CN115916241A - 与血管生成抑制剂组合的免疫刺激剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用组合疗法治疗患者癌症的组合物和方法，所述组合疗法包括向患者施用与血管生成抑制剂组合的SEQ ID NO:1的融合蛋白。

Description

与血管生成抑制剂组合的免疫刺激剂

相关申请

本申请要求2020年4月15日提交的美国临时申请号63/010,185的权益，该临时申请的全部公开内容据此以引用的方式并入。

背景技术

SEQ ID NO:1的融合蛋白是设计用于选择性地结合中等亲和力白细胞介素2(IL-2)受体IL-2Rβγ的人白细胞介素2(IL-2)变体融合蛋白。SEQ ID NO:1的融合蛋白的选择性是通过与IL-2受体的IL-2Rα链(CD25)融合的环状置换(circularly permuted)(cp)的IL-2的稳定融合来实现的。

SEQ ID NO:1的融合蛋白作为治疗剂具有优于天然IL-2的优点，因为它对IL-2Rβγ的选择性靶向和活化导致CD8+T细胞和NK细胞亚群的选择性活化，这可驱动抗肿瘤免疫响应。施用SEQ ID NO:1的融合蛋白对癌症患者有益，因为它降低了调控性T细胞(诸如CD4+T细胞)的免疫抑制作用，同时增加了CD8+记忆T细胞，从而招募患者自身的免疫系统来消除癌细胞。SEQ ID NO:1的融合蛋白在施用后也表现出持久的作用，从而进一步改善患者对治疗的响应。

不期望的或病理性的血管生成与包括糖尿病性视网膜病、牛皮癣、癌症、类风湿性关节炎和动脉粥样硬化在内的疾病状态相关联。肿瘤血管生成、新血管的形成以及它们的通透性主要由(肿瘤衍生的)血管内皮生长因子(VEGF)调节，该血管内皮生长因子经由至少以下两种不同的受体起作用：VEGF-R1(Flt-1)和VEGF-R2(KDR,Flk-1)。VEGF KDR受体对血管内皮细胞具有高度特异性(Endocr.Rev.1992,13,18；FASEB J.1999,13,9)。

许多人类肿瘤，尤其是胶质瘤和癌，表达高水平的VEGF及其受体。高水平的VEGF还与免疫抑制性肿瘤微环境相关联，并减弱对例如高剂量重组人IL-2的响应性。

目前的假设是肿瘤细胞释放的VEGF以旁分泌的方式刺激毛细血管的生长和肿瘤内皮的增殖，并通过改善血液供应来加速肿瘤的生长。VEGF表达或VEGF活性受到抑制的研究显示了VEGF作为体内肿瘤血管生成因子的作用的直接证据。这是利用抗VEGF抗体、抑制信号转导的显性阴性VEGFR-2突变体和反义VEGF RNA技术实现的。所有方法都由于抑制了肿瘤血管生成而导致体内胶质瘤细胞系或其他肿瘤细胞系的生长减少。然而，在血管生成抑制剂的临床开发过程中已经注意到一些问题。在临床前和临床环境中，都会出现对血管生成抑制剂的耐药性。在一些患者中，用血管生成抑制剂治疗会产生初始响应，然后是肿瘤进展(获得性耐药)。在其他患者中，观察到了内在的耐药性。

在过去的几十年里，开发抗血管生成治疗的努力主要集中在抑制VEGF/VEGFR信号传导通路，诸如抗VEGF抗体贝伐珠单抗(bevacizumab)和抗VEGFR2抗体雷莫芦单抗(ramucirumab)。抗VEGF/VEGFR单靶点药物往往会导致短暂的响应；然而，肿瘤发生了进展，因为其他通路，诸如PDGF/PDGFR、FGF/FGFR和ANGPT/Tie-2提供潜在的逃生机制。抑制多种信号传导通路的抗血管生成剂似乎更有希望；因此，已经开发了多种泛靶点剂(pan-targetagent)。

能够抑制多种信号传导通路的化合物的一个实例是卢西他尼(lucitanib)。卢西他尼，6-(7-((1-氨基环丙基)-甲氧基)-6-甲氧基喹啉-4-基氧基)-N-甲基-1-萘酰胺，或其药学上可接受的盐(诸如盐酸盐)，已被开发作为一种抗肿瘤剂，也称为“E3810”。该化合物还在WO/2008/112408中被公开为血管生成抑制剂。卢西他尼是以下激酶的酪氨酸激酶活性的强效选择性抑制剂：血管内皮生长因子受体1、2和3型(VEGFR1-3)；血小板衍生生长因子受体α和β型(PDGFRα/β)；和成纤维细胞生长因子受体1、2和3型(FGFR1-3)，它们是肿瘤生长、生存、迁移和血管生成的必需激酶。卢西他尼通过靶向这些分子有可能同时抑制几种血管生成通路以及导致细胞增殖的信号传导级联反应。

仍然需要与单一疗法和其他组合疗法相比增强和延长抗肿瘤免疫响应的组合疗法。

发明内容

本发明提供了用于通过向患者施用SEQ ID NO:1的融合蛋白与血管生成抑制剂(诸如卢西他尼)的组合来治疗患者的癌症的组合物、方法和组合治疗方案。优选地，本发明的方法包括：i)向患者施用治疗有效量的SEQ ID NO:1的融合蛋白；和ii)向患者施用治疗有效量的血管生成抑制剂；其中步骤(i)可以在步骤(ii)之前、之后或与其同时进行，其中该组合治疗方案治疗患者的癌症。

在一个方面，本公开提供了一种治疗有需要的患者中的癌症的方法，该方法包括：i)向患者施用治疗有效量的SEQ ID NO:1的融合蛋白；和ii)向患者施用治疗有效量的卢西他尼；其中步骤(i)在步骤(ii)之前、之后或与其同时进行。

在一些实施方案中，卢西他尼由式I的化合物表示

优选地，SEQ ID NO:1的融合蛋白的有效量是有效活化IL-2中间受体IL-2Rβγ的量。优选地，SEQ ID NO:1的融合蛋白是通过静脉内或皮下注射施用。优选地，血管生成抑制剂抑制多于一种受体酪氨酸激酶。优选地，血管生成抑制剂抑制以下受体酪氨酸激酶中的一者或多者：血管内皮生长因子受体1、2和3型；血小板衍生生长因子受体，α型和β型血小板衍生生长因子受体；和成纤维细胞生长因子受体1型、2型和3型。优选地，血管生成抑制剂是卢西他尼，并且优选卢西他尼是经口施用的。

优选地，与作为单一疗法的治疗有效量的SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用或作为单一疗法的治疗有效量的血管生成抑制剂的施用相比，步骤(i)和(ii)的组合导致患者的肿瘤和脾脏中CD8+T细胞的增加；并且优选地，所述CD8+T细胞的增加是与作为单一疗法的治疗有效量的SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用或作为单一疗法的治疗有效量的血管生成抑制剂的施用相比大至少2倍；并且优选地，患者中的CD4+T调控性(Treg)细胞或常规CD4+T细胞没有增加。

优选地，与作为单一疗法的治疗有效量的SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用或作为单一疗法的治疗有效量的血管生成抑制剂的施用相比，步骤(i)和(ii)的组合导致患者的肿瘤和脾脏中CD8+T细胞和树突状细胞的增加以及患者中肿瘤相关巨噬细胞的减少，并且优选地，患者中的CD4+T调控性(Treg)细胞没有增加。

优选地，与作为单一疗法的治疗有效量的SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用或作为单一疗法的治疗有效量的血管生成抑制剂的施用相比，步骤(i)和(ii)的组合导致患者的肿瘤和脾脏中的CD8+T细胞的增加。优选地，所述CD8+T细胞的增加是与作为单一疗法的治疗有效量的SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用或作为单一疗法的治疗有效量的血管生成抑制剂的施用相比大至少2倍，并且患者中的CD4+T调控性(Treg)细胞没有增加。

优选地，与作为单一疗法的治疗有效量的SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用或作为单一疗法的治疗有效量的血管生成抑制剂的施用相比，步骤(i)和(ii)的组合导致患者的肿瘤和脾脏中CD8+T细胞和树突状细胞的增加以及患者中肿瘤相关巨噬细胞的减少。

优选地，与对参考患者群体进行的作为单一疗法的治疗有效量的SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用或作为单一疗法的治疗有效量的血管生成抑制剂的施用相比，步骤(i)和(ii)的组合导致患者的无进展生存期增加了至少约10％。

优选地，与对参考患者群体进行的作为单一疗法的治疗有效量的SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用或作为单一疗法的治疗有效量的血管生成抑制剂的施用相比，步骤(i)和(ii)的组合导致与细胞毒性免疫细胞功能、T细胞活化和抗原呈递相关的基因的表达更高。

优选地，与对参考群体进行的作为单一疗法的治疗有效量的SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用或作为单一疗法的治疗有效量的血管生成抑制剂的施用相比，步骤(i)和(ii)的组合导致Esm1表达的降低以及I型干扰素相关基因和II型干扰素相关基因的表达增加。

附图简述

图1示出了被植入MC38肿瘤细胞并随后用各种剂量的SEQ IDNO:2(SEQ ID NO:1的鼠替代物)和/或卢西他尼处理的小鼠在一段时间内的平均肿瘤体积(mm³)的变化。

图2示出被植入MC38肿瘤细胞并随后用各种剂量的SEQ ID NO:2和/或卢西他尼处理的小鼠在一段时间内的生存百分比。

图3示出在被植入MC38肿瘤细胞并随后用各种剂量的SEQ IDNO:2和/或卢西他尼处理的小鼠的按占CD45+细胞的百分比以及按细胞/mg(组织中)计的位于肿瘤和脾脏中的常规CD4 T细胞数目的变化。

图4示出在被植入MC38肿瘤细胞并随后用各种剂量的SEQ IDNO:2和/或卢西他尼处理的小鼠的按占CD45+细胞的百分比以及按细胞/mg(组织中)计的位于肿瘤和脾脏中的CD8+T细胞数目的变化。

图5示出在被植入MC38肿瘤细胞并随后用各种剂量的SEQ IDNO:2和/或卢西他尼处理的小鼠的按占CD45+细胞的百分比以及按细胞/mg(组织中)计的位于肿瘤和脾脏中的CD4+T_reg细胞数目的变化。

图6示出在被植入MC38肿瘤细胞并随后用各种剂量的SEQ IDNO:2和/或卢西他尼处理的小鼠的按占CD45+细胞的百分比以及按细胞/mg(组织中)计的位于肿瘤和脾脏中的巨噬细胞数目的变化。

图7示出在被植入MC38肿瘤细胞并随后用各种剂量的SEQ IDNO:2和/或卢西他尼处理的小鼠的按占CD45+细胞的百分比以及按细胞/mg(组织中)计的位于肿瘤和脾脏中的树突状细胞数目的变化。

图8示出了在被植入MC38肿瘤细胞并随后用各种剂量的SEQ ID NO:2和/或卢西他尼处理的小鼠的ESM1表达的变化与肿瘤体积(mm³)变化百分比(％)的关系图。

图9示出了在被植入MC38肿瘤细胞并随后用各种剂量的SEQ ID NO:2和/或卢西他尼处理的小鼠的如由免疫细胞溶解细胞活性表示的细胞毒性基因表达的变化与肿瘤体积变化百分比的关系图。(免疫细胞溶解活性＝(Gzma+Prf1)/2)。

图10示出了在被植入MC38肿瘤细胞并随后用各种剂量的SEQ ID NO:2和/或卢西他尼处理的小鼠的如由免疫细胞溶解细胞活性表示的细胞毒性基因表达的变化与如由Esm1表达表示的VEGF通路的变化的关系图。(免疫细胞溶解活性＝(Gzma+Prf1)/2)。

图11是示出3mg剂量的与卢西他尼组合的SEQ ID NO:2的组合治疗的总数目的基因的表达变化的曲线图。

具体实施方式

定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然还可在本发明的实践或测试中使用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。

除非上下文另外明确规定，否则如本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“该/所述(the)”包括复数指示物。因此，例如，对“支架”的提及包括多个支架。在本说明书和随附的权利要求书中，将参考许多术语，这些术语应被定义为具有以下含义，除非明显相反的意图。还应注意，术语“包括/包含”旨在是开放性的并且允许但不要求包括额外的元件或步骤。当本文使用术语“包括/包含”时，术语“由……组成”因此也被涵盖和公开。

应当注意，比率、浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式表示。应当理解，这样的范围格式是为了方便和简洁而使用的，并且因此，应当以灵活的方式被解释为不仅包括作为范围界限而明确列举的数值，而且包括该范围内涵盖的所有单个数值或子范围，如同每个数值和子范围被明确列举一样。为了说明，“约0.1％至约5％”的浓度范围应解释为不仅包括明确列举的约0.1重量％至约5重量％的浓度，而且还包括所指示的范围内的单个浓度(例如1％、2％、3％和4％)和子范围(例如0.5％、1.1％、2.2％、3.3％和4.4％)。术语“约”可包括被修饰的数值的±1％、±2％、±3％、±4％、±5％、±6％、±7％、±8％、±9％或±10％或更多。此外，短语“约'x'至'y'”包括“约'x'至约'y'”。

如本文所用的术语“蛋白质”或“肽”是指通过肽键连接在一起的至少两个或更多个氨基酸残基。蛋白质或肽中的氨基酸序列以标准格式，即从氨基末端(N-末端)到羧基末端(C-末端)示出。

术语“融合蛋白”是指这样的蛋白或肽，该蛋白或肽与另一蛋白或肽通过它们各自的N-和C-末端氨基酸残基(或反之亦然)之间的肽键而连接在一起，或者通过将第一蛋白或肽插入(经由位于被插入的蛋白或肽的N-和C-末端处的两个肽键)到第二蛋白或肽的内部区域中而连接在一起。肽键是在一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的胺基之间形成的共价化学键。融合蛋白是通过使融合蛋白基因在表达宿主中表达来产生，在表达宿主中第一蛋白或肽的编码序列与第二蛋白或肽的编码序列连接。

“SEQ ID NO:1的融合蛋白”在本文中也称为“cpIL-2:IL-2Rα”并且在PCT申请公布号WO2013/184942中进行了描述。SEQ ID NO:1的融合蛋白是与IL-2受体的IL-2Rα部分的细胞外结构域融合的环状置换(cp)的IL-2变体，并且具有以下氨基酸序列：

SKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLTGGSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQGSGGGSELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTG(SEQ ID NO:1)。

本发明还涵盖SEQ ID NO:1的融合蛋白的“变体”的使用，该变体具有与SEQ IDNO:1的约20个氨基酸至最长全长的连续延伸段(contiguous stretch)具有约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。SEQ ID NO:1的变体可与SEQ ID NO:1相比在限定长度的连续氨基酸(例如，“比较窗口”)上具有限定的序列同一性。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。用于比较的序列的最佳比对可例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源算法，通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源比对算法，通过Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.US A85:2444(1988)的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics Software Package,Madison,Wis.中的GAP、BES TFIT、FASTA和TFASTA)，或通过人工比对和视觉检查(参见例如Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人编著，1995supp lement))来进行。

作为实例，SEQ ID NO:1的融合蛋白的变体可包含与SEQ ID NO:1的连续延伸段具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，该连续延伸段为SEQ ID NO:1的约20个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约80个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约120个氨基酸、约120个氨基酸至约140个氨基酸、约140个氨基酸至约150个氨基酸、约150个氨基酸至约155个氨基酸、约155个氨基酸至最长全长。

术语“IL-2疗法”包括施用基于IL-2的免疫疗法以及IL-2的作为免疫疗法的相关生物功能，包括但不限于维持CD4⁺调控性T细胞和使CD4⁺T细胞分化为多种亚群；促进CD8⁺T细胞和NK细胞细胞毒性活性，以及调节响应于抗原的T细胞分化程序，从而促进原始CD4⁺T细胞分化成T辅助-1(Th1)和T辅助-2(Th2)细胞，同时抑制T辅助-17(Th17)分化。因此，如本文所用的“IL-2疗法”包括但不限于使用rhIL-2或rhIL-2的变体(诸如SEQ ID NO:1的融合蛋白)的免疫疗法。

术语“高剂量IL-2”和“HD IL-2”“包括约或至少约600,000国际单位(IU)/kg体重(kg)/剂，或约或至少约720,000IU/kg/剂的优选人重组白介素-2(IL-2)的剂量。

如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指可以例如出于实验、诊断、防治和/或治疗目的施用根据本公开的组合物的任何生物体。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类和人)和/或植物。优选地，“患者”是指可能寻求或需要治疗、要求治疗、正在接受治疗、将接受治疗的人类受试者，或由接受受过训练的专业人员护理特定疾病或疾患的受试者。

短语“药学上可接受的”在本文用于指在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比率相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

术语“药学上可接受的赋形剂”是指与本公开的化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。药学上可接受的赋形剂通常是无毒的、生物学上可耐受的并且在生物学上在其他方面适于向受试者施用的物质(诸如惰性物质)，该物质被添加到药理组合物中或以其他方式用作媒介物、载体或稀释剂以促进剂的施用并与其相容。赋形剂的实例包括如适合于所需的特定剂型的水、任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性试剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。Remington's The Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro(Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,Md.,2006；通过引用并入本文)公开了用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备该药物组合物的已知技术。除非任何常规赋形剂介质与物质或其衍生物不相容(诸如因产生任何不期望的生物效应或另外以有害方式与药物组合物的任何一种或多种其它组分相互作用)，否则它的用途被考虑为在本公开的范围内。

如本文所用，术语“预防”是指部分或完全延迟感染、疾病、病症和/或疾患的发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状、特征或临床表现的发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状、特征或表现的发作；部分或完全延迟感染、特定疾病、病症和/或疾患的进展；以及/或者降低发展与感染、疾病、病症和/或疾患相关的病理的风险。

术语“重组产生”是指操纵两个或多个DNA序列并将其组合在一起的技术，包括重组、PCR(聚合酶链式反应)、体外诱变和直接DNA合成。这些技术描述于许多出版的书籍和手册中，该书籍和手册包括Current protocols in molecular biology”(Ausubel编辑，2008.John Wiley&Son)。

如本文所用，“组合”、“组合疗法”和/或“组合治疗方案”的任何施用形式或共同施用形式是指至少两种治疗活性药物或组合物，该至少两种治疗活性药物或组合物可以以单独的或组合的制剂同时地施用或共同施用，或在由数分钟、数小时或数天分开的不同时间顺序地施用或共同施用，但以某种方式一起作用从而提供所需治疗响应。

如本文所用，术语“肠胃外”是指旨在作为注射液或输注液施用的剂型，并且包括皮下、静脉内、动脉内、腹膜内、心内、鞘内和肌内注射，以及通常通过静脉内途径的输注注射。

术语“治疗剂”涵盖被施用来治疗需要此种治疗的个体的症状或疾病的任何剂。此种额外的治疗剂可以包含适合于所治疗的特定适应症的任何活性成分，优选具有彼此没有不利影响的互补活性的那些。优选地，额外的治疗剂是抗炎剂。

术语“化疗剂”是指这样的化合物或其衍生物，该化合物或其衍生物可以与癌细胞相互作用，从而例如通过削弱细胞分裂或DNA合成，或通过破坏DNA从而有效地靶向快速分裂的细胞而降低细胞的增殖状态以及/或者杀伤细胞。化疗剂的实例包括但不限于烷化剂(例如环磷酰胺、异环磷酰胺)；代谢拮抗剂(例如甲氨蝶呤(MTX)、5-氟尿嘧啶或其衍生物)；取代的核苷酸；取代的核苷；DNA去甲基化剂(也称为抗代谢物；例如，阿扎胞苷)；抗肿瘤抗生素(例如丝裂霉素、阿霉素)；植物来源的抗肿瘤剂(例如长春新碱、长春地辛、

紫杉醇、abraxane)；顺铂；卡铂；依托泊苷；等等。此类剂可以进一步包括但不限于抗癌症剂三甲曲沙(trimethotrexate)(TMTX)；替莫唑胺；雷替曲塞；S-(4-硝基苄基)-6-硫代肌苷(NBMPR)；6-苄基胍(6-BG)；亚硝基脲(吡喃阿拉伯糖基-N-甲基-N-亚硝基脲)(Aranose)、卡莫司汀(BCNU,BiCNU)、氯脲霉素、乙基亚硝基脲(ENU)、福莫司汀、洛莫司汀(CCNU)、尼莫司汀、N-亚硝基-N-甲基脲(NMU)、雷莫司汀(MCNU)、司莫司汀、链脲菌素(链脲佐菌素)；阿糖胞苷；和喜树碱；或它们中的任一者的治疗性衍生物。

如本文所用的术语“治疗(treating)疾病(或疾患或病症)”或者疾病(或疾患或病症)的“治疗(treatment)”是指防止疾病在可能易患该疾病但尚未经历或展现该疾病的症状的人受试者或动物受试者中发生(防治性治疗)、抑制疾病(减缓或遏制其发展)、提供疾病的症状或副作用的缓解(包括姑息治疗)，以及引起疾病的消退。关于癌症，这些术语还意指受癌症影响的个体的预期寿命可能增加或该疾病的一种或多种症状将减少。关于癌症，“治疗”还包括增强或延长受试者中的抗肿瘤响应。

短语“治疗有效量”或“有效量”是指剂以当被施用于受试者时能够对疾病、病症或疾患的任何症状、方面或特征具有任何可检测的积极作用的量，单独或作为药物组合物的一部分并且以单次剂量或作为一系列次剂量的一部分被施用于受试者。治疗有效量可以通过测量相关生理效应来确定，并且可以结合给药方案和受试者的疾患的诊断分析等来调节。例如，施用后产生的炎性细胞因子的量的测量值可以指示是否已经使用治疗有效量。关于与不受调节的细胞分裂有关的癌症或病理，治疗有效量是指具有以下作用的量：(1)减小肿瘤大小(即，肿瘤消退)，(2)抑制(即，在一定程度上减缓，优选地停止)异常细胞分裂，例如癌细胞分裂，(3)防止或减少癌细胞转移，以及/或者(4)在一定程度上缓解(或优选地消除)同与不受调节或异常的细胞分裂有关或部分地由不受调节或异常的细胞分裂引起的病理(包括例如癌症)相关的一种或多种症状。“有效量”也是在施用本发明的治疗活性组合物后产生期望的PD和PK谱以及期望的免疫细胞谱型的量。

术语“治疗有效量”在向患者施用融合蛋白SEQ ID NO:1的特定上下文中包括但不限于作为有效活化IL-2中间受体IL-2Rβγ的量的SEQ ID NO:1的融合蛋白的量。

术语“治疗有效量”在向患者施用血管生成抑制剂(诸如卢西他尼)的特定上下文中包括但不限于有效抑制一种或多种促血管生成受体酪氨酸激酶的活性的血管生成抑制剂的量，该促血管生成受体酪氨酸激酶包括但不限于血管内皮生长因子受体1、2和3型(VEGFR1-3)；血小板衍生生长因子受体α和β型(PDGFRα/β)；和成纤维细胞生长因子受体1、2和3型(FGFR1-3)；或它们的任何组合。

如在本文所述的癌症的上下文中使用的“无进展生存期(PFS)”是指在癌症治疗期间和治疗后肿瘤停止生长、减少或完全消除直至肿瘤恢复生长、肿瘤进展或出现其他肿瘤或直至患者因任何原因死亡的时间长度。治疗可通过包括身体检查、神经学检查或精神病学评估的结果在内的客观或主观参数评定。在优选的方面，PFS可通过盲化成像中心评审来评定，并且可进一步任选地通过总响应率(ORR)或通过盲化独立中心评审(BICR)来确认。PFS的增加可以基于与例如未接受本发明的组合疗法的一名或多名其他患者或仅接受组合疗法中的一种药物(即单一疗法)的一名或多名患者的比较来确定，并且可以表示为平均百分比。可以在治疗方案之间比较指定的时间范围，例如可以在本发明的组合疗法和仅使用组合疗法的组分之一的单一疗法之间进行比较。也可以在其他相同或不同血管生成抑制剂与例如高剂量人重组IL-2的组合疗法之间进行比较。

“总体生存(OS)”可以通过Kaplan-Meier方法在某些时间点(例如，1年和2年)通过OS率进行评定，并且对应的95％CI将基于Greenwood公式通过针对每种肿瘤类型的研究治疗得到。OS率定义为在该时间点时活着的参与者的比例。参与者的OS定义为从首次给药日期至因任何原因死亡的日期的时间。可以在治疗方案之间比较指定的时间范围，例如可以在本发明的组合疗法和仅使用组合疗法的组分之一的单一疗法之间进行比较。也可以在其他相同或不同血管生成抑制剂与例如高剂量人重组IL-2的组合疗法之间进行比较。

如本文所用，“完全响应”(CR)是所有癌症迹象响应于治疗而消失。完全响应在本文中也可称为“总体缓解”或“完全缓解”。术语完全响应包括但不限于在指定时间范围内实现的完全响应的鉴定。可以在治疗方案之间比较指定的时间范围，例如可以在本发明的组合疗法和仅使用组合疗法的组分之一的单一疗法之间进行比较。也可以在例如参考患者群体中的相同或不同血管生成抑制剂与例如高剂量人重组IL-2的组合疗法之间进行比较。

如本文所用，术语“部分响应”(PR)意指身体内的肿瘤大小或癌症程度响应于治疗而减小。部分响应在本文中也可以称为“部分缓解”。术语“部分响应”包括但不限于在指定时间范围内实现的部分响应的鉴定。可以在参考患者群体中的治疗方案之间比较指定的时间范围，例如可以在本发明的组合疗法和仅使用组合疗法的组分之一的单一疗法之间进行比较。也可以在相同或不同血管生成抑制剂与例如高剂量人重组IL-2的组合疗法之间进行比较。

如本文所用的术语“癌症”应被赋予它的作为异常细胞不受控制地分裂的疾病的通用术语的普通含义。

如本文所用的术语“减少肿瘤”或“肿瘤消退”是指减小肿瘤块的大小或体积、减少受试者中转移的肿瘤的数目、降低癌细胞的增殖状态(癌细胞繁殖的程度)等。

如本文所用的在患者对本发明的组合疗法的响应的背景下的术语“增强的”、“增强”、“增加”或“增加的”是指患者对本文中所公开的组合疗法治疗的响应的任何方面的改善，包括但不限于：与参考响应相比肿瘤大小减小的增强、PFS的增强、CR的增强和OS的增强。例如，响应的增强或增加可以包括响应性与参考响应相比增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或更多。参考响应可以是例如患者或患者群体对仅使用组合疗法的组分之一的单一疗法的响应。例如，可以在患者或患者群体中的相同或不同血管生成抑制剂与例如高剂量人重组IL-2的组合疗法之间进行另一参考响应比较。

如本文所用，“增强”和“增加”还可以指增强或增加对治疗(诸如包含SEQ ID NO:1的融合蛋白与以下中的任何一者或多者的组合疗法：血管生成抑制剂、化学疗法、耐药的具有免疫能力的细胞和免疫检查点抑制剂)有响应的受试者的数目。例如，响应的增加或增强可以指响应于治疗的受试者的总百分比，其中该百分比为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或更高。

“药学上可接受的盐”是指本公开的化合物的盐，其是药学上可接受的并且具有母体化合物的所需药理学活性。特别地，此类盐是无毒的，可以是无机或有机酸加成盐和碱加成盐。具体而言，此类盐包括：(1)与无机酸形成的酸加成盐，该无机酸为诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或与有机酸形成的酸加成盐，该有机酸为诸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡萄糖庚酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等；(2)当存在于母体化合物中的酸质子被金属离子(例如碱金属离子、碱土离子或铝离子)取代或者与有机碱(诸如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基葡糖胺等)配位时形成的盐。仅举例来说，盐还包括钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等；以及当该化合物含有碱性官能团时，还包括无毒的有机或无机酸的盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。

一般来说，此类盐可通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的量的适当碱或酸在水中或在有机溶剂中或者在二者的混合物中反应来制备；一般来说，优选非水性介质，如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适的盐的列表可见于Allen,Jr.,LV,ed.,Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第22版,Pharmaceutical Press,London,UK(2012)。

如本文所用，术语“血管生成抑制剂”是指防止新血管形成的药物、化合物、抗体或其他剂。在癌症治疗中，血管生成抑制剂可能会阻止肿瘤需要生长的新血管的生长。血管生成抑制剂包括那些可以靶向与受体酪氨酸激酶(RTK)相关的一种或多种信号传导通路的剂。RTK包括但不限于血管内皮生长因子受体1、2和3型(VEGFR1-3)；血小板衍生生长因子受体α和β型(PDGFRα/β)；和成纤维细胞生长因子受体(FGFR)1、2和3型(FGFR1-3)。优选的根据本发明的血管生成抑制剂具有广泛的靶向选择性并且能够同时靶向抑制多个RTK，并且在本文中被称为“多受体酪氨酸激酶抑制剂”。

一种优选的多受体酪氨酸激酶抑制剂是卢西他尼，6-(7-((1-氨基环丙基)-甲氧基)-6-甲氧基喹啉-4-基氧基)-N-甲基-1-萘酰胺(CAS#1058137-23-7)，或药学上可接受的盐(诸如盐酸盐)。另见美国专利号8,163,923，其通过引用整体并入。

卢西他尼由式I表示:

“血管内皮生长因子(VEGF)”是一种参与调节血管生成和血管发生(vasculogenesis)的信号传导蛋白。VEGF通过转磷酸化结合至并活化受体酪氨酸激酶VEGFR。已在人中鉴定出三种VEGFR同工型。

“血管内皮生长因子(VEGF)/血管内皮生长因素受体(VEGFR)”抑制剂是抑制VEGF和VEGFR的活性的剂。VEGR和VEGFR(一种酪氨酸激酶受体)信号传导调节血管生成，该血管生成涉及从现有血管制造新血管。已知异常血管生成发生在癌症、退行性眼部疾患和其他涉及炎症的疾患中。特定的单克隆抗体可用作VEGF抑制剂，并且特定的酪氨酸激酶抑制剂用作VEGFR抑制剂。血管内皮生长因子(VEGF)/血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂被用于治疗各种类型的癌症。

“VEGFR酪氨酸激酶抑制剂”是一种阻断形成血管所需的酶的物质。也称为血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂。卢西他尼是VEGFR酪氨酸激酶抑制剂。

“FGF受体”属于受体酪氨酸激酶的群组。在本发明中，FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4和FGFR5统称为FGF受体。此外，与FGFR1、FGFR2、PGFR3、FGFR4和FGFR5中的任一者的氨基酸序列具有同源性并且具有FGF受体活性的物质(包括功能目前仍然未知但未来将被归入在同一家族中的受体)也包括在FGF受体中。FGF受体活性可以通过用ELISA或Western印迹检测受体的磷酸化来确定。

“FGF受体抑制剂”是指对FGF受体具有抑制活性的抑制剂。FGF受体抑制剂可以对其他受体酪氨酸激酶和其他生物分子具有抑制活性，只要该FGF受体抑制剂对FGF受体具有抑制活性即可。

“血小板衍生生长因子(PDGF)受体”属于受体酪氨酸激酶的群组。在本发明中，PDGFR-α和PDGFR-β统称为PDGF受体。此外，与PDGFR-α和PDGFR-β中的任一者的氨基酸序列具有同源性并且具有PDGF受体活性的物质(包括功能目前仍然未知但未来将被归入在同一家族中的受体)也包括在PDGF受体中。PDGF受体活性可以通过用ELISA或Western印迹检测受体的磷酸化活性来确定。

“PDGF受体抑制剂”是指对PDGF受体具有抑制活性的抑制剂。PDGF受体抑制剂可以对其他受体酪氨酸激酶和其他生物分子具有抑制活性，只要该PDGF受体抑制剂对PDGF受体具有抑制活性即可。

“RET激酶”属于受体酪氨酸激酶的群组，是Glia细胞系衍生神经营养因子(GDNF)家族的配体的功能性受体。此外，在本发明中，与RET激酶的氨基酸序列具有同源性并且具有RET激酶活性的物质(包括功能目前未知但未来将被归入在同一家族中的受体)也包括在RET激酶中。RET激酶活性可以通过用ELISA或Western印迹检测受体的磷酸化活性来确定。

“RET激酶抑制剂”是指对RET激酶具有抑制活性的抑制剂。RET激酶抑制剂可以对其他受体酪氨酸激酶和其他生物分子具有抑制活性，只要该RET激酶抑制剂对RET激酶具有抑制活性即可。

“KIT激酶”，也称为c-Kit或SCF受体，属于受体酪氨酸激酶的群组。此外，在本发明中，与KIT激酶的氨基酸序列具有同源性并且具有KIT激酶活性的物质(包括功能目前未知但将来将被归入在同一家族中的物质)也包括在KIT激酶中。

“KIT激酶抑制剂”是指对KIT激酶具有抑制活性的抑制剂。KIT激酶抑制剂可以对其他受体酪氨酸激酶和其他生物分子具有抑制活性，只要该KIT激酶抑制剂对KIT激酶具有抑制活性即可。KIT激酶活性可以通过用ELISA或Western印迹方法检测受体的磷酸化活性来确定。

“EGF”是指上皮生长因子，并且“EGF抑制剂”是指对由EGF与其受体的结合诱导的信号传导具有抑制活性的抑制剂。EGF抑制剂可以对其他生物分子具有抑制活性，只要该EGF抑制剂对由EGF诱导的信号传导具有抑制活性即可。

“整合素”是主要用作细胞粘附分子的细胞表面蛋白中的一种。该结构是由α链和β链组成的异二聚体。迄今为止，22种由不同的呈组合形式的α链和β链组成的整合素已被发现并且形成整合素家族。“整合素抑制剂”是指对由整合素与其受体的结合所诱导的信号传导具有抑制活性的抑制剂。整合素抑制剂可以对其他生物分子具有抑制活性，只要该整合素抑制剂对由整合素诱导的信号传导具有抑制活性即可。

“基质金属蛋白酶”属于参与细胞外基质降解的锌离子(Zn2+)依赖性蛋白酶的群组。已知基质金属蛋白酶降解血管周围的基底膜，从而增强血管生成。“基质金属蛋白酶抑制剂”是指对基质金属蛋白酶具有抑制活性的抑制剂。基质金属蛋白酶抑制剂可以对其他生物分子具有抑制活性，只要该基质金属蛋白酶抑制剂对基质金属蛋白酶具有抑制活性即可。

SEQ ID NO:1的融合蛋白

本发明提供了利用SEQ ID NO:1的重组人IL-2变体融合蛋白的组合疗法，该SEQID NO:1的重组人IL-2变体融合蛋白描述于WO2013/184942中，是一种与IL-2受体的IL-2Rα部分的细胞外结构域融合的环状置换(cp)的IL-2变体。

考虑了与SEQ ID NO:1密切相关的融合蛋白，诸如那些在与SEQ ID NO:1的至少约20个氨基酸直至全长的连续序列上具有约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列同一性的融合蛋白也可以适合于根据本发明的方法的施用。

SEQ ID NO:1的融合蛋白被设计为选择性地结合至并活化中等亲和力IL-2R而非高亲和力IL-2R。SEQ ID NO:1的融合蛋白的IL-2Ra结构域的作用是在空间上阻碍SEQ IDNO:1的融合蛋白与高亲和力IL-2R的结合，但仍允许与中间亲和力IL-2R的结合。

体外和体内非临床药效学(PD)数据支持SEQ ID NO:1的融合蛋白通过中等亲和力IL-2受体的选择性信号传导，导致诸如NK细胞和CD8+T细胞的效应细胞的活化和扩增，同时最大限度地减少免疫抑制性T_reg的活化和扩增。此外，在小鼠体内，SEQ ID NO:1的融合蛋白的小鼠替代物在引起效应细胞相对于T_reg等同或更大扩增的剂量下相对于重组人IL-2(rhIL-2)显示出改善的耐受性。

首先美国专利公布号20210038684A1中描述的人临床数据表明，SEQ ID NO:1的融合蛋白在不存在剂量依赖性的Treg活化的情况下以剂量依赖性方式活化CD8+T细胞和NK细胞的扩增。因此，SEQ IDNO:1的融合蛋白可以以与高剂量rhIL-2相当的浓度给药于人患者，以引发与例如高剂量rhIL-2相比同等或更大的NK细胞和CD8+T细胞的扩增，但与高剂量rhIL-2相比要少得多(至少少两倍)的免疫抑制性Treg的相对扩增。

组合治疗方案的方法

本发明提供了用于治疗有需要的患者中的癌症的组合治疗方案的方法。本发明的方法包括：i)向患者施用治疗有效量的SEQ ID NO:1的融合蛋白；ii)向患者施用治疗有效量的血管生成抑制剂，诸如多受体酪氨酸激酶抑制剂；其中步骤(i)在步骤(ii)之前、之后或与其同时进行。

本发明还提供了用于治疗患者癌症的组合治疗方案，该组合治疗方案包括：i)向患者施用治疗有效量的SEQ ID NO:1的融合蛋白的变体，其中该变体具有与SEQ ID:1在全长SEQ ID NO:1上具有约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；ii)向患者施用治疗有效量的血管生成抑制剂；其中步骤(i)在步骤(ii)之前、之后或与其同时进行。

优选地，SEQ ID NO:1或其变体的有效量是有效活化IL-2中间受体IL-2Rβγ的量。优选地，血管生成抑制剂的有效量是有效抑制肿瘤生长的量。优选地，血管生成抑制剂的有效量是有效抑制一种或多种RTK的活性的量，该RTK包括但不限于血管内皮生长因子受体1型、2型和3型(VEGFR1-3)；血小板衍生生长因子受体α型和β型(PDGFRα/β)；和成纤维细胞生长因子受体1型、2型和3型(FGFR1-3)。

关于施用步骤(i)和(ii)，这些施用步骤可以以任一顺序(以及同时)进行并且本发明在这方面不受限制。施用步骤(i)可以在施用步骤(ii)之前进行。施用步骤(ii)可以在施用步骤(i)之前进行。施用步骤(i)和施用步骤(ii)可以同时进行。施用步骤(i)和/或施用步骤(ii)可以重复进行。施用步骤(i)和施用步骤(ii)可以仅进行一次。

与血管生成抑制剂组合的SEQ ID NO:1的融合蛋白的治疗有效量可能与当作为单一疗法被递送时的SEQ ID NO:1的融合蛋白的治疗有效量不同。然而，只要组合治疗方案提供期望的结果，在组合治疗方案中使用的SEQ ID NO:1的融合蛋白的量就被认为是治疗有效的。一般来说，当与血管生成抑制剂组合时，SEQ ID NO:1的融合蛋白的治疗有效量是足以活化靶中间IL-2受体IL-2Rβγ的量。IL-2Rβγ的活化包括，例如，NK细胞和CD8+T细胞的扩增。优选地，SEQ IDNO:1或其变体的有效量是有效地例如导致患者中的循环NK细胞和CD8+T细胞呈剂量依赖性增加，而循环T调控性(Treg)细胞呈极小的非剂量依赖性增加的量。优选地，在施用SEQ ID NO:1的融合蛋白的患者中，相对于循环T调控性(Treg)的增加的循环NK细胞和CD8+T细胞的增加更大。

本领域技术人员可以使用标准测定法诸如对用SEQ ID NO:1的融合蛋白，或者如本文实施例4中所述的与血管生成抑制剂的组合疗法处理的细胞或组织进行FACS分析来确定该量。SEQ ID NO:1的治疗有效量可以从最小活化到高度活化不等，只要与血管生成抑制剂的组合疗法提供治疗即可。

一般而言，使用SEQ ID NO:1的融合蛋白的单一疗法或本文描述的任何组合疗法的给药参数规定剂量量小于可能对受试者具有不可逆毒性的量(即，最大耐受剂量，“MTD”)并且不小于对受试者产生可测量作用所需的量。此类量根据例如将施用途径和其它因素考虑进去的与ADME相关的药代动力学和药效学参数来确定。

有效剂量(ED)是剂的在服用它的受试者的一定分数中产生治疗响应或所需效果的剂量或量。剂的“中位有效剂量”或ED50是剂的在施用它的群体的50％中产生治疗响应或所需效果的剂量或量。尽管ED50通常用作剂效果的合理预期的量度，但它不一定是临床医生考虑到所有相关因素认为合适的剂量。因此，在一些情况下，有效量可以大于计算的ED50，在其他情况下，有效量可以小于计算的ED50，并且在另外的其他情况下，有效量可以与计算的ED50相同。

此外，SEQ ID NO:1的融合蛋白的有效剂量可以是当以一个或多个剂量施用于受试者时相对于健康受试者产生期望结果的量。例如，对于经历特定病症的受试者，有效剂量可以是使该病症的诊断参数、量度、标志物等改善了至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或超过90％的剂量，其中100％被定义为正常受试者表现出的诊断参数、量度、标志物等。

本发明提供了包含在“单位剂型”中的剂量。短语“单位剂型”是指物理上离散的单位，每个单位含有足以产生所需效果的预定量的单独的或与一种或多种血管生成抑制剂和任选的一种或多种额外的治疗剂组合的SEQ ID NO:1的融合蛋白。应当理解，单位剂型的参数将取决于具体的剂和要达到的效果。

优选地，SEQ ID NO:1的融合蛋白作为每天单次I.V.输注施用。单次I.V.输注可能需要用时5分钟到2小时。优选地，SEQ ID NO:1的治疗有效量是通过I.V.输注向患者施用的被以下范围中的一者或多者所涵盖的量：基于约12kg至约50kg或更重的儿童或60-70kg的成人的从约0.01到1mg/kg；从约0.01mg/kg到约0.1mg/kg；从约1mg/kg到约1000mg/kg；从约2mg/kg到约900mg/kg；从约3mg/kg到约800mg/kg；从约4mg/kg到约700mg/kg；从约5mg/kg到约600mg/kg；从约6mg/kg到约550mg/kg；从约7mg/kg到约500mg/kg；从约8mg/kg到约450mg/kg；从约9mg/kg到约400mg/kg；从约5mg/kg到约200mg/kg；从约2mg/kg到约150mg/kg；从约5mg/kg到约100mg/kg；从约10mg/kg到约100mg/kg；以及从约10mg/kg到约60mg/kg或其相应的固定剂量。

优选地，本发明提供了用于I.V.施用的药物组合物，其包含儿科患者常常所需的以mg/kg计的一定剂量的SEQ ID NO:1的融合蛋白，例如，本发明提供了剂量为基于约12kg至约50kg或更重的儿童或60-70kg的成人的约0.1μg/kg、0.3μg/kg、1μg/kg、3μg/kg、3.5μg/kg、4μg/kg、4.5μg/kg、5μg/kg、5.5μg/kg、6μg/kg、6.5μg/kg、7μg/kg、7.5μg/kg、8μg/kg、8.5μg/kg、9μg/kg、9.5μg/kg、10μg/kg、10.5μg/kg、11μg/kg、11.5μg/kg、12μg/kg、12.5μg/kg、13μg/kg、13.5μg/kg、14μg/kg、14.5μg/kg或其相应的固定剂量的SEQ ID NO:1的融合蛋白。

优选地，SEQ ID NO:1的融合蛋白是通过皮下注射施用。优选地，本发明提供了用于皮下施用的药物组合物，其包含以下的一定剂量的SEQ ID NO:1的融合蛋白：基于约12kg至约50kg或更重的儿童或60-70kg的成人的至少约0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.5mg、0.8mg、0.9mg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、4.5mg、5mg、5.5mg、6mg、6.5mg、7mg、7.5mg、8mg、8.5mg、9mg、9.5mg、10mg、10.5mg、11mg、11.5mg、12mg、12.5mg、13mg、13.5mg、14mg、14.5mg、15mg、15.5mg、16mg、16.5mg、17mg、17.5mg、18mg、18.5mg、19mg、19.5mg、20mg、20.5mg、21mg、21.5mg、22mg、22.5mg、23mg、23.5mg、24mg、24.5mg、25mg、25.5mg、26mg、26.5mg、27mg、27.5mg、28mg、28.5mg、29mg、29.5mg或30mg或其相应的固定剂量。本发明的药物组合物可以任选地包含药学上可接受的赋形剂。

优选地，本发明提供了用于皮下施用的药物组合物，其包含儿科患者常常所需的以μg/kg计的一定剂量的SEQ ID NO:1的融合蛋白，例如，本发明提供了剂量为基于约12kg至约50kg或更重的儿童或60-70kg的成人的约0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.3μg/kg、0.4μg/kg、0.5μg/kg、0.6μg/kg、0.7μg/kg、0.8μg/kg、0.9μg/kg、1μg/kg、1.5μg/kg、2μg/kg、2.5μg/kg、3μg/kg、3.5μg/kg、4μg/kg、4.5μg/kg、5μg/kg、5.5μg/kg、6μg/kg、6.5μg/kg、7μg/kg、7,5μg/kg、8μg/kg、8.5μg/kg、9μg/kg、9.5μg/kg、10μg/kg、10.5μg/kg、11μg/kg、11.5μg/kg、12μg/kg、12.5μg/kg、13μg/kg、13.5μg/kg、14μg/kg、14.5μg/kg、15μg/kg或其相应的固定剂量的SEQ ID NO:1的融合蛋白。

优选地，SEQ ID NO:1的有效量是向患者施用的被以下范围中的一者或多者所涵盖的量：从约0.01到1mg/kg；从约0.01mg/kg到约0.1mg/kg；从约1mg/kg到约1000mg/kg；从约2mg/kg到约900mg/kg；从约3mg/kg到约800mg/kg；从约4mg/kg到约700mg/kg；从约5mg/kg到约600mg/kg；从约6mg/kg到约550mg/kg；从约7mg/kg到约500mg/kg；从约8mg/kg到约450mg/kg；从约9mg/kg到约400mg/kg；从约5mg/kg到约200mg/kg；从约2mg/kg到约150mg/kg；从约5mg/kg到约100mg/kg；从约10mg/kg到约100mg/kg；以及从约10mg/kg到约60mg/kg。

优选地，本发明的给药方案提供了按以下方案皮下施用包含SEQ ID NO:1的融合蛋白的药物组合物：约每3天(q3d)、约每4天(q4d)、约每5天(q5d)、约每6天(q6d)、约每7天(q7d)、约每8天(q8d)、约每9天(q9d)、约每10天(Q10d)、约每11天(q11d)、约每12天(q12d))、约每13天(q13d)、约每14天(q14d)、约每15天(q15d)、约每16天(q16d)、约每17天(q17)、约每18天(q18d)、约每19天(q19d)、约每20天(q20d)、约每21天、约每22天、约每23天、约每24天、约每25天、约每26天、约每27天，或约每28天。

优选地，SEQ ID NO:1的融合蛋白以约0.1mg、1mg、3mg、6mg、10mg或30mg的剂量，约每3天(q3d)、约每4天(q4d)、约每7天(q7d)、约每14天(q14d)或约每21天(q21d)皮下施用。

优选地，用于施用融合蛋白的给药方案提供一个或多个治疗过程。第一治疗过程可以在1-90天范围内的一段时间内进行。优选地，单个治疗过程延续7天、14天、21天、4周、6周、8周、10周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长的时段。治疗过程可以涉及，例如，在该治疗过程期间一次或多次皮下或IV施用SEQ IDNO:1的融合蛋白。可以有一个或多个连续的治疗过程，诸如第一个治疗过程后面接着第二治疗过程，优选在两个治疗过程之间有一段时间，诸如一天至一年。

与血管生成抑制剂组合的SEQ ID NO:1的融合蛋白的实际施用剂量和频率将随着受试者的年龄、体重和一般状况以及所治疗的疾患的严重程度、医疗保健专业人员的判断，以及正在施用的缀合物而变化。还可以基于患者是否对组合中的化合物中的一种或多种化合物有响应来确定给药和频率。例如，患者可能对单独的各种剂以及组合有响应，但对组合的响应更大。作为进一步的实例，患者可能对各种剂中的一种剂无响应，但对组合有响应。作为另进一步的实例，患者可能对单独的各种剂中的任一种剂无响应，但对组合有响应。

本文所述的组合疗法方法包括将至少一种血管生成抑制剂与SEQ ID NO:1的融合蛋白组合施用。本发明不限于任何特定的血管生成抑制剂，只要该分子抑制血管生成即可。在一些情况下，由于例如协同效应，该分子对血管生成的最小抑制在存在SEQ ID NO:1的融合蛋白的情况下可能是足够的。许多血管生成抑制剂是本领域已知的，例如，以下是FDA批准的血管生成抑制剂清单：

·阿西替尼(Axitinib)

·贝伐珠单抗(Bevacizumab)

·卡博替尼(Cabozantinib)

·依维莫司(Everolimus)

·来那度胺(Lenalidomide)

·乐伐替尼甲磺酸盐(Lenvatinib mesylate)

·帕唑帕尼(Pazopanib)

·雷莫芦单抗

·瑞戈非尼(Regorafenib)

·索拉非尼(Sorafenib)

·舒尼替尼(Sunitinib)

·沙利度胺(Thalidomide)(Synovir,

)

·凡德他尼(Vandetanib)

·Ziv-阿柏西普(Ziv-aflibercept)

鉴于许多商业上可获得的血管生成抑制剂和那些正在临床试验中的那些，技术人员可以参考文献来获得关于鉴定和测试任何潜在血管生成抑制剂的活性以及确定施用单独的或与SEQ ID NO:1的融合蛋白组合的血管生成抑制剂的合适剂量和频率的信息。优选的血管生成抑制剂是那些能够抑制多于一种RTK的抑制剂，并且包括多种受体酪氨酸激酶抑制剂。

足以促进血管生成抑制的血管生成抑制剂的施用量在本文中称为“血管生成抑制量”或剂量范围。本领域技术人员可以参考科学文献和商业上可获得的抑制剂的包装插页来确定用于本发明的组合疗法的血管生成抑制量。

用于组合治疗方法的优选血管生成抑制剂是多受体酪氨酸激酶抑制剂卢西他尼，6-(7-((1-氨基环丙基)-甲氧基)-6-甲氧基喹啉-4-基氧基)-N-甲基-1-萘酰胺(CAS#1058137-23-7)，或药学上可接受的盐(诸如盐酸盐)。

优选地，作为每日经口给药方案的卢西他尼的血管生成抑制量将优选为0.01mg/Kg总体重至200mg/Kg总体重。用于通过注射(包括静脉内、肌肉内、皮下和肠胃外注射)以及使用输注技术施用的每日剂量将优选为0.01mg/Kg总体重至200mg/Kg总体重。每日直肠给药方案将优选为0.01mg/Kg总体重至200mg/Kg总体重。每日阴道给药方案将优选为0.01mg/Kg总体重至200mg/Kg总体重。每日局部给药方案将优选为每天一次到四次地施用的0.01mg到200mg。透皮浓度将优选为维持0.01mg/Kg至200mg/Kg的每日剂量所需的透皮浓度。每日吸入给药方案将优选为0.01mg/Kg总体重至200mg/Kg总体重。

优选地，卢西他尼的血管生成抑制量在每日经口施用约1mg至约30mg，更优选每日经口施用约2mg至约10mg，更优选每日经口施用约5mg至约10mg的范围内。

组合治疗方案的益处。

本发明的组合疗法提供了许多有益的且意想不到的治疗效果，如由用SEQ ID NO:2(SEQ ID NO:1的鼠替代物)治疗的小鼠所证明的。用SEQ ID NO:2和卢西他尼的组合治疗的小鼠表现出对组合疗法的持久完全响应(图1)并且表现出延长的生存期(图2)。SEQ IDNO:2诱导CD8+T细胞增加，这种增加通过与卢西他尼的组合而被放大(图4)。卢西他尼诱导巨噬细胞减少，这种减少通过与SEQ ID NO:2的组合而被放大(图6)。与卢西他尼组合的SEQID NO:2诱导经治疗小鼠的肿瘤和脾脏中的树突状细胞增加(图7)。单独的和与SEQ ID NO:2组合的卢西他尼诱导肿瘤中VEGF诱导的Esm1基因表达的下调，从而导致经治疗小鼠的肿瘤消退(图8)。卢西他尼与SEQ ID NO:2的组合导致肿瘤中的细胞毒性基因表达更高，从而导致经治疗小鼠中的肿瘤消退以及VEGF通路抑制(图8-图10)。

对与T细胞信号传导相关的基因的分析表明，SEQ ID NO:2和卢西他尼的组合导致经治疗小鼠的肿瘤中的T细胞活化更高(表3)。与抗原呈递相关的基因表达的增加与用SEQID NO:2和卢西他尼的组合治疗的小鼠的肿瘤中树突状细胞浸润的增加有关(表4)。组合疗法还导致I型和II型干扰素通路相关基因的表达更高(表5)。总体而言，卢西他尼和SEQ IDNO:2的组合比单独的SEQ ID NO:2或卢西他尼改变了更多基因的表达(图11)。

治疗适应症

本文所述的组合治疗方法特别适用于治疗癌症。癌症细胞可以侵入附近的组织，并且通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。有几种主要类型的癌症，例如，癌(carcinoma)是从皮肤或作为内部器官的内衬或覆盖内部器官的组织中开始的癌症。肉瘤是从骨骼、软骨、脂肪、肌肉、血管或其他结缔或支持组织中开始的癌症。白血病是起始于诸如骨髓的造血组织并且导致大量异常血细胞产生并进入血流中的癌症。淋巴瘤是开始于免疫系统的细胞中的癌症。

当正常细胞失去作为指定、受控且协调的单位的行为能力时，就会形成肿瘤。一般来说，实体瘤是一种异常的组织块，该组织块通常不含囊肿或液体区域(一些脑肿瘤确实具有囊肿和充满液体的中央坏死区域)。单一的肿瘤内甚至可能具有不同的细胞群，其中不同的过程已出错。实体瘤可能是良性的(非癌性的)或恶性的(癌性的)。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞的类型命名。实体瘤的实例是肉瘤、癌和淋巴瘤。白血病(血液癌症)一般不会形成实体瘤。

可以使用本文所述的组合治疗方案治疗的实体瘤癌症的实例包括但不限于：胰腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、肾细胞癌；头颈部鳞状细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、宫颈癌、胃癌、子宫内膜癌、脑癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、头癌、颈癌、皮肤癌(包括黑色素瘤和基底癌)、间皮内膜癌、食道癌、乳腺癌、肌肉癌、结缔组织癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞癌)、肾上腺癌、甲状腺癌、肾癌或骨癌；胶质母细胞瘤、间皮瘤、胃癌、肉瘤、绒毛膜癌、皮肤基底细胞癌和睾丸精原细胞瘤。在优选的方面，所述癌症为宫颈癌、非小细胞肺癌、肾细胞癌；头颈部鳞状细胞癌、膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤或胃癌。在更优选的方面，所述癌症是黑素瘤、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、膀胱癌、肾细胞癌或胃癌。本发明的治疗方案特别适用于治疗实体瘤，包括但不限于：淋巴瘤、黑色素瘤、肾细胞癌(RCC)、晚期实体瘤、先前已用治疗疗法治疗但仍然是先前疗法难治的肿瘤。

也可以根据本发明治疗的癌症包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病，成人；急性成淋巴细胞性白血病，儿童期；急性髓样白血病，成人；肾上腺皮质癌；肾上腺皮质癌，儿童期；AIDS相关淋巴瘤；AIDS相关恶性肿瘤；直肠癌；星形细胞瘤，儿童期小脑；星形细胞瘤，儿童期大脑；胆管癌，肝外；膀胱癌；膀胱癌，儿童期；骨癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤；胶质母细胞瘤，儿童期；胶质母细胞瘤，成人；脑干胶质瘤，儿童期；脑瘤，成人；脑瘤，脑干胶质瘤，儿童期；脑瘤，小脑星形细胞瘤，儿童期；脑瘤，大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤，儿童期；脑瘤，室管膜瘤，儿童期；脑瘤，髓母细胞瘤，儿童期；脑瘤，幕上原始神经外胚层肿瘤，儿童期；脑瘤，视通路和下丘脑胶质瘤，儿童期；脑瘤，儿童期(其它)；乳腺癌；乳腺癌和妊娠；乳腺癌，儿童期；乳腺癌，男性；支气管腺瘤/类癌瘤，儿童期；类癌瘤肿瘤，儿童期；类癌瘤肿瘤，胃肠道；癌，肾上腺皮质；癌，岛细胞；原发部位不明癌；中枢神经系统淋巴瘤，原发性；小脑星形细胞瘤，儿童期；大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤，儿童期；宫颈癌；儿童期癌症；慢性淋巴细胞性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓增殖性病症；腱鞘的透明细胞肉瘤；结肠癌；结肠直肠癌，儿童期；皮肤T细胞淋巴瘤；子宫内膜癌；室管膜瘤，儿童期；上皮癌，卵巢；食道癌；食道癌，儿童期；尤因(Ewing)家族肿瘤；颅外生殖细胞瘤，儿童期；性腺外生殖细胞瘤；肝外胆管癌、眼癌，眼内黑素瘤；眼癌，视网膜母细胞瘤；胆囊癌；胃(胃部)癌；胃(胃部)癌，儿童期；胃肠道类癌瘤；生殖细胞瘤，颅外，儿童期；生殖细胞瘤，性腺外；生殖细胞瘤，卵巢；妊娠滋养细胞肿瘤；胶质瘤，儿童期脑干；胶质瘤，儿童期视通路和下丘脑；多毛细胞白血病；头颈癌；肝细胞(肝)癌，成人(原发性)；肝细胞(肝)癌，儿童期(原发性)；何杰金氏淋巴瘤，成人；何杰金氏淋巴瘤，儿童期；在妊娠期间的何杰金氏淋巴瘤；下咽癌；下丘脑和视通路胶质瘤，儿童期；眼内黑素瘤；胰岛细胞癌(内分泌胰腺)；卡波济氏肉瘤；肾癌；喉癌；喉癌，儿童期；白血病，急性成淋巴细胞性，成人；白血病，急性成淋巴细胞性，儿童期；白血病，急性髓样，成人；白血病，急性髓样，儿童期；白血病，慢性淋巴细胞性；白血病，慢性骨髓性；白血病，多毛细胞；唇和口腔癌；肝癌，成人(原发性)；肝癌，儿童期(原发性)；肺癌，非小细胞；肺癌，小细胞；成淋巴细胞性白血病，成人急性；成淋巴细胞性白血病，儿童期急性；淋巴细胞性白血病，慢性；淋巴瘤，AIDS相关的；淋巴瘤，中枢神经系统(原发性)；淋巴瘤，皮肤T细胞；淋巴瘤，何杰金氏，成人；淋巴瘤，何杰金氏，儿童期；淋巴瘤，在妊娠期间的何杰金氏；淋巴瘤，非何杰金氏，成人；淋巴瘤，非何杰金氏，儿童期；淋巴瘤，在妊娠期间的非何杰金氏；淋巴瘤，原发性中枢神经系统；巨球蛋白血症，瓦尔登斯特伦氏；男性乳腺癌；恶性间皮瘤，成人；恶性间皮瘤，儿童期；恶性胸腺瘤；髓母细胞瘤，儿童期；黑素瘤；黑素瘤，眼内；梅克尔(Merkel)细胞癌；间皮瘤，恶性；原发部位不明鳞状颈部转移癌；多发性内分泌肿瘤综合征，儿童期；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；蕈样肉芽肿病；骨髓增生异常综合征；骨髓性白血病，慢性；髓样白血病，儿童期急性；骨髓瘤，多发性；骨髓增殖性病症，慢性；鼻腔和鼻旁窦癌；鼻咽癌；鼻咽癌，儿童期；神经母细胞瘤；神经纤维瘤；非何杰金氏淋巴瘤，成人；非何杰金氏淋巴瘤，儿童期；在妊娠期间的非何杰金氏淋巴瘤；非小细胞肺癌；口癌，儿童期；口腔和唇癌；口咽癌；骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌，儿童期；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞瘤；卵巢低潜在恶性肿瘤；胰腺癌；胰腺癌，儿童期；胰腺癌，岛细胞；鼻旁窦和鼻腔癌；甲状旁腺癌；阴茎癌；嗜铬细胞癌；松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤，儿童期；垂体瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；妊娠和乳腺癌；妊娠和何杰金氏淋巴瘤；妊娠和非何杰金氏淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；原发性肝癌，成人；原发性肝癌，儿童期；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；肾细胞癌，儿童期；肾盂和输尿管，移行细胞癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤，儿童期；唾液腺癌；唾液腺癌，儿童期；肉瘤，尤因家族肿瘤；肉瘤，卡波济氏；肉瘤(骨肉瘤)/骨恶性纤维组织细胞瘤；肉瘤，横纹肌肉瘤，儿童期；肉瘤，软组织，成人；肉瘤，软组织，儿童期；塞扎里综合征；皮肤癌；皮肤癌，儿童期；皮肤癌(黑素瘤)；皮肤癌，梅克尔细胞；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤，成人；软组织肉瘤，儿童期；原发部位不明鳞状颈癌，转移性；胃(胃部)癌；胃(胃部)癌，儿童期；幕上原始神经外胚层肿瘤，儿童期；T细胞淋巴瘤，皮肤；睾丸癌；胸腺瘤，儿童期；胸腺瘤，恶性；甲状腺癌；甲状腺癌，儿童期；肾盂和输尿管移行细胞癌；滋养细胞瘤，妊娠期；原发部位不明瘤，儿童期；儿童期罕见癌；输尿管和肾盂，移行细胞癌；尿道癌；子宫肉瘤；阴道癌；视通路和下丘脑胶质瘤，儿童期；外阴癌；瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；和维尔姆斯瘤(Wilms'Tumor)，等等。

本发明的组合疗法特别适用于治疗实体瘤，包括但不限于：淋巴瘤、黑色素瘤、肾细胞癌(RCC)、肝细胞癌(HCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、卵巢癌、乳腺癌和三阴性乳腺癌。本发明的组合疗法还特别适用于治疗晚期实体瘤和先前已用抗癌症疗法治疗但仍然是先前疗法难治的肿瘤。

优选地，SEQ ID NO:1的融合蛋白在癌症的组合治疗中通过肠胃外施用，优选通过皮下注射或静脉内注射施用，并且优选卢西他尼经口施用。然而，也考虑了这两种化合物的其他施用方式，诸如肺部、鼻、颊部、直肠、舌下和经皮施用。如本文所用，术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、动脉内、腹膜内、心内、鞘内和肌肉内注射，以及输注。该方法的每种药理组分均单独施用。替代地，如果希望同时施用两种药理成分——并且该两种药理组分在一起是相容的并且在给定的制剂中是相容的——那么可以通过施用单一剂型/制剂来实现同时施用(例如，静脉内施用含有这两种药理活性剂的静脉内制剂)。本领域的普通技术人员可以通过常规测试确定两种给定的药理组分在一起以及在给定的制剂中是否相容。

根据本发明施用的组合物还可包含药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂以及另一种药物组合物，该另一种药物组合物包含一种或多种治疗剂(诸如治疗性抗体)，以及药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。

只要监督患者护理的临床医生认为本文所述的组合治疗方法有效，该治疗方法就可以继续使用。指示治疗方法有效的非限制性参数包括以下：肿瘤收缩(以重量和/或体积计)；单个肿瘤集落数目的减少；肿瘤消除；及无进展生存期(PFS)。

与本文公开的组合疗法的过程相关的示例性时间长度包括：约一周；两周；约三周；约四周；约五周；约六周；约七周；约八周；约九周；约十周；约十一周；约十二周；约十三周；约十四周；约十五周；约十六周；约十七周；约十八周；约十九周；约二十周；约二十一周；约二十二周；约二十三周；约二十四周；约七个月；约八个月；约九个月；约十个月；约十一个月；约十二个月；约十三个月；约十四个月；约十五个月；约十六个月；约十七个月；约十八个月；约十九个月；约二十个月；约二十一个月；约二十二个月；约二十三个月；约二十四个月；约三十个月；约三年；约四年和约五年。优选地，与本发明的组合疗法相关的时间长度最多为约2年。

药物组合物

根据本发明的SEQ ID NO:1的融合蛋白和血管生成抑制剂可以是一种或多种适合于施用于受试者的组合物的形式。一般来说，此类组合物是包含SEQ ID NO:1的融合蛋白和/或一种或多种血管生成抑制剂，以及一种或多种药学上可接受的或生理学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的“药物组合物”。

本发明的药物组合物可以被配制成与预期的施用方法或施用途径相容；本文阐述了示例性施用途径。此外，该药物组合物可以与如本文所述的其他治疗活性剂或化合物组合使用，以治疗或预防如本公开所考虑的疾病、病症和疾患。

该药物组合物通常包含治疗有效量的SEQ ID NO:1的融合蛋白和一种或多种药学上和生理学上可接受的配制剂(formulation agent)。合适的药学上可接受的或生理学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂包括但不限于抗氧化剂(例如抗坏血酸和硫酸氢钠)、防腐剂(例如苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯)、乳化剂、助悬剂,分散剂、溶剂、填充剂、增体剂、去污剂、缓冲剂、媒介物、稀释剂和/或佐剂。例如，合适的媒介物可以是可能补充有用于肠胃外施用的药物组合物中常见的其他材料的生理盐水溶液或柠檬酸盐缓冲盐水。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是进一步的示例性媒介物。本领域技术人员将容易地认识到可用于本文所考虑的药物组合物和剂型的多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括但不限于药学上可接受的弱酸、弱碱或它们的混合物。例如，缓冲剂组分可以是水溶性材料，诸如磷酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、谷氨酸以及它们的盐。可接受的缓冲剂包括例如Tris缓冲剂、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)和N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)。

在配制药物组合物后，可以将其作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。此类制剂可以以即用形式、使用前需要重构的冻干形式、使用前需要稀释的液体形式或其他可接受的形式储存。

优选地，该药物组合物提供在单次使用的容器(例如单次使用的小瓶、安瓿、注射器或自动注射器(类似于例如

))中，而其他实施方案中提供了多次使用的容器(例如多次使用的小瓶)。可以使用任何药物递送设备来递送药物组合物，该药物递送设备包括植入物(例如，可植入泵)和导管系统、慢速注射泵和装置，所有这些都是本领域技术人员所熟知的。一般皮下或肌肉内施用的贮库注射剂也可被用于在限定的时间段内释放本文公开的多肽。贮库注射剂通常是基于固体或油的，并且一般包含至少一种本文所阐述的制剂组分。本领域普通技术人员熟悉贮库注射剂的可能制剂和用途。

该药物组合物可呈无菌可注射水性悬浮液或油性悬浮液形式。该悬浮液可根据已知技术使用本文提及的那些合适的分散剂或润湿剂和助悬剂配制。无菌可注射制品还可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，如在1,3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的稀释剂、溶剂和分散介质包括水、林格溶液、等渗氯化钠溶液、CREMOPHOR EL^TM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)，以及它们的合适混合物。此外，无菌、不挥发性油通常用作为溶剂或悬浮介质。为了这个目的，可采用任何温和不挥发性油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。另外，诸如油酸的脂肪酸可应用于可注射剂的制备中。可以通过包含延迟吸收的剂(例如，单硬脂酸铝或明胶)来实现特定可注射制剂的延长吸收。

所述药物组合物可呈适合于经口使用的形式，例如呈片剂、胶囊、糖锭、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散粉剂或颗粒剂、乳液、硬质或软质胶囊，或糖浆、溶液、微珠或酏剂。意图用于经口使用的药物组合物可根据本领域中已知用于制造药物组合物的任何方法来制备，并且此类组合物可含有一种或多种剂，诸如例如甜味剂、调味剂、着色剂以及防腐剂以便提供药学上优良且可口的制品。片剂、胶囊等含有与适用于片剂的制造的无毒药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以为例如稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。

适用于经口施用的片剂、胶囊等可以未包衣或通过已知的技术包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收并从而提供持续作用。例如，可以采用诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的延时材料。它们也可通过本领域已知的技术包衣以形成用于受控释放的渗透型治疗片剂。额外的剂包括可生物降解或可生物相容的颗粒或聚合物物质，诸如聚酯、聚胺酸、水凝胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚酐、聚乙醇酸、乙烯-醋酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白或丙交酯和乙交酯共聚物、聚丙交酯/乙交酯共聚物，或乙烯乙酸乙烯酯共聚物以便控制所施用组合物的递送。例如，可以将经口剂包埋在通过凝聚技术或通过界面聚合分别通过使用羟甲基纤维素或明胶-微胶囊或聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊制备的微胶囊中，或者包埋在胶体药物递送系统中。胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、微珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。上面提到的制剂的制备方法对本领域技术人员来说是显而易见的。

用于经口使用的制剂还可呈现为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如碳酸钙、磷酸钙、高岭土或微晶纤维素)混合；或呈现为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。

水性悬浮液含有与适用于制造它的赋形剂混合的活性材料。此类赋形剂可以为助悬剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或湿润剂，例如天然存在的磷脂(如，卵磷脂)，或氧化烯与脂肪酸的缩合产物(如，聚氧乙烯硬脂酸酯)，或氧化乙烯与长链脂族醇的缩合产物(如，对于十七亚乙基氧基鲸蜡醇)，或氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(如，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)，或氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(如，聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂。

油性悬浮液可通过使活性成分悬浮于植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(诸如液体石蜡)中来配制。油性悬浮液可含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可添加甜味剂(诸如上面阐述的那些甜味剂)和调味剂以提供可口的经口制品。

适合于通过添加水来制备水性悬浮液的可分散粉剂和颗粒剂提供了与分散剂或润湿剂、助悬剂以及一种或多种防腐剂混合的活性成分。本文列举了合适的分散剂或润湿剂和助悬剂。

所述药物组合物还可以呈水包油乳液形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，或矿物油，例如液体石蜡，或这些的混合物。合适的乳化剂可以为天然存在的树胶(例如阿拉伯树胶或黄蓍树胶)、天然存在的磷脂(例如大豆、卵磷脂)和衍生自脂肪酸的酯或偏酯；己糖醇酐(例如失水山梨糖醇单油酸酯)，和偏酯与氧化乙烯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)。

制剂还可以包含用于保护组合物免受快速降解或从体内消除的载体，诸如包括植入物、脂质体、水凝胶、前药和微囊化递送系统在内的受控释放制剂。例如，可以使用延时材料，诸如单独的或与蜡组合的单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘酯。

栓剂可通过将药物与适合的无刺激赋形剂混合来制备，该无刺激赋形剂在常温下为固体但是在直肠温度下为液体并因此在直肠中熔融从而使药物释放。此类材料包括但不限于可可脂和聚乙二醇。

适合于根据本发明使用的药物组合物可以是目前已知的或将来开发的任何格式(例如，鼻用或吸入用的喷雾剂)。

制剂中SEQ ID NO:1的融合蛋白或一种或多种血管生成抑制剂的浓度可以广泛变化(例如，从按重量计小于约0.1％，通常在或至少约2％至高达20％至50％或更高)，并且将通常主要基于流体体积、粘度和基于受试者的因素根据例如所选择的特定施用方式进行选择。

额外的补充组合疗法

还考虑了将其他抗癌症治疗方案进一步与SEQ ID NO:1的融合蛋白和一种或多种血管生成抑制剂的组合疗法相组合，以用作用于治疗癌症的进一步组合疗法。其他治疗性治疗方案包括其他治疗性免疫疗法，诸如过继细胞转移方案、抗原特异性疫苗接种、DNA修复蛋白抑制(例如核酸酶聚(腺苷5'-二磷酸-核糖)聚合酶的抑制剂)“聚(ADP-核糖)聚合酶“PARP抑制剂”)和免疫检查点抑制分子阻断(例如细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)和程序性死亡1(PD-1)抗体)。

使用根据本发明的SEQ ID NO:1的融合蛋白和血管生成抑制剂的治疗方案也可以进一步与其他治疗剂和/或抗癌症剂组合以作为对免疫检查点抑制剂的补充或替代。优选地，该治疗剂和/或抗癌症剂是抗体。优选地，该治疗剂是治疗性蛋白质。优选地，该治疗剂是小分子。优选地，该抗癌症剂是抗原。优选地，该治疗剂是细胞群。优选地，该治疗剂是治疗性抗体。优选地，该治疗剂是另一种细胞毒性剂和/或化疗剂。如本文所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。“化疗剂”是包括可用于治疗癌症的化学化合物。放射疗法是另一种细胞毒剂。

免疫检查点抑制剂

免疫检查点蛋白调节免疫系统中的T细胞功能。T细胞在细胞介导的免疫中起核心作用。检查点蛋白与特定的配体相互作用，该配体将信号发送到T细胞中并且实质性地关闭或抑制T细胞功能。癌细胞通过驱动其表面上检查点蛋白的高水平表达来利用该系统，从而控制进入肿瘤微环境的T细胞表面上表达检查点蛋白的T细胞，从而抑制抗癌症免疫响应。因此，在本文被称为“免疫检查点蛋白(ICP)抑制剂”的剂对检查点蛋白的抑制将导致T细胞功能的恢复和对癌细胞的免疫响应。检查点蛋白的实例包括但不限于：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、OX40、B-7家族配体或它们的组合。优选地，免疫检查点抑制剂与检查点蛋白的配体相互作用，该检查点蛋白可以是CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、OX40、A2aR、B-7家族配体或它们的组合。优选地，检查点抑制剂是生物治疗剂或小分子。优选地，检查点抑制剂为单克隆抗体、人源化抗体、全人抗体、融合蛋白或它们的组合。优选地，PD1检查点抑制剂包含一种或多种抗PD-1抗体，包括纳武单抗(nivolumab)和帕博利珠单抗(pembrolizumab)。

本文所述的组合疗法方法包括将至少一种检查点抑制剂进一步与SEQ ID NO:1的融合蛋白和血管生成抑制剂组合来施用。本发明不限于任何特定的检查点抑制剂，只要检查点抑制剂在以有效量作为单一疗法或与SEQ ID NO:1的融合蛋白组合施用时抑制靶检查点蛋白的一种或多种活性即可。在一些情况下，由于例如协同效应，在存在SEQ ID NO:1的情况下，检查点抑制剂对检查点蛋白的最小抑制可能就足够了。许多检查点抑制剂是本领域已知的，例如，以下是FDA批准的检查点蛋白抑制剂清单：

·伊匹单抗(ipilimumab)

·帕博利珠单抗(pembrolizumab)

·阿特珠单抗(atezolizumab)

·德瓦鲁单抗(durvalumab)

·阿维鲁单抗(avelumab)

·纳武单抗(nivolumab)

本发明的优选治疗方案将根据本发明施用的SEQ ID NO:1的融合蛋白与检查点抑制剂帕博利珠单抗组合。优选地，帕博利珠单抗在根据本发明的治疗方案的每个治疗周期的第一天施用。优选地，根据制造商的建议施用200mg帕博利珠单抗，通常每三周或21天一次。

抗体

优选地，与血管生成抑制剂组合的SEQ ID NO:1的施用可以进一步与治疗性抗体相组合。产生抗体及其抗原结合片段的方法在本领域中是众所周知的，并且公开于例如美国专利号7,247,301、US2008/0138336和美国专利号7,923,221中，它们全部都通过引用以其整体并入本文。可用于本发明方法的治疗性抗体包括但不限于任何本领域认可的被批准用于临床试验或开发用于临床用途的治疗性抗体。在一些实施方案中，多于一种治疗性抗体可以包含在本发明的组合疗法中。

治疗性抗体的非限制性实例包括但不限于以下：

·曲妥珠单抗(HERCEPTIN^TM，Genentech,South San Francisco,Calif.)，其用于治疗HER-2/neu阳性乳腺癌或转移性乳腺癌；

·贝伐珠单抗(Genentech的RITUXAN^TM)，其用于治疗结肠直肠癌、转移性结肠直肠癌、乳腺癌、转移性乳腺癌、非小细胞肺癌或肾细胞癌；

·利妥昔单抗(Genentech的RITUXAN^TM)，其用于治疗非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴细胞性白血病；

·帕妥珠单抗(Genentech的OMNITARG^TM)，其用于治疗乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌或卵巢癌；

·西妥昔单抗(ImClone Systems Incorporated,New York,N.Y.的ERBITUX^TM)，其可用于治疗结肠直肠癌、转移性结肠直肠癌、肺癌、头颈癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、脑癌、胰腺癌、食道癌、肾细胞癌、前列腺癌、宫颈癌或膀胱癌；

·IMC-1C11(ImClone Systems Incorporated)，其用于治疗结肠直肠癌、头颈癌以及其它潜在的癌症靶标；

·托西莫单抗和托西莫单抗与碘I¹³¹(Corixa Corporation,Seattle,Wash的BEXXAR^TM)，其用于治疗非霍奇金淋巴瘤，该非霍奇金淋巴瘤可以是存在和不存在转化的CD20阳性的、滤泡性的非霍奇金淋巴瘤，该疾病是利妥昔单抗难治的并且在化疗后复发；

·In¹¹¹替伊莫单抗(ibirtumomab tiuxetan)；Y⁹⁰替伊莫单抗；I¹¹¹替伊莫单抗和Y⁹⁰替伊莫单抗(Biogen Idec,Cambridge,Mass的ZEVALIN^TM)，其用于治疗淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤，该淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤可包括复发性滤泡性淋巴瘤；复发性或难治性、低度或滤泡性非霍奇金淋巴瘤；或转化的B细胞非霍奇金淋巴瘤；

·EMD 7200(EMD Pharmaceuticals,Durham,N.C.)，其用于治疗非小细胞肺癌或宫颈癌；

·SGN-30(Seattle Genetics,Bothell,Wash的靶向CD30抗原的遗传工程化单克隆抗体)，其用于治疗霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤；

·SGN-15(Seattle Genetics的靶向Lewisγ相关抗原的遗传工程化单克隆抗体，该遗传工程化单克隆抗体缀合至阿霉素)，其用于治疗非小细胞肺癌；

·SGN-33(Seattle Genetics的靶向CD33抗原的人源化抗体)，其用于治疗急性髓样白血病(AML)和骨髓增生异常综合征(MDS)；

·SGN-40(Seattle Genetics的靶向CD40抗原的人源化单克隆抗体)，其用于治疗多发性骨髓瘤或非霍奇金淋巴瘤；

·SGN-35(Seattle Genetics的靶向CD30抗原的遗传工程化单克隆抗体，该遗传工程化单克隆抗体缀合至澳瑞他汀E)，其用于治疗非霍奇金淋巴瘤；

·SGN-70(Seattle Genetics的靶向CD70抗原的人源化抗体)，其用于治疗肾癌和鼻咽癌；

·SGN-75(Seattle Genetics的由SGN70抗体和澳瑞他汀衍生物组成的缀合物)；以及

·SGN-17/19(Seattle Genetics的与美法仑前药缀合的包含抗体和酶的融合蛋白)，其用于治疗黑素瘤或转移性黑素瘤。

用于本发明方法的治疗性抗体不限于本文所述的那些。例如，下列批准的治疗性抗体也可用于本发明的方法中：用于间变性大细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤的本妥昔单抗(brentuximab vedotin)(ADCETRI S^TM)、用于黑素瘤的伊匹单抗(ipilimumab)(MDX-101；YERVOY^TM)、用于慢性淋巴细胞性白血病的奥法木单抗(ofatumumab)(ARZERRA^TM)、用于结肠直肠癌的帕尼单抗(panitumumab)(VECTIBIX^TM)、用于慢性淋巴细胞性白血病的阿仑单抗(alemtuzumab)(CAMPATH^TM)、用于慢性淋巴细胞性白血病的奥法木单抗(ARZERRA^TM)、用于急性骨髓性白血病的吉妥珠单抗(MYLOTARG^TM)。

用于根据本发明使用的抗体还可以靶向由免疫细胞表达的分子，诸如但不限于替西木单抗(tremelimumab)(CP-675,206)和伊匹单抗(MDX-010)，其靶向CTLA4并且具有肿瘤排斥，防止再激发和增强肿瘤特异性T细胞响应的作用；OX86，其靶向OX40并且增加肿瘤位点处的抗原特异性CD8+T细胞并且增强肿瘤排斥；CT-011，其靶向PD1并且具有维持和扩增肿瘤特异性记忆T细胞并且活化NK细胞的作用；BMS-663513，其靶向CD137并引起已建立肿瘤的消退，以及CD8+T细胞的扩增和维持；和达利珠单抗(ZENAPAX^TM)，其靶向CD25并且引起CD4+CD25+FOXP3+Treg的瞬时耗竭并且增强肿瘤消退并且增加效应T细胞的数目。这些抗体的更详细讨论可见于例如Weiner等人，Nature Rev.Immunol 2010；10:317-27。

优选地，抗体是促炎性和/或促致瘤性细胞因子靶向抗体，其包括但不限于抗TNF抗体、抗IL-1Ra受体靶向抗体、抗IL-1抗体、抗IL-6受体抗体和抗IL-6抗体。优选地，抗体包括靶向促炎性T辅助17型细胞(TH17)的那些。所述治疗性抗体可以是抗体的片段；包含抗体的复合物；或包含抗体的缀合物。抗体可以任选地是嵌合的或人源化的或全人的。

治疗性蛋白质和多肽

优选地，本发明的方法包括将根据本发明的治疗方案的SEQ IDNO:1的融合蛋白和血管生成抑制剂的施用进一步与治疗性蛋白或肽相组合。有效治疗癌症的治疗性蛋白是本领域熟知的。优选地，治疗性多肽或蛋白是“自杀蛋白”，该自杀蛋白本身或在其它化合物存在下引起细胞死亡。

此种自杀蛋白的代表性实例是单纯疱疹病毒的胸苷激酶。额外的实例包括水痘带状疱疹病毒的胸苷激酶、细菌基因胞嘧啶脱氨酶(其将5-氟胞嘧啶转化为高毒性化合物5-氟尿嘧啶)、p450氧化还原酶、羧肽酶G2、β-葡糖醛酸酶、青霉素-V-酰胺酶、青霉素-G-酰胺酶、β-内酰胺酶、硝基还原酶、羧肽酶A、亚麻苦苷酶(也称为β-葡糖苷酶)、大肠杆菌gpt基因和大肠杆菌Deo基因，尽管其它基因是本领域已知的。在一些实施方案中，自杀蛋白将前药转化为毒性化合物。

如本文所用，“前药”意指可用于本发明方法的可转化为毒性产物(即对肿瘤细胞有毒性)的任何化合物。前药通过自杀蛋白转化为毒性产物。此类前药的代表性实例包括：用于胸苷激酶的更昔洛韦、阿昔洛韦和FIAU(1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘-尿嘧啶)；用于氧化还原酶的异环磷酰胺；用于VZV-TK的6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖苷；用于胞嘧啶脱氨酶的5-氟胞嘧啶；用于β-葡糖醛酸酶的多柔比星；用于硝基还原酶的CB1954和呋喃西林；和用于羧肽酶A的N-(氰基乙酰基)-L-苯丙氨酸或N-(3-氯丙酰基)-L-苯丙氨酸。前药可以由本领域内的普通技术人员容易地施用。本领域技术人员将能够容易地确定前药的最合适的施用剂量和途径。

优选地，治疗性蛋白或多肽是癌症抑制剂，例如p53或Rb，或编码此种蛋白或多肽的核酸。本领域技术人员知道各种各样的此类癌症抑制剂以及如何获得它们和/或编码它们的核酸。

抗癌症/治疗性蛋白或多肽的其它实例包括促凋亡治疗性蛋白和多肽，例如p15、p16或p21^WAF-1。

细胞因子和编码它们的核酸也可用作治疗性蛋白和多肽。实例包括：GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)；TNF-α(肿瘤坏死因子α)；干扰素(包括但不限于IFN-α和IFN-γ)；和白细胞介素(包括但不限于白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-β(IL-beta)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-13(IL-13)、白细胞介素-14(IL-14)、白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-16(IL-16)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-23(IL-23)、白细胞介素-24(IL-24))，尽管其它实施方案是本领域已知的。

杀细胞基因的其它实例包括但不限于突变的细胞周期蛋白G1基因。举例来说，杀细胞基因可以是细胞周期蛋白G1蛋白的显性负突变(例如WO/01/64870)。

疫苗

优选地，本发明的治疗方案包括将与血管生成抑制剂组合的SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用进一步与癌症疫苗的施用相组合，以刺激癌症特异性免疫响应，例如，用于产生针对癌症的宿主免疫力的先天性和适应性免疫响应。示例性疫苗包括但不限于例如抗原疫苗、全细胞疫苗、树突状细胞疫苗和DNA疫苗。根据疫苗的具体类型，疫苗组合物可包含一种或多种已知增强受试者对疫苗的免疫响应的合适佐剂。

疫苗可以是例如基于细胞的(即使用来自患者自身癌细胞的细胞来鉴定和获得抗原而产生的)。示例性疫苗包括基于肿瘤细胞的疫苗和基于树突状细胞的疫苗，其中将来自受试者的活化免疫细胞与其它蛋白质一起递送给该同一受试者，以进一步促进这些肿瘤抗原引发的免疫细胞的免疫活化。基于肿瘤细胞的疫苗包括全肿瘤细胞和基因修饰的肿瘤细胞。可以任选地加工全肿瘤细胞疫苗以增强抗原呈递，例如通过照射肿瘤细胞或肿瘤裂解物来加工。根据所用疫苗的类型，疫苗施用还可以伴随佐剂，例如卡介苗(BCG)或匙孔血蓝蛋白(KLH)。也可以使用质粒DNA疫苗，并且该质粒DNA疫苗可以通过直接注射或基因枪施用。还考虑使用肽疫苗、病毒基因转移载体疫苗和抗原修饰的树突状细胞(DC)。

优选地，所述疫苗是基于治疗性癌症肽的疫苗。肽疫苗可使用已知序列或从来自受试者自身的一个或多个肿瘤的分离的抗原来产生，并且包括新抗原和修饰的抗原。示例性的基于抗原的疫苗包括其中抗原是肿瘤特异性抗原的那些。例如，肿瘤特异性抗原可以选自癌症-睾丸(cancer-testis)抗原、分化抗原和广泛存在的过表达的肿瘤相关抗原等。当用于本发明的方法时，基于来自肿瘤相关抗原的肽的重组肽疫苗可以与佐剂或免疫调节剂一起施用或配制。用于基于肽的疫苗的示例性抗原包括但不限于以下抗原，因为该列表仅意在是说明性的。例如，肽疫苗可包含癌症-睾丸抗原(如MAGE、BAGE、NY-ESO-1和SSX-2)，该癌症-睾丸抗原由在成人组织中正常沉默但在肿瘤细胞中转录再活化的基因编码。替代地，肽疫苗可包含组织分化相关抗原，即正常组织来源的由正常组织和肿瘤组织共有的抗原。例如，疫苗可包含黑素瘤相关抗原如gp100、Melan-A/Mart-1、MAGE-3或酪氨酸酶；或者可以包含前列腺癌抗原如PSA或PAP。疫苗可包含乳腺癌相关抗原，诸如乳腺珠蛋白-A。可包含在用于本方法的疫苗中的其它肿瘤抗原包括例如CEA、MUC-1、HER1/Nue、hTERT、ras和B-raf。可用于疫苗的其它合适抗原包括与癌症干细胞或EMT过程相关的SOX-2和OCT-4。

抗原疫苗包括多抗原和单抗原疫苗。示例性癌抗原可包括具有约5至约30个氨基酸，或约6至25个氨基酸，或约8至20个氨基酸的肽。

如上所述，免疫刺激佐剂(不同于RSLAIL-2)可用于疫苗，特别是基于肿瘤相关抗原的疫苗，以帮助产生有效的免疫响应。例如，疫苗可掺有病原体相关分子模式(PAMP)以帮助提高免疫力。另外的合适的佐剂包括单磷酰脂质A或其它脂多糖；Toll样受体(TLR)激动剂，诸如例如咪喹莫德(imiquimod)、瑞喹莫德(resiquimod)(R-848)、TLR3、IMO-8400和雷他莫德(rintatolimod)。适用的其它佐剂包括热休克蛋白。

遗传疫苗通常使用携带表达盒的病毒或质粒DNA载体。在施用后，它们转染体细胞或树突状细胞作为炎性反应的一部分，从而导致交叉引发或直接抗原呈递。优选地，遗传疫苗是在一次免疫中提供多种抗原递送的疫苗。遗传疫苗包括DNA疫苗、RNA疫苗和基于病毒的疫苗。用于本发明方法的DNA疫苗是构建用于递送和表达肿瘤抗原的细菌质粒。DNA疫苗可通过任何合适的施用方式(例如皮下或皮内注射)施用，但也可直接注射到淋巴结中。另外的递送模式包括例如基因枪、电穿孔、超声、激光、脂质体、微粒和纳米颗粒。

优选地，疫苗包含一种新抗原或多种新抗原。优选地，疫苗是基于新抗原的疫苗。优选地，基于新抗原的疫苗(NBV)组合物可以编码串联的多种癌症新抗原，其中每种新抗原是衍生自癌细胞中突变的蛋白质的多肽片段。例如，新抗原疫苗可以包含含有编码多种免疫原性多肽片段(每种免疫原性多肽片段均为癌细胞中突变的蛋白质的免疫原性多肽片段)的核酸构建体的第一载体，其中每种免疫原性多肽片段包含一个或多个突变的氨基酸，所述突变的氨基酸侧翼为来自原始蛋白质的可变数量的野生型氨基酸，并且每种多肽片段头尾相连从而形成免疫原性多肽。形成免疫原性多肽中的每种免疫原性多肽片段的长度可以变化。

也可以使用病毒基因转移载体疫苗；在此类疫苗中，重组工程化病毒、酵母、细菌等被用于将癌症特异性蛋白引入到患者的免疫细胞中。在可以是肿瘤裂解性或非肿瘤裂解性的基于载体的方法中，载体由于例如其固有的免疫刺激性质而可以提高疫苗的效力。示例性的基于病毒的载体包括来自痘病毒科(诸如痘苗病毒、经修饰的痘苗病毒株Ankara和禽痘病毒)的载体。还适合使用的是癌症疫苗PROSTVA C，其含有有复制能力的痘苗病毒激发载体(vaccinia priming vector)和无复制能力的禽痘加强载体(fowlbox-boostingvector)。每个载体含有PSA的转基因和三种共刺激分子CD80、CD54和CD58，统称为TRICOM。其它合适的基于载体的癌症疫苗包括Trovax和TG4010(编码MUC1抗原和IL-2)。另外的供使用的疫苗包括基于细菌和酵母的疫苗，诸如重组单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogene)和酿酒酵母。

前述疫苗可与佐剂和其它免疫增强剂组合和/或一起配制以提高功效。根据具体的疫苗，施用可以是肿瘤内或非肿瘤内的(即全身性的)。

小分子

优选地，本发明的治疗方案包括将与血管生成抑制剂组合的SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用进一步与抗癌症小分子的施用相组合。有效治疗癌症的小分子是本领域熟知的并且包括参与肿瘤生长的因子(诸如EGFR、ErbB2(也称为Her2)、ErbB3、ErbB4或TNF)的拮抗剂。非限制性实例包括靶向一种或多种酪氨酸激酶受体(诸如VEGF受体、FGF受体、EGF受体和PDGF受体)的小分子受体酪氨酸激酶抑制剂(RTKI)。

许多治疗性小分子RTKI在本领域中是已知的，包括但不限于瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787)、厄洛替尼(erlotinib)(TARCEVA^TM)、OSI-7904、ZD6474(ZACTIMA^TM)、ZD6126(ANG453)、ZD1839、舒尼替尼(sunitinib)(SUTENT)^TM)、司马沙尼(semaxanib)(SU5416)、AMG706、AG013736、伊马替尼(Imatinib)(GLEEVEC^TM)、MLN-518、CEP-701、PKC-412、拉帕替尼(Lapatinib)(GSK572016)、VELCADE^TM、AZD2171、索拉非尼(sorafenib)(NEXAVAR^TM)、XL880和CHIR-265。小分子蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂(诸如Jiang等人，CancerMetastasis Rev.2008中公开的那些；27:263-72)也可用于实施本发明的方法。此类抑制剂可以靶向例如HSP2、PRL、PTP1B或Cdc25磷酸酶。

靶向Bcl-2/Bcl-XL的小分子(诸如US2008/0058322中公开的那些)也可用于实施本发明的方法。用于本发明的其它示例性小分子公开于Zhang等人，Nature Reviews:Cancer 2009；9:28-39中。特别地，导致免疫原性细胞死亡的化疗剂(诸如蒽环类)(Kepp等人，Cancer and Metastasis Reviews 2011；30:61-9)将非常适合于与延长PK IL-2协同作用。

癌抗原

优选地，本发明的治疗方案包括将与血管生成抑制剂组合的SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用进一步与癌抗原相组合，例如以用作癌症疫苗(参见例如Overwijk等人，Journal of Experimental Medicine 2008:198:569-80)。可用于疫苗接种的其它癌抗原包括但不限于(i)肿瘤特异性抗原，(ii)肿瘤相关抗原，(iii)表达肿瘤特异性抗原的细胞，(IV)表达肿瘤相关抗原的细胞，(v)肿瘤上的胚胎抗原，(vi)自体肿瘤细胞，(vii)肿瘤特异性膜抗原，(viii)肿瘤相关膜抗原，(ix)生长因子受体，(x)生长因子配体，和(xi)与癌症相关的任何其它类型的抗原或抗原呈递细胞或物质。

癌抗原可以是上皮癌抗原(例如乳腺、胃肠、肺)、前列腺特异性癌抗原(PSA)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)、膀胱癌抗原、肺(例如小细胞肺)癌抗原、结肠癌抗原、卵巢癌抗原、脑癌抗原、胃癌抗原、肾细胞癌抗原、胰腺癌抗原、肝癌抗原、食道癌抗原、头颈癌抗原或结肠直肠癌抗原。

在另一个实施方案中，癌抗原是淋巴瘤抗原(例如非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤)、B细胞淋巴瘤癌抗原、白血病抗原、骨髓瘤(即多发性骨髓瘤或浆细胞骨髓瘤)抗原、急性成淋巴细胞性白血病抗原、慢性髓样白血病抗原或急性骨髓性白血病抗原。所描述的癌抗原仅是示例性的，并且任何癌抗原都可以在本发明中被靶向。

优选地，癌抗原是在包括多发性骨髓瘤和一些B细胞淋巴瘤在内的所有人类腺癌(胰腺、结肠、乳腺、卵巢、肺、前列腺、头和颈)上发现的粘蛋白-1蛋白或肽(MUC-1)。患有炎性肠病(克罗恩病或溃疡性结肠炎)的患者发展结肠直肠癌的风险增加。MUC-1是I型跨膜糖蛋白。MUC-1的主要胞外部分具有大量由20个氨基酸组成的串联重复序列，其包含免疫原性表位。在一些癌症中，它以被免疫系统识别的非糖基化形式暴露(GendleR等人，J BiolChem 1990；265:15286-15293)。

在另一个实施方案中，癌抗原是与黑素瘤和结肠癌相关的突变B-Raf抗原。这些突变的绝大多数代表在核苷酸1796处T-A的单核苷酸变化，该变化导致在B-Raf的活化区段内的残基599处缬氨酸变为谷氨酸。Raf蛋白也作为活化的RAS蛋白的效应物与癌症间接相关，该活化的RAS蛋白的致癌形式存在于所有人类癌症的约三分之一中。正常的非突变B-Raf参与细胞信号传导，从而将信号从细胞膜转传至细胞核。该蛋白质通常仅在需要转传信号时才有活性。相反，已经报道突变体B-Raf具有持续的活性，从而破坏信号转传(Mercer和Pritchard,Biochim Biophys Acta(2003)1653(1):25-40；Sharkey等人,Cancer Res.(2004)64(5):1595-1599)。

优选地，癌抗原是人表皮生长因子受体-2(HER-2/neu)抗原。具有过表达HER-2/neu的细胞的癌症被称为HER-2/neu⁺癌症。示例性HER-2/neu⁺癌症包括前列腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、肝癌(例如肝细胞腺癌)、肠癌和膀胱癌。

HER-2/neu具有与表皮生长因子受体(EGFR)具有40％同源性的大约645aa的细胞外结合结构域(ECD)、高度疏水的跨膜锚定结构域(TMD)和与EGFR具有80％同源性的大约580aa的羧基端细胞内结构域(ICD)。HER-2/neu的核苷酸序列可获自GENBANK^TM。登录号AH002823(人HER-2基因、启动子区和外显子1)；M16792(人HER-2基因，外显子4)：M16791(人HER-2基因，外显子3)；M16790(人HER-2基因，外显子2)；和M16789(人HER-2基因、启动子区和外显子1)。HER-2/neu蛋白的氨基酸序列可从GENBANK^TM获得。登录号AAA58637。基于这些序列，本领域技术人员可以使用已知的测定开发HER-2/neu抗原以发现产生有效免疫响应的适当表位。

示例性HER-2/neu抗原包括p369-377(HER-2/neu衍生的HLA-A2肽)；dHER2(CorixaCorporation)；li-Key MHC II类表位杂合体(Generex Biotechnology Corporation)；肽P4(氨基酸378-398)；肽P7(氨基酸610-623)；肽P6(氨基酸544-560)和P7的混合物；肽P4、P6和P7的混合物；HER2[9_754]等。

优选地，癌抗原是表皮生长因子受体(EGFR)抗原。EGFR抗原可以是EGFR变体1抗原、EGFR变体2抗原、EGFR变体3抗原和/或EGFR变体4抗原。具有过表达EGFR的细胞的癌症被称为EGFR癌症。示例性EGFR癌症包括肺癌、头颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、脑癌和膀胱癌。

优选地，癌抗原是血管内皮生长因子受体(VEGFR)抗原。VEGFR被认为是癌症诱导的血管生成的调节剂。具有过表达VEGFR的细胞的癌症称为VEGFR⁺癌症。示例性VEGFR⁺癌症包括乳腺癌、肺癌、小细胞肺癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、白血病和淋巴细胞性白血病。

优选地，癌抗原是前列腺特异性抗原(PSA)和/或前列腺特异性膜抗原(PSMA)，其在雄激素非依赖性前列腺癌中普遍表达。

优选地，癌抗原是Gp-100。糖蛋白100(gp100)是与黑素瘤相关的肿瘤特异性抗原。

优选地，癌抗原是癌胚抗原(CEA)。具有过表达CEA的细胞的癌症被称为CEA⁺癌症。示例性CEA⁺癌症包括结肠直肠癌、胃癌和胰腺癌。示例性CEA抗原包括CAP-1(即CEA aa571-579)、CAP1-6D、CAP-2(即CEA aa 555-579)、CAP-3(即CEA aa 87-89)、CAP-4(CEA aa1-11)、CAP-5(即CEA aa 345-354)、CAP-6(即CEA aa 19-28)和CAP-7。

优选地，癌抗原是碳水化合物抗原10.9(CA19.9)。CA 19.9是与Lewis A血型物质有关的寡糖并且与结肠直肠癌相关。

优选地，癌抗原是黑素瘤癌抗原。黑素瘤癌抗原可用于治疗黑素瘤。示例性黑素瘤癌抗原包括MART-1(例如，MART-126-35肽、MART-127-35肽)；MART-1/MelanA；pMel17；pMel17/gp100；gp100(例如，gp100肽280-288、gp100肽154-162、gp100肽457-467)；TRP-1；TRP-2；NY-ESO-1；p16；β-连环蛋白；mum-1；等。

优选地，癌抗原是突变型或野生型ras肽。突变型ras肽可以是突变型K-ras肽、突变型N-ras肽和/或突变型H-ras肽。ras蛋白中的突变通常发生在位置12(例如，精氨酸或缬氨酸替换甘氨酸)、13(例如，天冬酰胺替换甘氨酸)、61(例如，谷氨酰胺被替换为亮氨酸)和/或59处。突变型ras肽可用作肺癌抗原、胃肠癌抗原、肝癌抗原、髓样癌抗原(例如急性白血病、脊髓发育不良)，皮肤癌抗原(例如黑素瘤、基底细胞、鳞状细胞)，膀胱癌抗原、结肠癌抗原、结肠直肠癌抗原和肾细胞癌抗原。

在本发明的另一个实施方案中，癌抗原是突变型和/或野生型p53肽。p53肽可用作结肠癌抗原、肺癌抗原、乳腺癌抗原、肝细胞癌抗原、淋巴瘤癌抗原、前列腺癌抗原、甲状腺癌抗原、膀胱癌抗原、胰腺癌抗原和卵巢癌抗原。

癌抗原可以是细胞、蛋白质、肽、融合蛋白、编码肽或蛋白质的DNA、编码肽或蛋白质的RNA、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、碳水化合物、脂多糖、脂质、它们中的两者或更多者的化学连接的组合、它们中的两者或更多者的融合体，或它们中的两者或更多者的混合物，或编码它们中的两者或更多者的病毒，或编码它们中的两者或更多者的溶瘤病毒。在另一个实施方案中，癌抗原是包含约6至约24个氨基酸；约8至约20个氨基酸；约8至约12个氨基酸；约8至约10个氨基酸；或约12至约20个氨基酸的肽。在一个实施方案中，癌抗原是具有MHC I类结合基序或MHC II类结合基序的肽。在另一个实施方案中，癌抗原包含对应于一个或多个细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位的肽。

细胞疗法

优选地，本发明的治疗方案包括将与血管生成抑制剂组合的SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用进一步与治疗性细胞疗法相组合。可用于治疗癌症的细胞疗法是众所周知的，并且公开于例如美国专利号7,402,431中。在一个优选的实施方案中，细胞疗法是T细胞移植。在优选的方法中，将T细胞在移植到受试者中之前用IL-2离体扩增。用于细胞疗法的方法公开于例如美国专利号7,402,431、US2006/0057121、美国专利号5,126,132、美国专利号6,255,073、美国专利号5,846,827、美国专利号6,251,385、美国专利号6,194,207、美国专利号5,443,983、美国专利号6,040,177、美国专利号5,766,920和US2008/0279836中。

其他细胞毒剂和化疗剂

优选地，本发明的治疗方案包括将与血管生成抑制剂组合的SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用进一步与一种或多种化学治疗剂相组合，该化学治疗剂包括但不限于烷化剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢剂、其他抗肿瘤抗生素和植物衍生剂。

烷化剂是通过与生物学重要分子中的氨基、羧基、巯基和磷酸基团形成共价键而损害细胞功能的药物。烷化的最重要的位点是DNA、RNA和蛋白质。烷化剂的活性依赖于细胞增殖，但不是细胞周期阶段特异性的。适用于本发明的烷化剂包括但不限于双氯乙胺类(氮芥类，例如苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、甲氯乙胺(mechlorethamine)、美法仑、尿嘧啶氮芥)、氮丙啶类(例如噻替派)、烷基烷酮磺酸酯(例如白消安)、亚硝基脲(例如BCNU、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲佐菌素)、非经典烷化剂(例如，六甲蜜胺(altretamine)、达卡巴嗪(dacarbazine)和丙卡巴肼(procarbazine))和铂化合物(例如，卡铂、奥沙利铂和顺铂)。

抗肿瘤抗生素(如阿霉素)在鸟嘌呤-胞嘧啶和鸟嘌呤-胸腺嘧啶序列处插入DNA，导致自发氧化和形成引起链断裂的游离氧自由基。适用于本发明的其它抗生素剂包括但不限于蒽环类(例如多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星和蒽二酮)、丝裂霉素C、博来霉素、更生霉素和普卡霉素。

适用于本发明的抗代谢剂包括但不限于氟尿苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、亚叶酸、羟基脲、硫鸟嘌呤、巯基嘌呤、阿糖胞苷、喷司他丁、磷酸氟达拉滨、克拉屈滨、天冬酰胺酶和吉西他滨。

植物衍生剂包括紫杉烷类，其是从紫杉属植物的针叶中提取的前体的半合成衍生物。这些药物具有新的14元环(即紫杉烷)。与引起微管分解的长春花生物碱不同，紫杉烷类(例如taxol)促进微管的组装和稳定性，因此阻断有丝分裂中的细胞周期。其他植物来源的剂包括但不限于长春新碱、长春花碱、长春地辛、长春利定、长春瑞滨、依托泊苷、替尼泊苷和多西他赛。

放射疗法

优选地，本发明的治疗方案包括将与血管生成抑制剂组合的SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用进一步与放射疗法相组合。术语“放射疗法”可与术语“放疗”互换使用，是一类使用强能量束杀死癌细胞的癌症治疗。放射疗法最常使用X射线，但也可使用γ射线、电子束或质子。术语“放射疗法”最经常是指外部射束放射疗法。在这种类型的放射期间，高能量束来自患者身体外部的机器，该机器将能量束瞄准身体上的精确点。每个环节快速且无痛，持续约15分钟。如本文所用，术语“环节”或“治疗环节”是指每次放疗治疗。放射疗法“方案”或“时间表”通常由在设定的时间段内给予的特定数量的治疗组成，这取决于癌症的类型和阶段。

重组产生

优选地，SEQ ID NO:1的融合蛋白是使用重组技术产生的。融合蛋白可以作为细胞内蛋白或作为分泌蛋白分别使用任何合适的构建体和任何合适的宿主细胞来产生，该宿主细胞可以是原核或真核细胞，诸如细菌(例如大肠杆菌)或酵母宿主细胞。可用作宿主细胞的真核细胞的其他实例包括昆虫细胞、哺乳动物细胞和/或植物细胞。在使用哺乳动物宿主细胞的情况下，它们可以包括人细胞(例如，HeLa、293、H9和Jurkat细胞)；小鼠细胞(例如，NIH3T3、L细胞和C127细胞)；灵长类动物细胞(例如Cos 1、Cos 7和CV1)；和仓鼠细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。

可以根据本领域已知的标准程序使用多种适合于表达多肽的宿主-载体系统。参见，例如，Sambrook等人，1989Current Protocols in Molecular Biology Cold SpringHarbor Press，纽约；和Ausubel等人，(1995)Current Protocols in Molecular Biology，Wiley和Sons编。将遗传物质引入到宿主细胞中的方法包括，例如，转化、电穿孔、缀合、磷酸钙方法等。可以选择转移方法以提供引入的编码多肽的核酸的稳定表达。编码多肽的核酸可以作为可遗传的游离型元件(episomal element)(例如，质粒)提供或可以是在基因组上整合的。用于生产目的多肽的多种合适的载体是可商购的。

载体可以提供宿主细胞中的染色体外维持或可以提供向宿主细胞基因组中的整合。表达载体提供转录和翻译调控性序列并且可以提供诱导型或组成型表达，其中编码区在转录起始区以及转录和翻译终止区的转录控制下可操作地连接。通常，转录和翻译调控性序列可以包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或活化子序列。启动子可以是组成型的或诱导型的，并且可以是强组成型启动子(例如，T7)。

表达构建体通常具有位于启动子序列附近的方便的限制性位点，以提供编码感兴趣蛋白质的核酸序列的插入。可以存在在表达宿主中可操作的可选择标志物以促进含有该载体的细胞的选择。此外，表达构建体可以包括额外的元件。例如，表达载体可以具有一个或两个复制系统，从而使该表达载体能够被维持在生物体中，例如，被维持在哺乳动物或昆虫细胞中用于表达以及在原核宿主中用于克隆和扩增。此外，表达构建体可以含有可选择标志物基因以允许选择转化的宿主细胞。可选择的基因在本领域中是众所周知的并且会随所用的宿主细胞而变化。

可以根据本领域已知的方法完成蛋白质的分离和纯化。例如，蛋白质可以从被遗传修饰为组成型地表达该蛋白质的细胞裂解物中和/在诱导后分离，或者通过免疫亲和纯化从合成反应混合物中分离，这通常涉及使样本与抗蛋白质抗体接触，洗涤以去除非特异性地结合的物质，以及洗脱特异性地结合的蛋白质。分离的蛋白质可以通过透析和蛋白质纯化中通常采用的其他方法进一步纯化。在一个实施方案中，可以使用金属螯合色谱方法分离蛋白质。蛋白质可以含有用于促进分离的修饰。

可以将SEQ ID NO:1的融合蛋白制备成基本上纯的或分离的形式(例如，不含其他多肽)。该多肽可以以组合物存在，该多肽在该组合物中相对于可以存在的其他组分(例如，其他多肽或其他宿主细胞组分)而言是富集的。例如，可以提供纯化的融合蛋白，以使得该融合蛋白以基本上不含其他表达蛋白(例如，小于约90％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、小于约5％，或小于约1％)的组合物存在。

优选地，可以使用生物重组表达系统产生SEQ ID NO:1的融合蛋白，这通常涉及用含有编码SEQ ID NO:1的融合蛋白的遗传模板的DNA载体转染细胞，然后培养该细胞以使得它们转录和翻译融合蛋白。通常，然后裂解细胞以提取表达的蛋白质用于随后的纯化。原核和真核体内蛋白质表达系统都适合于使用。优选地，SEQ ID NO:1的融合蛋白是在CHO细胞中产生的。

试剂盒

还提供了试剂盒，其包括配制用于施用的SEQ ID NO:1的融合蛋白和任选的任何其他化学治疗剂或抗癌症剂。该试剂盒通常为容纳各种组件的物理结构的形式，如下所描述，并且可被用于例如实施上面描述的方法。该试剂盒可包括可为适合于施用于受试者的药物组合物的形式的SEQ ID NO:1的融合蛋白(在例如无菌容器中提供)。

所述药物组合物可以以准备好使用的形式或以需要例如在施用前重构或稀释的形式提供。当组合物为需要由使用者重构的形式时，试剂盒还可包括与SEQ ID NO:1的融合蛋白一起包装或分开包装的缓冲剂、药学上可接受的赋形剂等。当考虑组合疗法(例如SEQIDNO:1的融合蛋白和一种或多种免疫检查点抑制剂)时，该试剂盒可单独地包含几种剂或者该几种剂可能已经在该试剂盒中被组合。类似地，当需要额外的补充疗法(例如SEQ IDNO:1的融合蛋白、一种或多种免疫检查点抑制剂和额外的补充疗法或剂)时，试剂盒可以单独包含几种剂或该几种剂中的两种或更多种剂可能已经在试剂盒中被组合。

本发明的试剂盒可被设计用于适当维持其中容纳的组分所需的条件(例如冷藏或冷冻)。该试剂盒可以含有标签或包装插页，其包括其中组件的识别信息和这些组件的使用说明(例如给药参数、一种或多种活性成分的临床药理学(包括一种或多种作用机制)、药代动力学和药效学、副作用、禁忌症等)。

试剂盒的每个组分可以封装在单独的容器内，并且所有各种容器可以在单个包装内。标签或插页可包括制造商信息，例如批号和过期日期。标签或包装插页可以例如整合到容纳组分的物理结构中、单独包含在物理结构内或粘贴到试剂盒的组件(例如安瓿、注射器或小瓶)上。

标签或插页可额外包括以下或并入到以下中：计算机可读媒体中，诸如磁盘(例如硬盘、卡、存储磁盘)、光盘(诸如CD或DVD-ROM/RAM)、DVD、MP3、磁带或电存储介质(诸如RAM和ROM)或这些的混合体(诸如磁/光存储介质、FLASH介质或记忆型卡)。在一些实施方案中，试剂盒中不存在实际说明书，但提供了用于从远程来源(例如经由互联网网站)获得说明书的手段。

实施例

以下实施例是以图解的方式提供的，不应被解释为以任何方式限制要求保护的本发明。

实施例1-评估卢西他尼和SEQ ID NO: 2 (即SEQ ID NO: 1的融合蛋白的小鼠直 向同源构建体)以及这两种剂的组合在雌性C57BL/6小鼠的小鼠结肠癌细胞系MC38中的抗 肿瘤功效。

目标：

评估卢西他尼、SEQ ID NO:2的融合蛋白(即SEQ ID NO:1的融合蛋白的小鼠直向同源构建体)以及这两种剂的组合在同基因小鼠癌症模型中的抗肿瘤功效。

SEQ ID NO:2的设计：

获得小鼠IL-2和IL2Ra序列(分别为UniProtKB-P04351和P01590)并且利用小鼠序列和人序列(UnitProtKB P60568和P01589)的序列比对来将该小鼠序列映射到SEQ ID NO:1的循环置换的人IL-2序列。

所得的SEQ ID NO:2的小鼠直向同源物具有以下氨基酸序列：

SKSFQLEDAENFISNIRVTVVKLKGSDNTFECQFDDESATVVDFLRRWIAFCQSIISTSPQGGSSSTQQQQQHLEQLLMDLQELLSRMENYRNLKLPRMLTFKFYLPKQATELKDLQCLEDELGPLRHVLDLTQGSGGGSELCLYDPPEVPNATFKALSYKNGTILNCECKRGFRRLKELVYMRCLGNSWSSNCQCTSNSHDKSRKQVTAQLEHQKEQQTTTDMQKPTQSMHQENLTGHCREPPPWKHEDSKRIYHFVEGQSVHYECIPGYKALQRGPAISICKMKCGKTGWTQPQLTCVDGSHHHHHH(SEQ ID NO:2).

SEQ ID NO:2的C末端处的His-标签被用于纯化并且可以存在于表达的蛋白质中或者可以任选地被去除。用于重组产生蛋白质的构建体可以任选地包括信号肽，例如，具有以下氨基酸序列的信号肽：MYRMQLLSCIALSLLVTNS(SEQ ID NO:3)。

实验设计

该研究将确定组合治疗是否可以增强单一疗法的功效。这些研究包括所述两种剂的多剂量以确定组合的最佳剂量。标准读数将包括肿瘤生长抑制和生存率。用于本研究的动物模型包括MC38，以便辨别在小鼠模型中与SEQ ID NO:2的组合是否有助于加强对卢西他尼的敏感性。

每个动物研究组的特征、试验品的施用和时间安排、样本的收集和总体研究设计如表1和表2所示：

表1

·治疗第1组-第6组，并且基于作为主要终点的肿瘤生长评估抗肿瘤疗效。

·第10天收获第7组-第12组(与第1组-第6组是同一的)，通过RNA-Seq分析每组6只小鼠的组织，通过流式细胞术分析其余4只小鼠。

表2

小鼠

雌性C57BL/6小鼠(C57BL/6N Crl Charles River)在研究的第1天为9周龄，体重(BW)范围为17.8g至26.7g。给动物随意喂食水(反渗透，1ppm Cl)和由18.0％粗蛋白、5.0％粗脂肪和5.0％粗纤维组成的NIH 31Modified and Irradiated Lab

小鼠在抵达后以及在整个研究期间还接受了Diet Gel补充剂。在20–22℃(68–72°F)和40–60％湿度下，将小鼠饲养在静态微型隔离器中的辐照过的Enrich-o'cob^TM垫子上，光照周期为12小时。北卡罗来纳州查尔斯河发现服务公司(Charles River Discovery Services North Carolina,CR Discovery Services)特别遵守《实验动物护理和使用指南(Guide for Care and Useof Laboratory Animals)》中关于约束、饲养、外科手术、饲料和流体管理以及兽医护理的建议。CR Discovery Services的动物护理和使用计划获得了国际实验动物护理评定和认证协会(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal CareInternational,AAALAC)的认可，该协会确保符合公认的实验动物护理和使用标准。

肿瘤细胞培养

使MC38鼠结肠癌细胞在含有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100单位/毫升的青霉素G、100μg/mL硫酸链霉素和25μg/mL庆大霉素的DMEM培养基中生长至对数生长中期(Mid-logPhase)。将该肿瘤细胞在组织培养瓶中于37℃的加湿培养箱中在具有5％ CO₂和95％的气氛中培养。

体内植入

在植入当天，在对数生长期收获MC38细胞，并将该细胞以5x10⁶细胞/毫升的浓度重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。用异氟醚麻醉小鼠，并通过将5x 10⁵个MC38细胞(在0.1mL悬浮液中)皮下植入到每只测试动物的右侧腹中来引发肿瘤。当肿瘤体积接近80至120mm³的目标范围时，对肿瘤进行监测。使用卡尺对肿瘤进行二维测量，并使用下面的公式计算体积：

其中w＝肿瘤的宽度并且l＝肿瘤的长度(以mm表示)。假设1mg相当于1mm³的肿瘤体积，可以估计肿瘤重量。在被指定为研究第1天的肿瘤植入后第十四天，将动物分为13组(第1组-第12组，n＝10；第13组，n＝5)，其中单个肿瘤体积范围为75至144mm³，并且组平均肿瘤体积范围为102至104mm³。

治疗剂

将卢西他尼避光储存在环境温度下，并且将SEQ ID NO:2以4.39mg/mL储备溶液形式避光储存在-80℃下。每三天，在媒介物2(含0.5％甲基纤维素(MC)的去离子(DI)水)中配制卢西他尼以获得1mg/mL透明无色给药溶液，该1mg/mL透明无色给药溶液在以针对每只动物体重调节的10mL/kg(0.2mL/20g小鼠)的给药体积被施用时递送10mL/kg。将额外的等分试样在4℃下储存，以供在配制的72小时内使用。在临施用前，将给药溶液轻轻倒置重新混合。每周一次，将一瓶新鲜SEQ ID NO:2储备溶液解冻、等分并在-80℃下重新冷冻，以供在一周内使用。在给药的每一天，将等分试样在媒介物1(无菌PBS，pH 7.4)中稀释并避光存放在4℃下直到给药以获得0.15mg/mL或0.3mg/mL的给药溶液,该0.15mg/mL或0.3mg/mL的给药溶液在以针对每只动物体重调节的10mL/kg的给药体积被施用时分别递送1.5mg/kg或3mg/kg。

处理

在研究第1天，将荷有已建立的皮下MC38肿瘤的小鼠分为13组(n＝10或5)。根据表1和2中总结的治疗计划启动给药。媒介物1(PBS)和SEQ ID NO:2以1.5mg/kg或3mg/kg在背侧肩胛区域中皮下(sc)施用；媒介物2(含0.5％甲基纤维素的DI水)和卢西他尼经口(po)给药；所有剂均以按每只动物的体重缩放的10mL/kg(0.2mL/20g小鼠)的体积施用。

·第1组接受第1、4、7、10、13、16和19天(q3d x 7)的媒介物1s.c.和二十八天一天一次(qd x 28)的媒介物2p.o.。

·第2组和第13组接受媒介物1q3d x 7和10mg/kg卢西他尼po qd x 28。

·第3组和第4组接受q3d x 7的分别1.5mg/kg和3mg/kg的SEQ ID NO:2sc，和媒介物2po qd x 28。

·第5组和第6组接受q3d x 7的分别1.5mg/kg和3mg/kg的SEQ ID NO:2sc，以及10mg/kg卢西他尼po qd x 28。

·第7组和第8组接受第1、4和7天(q3d x 3)的媒介物1s.c.，并且分别接受p.o.qdx 9的媒介物2和10mg/kg卢西他尼。

·第9组和第10组接受s.c.q3d x 3的分别1.5mg/kg和3mg/kg的SEQ ID NO:2，和媒介物2po qd x 9。

·第11组和第12组接受s.c.q3d x 3的分别1.5mg/kg和5mg/kg的SEQ ID NO:2，以及10mg/kg卢西他尼po qd x 9。

采样

在第10天，从第7组到第12组的所有动物中收集脾脏和肿瘤并称重，并在加工前称重。将每组四只动物的组织加工成单细胞悬浮液，以用于在CRL-NC处进行流式细胞术分析(如下所述)。将每组其余六只动物的组织保存在RNAlater中，储存在-80℃下。

在第36天，当第13组肿瘤达到平均肿瘤体积～200mm³时，将肿瘤和脾脏称重，然后保存在RNA中，然后储存在-80℃下。

流式细胞术

小鼠脾脏样本是通过根据制造商的说明用RPMI-1640培养基在细网眼上轻轻研磨该组织并用ACK(氯化铵钾)缓冲液裂解红细胞来解离。将样本离心并用PBS洗涤两次。

根据制造商的说明使用gentleMACS^TM“肿瘤解离试剂盒”协议解离小鼠肿瘤样本。将肿瘤样本通过70μm细胞过滤网(Cell Strainer)过滤并在PBS/2.5％ FBS缓冲液中冲洗两次以去除酶缓冲液。测量并记录总肿瘤样本和经铺板的孔的体积。

记录每个样本的总组织体积和Cellometer计数。最终的单细胞悬液在PBS pH 7.4中以2x10⁷细胞/毫升制备并且在流式细胞术分析之前短暂地存放在冰上，包括常规CD4⁺T细胞、CD4⁺T_reg、CD8⁺T细胞、巨噬细胞和树突状细胞(按CD45⁺％并按细胞/毫克组织)。

将单细胞悬液加入96孔板中，并遵循制造商的说明在4℃下用100μL重构的Live/Dead Aqua(Life Technologies)给该单细胞悬液染色30分钟。用150μL染色缓冲液洗涤两次后，使用100μL体积的TruStain Fc(Biolegend)在冰上封闭Fc受体5到10分钟，然后进行免疫染色。如所述协议中所描述的那样将细胞在37℃下用抗体组染色30分钟。将细胞用150μL染色缓冲液洗涤两次，并且重新悬浮在100μL染色缓冲液中以进行分析。对于诸如FoxP3的内部标志物的染色，根据制造商的说明用200μL转录因子固定/透化缓冲液(Transcription Factor Fixation/Permeabilization buffer)(eBioscience)在4℃下透化细胞15分钟。用150μL透化缓冲液(eBioscience)洗涤两次后，使用0.1μg稀释在100μL透化缓冲液中的每种抗体在4℃避光条件下进行内部标志物染色，持续30分钟。将细胞用150μL透化缓冲液洗涤两次，然后重新悬浮在100μL染色缓冲液中。将100μL含有Countbright珠粒的染色缓冲液添加到每个样本中。当认为有必要时，使用同种型对照抗体作为阴性染色对照。

所有数据均在FortessaLSR(BD)上收集并使用FlowJo软件(版本10.0.7r2,TreeStar,Inc.)进行分析。细胞群是如所述协议中所述的那样进行定义的，并且门控策略是通过对单峰(FSC-H与FSCA)并然后对活细胞的初始门控，基于Live/Dead Aqua活力染色来确定。

RNA测序

组织分离：

在研究的适当日期解剖肿瘤和脾脏，给肿瘤和脾脏称重并且将其立即放入RNAlater Stabilizing Reagent中以保存该组织并在4摄氏度下储存过夜。第二天，将样本从RNA中取出并快速冷冻并置于-80℃。

RNA分离：

除非另有指示，否则一切都在冰上完成，将材料在冰上预冷。将组织在Precellys组织研磨管中的TRIzol中均质化。均质化后，将TRIzol溶液转移到1.5ml管中，并以12,000xg离心5分钟以去除不溶性物质。然后将TRIzol溶液转移到Phasemaker管中。加入氯仿，盖上管子，剧烈摇动15秒。然后将样本在室温下孵育2-15分钟并以12,000xg离心5分钟。然后将上层水相转移到新管中，并加入等体积的70％乙醇并涡旋。然后将液体转移到QiagenRNeasy柱并以8000 x g离心。将DNA酶添加到每个管中以去除任何残留的DNA。然后如试剂盒指示的那样洗涤和洗脱该柱。使用Qubit确定RNA浓度。

文库制备和测序

如制造商指示的那样使用Ion Chef系统上的Mouse Transcriptome IonAmpliSeq Library Preparation制备文库以进行测序。将8个纯化的RNA样本和8个独特的IonCode分子条形码添加到96孔板中，该8个纯化的RNA样本和8个独特的IonCode分子条形码是一次性地制备的。制备好文库后，使用来自ThermoFisher的Ion 540Chef Kit将它们模板化并加载到Ion Torrent 540芯片上。然后将540个芯片加载到Gene Studio S5测序仪中并且对它们进行测序。

生物信息学分析：

原始测序数据由Gene Studio测序仪(ThermoFisher)附带的Torrent Suite(v5.8.0)软件加工。对于每个样本，该程序在CHP文件中汇总了基因表达。然后将CHP文件加载到转录组分析控制台(Transcriptome Analysis Console)(TAC)程序(ThermoFisher)中。对于每个感兴趣的比较，然后我们利用以下截止值设置鉴定出了如所指示的显著差异表达的基因：倍数变化>2和p值<0.05。我们还进行了GSEA(http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)以在MSigDB v6.2上找到一组显著富集的基因(通路)。

统计和图形分析

用于Windows的GraphPad Prism 8.0.2被用于体内肿瘤生长的统计分析和图形表示。棱镜报告结果为：在P>0.05时不显著(ns)，在0.01<P≤0.05时显著(由“*”表示)、在0.001<P≤0.01非常显著(“**”)，以及在P≤0.001时极显著(“***”)。因为统计测试是显著性测试，并且不提供组间差异大小的估计，所以在本报告的正文中，所有显著性水平都被描述为显著或不显著。

将组平均肿瘤体积与时间作图。当动物因肿瘤大小或TR死亡而退出研究时，其最终记录的肿瘤体积包含在用于计算平均体积的数据中。计算组的平均肿瘤体积，直到50％的动物已退出研究。Kaplan-Meier图示出了每组中保留在研究中的动物的百分比与时间的关系。

结果：

给C57BL/6小鼠皮下植入MC38细胞并用单一疗法SEQ ID NO:2(1.5mg/kg和3mg/kg每3天一次，持续3周)，卢西他尼(每日10mg/kg，28天)，或这两种分子的组合的优化给药方案治疗该小鼠。给药计划表见表1和表2。如在第11天所确定的，卢西他尼单一疗法治疗导致100％的肿瘤生长抑制(TGI)，而1.5mg/kg和3mg/kg SEQ IDNO:2单一疗法分别导致25％和51％ TGI(图1)。卢西他尼单一疗法延长了生存期，中位生存期为39天，而对于媒介物为15天(图2)。相反，在用任一剂量的SEQ ID NO:2单一疗法治疗的小鼠中的1/20小鼠(图2)，用较低剂量的与卢西他尼组合的SEQ ID NO:2治疗的小鼠中的5/10小鼠，和用较高剂量的与卢西他尼组合的SEQ ID NO:2治疗的小鼠中的10/10小鼠中观察到持久的完全肿瘤消退(图2)。中位生存时间对于SEQ ID NO:2单一疗法组为18天和22天，对于较低剂量组合组为60天，而对于较高剂量组合组为超过60天，所有动物在第70天表现出完全响应(图2))。流式细胞术分析揭示，与媒介物相比，使用SEQ ID NO:2的治疗和使用与卢西他尼的组合的治疗都没有改变常规CD4⁺的数目，然而，它们在脾脏中的数目减少(图3)。然而，SEQ ID NO:2治疗导致显著的外周CD8⁺T细胞扩增(图4)，而Foxp3⁺调控性T细胞(T_reg)没有增加(图5)。SEQ IDNO:2与卢西他尼的组合与甚至更高的CD8⁺T细胞扩增相关(图4)，而T_reg没有变化(图5)。该组合导致肿瘤内CD8⁺T细胞(图4)和树突状细胞(CD11c⁺F4/80^-，图7)的显著增加，连同肿瘤相关巨噬细胞(CD11b⁺F4/80⁺)的减少(图6)。该组合治疗根据RNA-Seq引发了在肿瘤中的不同的基因表达谱，将SEQ ID NO:2的免疫刺激作用与卢西他尼的抗血管生成作用融合在一起。参见下面的图8-10和基因表达表3-5。中等亲和力IL-2R选择性细胞因子和血管生成抑制剂的组合在结肠癌同基因小鼠模型中产生持久的剂量依赖性抗肿瘤功效。

基因分析

如表3所示，对与T细胞信号传导相关的基因的分析表明，SEQ ID NO:2和卢西他尼的组合导致T细胞活化更高。

表3

*所示值是相对于媒介物处理组的平均表达水平。

如表4所示，与抗原呈递相关的基因表达的增加与用卢西他尼和SEQ ID NO:2的组合治疗的小鼠的肿瘤中树突状细胞浸润的增加有关。

表4

*所示值是相对于媒介物处理组的平均表达水平。

如表5所示，卢西他尼与SEQ ID NO:2治疗的组合导致1型和II型干扰素通路相关基因的表达更高。

表5

*所示值是相对于媒介物处理组的平均表达水平。

结论

单一疗法治疗臂总结：

·卢西他尼单一疗法治疗导致肿瘤生长的短暂抑制，并且与以下相关联：

-如图3所示的脾脏中常规CD4 T细胞的增加。

-如图6所示的脾脏和肿瘤中的巨噬细胞减少。

-如图8所示的Esm1(一种VEGF信号传导的靶点)表达降低。

-如图9和表3和4所示的与细胞毒性免疫细胞功能、T细胞活化和抗原呈递相关的基因的表达增加。

·SEQ ID NO:2单一疗法治疗导致适度的肿瘤生长抑制和1完全响应。治疗与以下相关联：

-如图4和图7所示的脾脏和肿瘤中的CD8+T细胞和树突状细胞增加。

-如图3和图5所示的脾脏中CD4+T_reg的减少以及脾脏和肿瘤中巨噬细胞的减少。

-如图9和表3所示的与细胞毒性免疫细胞功能和T细胞活化相关的基因表达增加。

组合治疗臂的总结：

·卢西他尼和SEQ ID NO:2组合治疗导致持久的完全响应。

-具有持久响应的小鼠百分比与SEQ ID NO:2剂量相关联，如图2所示。

组合治疗与以下相关联，

-如图4和图7所示的脾脏和肿瘤中的CD8+T细胞和树突状细胞增加。

-如图3和5所示的常规CD4⁺T细胞和CD4⁺T_regs在脾脏中减少，但在肿瘤中没有变化。

-如图6所示的脾脏和肿瘤中的巨噬细胞减少。

-如图9和表3和4所示，与细胞毒性免疫细胞功能、T细胞活化和抗原呈递相关联的基因表达更高。

-如图8和表5所示的Esm1表达降低以及I型干扰素和II型干扰素相关基因表达增加。

-如图11所示，与由任一单一疗法治疗调节的总基因总和相比，组合治疗导致更多总数目的基因的表达发生变化。

本文提及的专利和科学文献确立了本领域技术人员可获得的知识。本文引用的所有美国专利和已公布或未公布的美国专利申请均以引用的方式并入本文。本文引用的所有公布的外国专利和专利申请均以引用的方式并入本文。本文引用的所有其他已公布的参考文献、文件、手稿和科学文献均据此通过引用并入。

虽然本发明已参考其优选实施方案进行特定示出和描述，但是本领域技术人员应了解，可在不脱离由随附权利要求书所涵盖的本发明的范围的情况下对本发明作出形式和细节方面的各种改变。还应当理解，本文描述的实施方案都不是相互排斥的并且可以在不背离所附权利要求书所涵盖的本发明的范围的情况下以各种方式进行组合。

Claims (30)

1.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括：

i)向所述患者施用治疗有效量的SEQ ID NO:1的融合蛋白；以及

ii)向所述患者施用治疗有效量的血管生成抑制剂；

其中步骤(i)在步骤(ii)之前、之后或与其同时进行。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述SEQ ID NO:1的融合蛋白的有效量是有效活化IL-2中间受体IL-2Rβγ的量。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述SEQ ID NO:1的融合蛋白是通过静脉内或皮下注射施用。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述血管生成抑制剂抑制多于一种受体酪氨酸激酶。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述血管生成抑制剂抑制以下受体酪氨酸激酶中的一者或多者：血管内皮生长因子受体1、2和3型；血小板衍生生长因子受体，α型和β型血小板衍生生长因子受体；和成纤维细胞生长因子受体1型、2型和3型。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述血管生成抑制剂是式I的化合物

7.如权利要求6所述的方法，其中式I是经口施用的。

8.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括：

i)向所述患者施用治疗有效量的SEQ ID NO:1的融合蛋白的变体，其中所述变体与SEQID NO:1是至少80％同一的；以及

ii)向所述患者施用治疗有效量的血管生成抑制剂；

其中步骤(i)在步骤(ii)之前、之后或与其同时进行。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述变体融合蛋白的有效量是有效活化IL-2中间受体IL-2Rβγ的量。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述变体融合蛋白通过静脉注射或皮下注射施用。

11.如权利要求8所述的方法，其中所述血管生成抑制剂抑制多于一种受体酪氨酸激酶。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述血管生成抑制剂抑制以下受体酪氨酸激酶中的一者或多者：血管内皮生长因子受体1、2和3型；血小板衍生生长因子受体，α型和β型血小板衍生生长因子受体；和成纤维细胞生长因子受体1型、2型和3型。

13.如权利要求8所述的方法，其中所述血管生成抑制剂是式I的化合物

14.如权利要求13所述的方法，其中式I是经口施用的。

15.如权利要求8所述的方法，其中所述变体融合蛋白与所述SEQ ID NO:1的融合蛋白是至少90％同一的。

16.如权利要求8所述的方法，其中所述变体融合蛋白与所述SEQ ID NO:1的融合蛋白是至少98％同一的。

17.如权利要求1所述的方法，其中与作为单一疗法的治疗有效量的所述SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用或作为单一疗法的治疗有效量的血管生成抑制剂的施用相比，步骤(i)和(ii)的组合导致所述患者的肿瘤和脾脏中的CD8+T细胞的增加。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述CD8+T细胞的增加是与作为单一疗法的治疗有效量的所述SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用或作为单一疗法的治疗有效量的血管生成抑制剂的施用相比大至少2倍。

19.如权利要求17所述的方法，其中所述患者的CD4+T调控性(T_reg)细胞或常规CD4⁺T细胞没有增加。

20.如权利要求17所述的方法，其中与作为单一疗法的治疗有效量的所述SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用或作为单一疗法的治疗有效量的血管生成抑制剂的施用相比，步骤(i)和(ii)的组合导致所述患者的肿瘤和脾脏中CD8+T细胞和树突状细胞的增加以及所述患者中肿瘤相关巨噬细胞的减少。

21.如权利要求1所述的方法，其中与作为单一疗法的治疗有效量的所述SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用或作为单一疗法的治疗有效量的血管生成抑制剂的施用相比，步骤(i)和(ii)的组合导致所述患者的肿瘤和脾脏中的CD8+T细胞的增加。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述CD8+T细胞的增加是与作为单一疗法的治疗有效量的所述SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用或作为单一疗法的治疗有效量的血管生成抑制剂的施用相比大至少2倍。

23.如权利要求21所述的方法，其中所述患者的CD4+T调控性(T_reg)细胞没有增加。

24.如权利要求21所述的方法，其中与作为单一疗法的治疗有效量的所述SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用或作为单一疗法的治疗有效量的血管生成抑制剂的施用相比，步骤(i)和(ii)的组合导致所述患者的肿瘤和脾脏中CD8+T细胞和树突状细胞的增加以及所述患者中肿瘤相关巨噬细胞的减少。

25.如权利要求1所述的方法，其中所述患者的无进展生存期与作为单一疗法的治疗有效量的所述SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用或作为单一疗法的治疗有效量的血管生成抑制剂的施用相比增加了至少约10％。

26.如权利要求1所述的方法，其中与作为单一疗法的治疗有效量的所述SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用或作为单一疗法的治疗有效量的血管生成抑制剂的施用相比，步骤(i)和(ii)的组合导致与细胞毒性免疫细胞功能、T细胞活化和抗原呈递相关的基因的表达更高。

27.如权利要求1所述的方法，其中与作为单一疗法的治疗有效量的所述SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用或作为单一疗法的治疗有效量的血管生成抑制剂的施用相比，步骤(i)和(ii)的组合导致Esm1表达的降低以及I型干扰素相关基因和II型干扰素相关基因的表达增加。

28.如权利要求1所述的方法，其中与作为单一疗法的治疗有效量的所述SEQ ID NO:1的融合蛋白的施用或作为单一疗法的治疗有效量的血管生成抑制剂的施用相比，步骤(i)和(ii)的组合导致更多总数的基因的表达发生变化。

29.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括：

i)向所述患者施用治疗有效量的SEQ ID NO:1的融合蛋白；以及

ii)向所述患者施用治疗有效量的卢西他尼；

其中步骤(i)在步骤(ii)之前、之后或与其同时进行。

30.如权利要求28所述的方法，其中卢西他尼由式I的化合物表示

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