레르기, 관절염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 방광염, 신장염, 골반염, 크론병, 궤양성 대장염, 강직성 척추염, 전신 홍반성 낭창 (Systemic lupus erythematodes, SLE), 천식, 부종, 지연성 알레르기 (IV형 알레르기), 이식거부, 이식편 대 숙주 질환, 자가면역 뇌척수염, 다발성 경화증, 염증성 장질환, 낭포성 섬유증, 당뇨성 망막증, 및 사구체 신염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 다른 항염증제와 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 병용투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환의 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 염증성 질환에 대한 치료 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 페놀계 화합물은 염증 유발성 사이토카인 등과 같은 다양한 염증 매개 물질들의 발현 및 활성을 억제시켜 우수한 항염증 효과를 나타냈을 뿐만 아니라, 이에 따른 유효한 치료효과를 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델에서 확인할 수 있었는바, 기존의 염증성 질환의 치료제를 대체할 수 있는 유효 물질로 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 제조예 1에서 제조한 화합물 Ⅰ의 1H NMR 스펙트럼 (250 MHz, MeOH-d4)을 나타낸 결과이다.
도 2는 제조예 1에서 제조한 화합물 Ⅰ의 13C NMR 스펙트럼 (63 MHz, MeOH-d4)을 나타낸 결과이다.
도 3은 비만세포에서, 화합물 Ⅰ 처리에 따른 TNF-α의 분비량 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 비만세포에서, 화합물 Ⅰ 처리에 따른 IL-4의 분비량 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 비만세포에서, 화합물 II-X 처리에 따른 TNF-α 및 IL-6의 분비량 변화를 확인한 결과이다.
도 6은 비만세포에서, 화합물 Ⅰ 처리에 따른 β-Hexosaminidase의 분비량 변화를 확인한 결과이다.
도 7은 비만세포에서, 화합물 Ⅰ 처리에 따른 Histamine의 분비량 변화를 확인한 결과이다.
도 8은 비만세포에서, 화합물 II-X 처리에 따른 Histamine의 분비량 변화를 확인한 결과이다.
도 9는 관절염 환자의 활막 세포에서, 화합물 Ⅰ의 세포독성을 확인한 결과이다.
도 10은 관절염 환자의 활막 세포에서, 화합물 Ⅰ 처리에 따른 염증 유발성 사이토카인 (TNF-α, IL-1, IL-6) 및 기질 분해효소 (MMP-1, MMP-3)의 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 11은 관절염 환자의 활막 세포에서, 화합물 Ⅰ 처리에 따른 신호 전달물질(NF-κB, PI3K, Akt, 및 IKK-α/β 등)의 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 12는 관절염 환자의 활막 세포에서, 화합물 XI 내지 화합물 XIV 처리(10μM))에 따른 염증 유발성 사이토카인 (IL-6) 및 기질 분해효소 (MMP-1)의 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 13은 관절염 환자의 활막 세포에서, 화합물 XIV의 처리 농도 (0.1, 1, 10μM)에 따른 IL-6, MMP-1, 및 MMP-3의 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 14는 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델의 제조과정 및 화합물 Ⅰ의 투여 시기를 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 15는 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델에서, 화합물 Ⅰ 처리에 따른 발바닥 두께의 변화를 확인한 결과이다.
도 16은 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델에서, 화합물 Ⅰ 처리에 따른 관절염 진행지수의 변화를 확인한 결과이다.
도 17은 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델에서, 화합물 Ⅰ 처리에 따른 관절염 발병률의 변화를 확인한 결과이다.
도 18은 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델에서, 화합물 Ⅰ 처리 후 발목과 주변 관절을 X-ray 및 PET-CT로 관찰한 결과이다.
도 19는 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델에서, 화합물 Ⅰ 처리에 따른 면역글로블린 G1 (IgG1)의 분비량 변화를 확인한 결과이다.
도 20은 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델에서, 화합물 Ⅰ 처리에 따른 면역글로블린 G2a (IgG2a)의 분비량 변화를 확인한 결과이다.
도 21은 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델에서, 화합물 Ⅰ 처리에 따른 표현형 Th1 반응의 변화를 확인한 결과이다.
도 22는 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델에서, 화합물 Ⅰ 처리에 따른 표현형 Th17 반응의 변화를 확인한 결과이다.
도 23은 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델에서, 화합물 Ⅰ 처리에 따른 염증 유발성 사이토카인 (TNF-α, IL-1, IL-6) 및 기질 분해효소 (MMP-1, MMP-3)의 분비량 변화를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 화합물의 용도; 및 치료상 유효량의 상기 화합물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 치료방법을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112017035204691-pat00002
상기 화학식 1에서, 바람직하게 R1은 수소, 하이드록시 또는 C1-C5 알콕시를 나타내고; R2는 수소, 하이드록시, 또는 C1-C5 알킬를 나타내고; R3 및 R4는 독립적으로 수소, 하이드록시, 또는 C1-C5 알콕시를 나타내고; 및 R5는 C1-C5 알킬, C1-C5 알킬알콜, C1-C5 알킬카르복시, 또는 C1-C5 알킬알데하이드를 나타낼 수 있으며, 보다 바람직하게, R1은 수소, 하이드록시, 또는 메톡시를 나타내고; R2는 수소, 하이드록시, 메틸을 나타내고; R3 및 R4는 독립적으로 수소, 하이드록시, 또는 메톡시를 나타내고; 및 R5는 메틸, 메틸알콜, 카르복시, 또는 알데하이드를 나타낼 수 있으며, 가장 바람직하게 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은, 4-메틸카테콜; 3,4-다이하이드록시벤질 알코올; 4-하이드록시-벤즈알데하이드; 3,4-다이하이드록시-벤즈알데하이드; 3,5-다이메톡시-4-메틸벤즈알데하이드; 4-하이드록시-3,5-다이메톡시벤즈알데하이드; 4-하이드록시벤조산; 3,4-다이하이드록시벤조산; 4-하이드록시-3-메톡시벤조산; 3-하이드록시-2-메톡시벤조산; 및 2-하이드록시-3-메톡시벤조산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
여기서, "알킬"은 일반적으로 명시된 수의 탄소원자 (예컨대, 1 내지 5개의 탄소원자)를 갖는 선형 및 분지형 포화 탄화수소 기를 의미한다. 알킬기의 예는 제한 없이 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-펜틸, 등을 포함한다. 알킬은 부착이 원자가 필요조건을 위반하지 않는다면 임의의 고리 원자에서 부모기 (Parent group) 또는 기재 (Substrate)에 부착될 수 있다. 마찬가지로, 알케닐 또는 알키닐은, 부착이 원자가 요구조건을 위반하지 않는다면 하나 이상의 비수소 치환기를 포함할 수 있다.
"알콕시"는 알킬-O-를 말하며, 상기에서 알킬은 상기 정의되어 있다. 알콕시기의 예는 제한없이 메톡시, 에톡시 등을 포함한다. 알콕시는 부착이 원자가 필요조건을 위반하지 않는다면 임의의 고리 원자에서 부모 기 (Parent group) 또는 기재 (Substrate)에 부착될 수 있다. 마찬가지로, 알콕시기는 부착이 원자가 요구조건을 위반하지 않는다면 하나 이상의 비수소 치환기를 포함할 수 있다.
또한, 상기 화합물은 당해 분야에서 알려진 다양한 방법을 통해 제조될 수 있으며, 일례로서, 페스탈로티옵시스 속 (Pestalotiopsis sp.) 균주를 배양하여 균주 배양물을 수득하고, 상기 수득한 배양물을 용매로 추출한 뒤, 정제함으로써, 상기 화합물을 제조 또는 수득할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 상기 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산 (Free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다.
본 발명에서 사용되는 용어 "염"은 약학적으로 허용 가능한 유리산 (Free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와, 지방족 모노 또는 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 또는 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 또는 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 纖하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1로 표시되는 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수도 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면, 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
또한, 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용되는 염 뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 이성질체, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 염증성 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 염증성 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, "개체"는 염증성 질환의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하며, 보다 구체적으로 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 조성물에 의한 예방 또는 치료의 대상 질병인 "염증성 질환"은 염증을 주 병변으로 하는 질병을 총칭하는 의미로서, 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 아토피, 건선, 피부염, 알레르기, 관절염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 방광염, 신장염, 골반염, 크론병, 궤양성 대장염, 강직성 척추염, 전신 홍반성 낭창 (Systemic lupus erythematodes, SLE), 천식, 부종, 지연성 알레르기 (IV형 알레르기), 이식거부, 이식편 대 숙주 질환, 자가면역 뇌척수염, 다발성 경화증, 염증성 장질환, 낭포성 섬유증, 당뇨성 망막증, 및 사구체 신염일 수 있으며, 여기에서, 관절염은 세균이나 외상, 자가면역 질환 등과 같은 다양한 원인에 의해 관절 내에 염증성 변화로 유발되는 질환을 말하는 것으로서, 바람직하게 골관절염, 퇴행성관절염, 류마티스 관절염, 박리성 골연골염, 관절 인대손상, 반월상 연골판 손상, 관절의 부정정렬, 무혈성 괴사증, 및 소아 특발성 관절염일 수 있으며, 가장 바람직하게는 류마티스 관절염일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 페스탈로티옵시스 속 (Pestalotiopsis sp .) 균주 배양물 또는 사인 (Amomi Fructus)으로부터 추출 및 정제하여 본 발명의 페놀계 화합물 (화합물Ⅰ 등)을 제조하였으며 (제조예 1 및 2 참고), 이를 비만세포에 처리할 경우, TNF-α, IL-4, IL-6뿐만 아니라, β-헥소사미니다제, 히스타민의 분비가 억제됨을 확인하였다 (실시예 1 참고). 또한, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 화합물 Ⅰ은 관절염 환자의 활막세포에 대한 세포 독성을 나타내지 않았으며 (실시예 2 참고), TNF-α, IL-1, IL-6, 및 기질 분해효소의 발현과 관련 인자인 PI3K, Akt, NF-κB의 활성을 현저하게 억제시킴을 확인하였다 (실시예 3 참고). 또한 상기 결과와 마찬가지로, 대표적인 염증 질환모델인 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델에서도, 항염증 작용에 따른 우수한 치료효과를 나타내었는바, 본 발명의 페놀계 화합물은 염증성 질환의 효과적인 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다 (실시예 4 참고).
본 발명의 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여 (예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 항염증제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 항염증제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 100 내지 500mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면, 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 이때, 상기 건강기능식품 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물에서, 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적 (예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 바람직하게 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 특별한 제한없이 다른 성분들을 필수 성분으로서 함유할 수 있다. 예를 들면, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올일 수 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[제조예]
제조예 1. 화합물 Ⅰ의 제조
1-1. 페스탈로티옵시스 속 ( Pestalotiopsis sp.) F12L0111 균주의 동정 및 배양
제주도에서 채집한 해면동물로부터 수득한 해면시료를 동결건조시켜 보관하였다. 상기 동결건조된 시료를 작은 조각으로 절단하고, 글루코스-이스트 익스트렉트-펩톤 아가 (Glucose-Yeast extract-Peptone agar) 배지에 스탬핑하였으며, 이를 28℃에서 7일간 배양한 뒤, 집락 (Colony)을 순수 분리하였다. 이후, rRNA 서열 분석을 통하여 얻어진 염기서열을 GenBank에서 검색한 결과, 페스탈로티옵시스 속 (Pestalotiopsis sp.) 균주와 99% 상동성을 나타내었다. 이후, 상기 균주는 조 배지로 0.1% (w/v) 글루코스, 0.01% (w/v) 이스트 익스트랙, 0.05% (w/v) 펩톤, 0.8% (w/v) 아가가 함유된 GPA 고체 배지, 생산배지로서 0.1% (w/v) 글루코스, 0.01% (w/v) 이스트 익스트랙, 0.05% (w/v) 펩톤이 함유된 GPA 액체 배지를 사용하여 배양하였다. 구체적으로, 상기 고체배지를 절단하여 생산 배지 1L가 담긴 2L 용량의 접종 플라스크 30개에 각각 접종하였으며, 이를 실온에서 18일간 정치배양 (Stationary culture) 하였다.
이하의 제조예 및 실시예에서, 상기 균주는 '페스탈로티옵시스 속 F12L011'로 명명하였다.
1-2. 화합물의 분리 및 구조 분석
상기 제조예 1-1에서 배양한 페스탈로티옵시스 속 F12L0111 균주의 배양물을 에틸아세테이트 (60L)로 추출하고, 수득된 추출액을 감압건조기로 감압증발시켜 농축하였다. 상기 농축액을 실리카에 흡착시키고, 실리카 배큠 컬럼크로마토그래피 (Silica vaccum column chromatography)를 실시하였다. 이때, 메틸렌클로라이드/메탄올 (100/0-0/100, v/v)을 혼합용매로 사용하였으며, 단계적으로 메탄올 농도를 증가시키면서 용출하였다. 이 중에서, 50% 농도의 메탄올이 함유된 혼합용매로 분획을 용출하였고, 상기 분획을 감압 농축한 후, 용매로 아세토나이트릴과 물을 사용하여 5:95-20:80 농도 구배 하, 용출 유속 6ml/분 조건으로 고속액체크로마토그래피 (컬럼 : Shim-pack ODS, 길이 250mm, 직경 21.5mm)를 통해 용출함으로써, 210nm의 UV 흡수 피크를 32분에서 나타내는 화합물을 수득하였다.
ESIMS 질량분석기 (Electrospray Ionization mass spectrometer)를 통해 화합물의 분자량을 확인하였고, 핵자기 공명 (NMR) (Bruker 250MHz NMR spectrometer)에 의한 1H-NMR, 13C-NMR 스펙트럼을 분석하여 화합물의 분자구조를 확인하였으며, 상기 1H-NMR, 13C-NMR 스펙트럼의 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
Figure 112017035204691-pat00003
상기 실험 결과를 종합해 볼 때, 상기 페스탈로티옵시스 속 F12L0111 균주의 배양물로부터 분리한 화합물은 3,4-다이하이드록시벤질 알코올 (3,4-dihydroxybenzyl alcohol, 화합물 Ⅰ)임을 확인할 수 있었다 (갈색 분말; UV (MeOH) λmax (logε) 207 (3.9), 227 (3.7), 296 (3.5); LRESIMS m/z 163.1 [M+Na]+ ).
제조예 2. 화합물 Ⅱ 내지 Ⅹ 등의 제조 및 이용
2-1. 사인 (Amomi Fructus)으로부터 화합물의 분리 및 구조분석
사인 (9.5kg)을 메탄올 (15L)로 3회 반복 추출하고, 수득된 추출액을 감압 건조기로 감압증발시켜 추출물(440g)을 농축하였다. 상기 농축액을 물에 현탁한 후, 노말헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트로 분액하여, 노말헥산 분획 (120g), 디클로로메탄 분획 (32.7g), 에틸아세테이트 분획 (9.8g), 물 분획 (275.1g)을 얻었다. 이 중 디클로로메탄 분획 (32.7g)으로 실리카 컬럼크로마토그래피 (Silica column chromatography)를 실시하였다. 이때, 디클로로메탄/아세톤 (100/0-0/100, v/v)을 혼합용매로 사용하였으며, 단계적으로 아세톤 농도를 증가시키면서 용출하였다. 이 중에서, 50% 농도의 아세톤이 함유된 혼합용매로 분획을 용출하였고, 상기 분획을 감압 농축한 후, 용매로 메탄올과 물을 사용하여 30:70-60:40 농도 구배하, 용출 유속 6ml/분 조건으로 고속액체크로마토그래피 (컬럼 : Luna C18, 길이 250 mm, 직경 21.2mm)를 통해 용출함으로써, 210nm의 UV 흡수 피크를 나타내는 화합물 II (4-hydroxy-benzaldehyde), 화합물 III (3,4-dihydroxy-benzaldehyde), 화합물 IV (3,5-dimethoxy-4-methylbenzaldehyde), 화합물 V (4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzaldehyde)를 수득하였다.
또한, 100% 아세톤으로 용출한 분획에 대해, 실리카 컬럼크로마토그래피 (Silica column chromatography)를 실시하였다. 이때, 디클로로메탄/메탄올 (10/0, 9/1, v/v)을 혼합용매로 사용하여 두 개의 분획으로 나누었으며, 디클로로메탄/메탄올 (9/1, v/v)로 용출한 분획을 감압 농축한 후, 용매로 메탄올과 물을 사용하여 10:90-55:45 농도 구배하, 용출 유속 6ml/분 조건으로 고속액체크로마토그래피 (컬럼 : Luna C18, 길이 250mm, 직경 21.2mm)를 통해 용출함으로써, 210nm의 UV 흡수 피크를 나타내는 화합물 VI (4-hydroxybenzoic acid), 화합물 VII (3,4-dihydroxybenzoic acid), 화합물 VIII (4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid), 화합물 X (2-hydroxy-3-methoxybenzoic acid)을 수득하였다.
아울러, 에틸아세테이트 분획 (9.8g)에 대해 실리카 컬럼크로마토그래피 (Silica column chromatography)를 실시하였다. 이때, 디클로로메탄/아세톤 (100/0-0/100, v/v)을 혼합용매로 사용하였으며, 단계적으로 아세톤 농도를 증가시키면서 용출하였다. 이 중에서, 100% 디클로로메탄을 용매로 용출한 분획을 감압 농축한 후, 용매로 메탄올과 물을 사용하여 20:80-50:50 농도 구배하, 용출 유속 6 ml/분 조건으로 고속액체크로마토그래피 (컬럼 : Luna C18, 길이 250 mm, 직경 21.2mm)를 통해 용출함으로써, 210nm의 UV 흡수 피크를 나타내는 화합물 IX (3-hydroxy-2-methoxybenzoic acid)를 수득하였다.
핵자기 공명 (NMR) (Bruker 250 MHz NMR spectrometer)에 의한 1H-NMR, 13C-NMR 스펙트럼을 분석하여 화합물의 분자구조를 확인하였으며, 상기 1H-NMR, 13C-NMR 스펙트럼의 결과는 하기에 나타내었다.
Figure 112017035204691-pat00004
2-2. 추가적인 페놀계 화합물의 이용
상기 화합물 I 내지 화합물 X외에도, 유사한 구조를 지닌 페놀계 화합물들의 염증 반응 억제 효과를 비교 및 확인하고자, 화합물 XI (3-하이드록시-4-메톡시벤질 알코올); 화합물 XII (4-메틸카테콜); 화합물 XIII (4-하이드록시-3-메톡시벤질 알코올); 및 화합물 XIV (3,4-다이메톡시벤질 알코올)을 수득하여 실험에 이용하였다.
[실시예]
실시예 1. 비만세포의 염증 유발물질 분비 억제 효과 확인
1-1. 염증 유발성 사이토카인의 분비량 비교
본 실시예에서는, 비만세포에서 본 발명의 화합물 (화합물 Ⅰ- X) 처리에 따른 염증 유발성 사이토카인의 분비량 변화를 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 효소결합 면역흡착 분석법을 이용하여 배양액 내 사이토카인 (TNF-α, IL-4 또는 IL-6)의 농도를 산출하였다 (San Diego, BD biosciences 사). 구체적으로, 항원이 부착된 well에 배양액 및 농도별로 희석한 시료 200μl를 넣고 방치하였다. 120분 후, 세척액으로 3회 세척한 뒤 1차 항체를 100μl씩 첨가하였다. 이를 혼합하고 다시 60분간 방치하였으며, 세척액으로 3회 세척한 후, 2차 항체와 효소 시약을 섞은 혼합시약을 100μl씩 첨가하였다. 반응이 끝난 후, 혼합물을 버리고, 다시 세척액으로 4회 세척한 뒤, 기질 용액을 100μl씩 첨가하였으며, 이후, 실온, 암실의 조건에서 20분간 방치하였다. 반응 후 정지시약 (H2SO4, 2N)을 50μl씩 첨가하여 반응을 정지시키고, 450nm에서의 흡광도를 흡광분석기 (Sunnyvale, Molecular devices 사)로 측정하였다.
그 결과, 도 3 또는 도 4에 나타낸 바와 같이, DNP-HSA (Dinitrophenylated human serum albumin) 처리에 의해 현저하게 증가되었던 TNF-α 분비량이 화합물 Ⅰ의 전처리에 의해 감소되었으며, 이와 마찬가지로, 화합물 Ⅰ에 의해 IL-4 분비량 역시 감소됨을 확인할 수 있었다.
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, IL-6의 분비량이 화합물 II-X의 전처리에 의해 현저하게 감소되었으며, TNF-α의 분비량은, 화합물 VII 또는 X를 전처리한 군에서 유의적인 감소를 확인할 수 있었다.
1-2. β- 헥소사미니다제의 분비량 비교
본 실시예에서는, 비만세포에서 본 발명의 화합물 (화합물 Ⅰ) 처리에 따른 비만세포의 β-hexosaminidase 분비량 변화를 확인하고자 하였다. 우선, RBL-2H3 세포에 100nM의 화합물을 전처리한 뒤, 항-DNP-HSA로 감작시켰다. 이후, 상기 세포에 DNP-HSA를 처리하여 활성화시키고, 세포 내 과립을 유리시켰으며, 이들의 배양액을 회수하여 분비된 β-hexosaminidase의 양을 측정하였다. 구체적으로, 40μL의 시료를 채취하고 동일한 양의 구연산나트륨 (Sodium citrate, 0.1M) 및 4-p-nitrophenyl-N-acetyl-D-glucosamide (1mM)을 혼합하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 200μL의 탄산나트륨 (Na2CO3 , 0.1M)과 탄산수소나트륨 (NaHCO3 , 0.1M) 혼합용액을 첨가하여 반응을 정지시키고, 405nm에서의 흡광도를 흡광분석기 (Sunnyvale, Molecular devices 사)로 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, DNP-HSA 처리에 의해 현저하게 증가되었던 β-hexosaminidase 분비량이 화합물 Ⅰ의 전처리에 의해 감소되었으며, 특히, 종래의 항염증제인 Dexamethasone (1μM)을 처리한 경우의 억제 활성과 비교해 볼 때에도, 큰 차이를 나타내지 않았다.
1-3. 히스타민의 분비량 비교
본 실시예에서는, 비만세포에서 본 발명의 화합물 (화합물 Ⅰ-X) 처리에 따른 비만세포의 히스타민 분비량 변화를 확인하고자 하였다. 우선, RBL-2H3 세포와 RPMCs 세포에 100nM의 화합물을 전처리한 뒤, 항-DNP-IgE로 감작시켰다. 이후, 상기 세포들에 DNP-HSA를 처리하여 활성화시키고 세포 내 과립의 주 함유 물질이자, 알레르기 유발 물질인 히스타민을 유리시켰으며, 이들의 배양액을 회수하여 분비된 히스타민의 양을 측정하였다. 구체적으로, 에펜돌프 튜브에 채취한 시료 (200μL)를 넣고, 80μL의 염산 (0.1N)과 20μL의 60％ 과염소산 용액을 혼합한 후, 원심분리 (13,000g, 20분, 5415R, Eppendorf 사)하였다. 이를 통해 수득한 상등액 (200μL)을 100μL의 NaOH 용액 (5N), 800L의 n-부탄올(n-butanol, 및 200μL의 NaCl (5M) 혼합용액과 함께 시험관에 넣고, 이를 진탕한 후, 원심분리 (13,000g, 20분)하였다. 상기 시험관에서 n-부탄올 (n-butanol) 층 500μL를 수득하고, 여기에 200μL의 염산 (0.1N), 500μL의 n-헵탄(n-heptane)을 첨가하여 진탕한 후, 원심분리 (13,000g, 20분)하여 얻어진 수 층 (150μL)에 40μL의 NaOH (1N), 10μL의 1％ o-프탈디알데하이드 (o-phthaldialdehyde) 용액 (Sigma사, Cat No. P1378)을 첨가하여 혼합하고 5분 동안 방치하였다. 이후, 20μL의 염산 (3N)을 첨가하여 방출파장 (emission wavelength) 440nm, 여기파장 (excitation wavelength) 360nm에서 형광강도를 형광분석기 (GEMINIEM, Molecular Devices 사)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, DNP-HSA 처리에 의해 현저하게 증가되었던 히스타민의 분비량이 화합물 Ⅰ 또는 화합물 IV-X의 전처리에 의해 감소됨을 확인할 수 있었다.
상기의 결과들을 종합해 볼 때, 본 발명의 페놀계 화합물은 TNF-α, IL-4, IL-6와 같은 염증 유발성 사이토카인 및 히스타민의 분비를 효과적으로 억제시킬 수 있었는바, 염증성 질환의 치료을 위한 유효 물질로 활용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2. 관절염 환자 유래 활막세포에 대한 세포 독성 실험
본 실시예에서는, 상기 화합물 Ⅰ 처리에 의한 세포 독성 여부를 확인하고자, 관절염 환자 유래 활막세포를 대상으로 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 실험을 실시하였다. 구체적으로, 인간 활막 세포주인 FLS 세포 (경북대학교 병원, 류마티스 내과)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지 (Dulbecco's modified eagle medium (Cat No. 12800-017), Gibco사 (USA))에 37℃, 2×104 cell/well 농도로 첨가하여 배양한 후, 화합물 Ⅰ을 각각 0.001~100μM로 처리하고 다시 24시간 동안 배양하였다. 이후, 각 웰에 20L의 MTT 용액을 첨가하고 2시간 동안 추가로 배양한 후, 배양액을 제거하고 100L의 디메틸설폭사이드 (dimethylsulfoxide)를 첨가한 다음, 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 화합물 Ⅰ을 처리한 세포의 생존율을 대조군과 비교하였을 때, 처리 농도 0.001-100μM 모두에서, 대조군과 큰 차이를 보이지 않았는바, 이로써, 본 발명의 화합물 Ⅰ은 세포에 대한 독성이 거의 없음을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 관절염 환자 유래 활막세포에 대한 항염 효과 확인
본 실시예에서는, 관절염 환자의 활막세포에서 염증 유발성 사이토카인, 기질 분해효소, 및 관련 인자의 변화를 측정하여 화합물 Ⅰ 처리에 따른 항염 효과를 확인하고자 하였으며, 이를 위하여 하기와 같이 실험을 실시하였다.
3-1. 시약 및 세포 배양
Recombinant Human TNF-α Protein (Catalog # 210-TA)은 R&D 사 (미국)로부터 구입하여 사용하였다. 인간 활막 세포주인 FLS 세포 (경북대학교 병원, 류마티스 내과)는 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지 (Dulbecco's modified eagle medium (Cat No. 12800-017), Gibco 사 (USA))에서 배양하였다.
3-2. 염증 유발성 사이토카인 및 기질 분해 효소의 mRNA 발현 분석
염증의 원인이 되는 생리 활성물질로 알려진 TNF-α, IL-1, IL-6와 기질 분해효소인 MMP-1, MMP-3의 발현에 화합물 Ⅰ이 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 우선, 활막세포에 화합물 Ⅰ을 농도별 (0.1, 1, 10μM)로 처리한 후 TNF-α (10 ng/ml)로 12시간 동안 활성화하였으며, 염증 유발성 사이토카인의 발현을 측정하기 위해 Maxime RT PreMix (Random primer, iNtRON Biotechnology 사)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 구체적으로, 각 튜브 당 2μL의 cDNA, 1μL의 센스 및 안티센스 프라이머 용액 (0.4μM), 12.5μL의 SYBR Premix Ex Taq (Takarabio 사), 9.5μL의 dH2O를 함께 혼합하여 총 25μL가 되도록 하였으며, TNF-α, IL-1, IL-6, MMP-1, 및 MMP-3 mRNA의 발현 정도를 TP850 소프트웨어를 사용해 real-time PCR을 통해 측정하였다.
그 결과, 도 10에서 나타난 바와 같이, 화합물 Ⅰ을 처리한 군은 TNF-α만을 처리한 대조군에 비해 염증 유발성 사이토카인인 TNF-α, IL-1, 및 IL-6와 기질 분해효소인 MMP-1, 및 MMP-3의 발현이 효과적으로 억제됨을 확인할 수 있었으며, 이러한 억제 효과는 화합물 Ⅰ의 농도에 의존적인 경향을 보였다.
3-3. PI3K , Akt , IKK -α/β, NF - κB , MMP1 /3 단백질의 발현 분석
항염 효과와 관련된 정확한 신호전달 기전을 밝히기 위해, 염증성 사이토카인의 전사를 조절하는 인자로서 면역반응과 염증반응을 매개하는 중요한 신호 전달 물질인 NF-κB, 및 그 상위 신호전달 물질인 PI3K, Akt, IKK-α/β의 발현에 화합물 Ⅰ이 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 비활성 상태의 NF-κB는 내인성 억제 단백질인 IBα에 결합하여 비활성화 상태를 유지하며, NF-κB가 활성화될 경우, IBα가 인산화 및 분해되면서 유리되어 핵으로 이동한 뒤, 전사인자로써 작용하므로 IBα의 분해 정도를 측정하였다. 아울러, 기질 분해효소 (Matrix metallo proteinase, MMP)은 관절의 연골기질을 파괴시키는 것으로 알려져 있는바, 관절 파괴에서 중요한 역할을 하는 상기 효소의 발현을 측정하였다. 이를 위하여, 활막세포를 TNF-α로 활성화하고, PI3K, Akt, IKK-α/β, NF-κB, MMP-1,3을 활성화시킨 뒤, 웨스턴블랏을 이용하여 핵과 세포질에서 각각의 단백질의 발현량을 측정하였다. 구체적으로, 활막세포를 0.5mM의 페닐메탄에설포닐 플루오라이드 (Phenylmethanesulfonyl fluoride, Sigma사, Cat No. P7626)와 5μg/mL의 류펩틴 (leupeptin, Sigma 사, Cat No. L2884)을 함유한 추출 완충액 (0.5% triton X-100, 1 mM Na3VO4 등을 함유한 PBS용액)으로 용해시킨 후, DNA를 초음파 분해 (sonication)하였다. 단백질의 양은 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin)을 표준으로 하여 Bio-Rad 사의 protein assay kit (Cat No. 500-0002)를 이용해서 측정하였으며, 세포 총 단백질 10~50μg을 0.1％ SDS가 함유된 8~12％ (w/v) 폴리아크릴아마이드겔 (polyacrylamide gel)에서 전기영동한 뒤, 겔에 존재하는 단백질을 일렉트로블로팅 (electroblotting) 방법으로 니트로셀룰로오스 (nitrocellulose, NC) 필터에 옮겼다. 이후, 비특이적인 결합을 차단하기 위하여 니트로셀룰로오스 필터를 5％ 탈지분유를 함유한 tris-buffered saline-tween(TBS-tween, Sigma 사) 용액에 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 필터를 타겟 단백질에 대한 항체가 함유된 TBS-tween 용액에 넣고 4℃에서 12시간 동안 방치하였고, HRP (horseradish peroxidase, Sigma 사, Cat No. P0889)로 표지된 2차 항체로 표지하였으며, ECL (Enhanced chemiluminescence, Thermo scientific 사, Cat No. 34080)을 이용하여 밴드를 확인하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 활막세포를 TNF-α로 활성화시킨 경우, IB의 분해, 핵 내의 NF-κB의 증가, 그 상위 신호전달물질인 PI3K, Akt, IKK-α/β와 MMP-1, 및 MMP-3의 증가를 확인할 수 있었던 반면, TNF-α로 활성화된 세포에 화합물 Ⅰ을 처리한 경우, TNF-α에 의한 IκBα의 분해 억제, 핵 내의 NF-κB의 감소, PI3K, Akt, IKK-α/β, MMP-1, 및 MMP-3의 감소와 같이 상반된 효과를 확인할 수 있었는바, 본 발명의 화합물 Ⅰ은 NF-κB 및 상위 신호전달물질들의 활성에 대한 억제효과가 있으며, 구체적으로, 핵 내에서 염증 유발성 사이토카인의 유전자 발현에 관여함을 알 수 있었다.
3-4. 추가적인 페놀계 화합물의 염증 유발성 사이토카인 및 기질 분해 효소의 mRNA 발현 분석
상기 실시예 3-2와 동일한 방법으로, 본 발명에 따른 화합물 XI 내지 화합물 XIV가 염증성 사이토카인인 IL-6, 및 기질 분해효소인 MMP-1의 발현에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 화합물 XI, XIII, 및 XIV과 달리, 화합물 XII을 처리한 군에서, 대조군에 비해 염증 유발성 사이토카인인 IL-6와 기질 분해효소인 MMP-1의 발현이 효과적으로 억제됨을 확인할 수 있었으며, MMP-1의 발현의 경우는 종래 치료 물질인 Dexamethasone 의 억제 효과와 근사하였다.
또한, 활막세포에 상기 화합물 XIV를 농도별 (0.1, 1, 10μM)로 처리한 후, IL-6, MMP-1, 및 MMP-3의 발현을 확인한 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 화합물 XII의 농도에 의존적인 경향을 보였다. 상기 결과들로부터, 본 발명의 염증 억제 효과는 치환기 및 치환되는 위치의 차이로부터 비롯되는 것임을 알 수 있었다.
실시예 4. 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델을 이용한 관절염 치료 효과 확인
본 실시예에서는, 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델 (Collagen-induced arthritis (CIA) mouse model)을 이용하여, 대표적인 염증성 질환인 류마티스 관절염에 대한 화합물 Ⅰ의 치료효과를 확인하고자 하였으며, 이를 위하여 하기와 같이 실험을 실시하였다.
4-1. 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물 모델의 제조 및 관절염 심화 정도 평가
류마티스 관절염에 대한 대표적인 동물 모델로서, 콜라겐 유도 관절염 (Collagen-inducedarthritis; CIA) 동물모델의 제조 과정은 도 14에 개략적으로 나타내었다. 구체적으로, 제2형 콜라겐 (bovine CII, Chondrex 사)과 완전 프로인트 보강제 (complete Freund adjuvant, Chondrex 사)를 혼합하여 콜라겐 혼합용액을 제조하였으며, 상기 콜라겐 혼합용액 (100μg)을 8주령 DBA/1J 마우스의 꼬리에 피내 주사하여 1차 면역을 유도하였다. 1차 면역 21일 후, CII와 불완전 프로인트 보강제 (incomplete Freund adjuvant)를 혼합한 후, 이를 다시 접종하여 2차 면역시킴으로써, 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물 모델을 제조하였다.
화합물 Ⅰ의 류마티스 관절염에 대한 치료효과를 확인하기 위해 화합물 Ⅰ을 2mg/kg, 10mg/kg 또는 50mg/kg의 농도로 인산 완충 식염수 (PBS)에 녹인 후, 1차 면역 28일째부터 매일 경구 투여하였다. 관절염 심화 정도는 발 두께 (Foot pad thickness), 관절염 진행 지수 (Clinical arthritis index), 발병률 (Incidence)을 통해 평가하였으며, 상기 관절염 진행 지수는 04점 (0: 부종 없음, 1: 한 개의 관절의 가벼운 부종, 2: 2개 이상 관절의 중등도 부종, 3: 대부분의 관절의 심한 부종, 4: 전체적인 심한 부종)으로 분류하였다. 비교군으로 현재, 상용화 중인 관절염 치료제, 덱사메타손 (Dexamethasone, Sigma 사)을 이용하였으며, 1mg/kg의 농도로 인산 완충 식염수 (PBS)에 녹인 후, 이를 경구 투여하였다.
그 결과, 도 15 및 도 16에 나타낸 바와 같이, 관절염의 유도에 의해 두꺼워진 발의 두께 및 관절염 진행지수가 화합물 Ⅰ을 처리함으로써 각각 감소하는 경향을 보였으며, 도 17에 나타낸 바와 같이, 관절염 발병률도 대조군에 비해 현격하게 감소되었는바, 본 발명의 화합물 Ⅰ의 류마티스 관절염 치료효과를 in vivo 상에서도 확인할 수 있었다.
4-2. 마이크로 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 검사
콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델을 이소플루란 (1~2% 산소 조건)으로 마취시키고 촬영 위치에 보정하였다. 다양한 그룹의 Micro PET 이미지는 꼬리 정맥을 통해 [18F] FDG를 주입한 후 40분 (식염수 150 ㎕, 9.25 MB)에 획득하였다. 각 마우스에 대한 전체 투여 시간은 20분이었으며, Micro PET 이미지 Inveon PET / CT 스캐너 (지멘스 헬스 케어사)를 사용하여 측정하였다.
X-ray 및 Micro PET 이미지를 분석을 한 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, 관절염에 의한 병변 부위가 효과적으로 치유되었음을 확인할 수 있었다.
4-3. 혈청 내 면역글루블린 G1 및 G2a 검사
콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델을 개복하여 복강 내 채혈을 한 다음, 이를 3,000rpm에서 15분간 원심분리하여 혈청 분리하였으며, 상기 혈청에서의 면역글로블린 G1 (IgG1)과 G2a (IgG2a)의 측정은 BD Biosciences사의 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 키트를 사용하여 측정하였다. 구체적으로, 코팅 완충액 (Coating Buffer, 1L 증류수 내 NaHCO3 (8.40g), Na2CO3 (3.56g), pH 9.5)에 포획 항체 (Purified rat anti-mouse IgG1, Anti-mouse IgG2a)를 각각 1:250의 비율로 희석시켰으며, 이를 각 웰에 100μL씩 분주한 뒤, 37℃에서 3시간 동안 반응시키고, 세척 완충액 (0.05% Tween-20 PBS)으로 3회 세척하였다. 이후, Assay Diluent (10% FBS)를 각 웰당 200μL씩 분주한 뒤, 37℃에서 1시간 반응시켰으며, 이를 다시 세척 완충액로 3번 세척하였다. 그 다음, 마우스 혈청을 Assay Diluent에 1:300으로 희석하여 각 웰당 100μL씩 분주한 뒤, 37℃에서 2시간 반응시키고 5회 세척하였으며, 검출 항체 (Biotin rat-anti mouse IgG1, Bioninylatedanti-mouse IgG2a)와 효소 반응액 (SAv-HRP)을 각각 1:250의 비율로 Assay Diluent에 희석하고 각 웰당 100μL씩 워킹 용액 (Working solution)을 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 각각 1분 동안 7회 세척하였다. 마지막으로, 기질 용액 (Substrate solution)을 100μL씩 분주하고 빛을 차단한 상태에서 30분간 방치한 다음, 50μL의 중지 용액 (Stop solution) 용액을 처리한 후, ELISA reader 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 19 및 도 20에 나타낸 바와 같이, 관절염의 발병에 의해 현저하게 증가되었던 혈청 내 IgG1의 농도가 화합물 Ⅰ의 처리에 의해 감소되었고, 상기 결과와 마찬가지로, IgG2a의 농도 역시 감소됨을 알 수 있었다. 특히, 종래의 항염증제인 Dexamethasone (1mg)을 처리한 경우의 IgG1 또는 IgG2a 농도와 비교해 볼 때에도 큰 차이를 나타내지 않았으며, 이러한 효과는 화합물 Ⅰ의 농도에 의존적인 경향을 보임을 알 수 있었다.
4-4. 서혜부 림프절내 T 세포 표현형 분석
콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델을 개복하여 서혜부 내 림프절을 채취하였으며, 상기 림프절을 여과기로 필터링시켰다. 이후, RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium)를 처리하여 여과기 내 존재하는 세포를 수득하였으며, 원심분리하여 세포들을 침전시켰다. 여기에, 다시 RPMI를 넣고 재부유시킨 후, 6-Well plate로 옮겨 안정화시켰다. 이후, 상층액을 분리하여 원심분리기로 세포들을 침전시키고, 다시 인산 완충 식염수 (PBS)로 재부유시켜 96-well에 존재하는 세포의 수를 계산하였다. 다음으로, 세포의 수를 일정하게 맞춘 뒤 유세포 분석기 튜브에 넣었으며, 쥐의 표현형 혼합액 (mouse phenotyping cocktail Cat. 51-9006631)을 넣은 후 안정화시키고, FACS calibur를 이용하여 T세포의 표현형을 분석하였다.
그 결과, 도 21 및 도 22에 나타낸 바와 같이, 관절염의 발병에 의해 현저하게 증가되었던 표현형 Th1 반응과 Th17 반응이 화합물 Ⅰ의 처리에 의해 감소됨을 확인할 수 있었다.
4-5. 콜라겐 유도 류마티스 관절염 마우스에 의한 염증 유발성 사이토카인 등의 분비 억제 활성 검정
콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델로부터 발목조직을 적출하였다. 발목조직 내 염증 유발성 사이토카인 및 기질 분해효소의 발현을 측정하기 위해, Maxime RT PreMix (Random primer, iNtRON Biotechnology 사)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 구체적으로, 각 튜브 당 2μL의 cDNA, 1μL의 센스 및 안티센스 프라이머 용액 (0.4μM), 12.5μL의 SYBR Premix Ex Taq (Takarabio 사), 9.5μL의 dH2O를 함께 혼합하여 총 25μL가 되도록 하였으며, 염증 유발성 사이토카인 (TNF-α, IL-1, IL-6) 및 기질 분해효소 (MMP-1, MMP-3) mRNA의 발현 정도를 TP850 소프트웨어를 사용해 real-time PCR을 통해 측정하였다.
그 결과, 도 23에서 나타난 바와 같이, 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델에서 상기 실시예 3-2의 결과와 마찬가지로 화합물 Ⅰ을 처리한 군은 대조군에 비해 염증 유발성 사이토카인인 TNF-α, IL-1, 및 IL-6와 기질 분해효소인 MMP-1, 및 MMP-3의 발현이 효과적으로 억제됨을 확인할 수 있었으며, 이러한 억제 효과는 화합물 Ⅰ의 농도에 의존적인 경향을 보였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (6)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112018083337490-pat00029

  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 아토피, 건선, 피부염, 알레르기, 관절염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 방광염, 신장염, 골반염, 크론병, 궤양성 대장염, 강직성 척추염, 전신 홍반성 낭창 (Systemic lupus erythematodes, SLE), 천식, 부종, 지연성 알레르기 (IV형 알레르기), 이식거부, 이식편 대 숙주 질환, 자가면역 뇌척수염, 다발성 경화증, 염증성 장질환, 낭포성 섬유증, 당뇨성 망막증, 및 사구체 신염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 삭제
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