KR101892154B1 - Ｒｈｏ-연관된 단백질 키나제 저해제를 포함하는 면역 반응 증강용 조성물 및 이를 이용한 방법 - Google Patents

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Abstract

일 양상에 따른 면역 반응 증강용 조성물 및 이를 이용한 방법을 제공한다. 이에 따르면, 선천성 면역 반응, 적응 면역 반응, 또는 이들의 조합에 의해 항암 면역 반응이 향상되고, 암 면역요법에 효과적으로 이용할 수 있다.

Description

Ｒｈｏ-연관된 단백질 키나제 저해제를 포함하는 면역 반응 증강용 조성물 및 이를 이용한 방법{Composition for enhancing immune response including Rho-associated protein kinase inhibitor, and method using the same}
Rho-연관된 단백질 키나제 저해제를 포함하는 면역 반응 증강용 조성물 및 이를 이용한 면역 반응을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
Rho-연관된 단백질 키나제(Rho-associated protein kinase: ROCK)는 세린/트레오닌 키나제의 AGC(PKA/PKG/PKC) 패밀리에 속하는 키나제이다. ROCK는 크게 ROCK1 및 ROCK2로 나뉘고, 인간 ROCK1와 ROCK2는 GTPase RhoA의 주요한 하류 이펙터(effector)이다. Rho GTPase는 세포의 이동, 성장 및 분화를 조절하는 신호 전달에 있어 중요한 역할을 하는 작은 G-단백질(protein)이다.
ROCK 저해제는 ROCK의 기능을 억제하는 저해제로서, 세포사멸(apoptosis)의 억제, 신경돌기의 재생, 미오신 인산화 및 평활근 수축에 있어 작용-유도성 Ca2 + 감작(agonist-induced Ca2 + sensitization) 억제 등의 기능을 하는 것으로 알려져 있다. ROCK 저해제는 협심증(angina), 관상동맥 연축(coronary vasospasm), 고혈압(hypertension), 폐동맥 고혈압(pulmonary hypertension), 심장 마비(heart failure), 뇌 허혈(cerebral ischemia) 등 다양한 심혈관계 질환들의 임상시험에서 안정성을 가지며 효과적인 치료제임이 보고되고 있다.
ROCK 저해제 중 파수딜(Fasudil)은 1995년도부터 일본에서 뇌혈관 치료에 사용되고 있으며, 미국에서는 Fasudil에 대해 레이노 현상(Raynaud's phenomenon) 치료와 죽상동맥경화증 및 고콜레스테롤 혈증에 대한 임상연구가 진행 중에 있다. 또한, 최근에는 ROCK 저해제 중 Y27632의 안구 건조증 예방 및 치료용 약제학적 조성물이 특허출원된 바 있다(한국 공개 번호 10-2015-025566).
그러나, ROCK 저해제의 면역세포, 특히 대식세포 및 수지상 세포에 대한 효과에 대해 알려진 바가 없으므로, ROCK 저해제를 이용하여 면역 반응을 증강하기 위한 조성물 및 이를 이용한 면역 반응을 증가시키는 방법이 요구된다.
면역 반응 증강용 조성물을 제공한다.
면역 반응을 증가시키는 방법을 제공한다.
일 양상은 Rho-연관된 단백질 키나제(Rho-associated protein kinase 혹은 Rho-kinase: ROCK) 저해제를 포함하는 면역 반응 증강용 조성물을 제공한다.
상기 ROCK 저해제는 상기 Rho-연관된 단백질 키나제의 발현 또는 기능을 억제하는 물질을 말한다. Rho-연관된 단백질 키나제의 Rho 단백질은 Ras 수퍼패밀리에 속하는, 작은 분자량(약 21 kDa)의 신혼전달 G 단백질이다. Rho 단백질은 세포소기관의 발생, 세포골격 움직임, 세포 이동, 및 기타 세포 기능에 관련된 신호를 전달하는 세포 전달 물질이다. Rho-연관된 단백질 키나제는 ROCK1, ROCK2, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 ROCK 저해제는 예를 들어, Y-27632(또는 Y27632), 파수딜(fasudil), 티아조비빈(thiazovivin), GSK429286A, RKI-1447, Y-39983, Wf-536, SLx-2119, 아자벤지미다졸-아미노퓨라잔(Azabenzimidazole-aminofurazan), DE-104, 올레핀, 이소퀴놀린, 인다졸, 피리딘알켄 유도체, H-1152P, ROKα 저해제, XD-4000, HMN-1152, 4-(1-아미노알킬)-N-(4-피리딜)시클로헥산-카르복스아미드, 로스타틴(Rhostatin), BA-210, BA-207, BA-215, BA-285, BA-1037, Ki-23095, VAS-012, 및 퀴나졸린(quinazoline)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 Y-27632은 (R)-(+)트란스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)시클로헥산카르복스아미드이다. 상기 Y-27632는 디히드로클로라이드(dihydrochloride) 염의 형태일 수 있다. 상기 파수딜은 5-(1,4-디아제판-1-술포닐)이소퀴놀린이다. 상기 파수딜은 염산염의 형태일 수 있다.
상기 면역 반응은 선천성(innate) 면역 반응, 적응(adaptive) 면역 반응, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 선천성 면역 반응은 비특이적 면역 반응으로도 불린다. 선천성 면역 반응은 대식세포(macrophage), 수지상 세포(dendritic cell), 호중구(neutrophil), 또는 이들의 조합에 의한 것일 수 있다. 상기 적응 면역 반응은 후천성(acquired) 면역 반응 또는 특이적 면역 반응으로도 불린다. 적응 면역 반응은 세포외(exogenous) 항원 또는 세포내(endogeneous) 항원의 항원 제시, T 세포와 B 세포의 작용에 의해 매개되고, 적응 면역 반응은 면역 기억(immunological memory)을 포함한다.
상기 면역 반응은 탐식 작용(phagocytosis)에 의한 것일 수 있다. 탐식 작용은 세포가 환경으로부터 고형 물질, 입자, 또는 다른 세포 등을 잡아들이는 것을 말한다. 탐식 작용에 의해 세포는 외부로부터 침입한 병원균, 암세포 등을 세포 내로 잡아들여 세포내소화를 통해 제거할 수 있다. 상기 탐식 작용은 대식세포, 수지상 세포, 호중구, 또는 이들의 조합의 탐식 작용일 수 있다. 상기 탐식 작용은 암세포에 대한 탐식 작용일 수 있다. 암세포에 대한 탐식 작용이 증가하면, 암세포 유래 항원의 제시 및 T 세포의 활성화 및 증식을 통해 암세포에 대한 적응 면역이 상승하여 암세포가 CD+8 T 세포를 매개로 제거되고, 암세포를 제거한 후에도 암세포에 대한 면역 기억을 통해 암이 재발되는 것이 억제될 수 있다.
상기 면역 반응은 항암 면역 반응일 수 있다. 상기 면역 반응은 암세포에 특이적인 항암 면역 반응일 수 있다. 상기 항암 면역 반응의 암은 고형암 또는 비고형암일 수 있다. 고형암은 예를 들어 간, 폐, 유방, 피부 등 장기에 암 종양이 발생한 것을 말한다. 비고형암은 혈액 내에서 발생한 암이고, 혈액암으로도 불린다. 상기 암은 암종(carcinoma), 육종(sarcoma), 조혈세포 유래의 암, 배세포 종양(germ cell tumor), 또는 모세포종(blastoma)일 수 있다. 상기 암은 예를 들어 유방암, 피부암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 대장암, 결장직장암, 위암, 난소암, 전립선암, 방광암, 요도암, 간암, 신장암, 투명세포 육종, 흑색종, 뇌척수종양, 뇌암, 흉선종, 중피종, 식도암, 담도암, 고환암, 생식세포종, 갑상선암, 부갑상선암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 골수형성이상 증후군(myelodysplastic syndromes: MDS), 골수섬유증(myelofibrosis), 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 호치킨병(Hodgkin's Disease), 내분비계암, 및 육종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 암세포는 상기 암으로부터 유래된 세포일 수 있다.
상기 면역 반응 증강은 면역 반응의 수준을 향상 또는 증가시키는 것을 말한다.
상기 조성물은 약학적 조성물 또는 사료용 조성물일 수 있다.
상기 조성물은 항암제를 더 포함할 수 있다. 상기 항암제는 화합물, 항체, 항원-결합 단편, 천연물, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 항암제는 예를 들어, 독소루비신(doxorubicin), 미토산트론(mitoxantrone), 시클로스파미드(cyclophosphamide), 메토트렉세이트(methotrexate), 5-플루오로우라실(fluorouracil), 무스틴(mustine), 빈크리스틴(vincristine), 프로카르바진(procarbazine), 프레드니솔론(prednisolone), 블레오미신(bleomycin), 다카르바진(dacarbazine), 에토포시드(etoposide), 시스플라틴(cisplatin), 에피루비신(Epirubicin), 카페시타빈(capecitabine), 폴린산(folinic acid), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 타목시펜(tamoxifen), 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 세툭시맙(cetuximab), 파니투무맙(panitumumab), 엘로티닙(erlotinib), 게피티닙(gefitinib), 트라스투주맙(trastuzumab), 페르투주맙(pertuzumab), 라파티닙(lapatinib), 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 조성물은 단일 조성물 또는 개별 조성물일 수 있다.
상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 희석제 또는 보조제를 포함하는 의미로 사용된다. 상기 담체는 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 마니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 생리식염수, PBS와 같은 버퍼, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 풍미제, 유화제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 통상의 방법에 따라 임의의 제형으로 준비될 수 있다. 상기 조성물은 예를 들면, 경구 투여 제형 (예, 분말, 정제, 캡슐, 시럽, 알약, 과립), 또는 비경구 제형 (예, 주사제)으로 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 전신 제형, 또는 국부 제형으로 제조될 수 있다.
상기 조성물은 ROCK 저해제, 항암제, 또는 이들의 조합을 유효한 양으로 포함할 수 있다. 용어 "유효한 양"은 면역 반응 증가를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 면역 반응이 유의하게 증가하기에 충분한 양을 말한다. 상기 유효한 양은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 조성물 당 약 0.5 ㎍ 내지 약 2 g, 약 1 ㎍ 내지 약 1 g, 약 10 ㎍ 내지 약 500 mg, 약 100 ㎍ 내지 약 100 mg, 또는 약 1 mg 내지 약 50 mg일 수 있다.
상기 조성물은 예를 들면, 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경피(transdermal), 직장, 점막, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하 투여와 같은, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 조성물의 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내 일 수 있다. 상기 투여는 1일 1회, 1일 다회, 또는 1주일에 1회, 2주일에 1회, 3주일에 1회, 또는 4주일에 1회 내지 1년에 1회 투여될 수 있다.
다른 양상은 ROCK 저해제를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 반응을 증가시키는 방법을 제공한다.
상기 ROCK 저해제 및 면역 반응은 전술한 바와 같다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 면역 반응이 정상 대조군에 비해 저하되거나 저하될 가능성이 있는 개체일 수 있다. 상기 정상 대조군은 면역 반응이 정상 수준인 개체를 의미한다.
상기 방법은 상기 개체에 항암제를 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. ROCK 저해제, 항암제, 또는 이들의 조합은 동시 또는 순차로 투여될 수 있다. ROCK 저해제, 항암제, 또는 이들의 조합은 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. ROCK 저해제, 항암제, 또는 이들의 조합의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 상기 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내 일 수 있다. 상기 투여는 1일 1회, 1일 다회, 또는 1주일에 1회, 2주일에 1회, 3주일에 1회, 또는 4주일에 1회 내지 1년에 1회 투여될 수 있다.
일 양상에 따른 면역 반응 증강용 조성물 및 이를 이용한 방법에 따르면, 선천성 면역 반응, 적응 면역 반응, 또는 이들의 조합에 의해 항암 면역 반응이 향상되고, 암 면역요법에 효과적으로 이용할 수 있다.
도 1은 일 양상에 따른 항암 면역을 증가시키는 방법에 대한 모식도이다.
도 2a 및 도 2b는 각각 골수-유래 대식세포의 암세포 탐식 비율 및 수지상세포의 암세포 탐식 비율을 나타내는 그래프이다(*: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001).
도 3a는 동소적 종양 모델에서 Y27632의 효과를 확인하기 위한 실험의 모식도이고, 도 3b 및 도 3c는 각각 CT26.CL25 종양 세포 주입 후 시간(일)에 따른 종양의 크기 및 마우스의 체중을 나타내는 그래프이고, 도 3d는 CT26 종양 세포 주입 후 시간(일)에 따른 종양의 크기를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 B16F10-Ova 동소적 종양 동물모델에서 Y27632의 효과를 확인하기 위한 실험의 모식도이고, 도 4b 및 도 4c는 각각 종양 세포 주입 후 시간(일)에 따른 종양의 크기 및 마우스의 체중을 나타내는 그래프이다.
도 5a는 Y27632의 존재 여부에 따른 비장 세포가 분비한 인터페론-감마의 양을 나타내는 그래프이고, 도 5b는 종양 조직 중 CD8 T 세포를 염색한 이미지이고, 도 5c는 유세포 분석을 통해 Y27632의 투여에 따른 교차 감작(Cross prime) 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a 및 도 6b는 각각 Balb/c 누드 마우스에 주입된 암세포 CT26.CL25에 대한 Y27632의 존재 여부에 따른 종양의 부피 및 마우스의 체중을 나타내는 그래프이고, 도 6c는 Balb/c 야생형 마우스에 주입된 암세포 CT26.CL25에 대해 탐식세포(대식세포와 수지상세포) 고갈시 Y27632의 존재 여부에 따른 종양의 크기를 나타내는 그래프이고, 도 6d는 Balb/c 야생형 마우스에 주입된 암세포 CT26.CL25에 대해 CD8+ T 세포 고갈시 Y27632의 존재 여부에 따른 종양의 크기를 나타내는 그래프이다.
도 7a는 실험의 모식도이고, 도 7b 내지 도 7e는 각각 Balb/c 야생형 마우스에서 유발된 암에 대한 Y27632와 독소루비신의 존재 여부에 따른 종양의 크기, 마우스의 체중, 상대적 종양 크기, 및 상대적 종양 중량을 나타내는 그래프이다.
도 8a는 Y27632 및 독소루비신의 존재 여부에 따른 비장 세포가 분비한 인터페론-감마의 양을 나타내는 그래프이고, 도 8b는 종양 조직 중 CD8+ T 세포를 염색한 이미지이고, 도 8c는 항암 치료가 끝난 후 22일 차 때 수술을 통해 암을 절제하고 1주일 뒤 반대쪽 등에 초기 암 심었던 것보다 7배 많은 암세포 CT26.CL25를 다시 심어서 암에 대한 백신 효과를 나타내는 그래프이다(좌: 암이 발생하지 않은 마우스의 비율(%), 우: 종양의 크기).
도 9a 및 도 9b는 Balb/c 누드 마우스에 주입된 암세포 CT26.CL25에 대한 Y27632 및 독소루비신의 존재 여부에 따른 종양의 부피 및 마우스의 체중을 나타내는 그래프이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. ROCK 저해제의 항암 면역 향상 효과의 확인
1. 대식세포와 수지상세포의 탐식에 대한 ROCK 저해제의 효과
ROCK 저해제에 의해 항암 면역이 향상되는지 여부를 확인하기 위해, 대식세포와 수지상 세포의 탐식에 대한 ROCK 저해제의 효과를 확인하였다.
구체적으로, 골수-유래 대식세포(Bone marrow-derived macrophage: BMDM) 및 골수-유래 수지상 세포(Bone marrow-derived cell: BMDC)를 준비하였다. 준비된 세포를 1 μM의 CellTracker Deep Red(Thermo Fisher Scientific, USA)로 염색하였다. 각각 15x104 세포/ml의 염색된 대식세포 및 수지상세포에 30 μM의 Y27632(abcam) 또는 30 μM의 Fasudil(selleck chemicals)을 가하고, 약 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 음성 대조군으로서, Y27632 및 Fasudil로 인큐베이션하지 않은 대식세포 또는 수지상세포를 사용하였다.
RPMI 배지 내에서 준비된 골수-유래 대식세포 또는 수지상세포와, 1 μM의 CellTracker Green(Thermo Fisher Scientific, USA)으로 염색한 암세포주를 약 37℃에서 약 2시간 동안 공배양하였다. 암세포주는 CT26.CL25와 B16F10-OVA 세포주를 사용하였다.
그 후, 유세포 분석법으로 암세포주의 비율을 측정하여, 대식세포 및 수지상세포의 암세포에 대한 탐식 비율을 산출하고, 그 결과를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다(좌: 암세포주 CT26.CL25 주입, 우: 암세포주 B16F10-OVA 주입).
도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, ROCK 저해제인 Y27632 및 Fasudil에 의해, 대식세포 및 수지상세포의 암세포 탐식 능력이 유의하게 증가함을 확인하였다.
2. 종양동물 모델에서 ROCK 저해제의 암치료 효과 분석
(1) CT26 . CL25 공통유전자적( syngeneic ) 종양 동물모델
β-갈락토시다아제(galactosidase)를 발현하는 CT26.CL25 암세포 1X106 세포를 Balb/c 야생형 마우스의 왼쪽 등에 피하 주입하여 암을 유발시켰다.
암세포 주입 후 6일째(암세포 주입한 날을 0일째로 함)에 Y27632을 10 ㎎/체중 kg의 용량으로 정맥 주사로 2 일간 연속 투여 후 하루 쉬었고, 상기 투여를 1 사이클로 하여 3일 간격으로 3 사이클을 투여하였다. 암세포 주입 후 22 일째에 마우스를 희생시켰다(도 3a). 음성 대조군으로서, Y27632를 대신에 인산염 완충 염수(Phosphate-buffered saline)를 투여하였다.
마우스의 종양 조직을 절제하여 생체 외(ex vivo) 이미지를 촬영하고, 종양 조직의 중량을 측정하였다. 또한, 마우스를 희생시키기 전, 암세포 주입 5일째부터 3일 간격으로 캘리퍼를 사용하여, 종양 조직의 길이(L) 및 폭(W)을 측정하였고, 시간 경과에 따른 종양 조직의 부피를 하기 공식을 이용하여 산출하였다.
종양 조직의 부피(V[㎣])=(L[㎜])x(W[㎜])2 x 0.5
종양 조직의 부피 및 종양 모델 쥐의 그룹별 무게의 평균값을 각각 도 3b 및 도 3c에 나타내었다. 도 3b 및 도 3c에 나타난 바와 같이, ROCK 저해제인 Y27632를 처리하였을 경우 종양의 크기 및 부피가 현저하게 감소하였지만, 반면에 마우스의 체중에 유의한 변화가 없었다. 따라서, Y27632은 동물 모델에 독성이 없지만, 암의 성장을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
한편, 암세포 CT26.CL25 대신에 CT26를 사용하고, 10 ㎎/체중 kg의 Y27632 또는 20 ㎎/체중 kg의 Fasudil을 투여하는 것을 제외하고, 상기와 동일한 방법을 반복하였다. CT26 암세포가 주입된 경우 종양의 크기를 도 3d에 나타내었다. 도 3d에 나타난 바와 같이, Y27632와 다른 ROCK 저해제인 Fasudil도 Y27632과 유사하게 암의 성장을 억제하였다.
(2) B16F10-OVA 동소적( orthotopic ) 종양 동물모델
오브알부민(Ovalbumin)을 발현하는 B16F10-ova 암세포 5X105 세포를 C57L/B6 야생형 마우스의 왼쪽 등에 피하 주입하여 암을 유발시켰다.
암세포 주입 후 9일째 (암세포 주입한 날을 0일째로 함)에 Y27632을 10 ㎎/체중 kg의 용량으로 정맥 주사로 2 일간 연속 투여 후 하루 쉬었고, 상기 투여를 1 사이클로 하여 3일 간격으로 3 사이클을 투여하였다. 암세포 주입 후 20 일째에 마우스를 희생시켰다(도 4a).
마우스의 종양 조직을 절제하여 종양 조직의 부피를 산출하였다.
종양 조직의 부피 및 종양 모델 쥐의 그룹별 무게의 평균값을 각각 도 4b 및 도 4c에 나타내었다. 도 4b 및 도 4c에 나타난 바와 같이, ROCK 저해제인 Y27632를 처리하였을 경우 종양의 크기 및 부피가 현저하게 감소하였지만, 반면에 마우스의 체중은 유의한 변화가 없었다. 따라서, Y27632은 동물 모델에 독성이 없지만, 암의 성장을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
3. 종양 동물 모델에서 ROCK 저해제 Y27632 의 암치료
(1) CT26 . CL25 공통유전자적 종양 동물모델에서 항암 면역 반응
실시예 1.2.의 항암 면역 반응이 암세포 특이적인 반응인지 확인하기 위해, 실시예 1.2.의 대조군 및 Y27632를 투여한 마우스의 비장을 적출하여 CT26.CL25 암세포에 대한 세포성 면역반응을 조사하였다.
구체적으로, CT26.CL25 암세포의 항원인 β-갈락토시다아제에 특이적인 T 세포의 인터페론-감마(INF-γ)의 수치를 ELISA(R&D Systems, Inc, USA) 분석으로 정량하였다.
대조군 또는 Y27632를 투여한 마우스에서 그룹 당 5 마리씩을 선택하고, 각각의 마우스에서 비장을 적출하였다. 멸균된 페트리디쉬에 적출된 비장 조직을 옮기고, 세포 스트레이너(cell strainer)를 사용하여 비장을 갈아 조직 피막으로부터 비장 세포를 분리하였다. 페트리디쉬 내의 모든 혼합물을 15 ㎖ 튜브에 옮기고, 튜브를 RPMI 1640 배지로 가득 채우고, 4℃에서 450x g의 속도로 10 분간 원심분리 한 후 상층액을 제거하였다. 펠렛에 적혈구 용해 완충액(Sigma-Aldrich, Germany)을 가하여 혼합물 중 적혈구를 용혈시켰다. 튜브에 포함된 세포를 PBS로 세척한 후, RPMI 1640 배지에 부유시켜 비장세포(splenocyte)를 분리하였다. 분리된 5x106 세포/㎖의 비장세포를 24-웰 플레이트에 접종하고, 5 ㎍/㎖의 β-gal 펩티드(TPHPARIGL, 서열번호 1, β-gal의 아미노산 잔기 876 내지 884를 포함하는 자연적으로 가공된 H-2 Ld 제한 에피토프를 포함함, (주)펩트론), 5 ㎍/㎖의 AH1 펩티드(SPSYVYHQF, 서열번호 2, CT26 유래의 CD8+ 세포독성 T 세포 결정기를 포함, (주)펩트론), 5 ㎍/㎖의 PIA 펩타이드(음성 대조군, (주)펩트론), 또는 PBS를 가하였다. 상기 세포를 약 37℃에서 약 48 시간 동안 인큐베이션하여 IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 세포의 활성화를 촉진시켰다. 그 후에 상층액을 분리하고, 상층액 중 인터페론-감마(INF-γ)를 ELISA(R&D Systems, Inc, USA) 분석으로 정량하고, 그 결과를 도 5a에 나타내었다.
도 5a에 나타난 바와 같이, 암-특이적 외인성 항원(β-gal), 내인성 항원(AH1), 음성 대조군(P1), 또는 PBS를 가하여 암-특이적인 T 세포 면역 능력을 비교한 결과, Y27632의 투여군에서 암-특이적 외인성 항원에 대한 T 세포 면역 능력이 유의하게 증가함을 확인하였다.
또한, 실시예 1.2.(1)의 Balb/c 야생형 마우스에 β-갈락토시다아제를 발현하는 1X106 세포의 CT26.CL25 암세포를 왼쪽 등에 피하 주입하고, 실시예 1.2.에 기재한 바와 같이 대조군 및 Y27632를 투여하였다. 22일째 종양을 적출하여 O.C.T(optimum cutting temperature) 화합물을 사용하여 냉동 블록을 제조하였다. 각 그룹 별 블록을 절편화하고, 항-CD8a 항체(BD Pharmingen™)로 염색하여 종양 조직 중 CD8+ T 세포를 확인하였다. 염색된 이미지를 도 5b에 나타내었다. 도 5b에 나타난 바와 같이, Y27632의 투여군은 음성 대조군에 비해 세포독성 CD8+ T 세포의 양이 증가하여 T 세포 면역 능력이 향상되었다.
(2) B16F10-OVA 동소적 종양 동물모델에서 교차 감작의 확인
Y27632에 의해 교차 감작(cross prime)을 확인하기 위해, OT1 마우스의 비장과 림프절에서 CD8+ T세포를 분리하고, Y27632을 투여한 마우스의 꼬리 정맥을 통해 분리된 CD8+ T세포를 투여한 경우, 투여된 CD8+ T세포가 마우스의 항원 제시 세포에 의해 교육되어 증식(즉, 교차 감작)되는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 8주령 수컷, C57BL/6 마우스의 왼쪽 등에 오브알부민을 발현하는 B16F10-Ova 암세포를 5X105 세포를 피하 주입하여 암을 유발시키고, 암세포 주입 후 9일, 10일, 12일, 13일, 15일, 및 16일(암세포 주입한 날을 0일째로 본 기준)에 Y27632을 10 ㎎/체중 kg의 용량으로 꼬리 정맥으로 총 6회 투여하였다. 음성 대조군으로 Y27632 대신에 PBS을 투여하였다.
OT1 마우스의 비장과 림프절에서 분리한 CD8+ T 세포를 10 μM의 카르복시플루오레세인 술신이미딜 에스테르(Carboxyfluorescein succinimidyl ester: CFSE)로 염색하고, 2X106 개의 염색된 CD8+ T 세포를 상기 C57BL/6 마우스에 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 3일 후, 마우스의 배수되는(draining) 림프절을 적출하여 단일 세포로 만들었다. 수득된 단일 세포를 유세포 분석기(fluorescent-activated cell sorter: FACS)로 분석하여 그 결과를 도 5c에 나타내고, OT1 마우스의 CD8+ T 세포가 얼마나 증식되었는지 여부를 확인하였다. 도 5c에서 "0" 내지 "7"은 CD8+ T 세포의 증식 횟수를 나타낸다. 예를 들어, "7"은 7회 증식한 CD8+ T 세포를 나타내고, "5-7"은 5회 내지 7회 증식한 CD8+ T 세포를 나타낸다.
도 5c에 나타난 바와 같이, Y27632의 투여군은 음성 대조군에 비해 OT1 마우스의 CD8+ T 세포의 증식이 증가하였다. 따라서, Y27632의 투여군은 음성 대조군에 비해 항원 제시 세포의 교차 감작이 증가하고 이에 의해 CD8+ T 세포가 증식된다는 것을 확인하였다.
4. 면역 결핍 마우스 모델에서 ROCK 저해제에 의한 항암 효과
(1) 면역 결핍 누드 마우스 모델에서 ROCK 저해제에 의한 항암 효과
Balb/c 누드 마우스에 β-갈락토시다아제(β-galactosidase)를 발현하는 1X106 세포의 CT26.CL25 암세포를 왼쪽 등에 피하 주입하여 암을 유발시켰다. 암세포 주입 12일째 (암세포 주입한 날을 0일째로 본 기준)에 10 mg/kg의 Y27632를 정맥 주사로 2 일간 연속 투여 후 하루 쉬었고, 상기 투여를 1 사이클로 하여 3일 간격으로 3 사이클 투여를 하였다. 암세포 주입한 후 25 일째 마우스를 희생시킨 후 종양 조직을 절제하여 생체 외(ex vivo) 이미지를 촬영하였고, 종양 조직의 중량을 측정하였다.
또한, 마우스의 희생 전에, 암세포 주입 11 일째부터 3일 간격으로 캘리퍼를 사용하여 종양의 길이(L) 및 폭(W)을 측정한 후, 하기 공식을 이용하여 시간 경과에 따른 종양의 부피를 계산하였다.
종양 조직의 부피(V[㎣])=(L[㎜])x(W[㎜])2 x 0.5
산출된 종양의 부피 및 마우스의 체중을 도 6a 및 도 6b에 나타내었다. 도 6a 및 도 6b에 나타난 바와 같이, 면역 결핍 누드 마우스에서는 Y27632에 의한 항암 효과는 유의한 효과가 없었다.
(2) 대식세포 고갈 또는 CD8 T 세포 고갈시 ROCK 저해제에 의한 항암 효과
Balb/c 야생형 마우스에 β-갈락토시다아제를 발현하는 1X106 세포의 CT26.CL25 암세포를 왼쪽 등에 피하주입하여 암을 유발시켰다.
탐식세포 고갈(depletion)을 위해, 암세포를 주입한 날을 0일째로 보았을 때 5일차에 200 ㎕의 대조군 리포좀(formumax), 또는 200 ㎕의 클로드로네이트(Clodronate) 리포좀(formumax)을 복강 내 주입하고, 이후 실험 종료시까지 4일 간격으로 리포좀을 100 ㎕씩 복강 내 주입하였다. 마찬가지로, CD8+ T 세포 고갈을 위해, 암세포를 주입한 날을 0일째로 보았을 때 5일차에 200 ㎍의 항-CD8a 항체(클론 2.43, bioXcell)를 복강 내 주입하고, 실험 종료시까지 3일 간격으로 항체를 200 ㎍씩 복강 내 주입하였다.
암세포 주입 6일째 (암세포 주입한 날을 0일째로 본 기준)에 10 mg/kg의 Y27632를 정맥 주사로 2 일간 연속 투여 후 하루 쉬었고, 상기 투여를 1 사이클로 하여 3일 간격으로 3 사이클 투여를 하였다. 암세포 주입한 후 22 일째 마우스를 희생시킨 후 종양 조직을 절제하여 생체 외 이미지를 촬영하였고, 종양 조직의 중량을 측정하였다. 또한, 마우스의 희생 전에, 전술한 바와 같이 시간 경과에 따른 종양의 부피를 계산하였다. 산출된 종양의 부피를 도 6c 및 도 6d에 나타내었다.
도 6c 및 도 6d에 나타난 바와 같이, 클로드로네이트로 탐식세포를 고갈시키거나 또는 항-CD8 항체로 CD8+ T 세포를 고갈시킬 경우, Y27632에 의한 항암 효과가 사라졌다. 따라서, ROCK 저해제의 치료적 효과는 CD8+ T 세포를 요구한다는 것을 확인하였다.
실시예 2. ROCK 저해제와 항암제의 병행 투여에 의한 항암 면역 향상 효과의 확인
1. 종양동물 모델에서 Y27632 와 독소루비신의 병행 투여에 의한 항암 효과
Balb/c 야생형 마우스에 β-갈락토시다아제를 발현하는 1X106 세포의 CT26.CL25 암세포를 왼쪽 등에 피하 주입하여 암을 유발시켰다.
암세포 주입 5일째 (암세포 주입한 날을 0일째로 본 기준)에 2 mg/kg의 독소루비신(Sigma)을 정맥 주사로 투여한 후, 10 mg/kg의 Y27632을 독소루비신 투여 1일 및 2일 경과시 2 회 투여하였고, 상기 투여를 1 사이클로 하여 3일 간격으로 3 사이클을 투여하였다(도 7a). 암세포 주입한 후 22 일째 마우스를 희생시킨 후 종양 조직을 절제하여 생체 외 이미지를 촬영하였고, 종양 조직의 중량을 측정하였다. 또한, 마우스의 희생 전에, 암세포 주입 5 일째부터 3일 간격으로 캘리퍼를 사용하여 전술한 바와 같이 시간 경과에 따른 종양의 부피를 계산하였다.
도 7b에 산출된 종양의 크기, 도 7c에 쥐 종양 모델의 그룹별 무게, 도 7d에 상대적 종양 크기, 도 7e에 상대적 종양 중량을 나타내었다. 도 7d에 나타난 바와 같이, 독소루비신과 Y27632를 병행 투여할 경우의 종양의 크기는 음성 대조군 대비 84% 감소하고, Y27632 단독 투여 대비 55% 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 도 7e에 나타난 바와 같이, 독소루비신과 Y27632를 병행 투여할 경우의 종양의 중량은 음성 대조군 대비 85% 감소하고, Y27632 단독 투여 대비 58% 억제하는 것을 확인하였다.
따라서, 독소루비신과 ROCK 저해제인 Y27632를 병행 투여할 경우, 음성 대조군 및 각각 처리한 경우에 비해 더욱 효과적으로 암의 성장을 억제하였다.
2. ROCK 저해제 Y27632 와 독소루비신의 병행 투여에 의한 항암 면역 능력 항진
실시예 2.1에 기재된 바와 같은 면역 반응이 암세포 특이적으로 일어났는지 확인하기 위해, 실시예 2.1의 동물 실험 모델의 대조군, Y27632, 독소루비신, 및 독소루비신과 Y27632의 병행 투여한 각 그룹별 마우스의 비장을 적출하여 CT26.CL25 암세포에 대한 세포성 면역반응을 조사하였다. 이를 위해 실시예 1.3에 기재된 바와 같이 CT26.CL25의 항원인 β-갈락토시다아제에 특이적인 T 세포의 인터페론-감마(INF-γ)의 수치를 ELISA(R&D Systems, Inc, USA) 분석으로 정량하였다. 그 결과를 도 8a에 나타내었다.
종양 동물 모델에 대조군, 독소루비신 단독 투여, Y27632 단독 투여, 및 독소루비신과 Y27632의 병행 투여 후, 각 그룹별로 22일째 종양을 적출하여 O.C.T 화합물을 이용하여 냉동 블록을 만들었고, 각 그룹 별 블록을 절편화하고, 항-CD8a 항체(BD Pharmingen™)로 염색하여 종양 조직에 CD8 T 세포의 양을 확인하였다. 그 결과를 도 8b에 나타내었다.
도 8a 및 도 8b에 나타난 바와 같이, Y27693 단독 투여군 뿐만 아니라, 독소루비신과 Y27632의 병행 투여군에서 암-특이적인 T 세포 면역 능력이 항진함을 확인하였다.
한편, 상기와 같이 암세포 주입 5일째 (암세포 주입한 날을 0일째로 본 기준)에 2 mg/kg의 독소루비신(Sigma)을 정맥 주사로 투여한 후, 10 mg/kg의 Y27632을 독소루비신 투여 1일 및 2일 경과시 2 회 투여하였고, 상기 투여를 1 사이클로 하여 3일 간격으로 3 사이클을 투여하였다. 암세포 주입한 후 22일째 잔존 종양 없이 암을 완전 절제 후 봉합하였다. 1주일 후, 암에 대한 면역에 생겼는지 확인하기 위해, 암을 심었던 반대쪽 등에 처음 심었던 암의 양의 7배인 7X106 개의 CT26.CL25 세포를 피하주입한 후, 그룹별로 종양이 발생한 마우스의 비율(%) 및 종양의 크기(㎣)를 측정하고, 그 결과를 도 8c에 나타내었다. 도 8c에 나타난 바와 같이, 대조군에 비해 Y27632 또는 독소루비신의 투여군에서 암의 발생 빈도가 감소하였고, Y27632와 독소루비신의 병용투여군은 암이 발생하지 않았다. 따라서, ROCK 저해제와 독소루비신의 병용요법에 의해 암에 대한 면역이 발생함을 확인하였다.
3. 종양동물 모델에서 Y27632 와 독소루비신의 병행투여에 의한 항암 효과
Balb/c 누드 마우스에 β-갈락토시다아제를 발현하는 1X106 세포의 CT26.CL25 암세포를 왼쪽 등에 피하 주입하여 암을 유발시켰다.
암세포 주입 11일째 (암세포 주입한 날을 0일째로 본 기준)에 2 mg/kg의 독소루비신(Sigma)을 정맥 주사로 투여한 후, 10 mg/kg의 Y27632을 독소루비신 투여 1일 및 2일 경과시 2 회 투여하였고, 상기 투여를 1 사이클로 하여 3일 간격으로 3 사이클 투여를 하였다. 암세포 주입한 후 25 일째 마우스를 희생시킨 후 종양 조직을 절제하여 생체 외 이미지를 촬영하였고, 종양 조직 무게를 측정하였다. 또한, 마우스의 희생 전에, 암세포 주입 5 일째부터 3일 간격으로 캘리퍼를 사용하여 전술한 바와 같이 시간 경과에 따른 종양의 부피를 계산하였다. 산출된 종양의 크기 및 마우스의 중량을 도 9a 및 도 9b에 나타내었다.
도 9a 및 도 9b에 나타난 바와 같이, 적응 면역(adaptive immunity)이 없는 누드 마우스에 CT26.CL25를 주입한 경우, 마우스의 체중은 유의한 차이가 없으나, ROCK 저해제인 Y27632과 독소루비신의 병행 투여는 유의한 항암 효과가 없었다. 따라서, ROCK 저해제, 독소루비신, 또는 이들의 조합은 선천성 면역 항진을 통한 적응 면역을 향상시켜 항암 면역 반응을 유도할 수 있음을 확인하였다.
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Composition for enhancing immune response including Rho-associated protein kinase inhibitor, and method using the same <130> KI-116484-KR <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid residues Nos. 876-884 of beta-galactosidase <400> 1 Thr Pro His Pro Ala Arg Ile Gly Leu 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antigenic determinant of cytotoxic T lymphocyte derived from CT26 <400> 2 Ser Pro Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe 1 5

Claims (15)

  1. Y-27632, 파수딜(fasudil), 티아조비빈(thiazovivin), GSK429286A, RKI-1447, Y-39983, Wf-536, SLx-2119, DE-104, H-1152P, XD-4000, HMN-1152, 4-(1-아미노알킬)-N-(4-피리딜)시클로헥산-카르복스아미드, 로스타틴(Rhostatin), BA-210, BA-207, BA-215, BA-285, BA-1037, Ki-23095, 및 VAS-012으로 구성되는 군으로부터 선택되는 Rho-연관된 단백질 키나제(Rho-associated protein kinase: ROCK) 저해제 및 독소루비신(doxorubicin), 미토산트론(mitoxantrone), 시클로스파미드(cyclophosphamide), 블레오미신(bleomycin), 에피루비신(Epirubicin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 세툭시맙(cetuximab) 및 파니투무맙(panitumumab)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항암제를 포함하는 항암 치료용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 청구항 1에 있어서, 암세포에 대한 탐식 작용(phagocytosis)을 촉진시키는, 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 탐식 작용은 대식세포, 수지상 세포, 또는 이들의 조합의 탐식 작용인 것인 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 청구항 1에 있어서, 단일 조성물 또는 개별 조성물인 것인 조성물.
  12. 청구항 1의 조성물을 암에 걸린 인간을 제외한 포유동물 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 암치료 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 청구항 12에 있어서, 상기 ROCK 저해제 및 상기 항암제는 동시 또는 순차로 투여하는 것인 방법.
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