KR20240023365A - 지의류 내생 곰팡이 추출물 및 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 면역 항암용 조성물 - Google Patents

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재 선 허
강교빈
무자히트 바를르
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Abstract

본 발명은 지의류 내생 곰팡이 EL006872의 추출물 및 이로부터 분리된 라디안스펜(radianspene) C 화합물, 라디안스펜(radianspene) D 화합물, 및 달리안(dahliane) D 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상을 유효성분으로 포함하는 면역 항암용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 유효성분인 지의류 내생 곰팡이 EL006872의 추출물 및 이로부터 분리된 라디안스펜(radianspene) C 화합물, 라디안스펜(radianspene) D 화합물, 및 달리안(dahliane) D는 면역관문억제제로서 AhR의 발현을 차단하거나, PD-1 및 PD-L1의 결합을 차단하거나, ICOS 및 ICOSL의 결합을 차단하거나, GITR 및 GITRL의 결합을 차단하여 T 세포를 활성화시키고, 그 활성화된 T 세포에 의해 암 세포를 공격하도록 하여 암을 효과적으로 경감, 개선, 또는 치료할 수 있다. 따라서, 본 발명의 지의류 내생 곰팡이 EL006872 추출물, 라디안스펜(radianspene) C 화합물, 라디안스펜(radianspene) D 화합물, 및 달리안(dahliane) D 화합물은 암 예방, 개선 또는 치료를 위한 의약품 및 식품 등에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

지의류 내생 곰팡이 추출물 및 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 면역 항암용 조성물{Composition for cancer immunotherapy comprising extracts of Endolichenic fungi and compounds derived from the fungi}
본 발명은 지의류 내생 곰팡이 추출물 및 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 면역 항암용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 지의류 내생 곰팡이인 니마니아 속(Nemania sp.) EL006872의 추출물 및 이로부터 분리된 라디안스펜(radianspene) C 화합물, 라디안스펜(radianspene) D 화합물, 및 달리안(dahliane) D 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상을 유효성분으로 포함하는 면역 항암용 조성물에 관한 것이다.
환경 오염 물질과 담배 연기에 대한 노출은 중요한 공중 보건 문제이다. 주요 오염 물질은 벤조에이피렌(benzo[a]pyrene, BaP) 분자이다(Poirier, 2004; Tas et al., 2019b). BaP의 출처는 콜타르(Zieliski et al., 1996), 담배 연기, 자동차 배기 가스(Tancell et al., 1995), 유기 물질의 연소에 의해 생성된 연기, 구운 음식(Fatma Aygun and Kabadayi, 2005)을 포함한다. BaP에 대한 노출은 폐암과 전신 염증을 유발한다(Shi et al., 2017). 폐암은 전 세계적으로 암 관련 사망의 가장 흔한 원인이다(Gomes et al., 2014). 유전자 전사의 BaP 매개 조절은 아릴 탄화수소 수용체(Aryl hydrocarbon Receptor, AhR)의 활성화 또는 DNA 손상을 통해 발생한다(Hockley et al., 2007; Shimizu et al., 2000; Vazquez-Gσmez et al., 2018). BaP 및 담배 연기에 노출되면 AhR은 중요한 면역 관문인 PD-L1(programmed death ligand 1)의 발현을 유도한다(Wang et al., 2019). 따라서 새로운 유효약제나 암면역치료제의 개발이 필요하다(Jain et al., 2018).
면역항암요법(cancer immunotherapy)은 인간 면역 체계를 강화하여 암세포를 제거하는 것을 목표로 한다(Li et al., 2016). 면역항암요법은 기존의 방사선요법, 세포독성 치료제, 표적항암제와 작용메커니즘부터가 다르다. 기존의 항암제는 암세포의 DNA 또는 발현 단백질을 타겟으로 하여 공격하는 반면에 면역항암제는 면역세포의 기능에 집중하여 면역세포의 암세포를 공격하는 잠재력을 깨우는 것이다. 또한, 기존의 항암제는 암세포 자체를 타겟으로 하지만 면역항암제는 암세포뿐만이 아니라 암 주변에 존재하는 세포, 종양미세환경(tumor microenvironment)를 조절한다. 이러한 작용메커니즘의 차이는 치료효과에도 차이를 보인다.
면역항암요법의 기초 근거는 면역 체계가 암과 정상 세포 사이의 가장 작은 생화학적 차이를 구별할 수 있도록 하는 특정 항체와 T 세포의 활용에 있다(Rojas-Martnez et al., 2017). 종양은 다중 면역 조절 메커니즘을 사용하여 항종양 면역 효과를 억제한다. 면역관문(immune checkpoint)은 면역 반응을 미세 조정하기 위해 공동 자극 경로(co-stimulatory pathway)의 생리학적 균형을 유지하는 억제 경로이다. 면역관문의 두 가지 구성 요소와 관련하여 면역 세포에 의해 발현되는 분자는 종종 면역관문 수용체라고 불리는 반면, 항원 제시 세포, 종양 세포 또는 기타 세포 유형에 의해 발현되는 분자는 면역관문 리간드라고 한다(Foy et al., 2016). 종양 세포에 의한 면역관문 리간드의 과발현은 암 미세 환경(cancer microenvironment)에서 종양 특이적 T 세포 면역에 영향을 미친다. 이러한 관문(checkpoint)를 기반으로 하는 대부분의 종양 면역 탈출 기전(tumor immune escape mechanism)은 이펙터세포(effector cell) 기능을 차단하기 때문에 항종양 면역은 억제 수용체-리간드 상호작용을 차단하는 항체에 의해 회복되어 면역관문을 비활성화할 수 있다(Carosella et al., 2015).
면역항암제는 크게 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor)와 면역세포치료제(immune cell therapy), 치료용 항체(therapeutic antibody), 항암백신(anticancer vaccine)으로 분류할 수 있다.
현재까지 가장 활발하게 개발되고 있는 면역항암제는 면역관문억제제이다. 면역관문억제제는 T 세포 억제에 관여하는 면역관문 단백질(immune checkpoint protein)의 활성을 차단하여 T 세포를 활성화시켜 암세포를 공격하는 약제로서 대표적으로, PD-1(programmed cell death-1), PD-L1(programmed cell death ligand-1), CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4)를 인식하는 항체를 사용한다.
T 세포의 표면에 분포하여 예정된 세포자멸사(programmed cell death)를 유도하는 단백질인 PD-1은 T 세포의 비활성화, 즉 T 세포의 기능을 억제하기 때문에 PD-1을 인식하는 항체를 사용하여 PD-1을 억제함으로써 면역기전을 회복시키고, T 세포를 활성화시켜 암세포를 공격할 수 있도록 한다. 키트루다(Pembrolizumab, MSD사), 옵디보(Nivolumab, BMS사)라는 상품명을 갖는 PD-1 억제제인 항 PD-1 항체는 2014년 FDA의 승인을 받았으며, 악성흑색종이나 폐암에 치료 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
또한, ICOS/ICOSL(CD275/CD278) 경로는 Treg 개체군을 조절하고 이에 따라 종양 발달을 조절한다(Amatore et al., 2020). ICOS/ICOSL의 발현은 CD4+, CD8+ 및 FoxP3+ 조절 효과기 세포 집단을 조절한다. ICOS 리간드의 과발현은 환자 생존 감소와 관련이 있다(Burmeister et al., 2008; Marinelli et al., 2018). 많은 연구에서 다양한 면역 관문을 표적으로 하는 분자를 조사했다. 예를 들어, GSK3359609, JTX-2011, MEDI-570 및 KY1044는 ICOS를 억제한다(Solinas et al., 2020). 또 다른 면역관문 마커는 면역 세포 활성화, 생존 및 신호 전달에 역할을 하는 GITRL(글루코코르티코이드 유도 종양 괴사 인자 수용체 관련 단백질 리간드)이다 (Wang et al., 2021). GITRL-GITR 경로를 표적으로 하면 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 활성화되어 종양 억제가 촉진된다(Durham et al., 2017). 면역관문 신호전달경로와 다른 신호전달경로 간의 상호작용과 다양한 면역질환에서의 억제에 대한 연구가 계속되고 있다.
진균과 남조류(또는 조류)를 포함하는 공생 유기체인 지의류는 암을 포함한 수많은 질병의 치료를 위한 치료제의 공급원으로 많은 주목을 받아왔다(Tas et al., 2019; Tas et al., 2019a; Yang et al., 2018b, 2018a, Zhou et al., 2017). 식물 내부에 서식하는 내생식물과 유사하게 지의류 내생 진균(Endolichenic fungi, ELF)은 엽체 내부에 산다(Honegger et al., 2013). 많은 연구에서 ELF에서 이차 대사 산물을 확인하였다(He et al., 2012; Jiao et al., 2015; Li et al., 2015, 2012; Wang et al., 2010; Wijeratne et al., 2012, 2010). 지의류 이차 대사 산물은 펩티드(peptide), 알칼로이드(alkaloids), 스테로이드(steroids), 크산톤(xanthones), 알릴(allylics) 및 벤조피라노이드(benzopyranoids)를 포함한 다양한 화학 그룹으로 분류될 수 있다. 종래 일부 연구에서 지의류 이차 대사산물은 항산화, 항균, 항진균, 세포독성 및 항암 활성이 있다고 하였다(Kellogg Huzefa A Raja et al., 2017; Korkmaz et al., 2018; Kosani et al., 2013; Suryanarayanan and Thirunavukkarasu, Tas et al., 2021; Zhou et al., 2022). 또한, 본 발명자들도 이전에 우스닉산(usnic acid), 아트라노린(atranorin), 피시코스포린(physicosporin), 투미둘린(tumidulin) 및 ELF 추출물이 항암 활성을 가지고 있음을 보여주었다(Tas et al., 2019a; Yang et al., 2018c, 2018b, 2018a; Zhou et al., 2017). 40,000개 이상의 테르페노이드 화합물이 천연 공급원에서 분리되었다. 테르페노이드는 삶의 모든 영역에서 발견될 수 있으며 진균류와 식물의 2차 대사 산물이다(Zhang and Feng, 2022). 구조적 다양성과 생물학적 활성으로 인해 디테르페노이드는 잠재적인 대체 요법이 될 수 있다. 연구에 따르면 진균 디테르페노이드(diterpenoids)는 세포독성, 항염증, 항균, 항-MRSA, 항바이러스 및 항고혈압 특성을 가지고 있다고 하였다(B
Figure pat00004
schleb et al., 2016; Hu et al., 2020; Ling et al., 2014; Min et al., 2020).
이에 본 발명자들은 지의류 및 지의류 내생 곰팡이 등에 관한 연구를 지속하던 중 면역관문 억제 효능을 나타내는 신규 지의류 내생 곰팡이를 발견하였고, 그로부터 분리된 화합물 중 특정 화합물이 면역관문 억제 효능이 매우 우수함을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 신규 지의류 내생 곰팡이 EL006872를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 지의류 내생 곰팡이 EL006872 추출물, 라디안스펜(radianspene) C 화합물, 라디안스펜(radianspene) D 화합물, 및 달리안(dahliane) D 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질을 포함하는 면역항암용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 지의류 내생 곰팡이 EL006872 추출물, 라디안스펜(radianspene) C 화합물, 라디안스펜(radianspene) D 화합물, 및 달리안(dahliane) D 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질을 포함하는 항암 보조제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 지의류 내생 곰팡이 EL006872 추출물, 라디안스펜(radianspene) C 화합물, 라디안스펜(radianspene) D 화합물, 및 달리안(dahliane) D 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질을 포함하는 암 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 약학적 조성물을 암 질환의 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 지의류 내생 곰팡이 EL006872 추출물, 라디안스펜(radianspene) C 화합물, 라디안스펜(radianspene) D 화합물, 및 달리안(dahliane) D 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질을 유효성분으로 포함하는 면역항암용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 지의류 내생 곰팡이 EL006872은 브리오리아 속(Bryoria sp.) 지의류로부터 분리된 지의류 내생 곰팡이(Endolichenic fungi)로 니마니아 속(Nemania sp.)에 속하는 균류이며, 서열번호 3으로 이루어진 ITS를 포함하고 있는 것을 특징으로 한다. 여기서, 지의류 내생 곰팡이는 자낭균(lichenized fungi)에 속하는 균류로서 지의류를 형성하는 곰팡이가 아닌 지의체 내에서 특별한 피해를 유발하지 않고 서식하고 있는 곰팡이로서 지의류의 지의체(thallus)로부터 분리한 균류를 말한다.
하나의 구체적 예로서, 브리오리아 속(Bryoria sp.) 지의류의 지의체 조직을 완전 표면살균 후에 감자한천배지(potato dextrose agar; PDA)에서 치상, 배양하여 지의류 내생 곰팡이를 분리한 후, 지의류 내생 곰팡이의 ITS 부위 염기서열을 분석한 결과, 니마니아 속(Nemania sp.)에 속하는 새로운 균주를 발견하게 되었고, 그 새로운 균주는 572bp 염기서열로 이루어진 ITS를 포함하는 지의류 내생 곰팡이 EL006872로 명명하였다. 또한, 본 발명자는 상기 지의류 내생 곰팡이 EL006872을 2022년 08월 23일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 15057BP를 부여받았다.
본 발명에 있어서, “추출물”은 신규 지의류 내생 곰팡이 EL006872로부터 통상의 방법에 의하여 추출하거나 이로부터 분리된 지의류 내생 곰팡이의 대사산물을 말한다. 또한, 본 발명에 있어서 “추출물”은 상기 추출액 뿐만 아니라 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명에 따른 지의류 내생 곰팡이 EL006872의 추출물은 지의류 내생 곰팡이 EL006872를 유기용매로 추출하여 획득한 물질로, 세포독성이 없으며, 세포의 AhR(aromatic hydrocarbon receptor) 및 PD-L1, ICOSL 및 GITRL의 발현을 억제하여 면역관문 억제 효능을 나타내는 물질이다.
본 발명에 있어서, 상기 유기용매는 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 에틸아세테이트, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N'-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매이며, 바람직하게는 에틸아세테이트, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 헥산, 디클로로메탄 또는 이들의 혼합용매이며, 추출물의 유효성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 추출물의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 상기 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다.
또한, 상기 지의류 내생 곰팡이 EL006872 추출물은 유기용매에 의하여 추출하는 방법 외에 통상적인 정제 과정을 거쳐서도 수득할 수 있다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획을 통하여서도 수득할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 라디안스펜(radianspene) C 화합물은 하기 화학식 1의 구조를 가지며, 지의류 이차 대사산물로서 지의류 내생 곰팡이로부터 유래되거나 화학적으로 합성될 수 있다. 본 명세서에서 화합물 1로 표현될 수 있다.
[화학식 1]
본 발명에 있어서, 상기 라디안스펜(radianspene) D 화합물은 하기 화학식 2의 구조를 가지며, 지의류 이차 대사산물로서 지의류 내생 곰팡이로부터 유래되거나 화학적으로 합성될 수 있다. 본 명세서에서 화합물 2로 표현될 수 있다.
[화학식 2]
본 발명에 있어서, 상기 달리안(dahliane) D 화합물은 하기 화학식 3의 구조를 가지며, 지의류 이차 대사산물로서 지의류 내생 곰팡이로부터 유래되거나 화학적으로 합성될 수 있다. 본 명세서에서 화합물 3으로 표현될 수 있다.
[화학식 3]
본 발명의 상기 상기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물 1 내지 3은 무기산 또는 유기산으로부터 유도된 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이의 수화물 또는 용매화물의 형태일 수 있다. 상기 무기산은 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고, 유기산은 메탄술폰산, ρ-톨로엔술폰산, 아세트산, 트리플루오르아세트산, 시트르산, 말레인산, 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산, 구연산, 젖산, 글리콜산, 글로콘산, 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산, 글루쿠론산, 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.
상기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물 1 내지 3은 상술한 지의류 내생 곰팡이 EL006872의 추출물로부터 분리된 화합물로서, 세포독성이 없으며, 세포의 AhR(aromatic hydrocarbon receptor) 및 PD-L1, ICOSL 및 GITRL의 발현을 억제하여 면역관문 억제 효능을 나타내는 물질이다.
본 발명에 있어서, 상기 면역항암은 면역 억제력이 높은 암 세포에서 면역 반응의 진행을 막는 면역관문(immune checkpoint)를 차단하여 암 세포의 면역 회피를 억제함으로서 암 질환을 예방 또는 치료하는 것을 의미한다.
상기 암은 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 아팝토시스 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 말한다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내의 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 되는데, 이러한 상태를 암이라고 한다.
상기 암의 종류는 뇌척수종양, 뇌암, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 식도암, 위암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁경부암, 자궁 내막암, 림프종, 백혈병 예컨대 급성 백혈병 또는 만성백혈병, 골육종, 다발성 골수종, 육종, 흑색종, 악성 흑색종 및 피부암 등이 있다. 본 발명의 면역항암용 조성물은 암의 종류에 제한없이 사용될 수 있으나, 본 발명의 목적상 간암, 폐암, 위암, 췌장암, 대장암, 자궁경부암, 유방암, 전립선암, 난소암, 뇌암, 골육종, 방광암, 두경부암, 신장암, 흑색종, 백혈병 및 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 암을 억제시키거나 발명을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 암에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 상기 암의 예방 또는 치료는 본 발명의 지의류 내생 곰팡이 EL006872 추출물, 라디안스펜 C 화합물, 라디안스펜 D 화합물, 달리안 D 화합물, 또는 이들의 조합물에 의해 암 세포에 존재하는 PD-L1의 발현을 매개하는 AhR의 발현을 감소시키거나 암 세포에 존재하는 PD-1의 리간드인 PD-L1, ICOS의 리간드인 ICOSL, 및 GITR의 리간드인 GITRL의 발현을 감소시킴에 의해 달성할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 지의류 내생 곰팡이 EL006872 추출물, 라디안스펜 C 화합물, 라디안스펜 D 화합물, 달리안 D 화합물, 또는 이들의 조합물은 도 15에서 볼 수 있듯이 AhR의 발현을 차단하거나, PD-1 및 PD-L1의 결합을 차단하거나, ICOS 및 ICOSL의 결합을 차단하거나, GITR 및 GITRL의 결합을 차단하여 T 세포를 활성화시킬 수 있으며, 그에 따라 활성화된 T 세포에 의해 암세포를 공격하여 암을 경감, 개선, 또는 치료할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 지의류 내생 곰팡이 EL006872 추출물, 라디안스펜(radianspene) C 화합물, 라디안스펜(radianspene) D 화합물, 달리안(dahliane) D 화합물, 또는 이들의 조합물은 암 치료를 위해 PD-1과 PD-L1, ICOS와 ICOSL, 및/또는 GITR과 GITRL을 타겟으로 한 면역관문억제제로서 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적 조성물"은 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
또한, 각각의 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 담체를 추가로 포함하여 제조할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
따라서, 본 발명의 약학적 조성물을 개체에 투여하여 암 질환의 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개체"는 쥐, 가축, 생쥐, 인간 등 포유류일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개체에 투여를 위한 다양한 형태로 제형화 될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신)와 활탁제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 방부제, 수화제, 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제와 같은 보조제와 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 항암제를 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 경구적으로 또는 정맥내, 피하, 비강내 또는 복강내 등과 같은 비경구적으로 사람과 동물에게 투여될 수 있다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육내 주사 및 정맥 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 본 발명에 따른 지의류 내생 곰팡이 EL006872 추출물, 라디안스펜 C 화합물, 라디안스펜 D 화합물, 및/또는 달리안 D 화합물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 1회 투여시 100 ㎍ 내지 3,000 ㎎의 유효용량으로 하루에 수차례 반복 투여될 수 있다. 그러나 상기 지의류 내생 곰팡이 EL006872 추출물, 라디안스펜 C 화합물, 라디안스펜 D 화합물, 또는 달리안 D 화합물의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정될 수 있다. 따라서 이러한 점을 고려할 때 당분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 지의류 내생 곰팡이 EL006872 추출물, 라디안스펜 C 화합물, 라디안스펜 D 화합물, 또는 달리안 D 화합물의 암 질환의 치료 또는 예방제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있으며, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여방법에 특별히 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 지의류 내생 곰팡이 EL006872 추출물, 라디안스펜 C 화합물, 라디안스펜 D 화합물, 또는 달리안 D 화합물 이외에 공지된 항암제를 추가로 포함할 수 있고, 이들 질환의 치료를 위해 공지된 다른 치료와 병용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 항암제는 화학항암제, 표적항암제, 또는 면역항암제일 수 있다.
구체적으로, 상기 화학항암제는 이에 한정되지는 않으나, 알킬화제(alkylating agent), 미세소관 억제제(microtuble inhibitor), 대사길항제(antimetbolite), 또는 토포이소머라아제 억제제(topoisomerase inhibitor)일 수 있다.
상기 알킬화제는 메클로르에타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로람부실(chlorambucil), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 프로카바진(procarbazine), 부설판(busulfan), 스트렙토조신(streptozocin), 카르무스틴(carmustine), 이오무스틴(iomustine), 다카바진(dacarbazine), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 미소세관 억제제는 도세탁셀(docetaxel), 빈블라스틴(vinblastine), 온코빈(Oncovin), 비노렐빈(vinorelbine)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 대사길항제는 플루오로유라실(fluorouracil), 카페시타빈(capecitabine), 시타라빈(cytarabine), 젬시타빈(gemcitabine), 플루다라빈(fludarabine), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉시드(Pemetrexed), 메르캅토퓨린(mercaptopurine)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 토포이소머라아제 억제제는 하이캄틴(hycamtin), 캠토사(camptosar), 베페시드(vepesid), 탁솔(taxol), 블레오마이신(bleomycin), 아드리아마이신(adriamycin), 세루비딘(cerubidine)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
또한, 상기 표적항암제는 이에 한정되지는 않으나, 트라스투주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab), 파니투무맙(panitumumab), 세툭시맙(cetuximab), 베바시주맙(bevacizumab), 라무시루맙(ramucirumab), 애플리버셉트(aflibercept), 리툭시맙(rituximab), 오비누투주맙(obinutuzumab), 다라투무맙(daratumumab), 데노수맙(denosumab), 이브루티닙(ibrutinib), 다사티닙(dasatinib), 닐로티닙(nilotinib), 이마티닙(imatinib), 보수티닙(bosutinib), 오시머티닙(osimertinib), 엘로티닙(erlotinib), 제피티닙(gefitinib), 닌테다닙(nintedanib), 수니티닙(sunitinib), 소라페닙(sorafenib), 카보잔티닙(cabozantinib), 렌바티닙(lenvatinib), 레고라페닙(regorafenib), 액시티닙(axitinib), 파조파닙(pazopanib), 카보잔티닙(cabozantinib), 트라메티닙(trametinib), 다브라페닙(dabrafenib), 아베마시클립(abemaciclib), 팔보시클립(palbociclib), 레날리도마이드(lenalidomide), 록소리티닙(ruxolitinib), 알렉티닙(alectinib), 크리조티닙(crizotinib), 올라파립(olaparib), 베네토클락스(venetoclax)일 수 있다.
또한, 상기 면역항암제는 이에 한정되지는 않으나, 면역관문억제제, 면역세포 치료제(CAR-T), ADC(antibody drug conjugate), 이중항체, 항암 바이러스, 또는 항암백신일 수 있다.
상기 면역관문억제제는 PD-1 항체, PD-L1 항체, CTLA-4 항체, TIM3 항체 또는 LAG3 항체일 수 있다. 상기 PD-1 항체는 펨브로리주맙(pembrolizumab), 니볼루맙(nivolumab), 세미플리맙(cemiplimab)일 수 있고, 상기 PD-L1 항체는 아테졸리주맙(atezolizumab), 아벨루맙(avelumab), 더발루맙(durvalumab)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 CTLA-4 항체는 이필리무맙(ipilimumab), 트레멜리무맙(tremelimumab)일 수 있고, 상기 TIM3 항체는 MBG452일 수 있으며, LAG3 항체는 BMS-986016, LAG525일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 면역세포 치료제는 티사젠렉류셀(tisagenlecleucel), 애시카브타겐실루셀(axicabtagene ciloleucel)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 ADC는 젬투주맙 오조가미신(gemtuzumab-ozogamicin), 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin), 트라스투주맙 엠탄신(trastuzumab emtansine), 이노츠맵 오조감신(inotuzumab ozogamicin), 에리불린 메실산염(eribulin mesylate)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 이중항체는 블리나투모맙(blinatumomab)일 수 있고, 상기 항암 바이러스는 탈리모진 라헤르파렙벡(talimogene laherparepvec)일 수 있으며, 상기 항암백신은 시풀루셀-T(sipuleucel-T)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 암 질환의 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 암 질환의 의심 개체는 암 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 지의류 내생 곰팡이 EL006872 추출물, 라디안스펜 C 화합물, 라디안스펜 D 화합물, 및 달리안 D 화합물로 이루어진 군으로부터 1이상 선택된 물질을 포함하는 약학적 조성물을 암 질환 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 암 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개체"는 쥐, 가축, 생쥐, 인간 등 포유류일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 암 질환 의심 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 치료 방법은 지의류 내생 곰팡이 EL006872 추출물, 라디안스펜 C 화합물, 라디안스펜 D 화합물, 또는 달리안 D 화합물로 이루어진 군으로부터 1이상 선택된 물질을 포함하는 약학적 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 지의류 내생 곰팡이 EL006872 추출물, 라디안스펜 C 화합물, 라디안스펜 D 화합물, 및 달리안 D 화합물로 이루어진 군으로부터 1이상 선택된 물질을 포함하는 항암 보조제를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 항암 보조제는 종래의 화학항암제 등과 함께 병용하여 사용함으로써 암 세포를 사멸시키는 항암제의 효과를 증강시키는 것을 말한다. 일례로서, 항암제의 치료학적 유효 투여량을 감소시켜 항암제로 인한 부작용을 최소화시키거나, 암의 성장을 유의적으로 저해시키는 것을 나타낸다. 상기 화학적 항암제 등은 상술한 바와 같다.
본 발명의 지의류 내생 곰팡이 EL006872 추출물, 라디안스펜 C 화합물, 라디안스펜 D 화합물, 및 달리안 D 화합물은 암 세포의 AhR의 발현을 차단하거나, PD-1 및 PD-L1의 결합을 차단하거나, ICOS 및 ICOSL의 결합을 차단하거나, GITR 및 GITRL의 결합을 차단하여 T 세포에 의한 암 세포의 공격을 활성화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 지의류 내생 곰팡이 EL006872 추출물, 라디안스펜 C 화합물, 라디안스펜 D 화합물, 및 달리안 D 화합물은 항암 보조제로서도 유용하게 사용할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 지의류 내생 곰팡이 EL006872 추출물, 라디안스펜 C 화합물, 라디안스펜 D 화합물, 및 달리안 D 화합물로 이루어진 군으로부터 1이상 선택된 물질을 포함하는 암 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개선"은, 상기 조성물을 이용하여 암 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 지의류 내생 곰팡이 EL006872 추출물, 라디안스펜 C 화합물, 라디안스펜 D 화합물, 또는 달리안 D 화합물을 식품 조성물로 사용하는 경우, 이들 성분 이외에 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물은 포도당 및 과당 당의 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스 및 올리고당 등의 디사카라이드, 덱스트린 및 사이클로덱스트린 등의 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 이의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품이 음료일 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
상기 식품은 상술한 성분 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일쥬스, 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 지의류 내생 곰팡이 EL006872 추출물, 라디안스펜(radianspene) C 화합물, 라디안스펜(radianspene) D 화합물, 및 달리안(dahliane) D 화합물은 면역관문억제제로서 AhR의 발현을 차단하거나, PD-1 및 PD-L1의 결합을 차단하거나, ICOS 및 ICOSL의 결합을 차단하거나, GITR 및 GITRL의 결합을 차단하여 T 세포를 활성화시키고, 그 활성화된 T 세포에 의해 암 세포를 공격하도록 하여 암을 효과적으로 경감, 개선, 또는 치료할 수 있다. 따라서, 본 발명의 지의류 내생 곰팡이 EL006872 추출물, 라디안스펜(radianspene) C 화합물, 라디안스펜(radianspene) D 화합물, 및 달리안(dahliane) D 화합물은 암 예방, 개선 또는 치료를 위한 의약품 및 식품 등에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 브리오리아 속(Bryoria sp.) 지의류로부터 분리된 지의류 내생 곰팡이인 니마니아 속(Nemania sp.) EL006872의 배양 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 지의류 내생 곰팡이인 니마니아 속(Nemania sp.) EL006872 추출물의 처리에 따른 H1975 세포에 대한 세포독성 실험 결과이다. (데이터는 3회 반복 실험 결과로, 평균 ± 표준편차임. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. NS는 BaP 처리군과 추출물 처리군간에 유의한 차이가 없음을 의미함)
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 지의류 내생 곰팡이인 니마니아 속(Nemania sp.) EL006872 추출물로부터 분리된 화합물 1 내지 3의 농도별 처리에 따른 H1975 세포에 대한 세포독성 실험 결과이다. (데이터는 3회 반복 실험 결과로, 평균 ± 표준편차임. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. NS는 BaP 처리군과 추출물 처리군간에 유의한 차이가 없음을 의미함)
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 지의류 내생 곰팡이인 니마니아 속(Nemania sp.) EL006872 추출물의 처리에 따른 벤조에이피렌(BaP)에 노출된 H1975 세포 내 AhR(aromatic hydrocarbon receptor) mRNA 발현 억제 효과를 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 그림이다 (데이터는 3회 반복 실험 결과로, 평균 ± 표준편차임. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. NS는 BaP 처리군과 추출물 처리군간에 유의한 차이가 없음을 의미함).
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 지의류 내생 곰팡이인 니마니아 속(Nemania sp.) EL006872 추출물의 처리에 따른 벤조에이피렌(BaP)에 노출된 H1975 세포 내 PD-L1 mRNA 발현 억제 효과를 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 그림이다 (데이터는 3회 반복 실험 결과로, 평균 ± 표준편차임. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. NS는 BaP 처리군과 추출물 처리군간에 유의한 차이가 없음을 의미함).
도 6 및 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 지의류 내생 곰팡이인 니마니아 속(Nemania sp.) EL006872 추출물의 처리에 따른 벤조에이피렌(BaP)에 노출된 H1975 세포 내 PD-L1 표면 단백질(surface protein) 발현 억제 효과를 유세포분석(flow cytometry)하여 나타낸 그림이다 (데이터는 3회 반복 실험 결과로, 평균 ± 표준편차임. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. NS는 BaP 처리군과 추출물 처리군간에 유의한 차이가 없음을 의미함. MFI는 평균 형광강도(mean fluorescence intensity)임).
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 니마니아 속(Nemania sp.) EL006872 추출물로부터 분리된 화합물 1 내지 3의 처리에 따른 벤조에이피렌(BaP)에 노출된 H1975 세포 내 AhR(aromatic hydrocarbon receptor) mRNA 발현 억제 효과를 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 그림이다 (데이터는 3회 반복 실험 결과로, 평균 ± 표준편차임. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. NS는 BaP 처리군과 추출물 처리군간에 유의한 차이가 없음을 의미함).
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 니마니아 속(Nemania sp.) EL006872 추출물로부터 분리된 화합물 1 내지 3의 처리에 따른 벤조에이피렌(BaP)에 노출된 H1975 세포 내 PD-L1 mRNA 발현 억제 효과를 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 그림이다 (데이터는 3회 반복 실험 결과로, 평균 ± 표준편차임. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. NS는 BaP 처리군과 추출물 처리군간에 유의한 차이가 없음을 의미함).
도 10 및 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 니마니아 속(Nemania sp.) EL006872 추출물로부터 분리된 화합물 1 내지 3의 처리에 따른 벤조에이피렌(BaP)에 노출된 H1975 세포 내 PD-L1 표면 단백질(surface protein) 발현 수준을 유세포분석(flow cytometry)하여 나타낸 그림이다 (데이터는 3회 반복 실험 결과로, 평균 ± 표준편차임. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. NS는 BaP 처리군과 추출물 처리군간에 유의한 차이가 없음을 의미함. MFI는 평균 형광강도(mean fluorescence intensity)임).
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 니마니아 속(Nemania sp.) EL006872 추출물로부터 분리된 화합물 1(Radianspene C)의 처리에 따른 전사 인자 AhR 및 면역관문 마커 PD-L1, ICOSL 및 GITRL의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸다. (GAPDH는 로딩 컨트롤(loading controla)임. 데이터는 3회 반복 실험 결과로, 평균 ± 표준편차임. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.)
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 니마니아 속(Nemania sp.) EL006872 추출물로부터 분리된 화합물 2(Radianspene D)의 처리에 따른 전사 인자 AhR 및 면역관문 마커 PD-L1, ICOSL 및 GITRL의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸다. (GAPDH는 로딩 컨트롤(loading controla)임. 데이터는 3회 반복 실험 결과로, 평균 ± 표준편차임. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.)
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 니마니아 속(Nemania sp.) EL006872 추출물로부터 분리된 화합물 3(Dahliane D)의 처리에 따른 전사 인자 AhR 및 면역관문 마커 PD-L1, ICOSL 및 GITRL의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸다 (GAPDH는 로딩 컨트롤(loading controla)임. 데이터는 3회 반복 실험 결과로, 평균 ± 표준편차임. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.).
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 지의류 내생 곰팡이인 니마니아 속(Nemania sp.) EL006872 추출물 및 이로부터 분리된 화합물 1 내지 3의 처리에 따른 암 세포의 면역관문 억제 효능을 도식화하여 나타낸 그림이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 지의류 내생 곰팡이의 분리 및 동정
브리오리아 속(Bryoria sp.)의 지의류 샘플은 2019년 터키 이스탄불 마르마라 대학교 식물 질병 미생물학과의 세살(Sesal) 교수가 주관한 터키 부르사(Bursa)의 울루다그 산(Mt. Uludao) 견학 중 수집한 것이다. 현장 연구에는 멸종 위기에 처하거나 보호되는 종은 포함되지 않았다. 중복시료(KoLRI 052660)는 순천대학교 한국지의류연구소(KoLRI) 내 한국의 지의류 및 연합생물자원센터(KOLABIC)에 기탁되어 있다(https://cc.aris.re.kr/kolabic). 지의류 내생 곰팡이(Endolichenic fungi, ELF)는 표면 살균 방법으로 분리되었다 (Guo et al., 2003).
곰팡이 ITS(internal transcribed spacer) 시퀀싱(sequencing)은 양 등(Yang et al., 2018b)에 기술된 방법대로 수행되었다. 지의류 내생 곰팡이(Endolichenic fungi, ELF)는 PDA(Potato dextrose agar)(BD Difco, Sparks, MD, USA) 배지에서 배양되었다. 제조업체의 프로토콜(Qiagen, Hilden, Germany)에 따라 DNeasy Plant Mini Kit를 사용하여 ELF에서 DNA를 추출하였다. rDNA의 ITS(internal transcribed spacer) 영역은 ITS1F(5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3') (서열번호 1) 및 LR5(5'-ATCCTGAGGGAAACTTC-3') (서열번호 2) 프라이머를 사용하여 공통적으로 증폭되었다. 본 실험에 사용된 균주(EL006872)는 ITS 서열의 BLAST 검색에 의해 네마니아 속(Nemania sp.)으로 확인되었으며, 네마니아 속(Nemania sp.) 유전자형 184(GenBank Accession No. JQ761782.1)에 대해 99.81%의 유사성을 나타내었다. 네마니아 속(Nemania sp.) EL006872의 ITS 서열(서열번호 3)은 하기 표 1에 나타내었으며, 도 1에 분리된 지의류 내생 곰팡이인 네마니아 속(Nemania sp.) EL006872를 나타내었다. 또한, 상기 분리된 신규 지의류 내생 곰팡이 EL006872는 2022년 8월 23일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 15057BP를 부여받았다.
TATGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTATACATTGGGGGGTGTTTTACGGCAGGGCGCCGGGCTTAGGCTACAGGCGATGTGTAAAAGCTACTACGTCTGGAGTGTTAAACCGGCTCCGCCACTGACTTTGGGGAGCTACGGGACAGGGTCCGGTAGGCTCCCAACGCTAAGCAACTGGGGCTTAAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCACCAGAATACTGGTGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTGATTTAGTTATCTTTGTTTCAGAGGTCTAATGCTATACAAAACAGAGTTTCGGGGGCCGTCGGCAGGTTTCGCCTACGAGGGGTAGGGCGGCGCCTGCCGAGGCAACGAGAGGTATGTTCACATGGGTTTGGGAGTTTGTTAGAACTCTATAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGA
실시예 2: 지의류 내생 곰팡이 추출물의 제조
PDA(BD Difco, Sparks, MD, USA) 분말(39g)을 1L의 증류수에 넣은 후 가열하여 분말을 용해시켰다. 혼합물을 고압증기멸균(autoclave) 하였다. 고압증기멸균된 PDA 용액을 55 ~ 60°C로 냉각한 다음 페트리 디쉬로 옮겨 담고 실온으로 냉각시켰다. 상기 실시예 1의 지의류 내생 곰팡이인 네마니아 속(Nemania sp.) EL006872을 각 페트리 디쉬의 한천에서 배양되도록 옮겨진 후 3 내지 4주 동안 25℃에서 배양되었다. 배양된 ELF는 한천(agar)와 함께 동결된 후 동결건조하였다. 동결건조물을 물에 용해한 다음 이를 샘플 튜브에 넣은 후 아세톤을 첨가하고, 튜브를 약 2시간 동안 흔들었다. 그런 다음 각 샘플을 여과하여 고체 입자로부터 분리하였다. 그런 다음 아세톤을 증발시켜 ELF의 조 추출물을 얻었다. 상기 얻어진 조추출물은 하기 실험에서 100% DMSO에 녹여 사용하였다.
실시예 3: 지의류 내생 곰팡이 추출물로부터 화합물 1 내지 3의 분리 및 구조 동정
상기 실시예 2의 건조된 조 추출물(2.7g)을 물에 현탁한 다음, n-헥산 및 EtOAc로 연속적으로 추출하였다. Hector-M C18 컬럼(250 × 10 mm, 5 μm, RS Tech, 대전, 한국) 또는 Spursil C18 EP 컬럼(250 × 10.0 mm, 5 μm, Dikma Technologies, Foothill Ranch, CA, USA)이 장착된 Waters 600 HPLC 시스템(Waters Co., Milford, MA, USA)에 의해 EtOAc 분획으로부터 화합물 1-3을 정제하였다. EtOAc 분획(78.9 mg)을 분취용 HPLC(Hector C18 컬럼, 4 mL/분, H2O 중 MeCN-0.1% 포름산 20:80 →80:20)에 의해 5개의 하위 분획(E1-E5)으로 추가로 분리하였다. 화합물 1(1.0mg, tR = 10.0분) 및 화합물 2(1.3mg, tR = 8.0분)는 분취용 HPLC(Spursil C18 EP 컬럼, 4mL/분, H2O 중 MeCN-0.1% 포름산 45:55 →58:42)에 의해 하위 분획 E4로부터 정제하였다. 화합물 3(0.7mg, tR = 11.5분)은 분취용 HPLC(Spursil C18 EP 컬럼, 4mL/분, H2O 중 MeCN-0.1% 포름산 45:55 →58:42)에 의해 하위 분획 E4로부터 얻었다. Bruker Avance III HD 500 분광계(Bruker BioSpin, Billerica, MA, USA)를 사용하여 NMR 스펙트럼을 얻었다. 하기 표 2에 이들 화합물 1 내지 3의 1H NMR (500 MHz) 및 13C NMR (125 MHz) 스펙트럼 데이터를 나타내었다.
Radianspene C Radianspene D Dahliane D
position dC dH (J in Hz) dC dH (J in Hz) dC dH (J in Hz)
1 166.7 - 159.2
2 120.0 6.35 (d, 2.7) 121.6 6.14 (d, 2.2) 120.2
3 163.9 - 166.4
4 133.3 - 134.6
5a 201.2 28.5 2.17 (m) 201.2
5b 2.11 (m)
6a 34.6 2.61 (ddd, 16.5, 11.3, 5.0) 19.8 1.69 (m) 34.8 2.6 (m)
6b 2.41 (ddd, 16.5, 6.6, 4.8) 1.66 (m) 2.43 (m)
7a 35.8 1.87 (m) 39.2 2.18 (m) 38.9 1.94 (m)
7b 1.84 (m)
8 37.9 - 37.0
9a 36.9 2.41 (m) 41.8 1.23 (m) 37.4 1.48 (m)
9b 1.46 (m) 1.49 (m) 1.46 (m)
10a 38.8 1.93 (m) 35.8 1.71 (m) 36.0 1.84 (m)
10b 1.86 (m) 1.67 (m)
11 45.4 - 46.8
12 58.1 1.2 (m) 53.1 1.39 (m) 53.4 1.48 (m)
13 74.7 4.08 (dd, 4.4, 3.6) 74.2 4.08 (dd, 4.4, 3.5) 74.2 4.13 (m)
14 76.3 4.42 (dd, 4.4, 2.7) 4.36 (m) 76.4 4.43 (dd, 4.4, 2.7)
15a 56.2 4.29 (d, 11.5) 63.5 4.22 (d, 12.3) 56.2 4.29 (d, 11.5)
15b 4.25 (d, 11.5) 3.88 (d,12.3) 4.27 (d, 11.5)
16 26.4 1.21 (s) 26.5 1.01 (s) 26.4 1.21 (s)
17 20.2 1.18 (s) 18.8 1.18 (s) 20.4 1.19 (s)
18 26.6 2.06 (m) 33 2.06 (m) 33.2 2.05 (m)
19a 23.4 1.06 (d, 6.6) 67.6 3.69 (dd, 11.1, 4.3) 67.83 3.68 (dd, 10.6, 3.8)
19b 3.61 (dd, 10.7, 5.1) 3.64 (dd, 10.6, 5.1)
20 23.5 1.00 (d, 6.6) 18.1 1.06 (d, 6.8) 18.3 1.07 (d, 6.8)
상기한 분석 결과, 화합물 1은 라디안스펜(radianspene) C로 동정하였고(화학식 1), 화합물 2는 라디안스펜(radianspene) D로 동정하였고(화학식 2), 화합물 3은 달리안(dahliane) D로 동정하였다.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
실시예 4: 추출물 및 화합물 1 내지 3의 세포 독성 실험
지의류 내생 곰팡이 추출물 및 이로부터 분리된 화합물 1 내지 3의 세포독성 실험을 위하여 H1975 비소형 폐암 세포주를 사용하였다. H1975 세포는 10% 태아 소 혈청(GenDepot, Katy, TX, USA) 및 1% 페니실린 스트렙토마이신 용액이 보충된 RPMI(GenDepot, Katy, TX, USA) 배지로 37°C, 가습 분위기, 및 5% CO2 조건에서 배양하였다.
추출물과 이로부터 분리한 화합물 1 내지 3을 각각 DMSO(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 용해하였다. 상기 배양된 H1975 세포를 96-웰 플레이트에 3 x 103세포/웰의 밀도로 분주(seeding)하고 밤새 성장시킨 다음 상기 추출물 및 화합물 1 내지 3을 각각 처리하였다. 배양 후, 15 μL MTT(methyl thiazolyl tetrazolium) 시약(Sigma-Aldrich)을 각 웰에 첨가하고 샘플을 추가로 4시간 동안 배양하였다. 4시간 후 상층액을 제거하고 포르마잔 결정을 150μL DMSO에 용해하였다. 흡광도는 570nm에서 측정되었으며 Gen5(v2.03.1) 소프트웨어(BioTek, Winooski, VT, USA)가 있는 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 결정되었다.
도 2에서 볼 수 있듯이, 지의류 내생 곰팡이인 네마니아 속(Nemania sp.) EL006872의 아세톤 추출물(10 μg/ml)은 추출물은 세포독성을 나타내지 않았다.
또한, 도 3에서 볼 수 있듯이, 네마니아 속(Nemania sp.) EL006872 추출물로부터 분리된 화합물 1 내지 3(라디안스펜 C와 D, 및 달리안 D)도 30 μM 농도까지 세포독성을 나타내지 않았다. 따라서, 이하의 실험에서 화합물 1 내지 3의 농도를 세포독성이 없는 7.5, 15, 및 30 μM 농도로 사용하였다.
실시예 5: 지의류 내생 곰팡이 추출물 및 이로부터 분리된 화합물의 면역관문 억제 활성
벤조에이피렌(benzo[a]pyrene, BaP)에 대한 노출은 폐 상피 세포에 의한 PD-L1의 발현을 증가시키며, 이는 방향족 탄화수소 수용체(aromatic hydrocarbon receptor; AhR)을 통해 매개되는 것으로 고려되고 있다(Wang et al., 2019). 최근에는 AhR은 키누레닌(kynurenine)(Esser, 2016; Gutiιrrez-Vαzquez 및 Quintana, 2018; Kawajiri 및 Fujii-Kuriyama, 2017)과 같은 대사 산물 및 유도체와 상호 작용하며, AhR은 BaP에 의해 발현이 유도되는 것으로 알려졌다. 많은 암에서 AhR의 과발현은 CYP1A1 및 CYP1B1의 과발현을 통해 독성 대사산물의 생산을 유발한다(Harrigan et al., 2004). 본 실험 전의 예비 실험에서 H1975 비소형 폐암 세포주는 PD-L1을 과발현하는 것을 확인하였기 때문에 이하의 실험에서 상기 세포주를 사용하였다. 암의 전형적 특징은 암 세포가 숙주 면역 세포의 공격을 피할 수 있다는 것이다. 암종 세포(Carcinoma cells)는 면역 세포 사멸 및 기능 장애를 유도하는 많은 면역 억제 신호 전달 경로를 발현할 수 있다. PD-L1(Programmed death ligand-1)은 수지상 세포, B 세포, T 세포 및 자연 살해 T 세포에 의해 발현되는 PD-1(Programmed death-1)에 결합하여 이들의 항암 효과를 억제한다(Chen et al., 2016).
이에 지의류 내생 곰팡이 네마니아 속(Nemania sp.) EL006872 추출물 및 이로부터 분리된 화합물의 면역관문 억제 활성을 확인하기 위하여 벤조에이피렌(benzo[a]pyrene, BaP)에 노출된 H1975 세포의 AhR(aromatic hydrocarbon receptor) 및 PD-L1 mRNA의 발현 여부를 qRT-PCR(Quantitative RT-PCR)로 확인하였으며, PD-L1의 발현 수준을 유세포 분석기로 분석하였다.
구체적으로, H1975 세포를 6-웰 플레이트에 2 x 105세포/웰의 밀도로 플레이팅하고 밤새 성장시켰다. 세포에 추출물, 화합물 1 내지 3 및 벤조에이피렌 또는 DMSO를 처리하였다. RNAiso Plus(TaKaRa, Otsu, Japan)를 사용하여 H1975 세포에서 총 RNA를 분리하였다. M-MLV 역전사효소(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 1mg의 RNA를 cDNA로 전환시켰다. qPCR은 SYBR Green(Enzynomics, Seoul, Korea)을 사용하여 수행되었다. qRT-PCR 반응 및 분석은 CFX 기기(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에서 수행되었다. qRT-PCR에 사용된 프라이머는 다음과 같다:
GAPDH(정방향) 5'-atcaccatcttccaggagcga-3' (서열번호 4) 및 (역방향) 5'-agttgtcatggatgaccttggc-3' (서열번호 5); PD-L1(정방향) 5'-ggagattagatcctgaggaaaacca-3' (서열번호 6) 및 (역방향) 5'-aacggaagatgaatgtcagtgcta-3' (서열번호 7); AhR(정방향) 5'-attgtgccgagtcccatatc-3' (서열번호 8) 및 (역방향) 5'-aagcaggcgtgcattagact-3' (서열번호 9).
또한, H1975 세포를 6웰 플레이트에 2 x 105세포/웰의 밀도로 플레이팅하고 밤새 성장시켰다. 세포는 벤조에이피렌(1 μM)에 노출되기 4시간 전에 본 발명의 추출물 및 이로부터 분리된 화합물(라디안스펜 C와 D, 및 달리안 D)를 각각 처리한 다음 72시간 동안 배양하였다. H1975 세포주를 72시간 동안 배양하고 PBS에서 트립신 소화(trypsin digestion)에 의해 수집하였다. 세 번 세척한 후, 세포 펠릿을 2% BSA에 재현탁하고 100μl 분취량(1×106개 세포)을 4℃에서 30분 동안 암실에서 항-PD-L1 항체(Cell signaling, #13684)로 항체 표지하는데 사용하였다. FACS 완충액으로 2회 세척하고 세포를 2차 항체 항-토끼 IgG(H+L)(Cell 신호 전달, Alexa flour 488 conjugate, #4412)와 함께 4℃에서 30분 동안 암실에서 배양하였다. 세척 단계 후, 표지된 세포는 Cytoflex 유세포 분석기(Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis, IN, USA) 및 CytExpert 2.0.0.152 소프트웨어를 사용하여 유세포 분석에 의해 분석되었다.
그 결과, 네마니아 속(Nemania sp.) EL006872 추출물은 BaP에 노출된 H1975 세포에서 PD-L1 및 AhR mRNA의 발현을 하향조절하였으며(도 4 및 5 참조), PD-L1의 증가된 표면 단백질 수준을 감소시켰다(도 6 및 7 참조). 또한, 네마니아 속(Nemania sp.) EL006872 추출물로부터 분리된 화합물 1 내지 3(라디안스펜 C와 D, 및 달리안 D)도 각각 BaP에 노출된 H1975 세포에서 PD-L1 및 AhR mRNA의 발현을 하향조절하였으며(도 8 및 9 참조), PD-L1의 표면 단백질 수준을 농도 의존적으로 감소시켰다(도 10 및 11 참조).
실시예 6: 화합물 1 내지 3의 다중 면역관문 마커 발현 억제 효과
지의류 내생 곰팡이인 네마니아 속(Nemania sp.) EL006872 추출물로부터 분리된 화합물 1 내지 3이 다중 면역관문 마커의 발현을 억제하는지 확인하였다.
구체적으로, H1975 세포를 6웰 플레이트에서 12시간 동안 배양한 후, 화합물 1 내지 3을 각각 7.5, 15, 30μM 농도로 72시간 동안 처리하였다. 이후 차가운 PBS로 2회 세척하고 용해 완충액에 용해시켰다. 1차 항체(PD-L1(Cell signaling, #13684), ICOSL(Sigma-Aldrich, WH0023308M1), GITRL(Abcam, ab25948), AhR(Cell signaling, #83200) 및 GAPDH(Cell signaling, #5174))가 프로브 멤브레인(probe membrane)을 조사하는 데 사용되었다. 멤브레인을 이차 항체(Thermo Fisher Scientific)로 배양한 후, Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate Kit(Merck Millipore, Germany) 및 발광 이미징(iBright™FL1000 Imaging System, Thermo Fisher Sciences)을 사용하여 검출하였다. Multi-Gauge 3.0을 사용하여 밴드 밀도를 평가한 다음 각 샘플의 GAPDH 수준으로 정규화하였다. 값은 신호 강도와 상관관계가 있는 임의의 농도 측정 단위로 제공되었다.
그 결과, 도 12 내지 14에서 볼 수 있듯이, 화합물 1 내지 3은 PD-L1, GITRL 및 ICOSL의 발현을 용량 의존적 방식으로 하향 조절하였다. 또한 전사 조절자 AhR 단백질의 수준은 화합물 1 내지 3의 처리에 따라 감소하였다. 따라서 본 발명의 화합물 1 내지 3은 자중 면역관문에 대해 강력한 억제 효과를 나타낸다.

Claims (7)

  1. 브리오리아 속(Bryoria sp.) 지의류로부터 분리된 지의류 내생 곰팡이 EL006872(기탁번호 KCTC 15057BP).
  2. 지의류 내생 곰팡이 EL006872(기탁번호 KCTC 15057BP) 추출물, 라디안스펜(radianspene) C 화합물, 라디안스펜(radianspene) D 화합물, 및 달리안(dahliane) D 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질을 유효성분으로 포함하는 면역항암용 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 PD-L1의 발현을 매개하는 AhR의 발현을 감소시키거나 암 세포에 존재하는 PD-1의 리간드인 PD-L1, ICOS의 리간드인 ICOSL, 및 GITR의 리간드인 GITRL의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 면역항암용 약학적 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 면역항암은 간암, 폐암, 위암, 췌장암, 대장암, 자궁경부암, 유방암, 전립선암, 난소암, 뇌암, 골육종, 방광암, 두경부암, 신장암, 흑색종, 백혈병 및 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 암의 예방 또는 치료인 것을 특징으로 하는 면역항암용 약학적 조성물.
  5. 지의류 내생 곰팡이 EL006872(기탁번호 KCTC 15057BP) 추출물, 라디안스펜(radianspene) C 화합물, 라디안스펜(radianspene) D 화합물, 및 달리안(dahliane) D 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질을 유효성분으로 포함하는 항암 보조제.
  6. 지의류 내생 곰팡이 EL006872(기탁번호 KCTC 15057BP) 추출물, 라디안스펜(radianspene) C 화합물, 라디안스펜(radianspene) D 화합물, 및 달리안(dahliane) D 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질을 유효성분으로 포함하는 암 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 암은 간암, 폐암, 위암, 췌장암, 대장암, 자궁경부암, 유방암, 전립선암, 난소암, 뇌암, 골육종, 방광암, 두경부암, 신장암, 흑색종, 백혈병 및 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 암의 예방 또는 치료인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
KR1020220167570A 2022-08-11 2022-12-05 지의류 내생 곰팡이 추출물 및 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 면역 항암용 조성물 KR20240023365A (ko)

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