KR101846742B1

KR101846742B1 - 신규한 락토바실러스 파라플란타룸 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101846742B1
Application number: KR1020160158847A
Authority: KR
Inventors: 이종승
Original assignee: (주)앰틱스바이오
Priority date: 2016-11-26
Filing date: 2016-11-26
Publication date: 2018-04-06

Abstract

본 발명은 김치에서 분리한 신규한 유산균 균주 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 유산균 및 이것의 배양물은 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미디스 (Staphlococcus epidermidis) 및 프로피오니박테리움 애크니스 (Propionicbacterium acnes)를 포함하는 피부트러블의 원인이 되는 유해균에 대해 광범위한 생육 억제 활성을 갖는다. 따라서 본 발명의 유산균을 포함하는 조성물을 피부트러블 예방 및 개선을 위한 조성물의 제조에 이용될 수 있다.

Description

신규한 락토바실러스 파라플란타룸 균주 및 이의 용도 {A novel Lactobacillus paraplantarum strain and the use thereof}

본 발명은 김치에서 분리한 신규 유산균 균주 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 피부트러블 원인균에 대한 광범위한 항균활성을 갖는 락토바실러스 파라플란타룸 균주, 상기 균주 및 이의 배양물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

여드름은 피지관련 질환으로서 남성호르몬에 기인한 과잉 피지에 의해 발생한다. 보다 상세하게는, 남성호르몬에 의해 피지가 생성되고 모공각화가 유발됨에 따라 피지가 모공 밖으로 배출되지 못해 미세면포 (microcomedones)가 형성되며, 피지 내에 존재하는 혐기성균인 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionicbacterium acnes)가 작용하여 여드름이 발생한다. 일반적으로 여드름과 같은 피부질환 치료를 위해 테트라사이클린 (tetracycline), 신다마이신 (cindamycine), 또는 에리트로마이신 (erythromycin) 등 과 같은 항생제를 주로 사용된다. 그러나 이러한 항생제는 장기간 사용시 여드름균 및 기타 상재균에 대하여 내성균을 유발시켜 치료효과를 감소시키고, 광과민작용 등의 부작용을 일으키는 등의 문제를 유발하는 것으로 보고되고 있다. 또한. 합성 항균제로서 사용되는 파라옥시안식향산에스텔 및 파라벤류 등의 방부제는 피부에 알러지 또는 부종을 유발하는 부작용이 보고되고 있다 (Andrea Counti et al., Contact Dermatitis, 1997, 37: 35-36; Edwin et al., Toxicology and Applied Pharmacology, 1998, 153: 12-19). 천연항균제로서, 예를 들어, 히노키티올 (hinokitiol, 편백추출물), 바이칼린 (baicalin, 황금추출물), 메그노놀 (megnonol, 목련 추출물), 및 자몽종자추출물인 DF-100 등이 상용화되어 있다. 이러한 천연항균제는 pH 또는 킬레이트에 의한 항균효과를 갖는 것으로 보고된 바 있다 (EI-shenawy et al., J. Food Protec. 1989, 52(11): 771-778; Bizri et al ., J. Food Science, 1994, 59(1):130-135),

유산균은 탄수화물을 혐기적으로 이용하여 젖산을 생산하는 미생물로 자연계에 널리 분포하는 미생물이다. 이와 같은 유산균 및 유산균 배양액은 중성 및 알칼리성에서 잘 생육하는 부패성 미생물의 생육을 억제하여 보존제의 수단으로 널리 이용되어 왔다. 특히 이들 유산균이 생산하는 것으로서 유기산 및 박테리오신을 포함하는 대사산물은 산도 (pH)를 낮추고 많은 미생물에 대한 살균작용 (bactericidal)을 나타내어 산업적 활용도가 높은 것으로 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 여드름을 포함하는 피부트러블의 원인이 되는 미생물에 대한 억제활성을 갖는 신규한 유산균을 발견하고자 부단히 노력하였으며, 그 결과 김치로부터 분리한 락토바실러스 파라플란타룸 유산균이 여드름 원인균을 포함하는 피부트러블 원인균에 광범위한 항균활성을 보이는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

Andrea Counti et al., Contact Dermatitis, 1997, 37: 35-36; Edwin et al., Toxicology and Applied Pharmacology, 1998, 153: 12-19. EI-shenawy et al., J. Food Protec. 1989, 52(11): 771-778; Bizri et al ., J. Food Science, 1994, 59(1):130-135.

본 발명은 피부트러블 원인균에 대해 광범위한 항균활성을 갖는 신규한 락토바실러스 파라플란타룸 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 파라플란타룸 균주 및/또는 이의 배양물을 포함하는, 피부트러블의 예방, 개선 및/또는 치료를 위한 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 신규 락토바실러스 파라플란타룸 (lactobacillus paraplantarum) AB160062 균주를 제공한다. 상기 락토바실러스 파라플란타룸 (lactobacillus paraplantarum) AB160062는 2016년 09월 12일자로 한국종균협회에 기탁하였으며, 기탁번호 KCCM 11893P를 부여받았다.

본 발명은 또한 상기 락토바실러스 파라플란타룸 AB160062 및/또는 이의 배양물을 포함하는 피부트러블 예방 및 개선을 위한 화장료 조성물을 제공한다. 일 예에서, 본 발명의 화장료 조성물은 에센스, 크림, 마스크팩, 모델링팩, 또는 미스트 (mist)와 같은 다양한 형태로 제작될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 일예에서, 본 발명의 화장료 조성물을 포함하는 제품은 얼굴, 가슴 및 등을 포함하여 다양한 신체부위에서 발생하는 피부트러블의 예방 및 개선을 위해, 이에 적합한 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명에서 화장료 조성물에 포함되는 락토바실러스 파라플란타룸 AB160062 배양물은 조성물 전체를 기준으로 0.1 ~ 50% 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1 ~ 3% 포함될 수 있다.

본 발명의 신규 락토바실러스 파라플란타룸 (Lactobacillus paraplantarum) AB160062는 여드름 원인균을 포함한 다양한 피부트러블 원인균에 대해 높은 억제활성을 갖는다. 또한, 본 발명의 AB160062 균주의 배양물이 다양한 피부트러블 원인균에 대해 광범위한 항균 활성을 갖는 것으로 확인되었다.

도 1은 본 발명의 락토바실러스 파라플란타룸 (lactobacillus paraplantarum) AB160062 균주의 분자생물학적 연관성을 나타내는 계통도 (Phylogenetic tree)이다.
도 2는 본 발명의 AB160062 균주의 성장곡선을 표준균주와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 AB160062 균주의 성장산도를 표준균주와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 AB160062 균주 배양액의 농도희석에 따른 스타필로코커스 아우레우스의 항균활성을 표준균주와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 AB160062 균주 배양액의 농도희석에 따른 스타필로코커스 에피더미디스의 항균활성을 표준균주와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 AB160062 균주 배양액의 농도희석에 따른 프로피오니박테리움 아크네스의 항균활성을 표준균주와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 AB160062 균주 배양액과 에센스의 배합물의 여드름균 억제 활성을 나타내는 사진이다.

이하, 실시예에 따라 본 발명을 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

실험방법: 미생물 배양 및 분리동정

(1) 신규 유산균의 분리

먼저 항균활성을 나타내는 유산균 균주를 분리하기 위해 국내에서 제조, 판매되는 김치, 간장 및 된장을 포함하는 발효제품으로부터 다양한 유산균을 분리하였다. 2% 아가 (agar)이 포함된 하기 표 1의 성분을 갖는 MRS 고체배지를 사용하고, 10배 희석법으로 유산균을 분리하였다.

MRS 배지 성분	함량 (g/L)
박토펩톤	10
소고기 추출물	10
효모추출물	5
글루코스	20
트윈80	1
구연산	2
제2 인산칼륨	2
초산나트륨	5
황산망간	0.1
황산마그네슘	0.05

생성된 각각의 콜로니를 MRS 아가 플레이트에 획선 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 분리한 유산균을 멸균한 MRS 액체배지에 접종하고 37℃에서 24시간 정치배양 한 다음, 20%(v/v) 글리세롤을 가하고 -80℃ 초저온냉동고에 보관하고, 후속하는 실험에 이용하였다.

(2) 여드름 원인균 및 피부상재균의 배양

상기 분리한 유산균 중에서 여드름원인균 및 다른 피부상재균의 생육을 저해하는 유산균을 선별하였다. 먼저 피부트러블의 원인균인 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus, KCCM11335), 스타필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis, KCCM40416), 및 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionicbacterium acenes, KCCM41747)를 한국종균협회로부터 입수하여, 하기 표 2의 조성의 고체영양배지에서 배양하였다. 생성된 각각의 콜로니를 다시 액체영양배지에 접종하고 37℃에서 24시간 정치배양 한 다음, 20% 글리세롤 가한 후 -80℃ 초저온냉동고에 보관하였다. 실험에 사용한 TSB (Tryptic Soy Broth) 및 RCM (Reinforced Clostridial Medium) 배지는 Difco사에서 입수하였다.

병원균	영양배지
스타필로코커스 아우레우스	TSB (Tryptic Soy Broth)
스타필로코커스 에피더미디스	TSB (Tryptic Soy Broth)
프로피오니박테리움 아크네스	RCM (Reinforced Clostridial Medium)

(3) 항균활성을 갖는 유산균 동정

먼저, 항균활성을 갖는 것으로 선별된 유산균을 MRS 평판배지 (상기 표 1의 배지 조성)에 배양하고, 콜로니의 외형적 특징을 현미경 (제조사)으로 관찰 하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

구분	외형적 특징
모양	원형
크기	1-1.5mm
색	흰색
불투명도	불투명
융기	돌출
표면	매끄러움

다음, 16s rRNA를 통해 유산균을 동정하였다. 그 결과 본 발명의 균주가 서열목록 1의 16s rRNA 염기서열을 갖는 것으로 확인되었다. 이를 기초로 계통수 연구한 결과, 분리된 균주는 락토바실러스 파라플란타룸 (Lactobacillus paraplantarum)과 유사도를 나타내어 락토바실러스 파라플란타룸 종에 속하는 락토바실러스 파라플란타룸 AB160062 균주로 명명하였다. 본 균주는 2016년 09월 12일로부터 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국 미생물 보존센터에 기탁하여 기탁번호 KCCM11893P를 부여받았다 (도 1).

(4) 선발된 유산균주의 배양특성

본 발명에서 선별된 유산균을 멸균된 MRS 액체배지에 접종하여 30℃에서 정치배양하면서 탁도 (OD625 ㎚)와 산도 (pH)의 변화를 관찰하였다. 균주의 성장곡선 및 산도 변화를 각각 도 2, 도 3에 나타내었다.

실시예

실시예 1: 유산균의 항균 및 항진균 활성

국내에서 시판 중인 김치, 간장 및 된장을 포함하는 발효제품으로부터 2,000여종의 균주를 분리하고, 이들의 항균활성을 확인하였다. 이를 위해, 먼저 MRS 고체배지에 -80℃에서 보관중인 분리 균주를 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 배양한 후 콜로니를 취해 PBS 500 ㎕에 현탁하여 유산균 현탁액을 제조하였다. 다음, 배양액을 4,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 균체를 제거한 후 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 배양액을 제조하였다. 제조된 배양액은 -80℃, 5mTorr (토리첼리, 진공단위) 조건에서 동결건조하여 유산균 배양액 동결건조 분말을 제조하였다. 다음, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus, KCCM11335), 스타필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis, KCCM40416), 및 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionicbacterium acenes, KCCM41747)과 같은 피부트러블 원인균을 상기 실험방법에 기술한 것과 같은 조성의 생육 영양배지에 접종하고 24시간 배양하였다. 다음, 상기 피부트러블 원인균용 중층배지를 제조하였다. 이를 위해, 미리 멸균처리하여 55℃로 온도를 낮춰놓은 MRS 함유 소프트아가배지 (1% 아가)에, 상기 피부트러블 원인균 배양액을 1%(v/v) 접종하였다. 상기 피부트러블 원인균이 접종된 소프트아가배지를 일회용 페트리접시에 옮긴 후 식혀 중층배지를 제조하였다.

상기 수득한 평판배지 위에 멸균된 8 ㎜ 종이디스크를 올려놓고, 상기 제조한 유산균 현탁액을 50 ㎕씩 점적한 후, 37℃에서 배양하였다. 24시간 배양 후, 각 유해균에 대한 생육억제환 (clear zone)의 지름으로 항균활성을 측정하였다. 생육억제환의 크기에 따라, 8 ㎜ 이상: +, 13 ㎜ 이상: ++, 15 ㎜ 이상: +++, 및 17 ㎜ 이상 ++++로 표기하였다. 3종의 유해균에 대해 가장 우수한 항균활성을 나타내는 균주를 선별하였다. 표 5는 본 실시예에서 선별된 신규 유산균 균주 AB160062의 활성을 나타낸 것이다.

병원균	본 발명의 AB160062 저해환 크기
스타필로코커스 아우레우스	++
스타필로코커스 에피더미디스	++
프로피오니박테리움 아크네스	++++

실시예 2: 최소저해농도 ( MIC , Minimum Inhibitory Concentration)

최소저해농도 (MIC)측정은 표준참고방법 (Weigand et al. Nat Protoc. 2008)에 따라 수행하였다. 상세하게는, S. aureus 및 S. epidermidis는 멸균된 시험용 고체영양배지 (MHB, Muller Histon Broth, Difco)에, P. acnes 영양배지 (BHI, Brain Heart Infusion, Difco)에 각각 접종하고, 37℃로 24시간 배양한 다음, 멸균된 액체배지에 다시 접종하였다. 이어서, 상기 실험방법에 따라 제조한 유산균 배양액을 상기 유해균이 접종된 액체배지에 가한 다음, 37℃에서 24시간 배양한 후 배양액의 혼탁여부를 측정하였다. 상기 실험방법에 따라 배양한 유산균 배양액을 균제를 제거하고 동결건조하여 준비한 후, 이를 3차 증류수에 용해시켜 사용하였다. 농축 배양액을 연속하여 2배씩 희석하면서 실험을 수행하였으며, 육안 관찰을 통해 피부트러블 원인균의 성장을 저해하는 가장 낮은 배양액 농도를 확인하였다. 항균활성은 3회 반복 실시하였으며, 최소 저해농도 측정을 위해 마이크로플레이트 스펙트로포토미터 (microplate spectrophotometer) (아머샴바이오사이언스)를 사용하여양 배양액의 흡광도 (OD620 ㎚)를 측정하였다 (표 6 참조, 도 4 내지 6). 특히, 본 발명의 AB160062는 여드름 원인균인 P.acnes에 대해 매우 높은 억제활성을 보였다.

구분	병원균	Minimum Inhibitory Concentration (mg/ml)
구분	병원균	본 발명의 AB160062
G(+)	S. aureus	6.25
G(+)	S. epidermidis	12.5
G(+)	P. acnes	12.5

실시예 3: 항균 활성에 대한 열 안정성 확인

본 발명의 유산균 배양액이 갖는 항균활성이 열에 대한 안정성을 갖는지 확인하였다. 상기 실시예와 동일한 방법으로 제작한 농축 배양액을 각각 비열처리, 열처리 그룹으로 나눠 항균 활성을 보이는 최소 저해농도를 측정하였다. 열처리 실험은 80℃ 항온수조에 30분 및 121℃ 15분 열처리한 배양액을 이용하여 실험하였다. 실험 결과는 하기 표 7과 같다.

구분	병원균	Minimum Inhibitory Concentration(mg/ml)
		락토바실러스 파라플란타룸 AB160062
		비 열처리	80℃, 30분	121℃, 15분
G(+)	S. aureus	6.25	6.25	6.25
G(+)	S. epidermidis	12.5	12.5	12.5
G(+)	P. acnes	12.5	12.5	12.5

실시예 4: 유산균 배양액 함유 화장료의 제조

화장품에서 보편적으로 사용되는 조성의 에센스 베이스 (프리미엄 네추럴 에센스, 에코펙토리)를 입수하고, 본 발명의 유산균 배양액과 혼하한 후 여드름 원인균에 대한 항균활성 실험을 수행하였다. 실험결과 에센스 베이스와 유산균 배양액의 조합에서 여드름균의 생육 억제환이 관찰되었다 (도 7).

본 발명의 신규한 유산균 및 이의 배양액은 피부질환관 관련된 유해균인 S. aureus , S. epidermidis 및 P. acnes에 대해 높은 억제 활성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 유산균 또는 이의 배양액은 민감성 피부의 개선을 위한 화장료 조성물을 제조하는데 이용될 수 있다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11893P

20160912

<110> AmtixBio Co., Ltd <120> A novel Lactobacillus paraplantarum strain and the use thereof <130> AMTIX16P-04-KR <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1466 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus paraplantarum AB160062 16s rRNA <400> 1 taatacatgc aagtcgaacg aactctggta ttgattggtg cttgcatcat gatgtacatt 60 tgagtgagtg gcgaactggt gagtaacacg tgggaaacct gcccagaagc gggggataac 120 acctggaaac agatgctaat accgcataac aacttggacc gcatggtccg agtttgaaag 180 atggcttcgg ctatcacttt tggatggtcc cgcggcgtat tagctagatg gtgaggtaac 240 ggctcaccat ggcaatgata cgtagccgac ctgagagggt aatcggccac attgggactg 300 agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccacaa tggacgaaag 360 tctgatggag caacgccgcg tgagtgaaga agggtttcgg ctcgtaaaac tctgttgtta 420 aagaagaaca tatctgagag taactgttca ggtattgacg gtatttaacc agaaagccac 480 ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggatttat 540 tgggcgtaaa gcgagcgcag gcggtttttt aagtctgatg tgaaagcctt cggctcaacc 600 gaagaagtgc atcggaaact gggaaacttg agtgcagaag aggacagtgg aactccatgt 660 gtagcggtga aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg gcgaaggcgg ctgtctggtc 720 tgtaactgac gctgaggctc gaaagtatgg gtagcaaaca ggattagata ccctggtagt 780 ccataccgta aacgatgaat gctaagtgtt ggagggtttc cgcccttcag tgctgcagct 840 aacgcattaa gcattccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctgaaactca aaggaattga 900 cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagctacgcg aagaacctta 960 ccaggtcttg acatactatg caaatctaag agattagacg ttcccttcgg ggacatggat 1020 acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1080 gagcgcaacc cttattatca gttgccagca ttaagttggg cactctggtg agactgccgg 1140 tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct 1200 acacacgtgc tacaatggat ggtacaacga gttgcgaact cgcgagagta agctaatctc 1260 ttaaagccat tctcagttcg gattgtaggc tgcaactcgc ctacatgaag tcggaatcgc 1320 tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380 gtcacaccat gagagtttgt aacacccaaa gtcggtgggg taacctttta ggaaccagcc 1440 gcctaatggg tggatcaggg tttggg 1466

Claims

피부 유해균인 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis) 및 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionicbacterium acenes)에 대한 항균활성을 갖는 락토바실러스 파라플란타룸 (Lactobacillus paraplantarum) AB160062 (기탁번호: KCCM11893P) 균주.
제 1항의 락토바실러스 파라플란타룸 (Lactobacillus paraplantarum) AB160062 균주의 배양물.
제 1항의 균주 또는 제 2항의 배양물을 함유하는, 여드름 예방 및 개선용 화장료 조성물.
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