KR101837865B1 - 수피 특이적 프로모터 및 이의 활용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물체의 수피 특이적 프로모터, 상기 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자를 포함하는, 목적 유전자의 식물체 수피 특이적 발현 카세트, 상기 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 세균 및 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 식물체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 재조합 벡터를 이용한, 수피 특이적으로 목적 유전자를 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법, 상기 형질전환 식물체에서 목적 유전자를 발현시켜 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 프로모터 및 게이트웨이(gateway) 카세트를 포함하는, 목적 유전자의 식물체 수피 특이적 발현 카세트 제조를 위한 목적 유전자 도입용 카세트, 상기 도입용 카세트를 포함하는 목적 유전자 도입용 벡터, 및 상기 도입용 벡터를 이용하여 목적 유전자의 수피 특이적 발현 벡터를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

수피 특이적 프로모터 및 이의 활용 {A bark-specific promoter and uses thereof}

본 발명은 식물체의 수피 특이적 프로모터, 상기 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자를 포함하는, 목적 유전자의 식물체 수피 특이적 발현 카세트, 상기 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 세균, 및 상기 발현벡터에 의해 형질 전환된 식물체에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터를 이용한, 수피 특이적으로 목적 유전자를 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법, 및 상기 형질전환 식물체에서 목적 유전자를 발현시켜 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 프로모터 및 게이트웨이(gateway) 카세트를 포함하는, 목적 유전자의 식물체 수피 특이적 발현 카세트 제조를 위한 목적 유전자 도입용 카세트, 상기 도입용 카세트를 포함하는 목적 유전자 도입용 벡터, 및 상기 도입용 벡터를 이용하여 목적 유전자의 식물체 수피 특이적 발현 벡터를 제조하는 방법에 관한 것이다.

수피(bark)는 목본식물의 줄기와 뿌리의 가장 바깥쪽에 위치하는 층이다. 내피(inner bark) 와 외피(outer bark)로 구분할 수 있는데, 내피는 살아있는 세포로 구성되어 있으나 외피는 죽은 세포들로 수베린(suberin)이 많은 주피(periderm), 피층(cortex), 체관조직(phloem) 이 여러 층으로 축적된, 흔히 볼 수 있는 코르크(cork)화 된 매우 두꺼운 껍질이다. 수피는 목본식물 전체 무게의 약 10~20%를 차지하며, 다양한 바이오폴리머(biopolymer), 탄닌(tanin), 리그닌(lignin), 수베린, 탄수화물을 포함하고 있다. 리그닌은 셀룰로오스와 같은 다당류와 결합하여 구조적인 지지 역할을 하며, 또한 구아실(Guaiacyl) 리그닌 모노머(monomer)의 비율이 높아서 곰팡이의 분해로부터 수피를 보호한다. 수피에 고농도로 존재하는 농축 탄닌(condensed tanin)과 수베린은 수피의 분해/부패를 방지하여 결국 기생충의 침입, 질병, 초식동물로부터 식물을 보호하게 된다.

생명공학을 이용한 형질전환 식물체 개발 기술은 작물의 성장과 발달에 필요한 유용한 형질을 용이하게 도입할 수 있어서 매우 중요하며, 이때 유용 형질을 결정하는 유전자의 발현 양상은 특정 ‘프로모터’에 의해 조절된다. ‘프로모터’란 유전자의 전사 개시점(transcription initiation point)의 상류(upstream)에 위치하여, 해당 유전자의 전사 개시와 빈도 등 발현 정도와 패턴을 결정하는 DNA 영역을 의미한다. 프로모터에 의한 전사 개시는, RNA 중합효소, RNA 중합효소를 활성화하는 특정 전사조절 인자(transcription factor)들과 기본적인 전사 복합체(basal transcription complex)가 함께 프로모터 염기서열에 결합함으로써 이루어진다. Cauliflower Mosaic Virus에서 유래한 35S 프로모터는 식물의 모든 조직에서 항상적으로 유전자를 발현시키는 프로모터로서, 식물 형질전환체 개발에서 가장 많이 사용되고 있다. 그러나 이 35S 프로모터를 사용하여 외래 유용 유전자를 모든 조직에서 항상적으로 발현시키는 경우, 종종 식물의 비정상적인 생장을 유발할 수 있음이 잘 알려져 있다. 따라서 외래 유용 유전자를 목적에 따라 발현을 조절할 수 있는, 즉, 조직, 발달단계, 또는 환경 특이적인 제어 기술이 절실하다.

만일 수피 특이적으로 외래 유전자 발현을 조절할 수 있으면 다음과 같은 두 가지 측면에서 생명공학적 활용이 가능하다. 첫째, 유용한 바이오폴리머 또는 이차대사산물 생합성 유전자의 발현으로 필요한 대사산물의 대량 생산 및 축적을 할 수 있고, 수피 특성상 수확이 용이하다. 둘째, 병해충, 균류에 대한 저항성 유전자 등의 발현으로 식물을 보호하여 생산성 증진이 가능하다.

본 발명은 외래 유전자의 발현을 식물체의 줄기 수피에서 특이적으로 발현시킬 수 있는 프로모터, 이 프로모터를 포함하는 발현 벡터, 이 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명자들은 이전의 연구를 통하여 체관부 특이적 프로모터 (대한민국 공개특허 제 2016-0087487호), 목질부 특이적 프로모터 (대한민국 공개특허 제 2016-0087488호), 형성층 특이적 프로모터 (대한민국 공개특허 제 2016-0087489호)를 개발한 바 있다. 그러나, 수피 특이적 프로모터에 대해서는 아직까지 알려진 바 없었다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 포플러 (Populus trichocarpa)의 여러 조직(정단분열조직, 잎, 수피, 체관조직, 형성층, 도관형성조직, 목부조직 등)을 분리한 후 유전자칩 분석을 통해 수피에서만 특이적이며 강력한 발현을 보이는 유전자를 동정하였고 이의 프로모터를 발굴함으로써, 중요 형질을 결정하는 유전자를 여러 식물체에 형성층 특이적으로 도입할 수 있는 시스템을 확립하고자 하였다. 이 과정에서 포플러 Potri.001G220900 유전자의 프로모터를 확보하여 이를 포함하는 발현벡터를 제조한 후 이를 애기장대 식물과 포플러에 도입하여 형질전환시킨 형질전환체에서 줄기의 수피 조직 특이적으로 GUS 리포터 유전자가 발현됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명에서 개발된 프로모터는 월등한 수피 특이성과 강력한 발현을 유도할 수 있다.

본 발명의 하나의 목적은 식물체의 수피 특이적 프로모터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자를 포함하는, 목적 유전자의 식물체 수피 특이적 발현 카세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로모터 및 게이트웨이 카세트를 포함하는, 목적 유전자의 식물체 수피 특이적 발현 카세트 제조를 위한 목적 유전자 도입용 카세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 도입용 카세트를 포함하는 목적 유전자 도입용 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터를 포함하는 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 목적 유전자 도입용 벡터를 이용하여, 목적 유전자의 식물체 수피 특이적 발현 벡터를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터를 이용한, 수피 특이적으로 목적 유전자를 발현하는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 식물체에서 목적 유전자를 발현시켜 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 식물체의 수피 특이적 프로모터를 제공한다.

본 발명에서 용어, "수피"란, 목본식물의 줄기와 뿌리의 가장 바깥쪽에 위치하는 층이다. 내피(inner bark) 와 외피(outer bark)로 구분할 수 있는데, 내피는 살아있는 세포로 구성되어 있으나 외피는 죽은 세포들로 수베린(suberin)이 많은 주피(periderm), 피층(cortex), 체관조직(phloem) 이 여러 층으로 축적된, 흔히 볼 수 있는 코르크(cork)화 된 매우 두꺼운 껍질이다.

본 발명에서 용어, "수피 특이적"이란, 다른 조직에 비해 수피에서 유전자 발현 수준이 높은 것을 의미하며, 유전자가 다른 조직에서는 발현 수준이 낮으나 수피에서는 상대적으로 높게 발현되는 것일 수 있고, 바람직하게는 다른 조직에서는 유전자가 발현되지 않고 수피에서만 발현되는 것일 수 있다.

본 발명에서의 용어, "프로모터(promoter)"란, 일반적으로 전사를 개시하는 지점을 포함하는 암호화 부위의 상류 쪽에 위치하는 유전자 부위로, 흔히 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자 발현을 촉진하는 인핸서 등으로 이루어져 있다. 또한, 이러한 프로모터 중에는 모든 조직에서 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 시간 또는 위치 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터가 있으며, 구체적으로 본 발명에 따른 프로모터는 식물에서 수피 특이적으로 발현하는 PtrBP3 프로모터이다.

상기 PtrBP3 프로모터는 본 발명자들이 포플러에서 동정한 프로모터로서, 수피 조직에 특이적임과 동시에 수피에서 특이적으로 발현되기를 원하는 목적 유전자의 발현을 크게 증가시킬 수 있다. 구체적으로 상기 PtrBP3 프로모터는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 서열번호 3으로 기재한 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 가장 구체적으로는 98% 이상의 유사성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서는 먼저 식물체의 수피에서 특이적으로 발현되는 유전자를 발견하여, 상기 유전자의 프로모터를 동정하였으며, 상기 프로모터 서열 및 프로모터 하류(downstream)에 작동 가능하도록 연결된 목적 유전자의 서열이 포함된 재조합 발현 벡터를 제작하고, 이를 통해 형질전환된 식물 형질전환체에서 수피 특이적으로 목적 유전자가 발현되는 것을 확인함으로써 발명을 완성하였다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 포플러 유래의 Potri.001G220900 유전자(도 5, 서열번호 1 및 서열번호 2)가 포플러의 수피 특이적으로 발현되는 것을 확인하고(도 1 내지 도 4), 상기 유전자의 상류에 위치하는 수피 특이적 프로모터(PtrBP3 promoter)의 서열(서열번호 3)을 동정하였다. 상기 PtrBP3 프로모터는 하류(downstream)에 위치한 목적 유전자를 식물체의 수피 특이적으로 발현시킬 수 있다.

본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는 상기 PtrBP3 프로모터 서열(서열번호 3) 및 GUS 리포터 유전자를 포함하는 PtrBP3::GUS 발현 벡터를 이용하여 형질전환 애기장대를 제조하였고, 상기 형질전환 애기장대의 모든 기관에서 수피 특이적으로 GUS가 발현되는 것을 확인하였으며, 또한 같은 PtrBP3::GUS 발현 벡터로 제조한 형질전환 포플러에서도 수피 특이적 GUS 발현을 확인하였다(도 7). 이러한 수피 특이적인 유전자 발현은 식물체의 내?외부 스트레스(도 9 및 도 10)에 영향을 받지 않는다는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 식물체 수피 특이적 프로모터는 목적에 따라 원하는 유전자를 식물체의 수피 특이적으로 발현시키는데 유용하게 이용될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자를 포함하는, 목적 유전자의 식물체 수피 특이적 발현 카세트(cassette)를 제공한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 프로모터 및 게이트웨이(gateway) 카세트를 포함하는 목적 유전자의 식물체 수피 특이적 발현 카세트 제조를 위한 목적 유전자 도입용 카세트를 제공한다.

프로모터 및 식물체의 수피 특이적 유전자 발현에 대하여는 상기 설명한 바와 같다.

본 발명에서 "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 숙주 세포 내에서 숙주 세포의 작용에 의해 조절 요소들이 인코딩 서열의 발현을 지시할 수 있도록 하는 배치(들)로 코딩 서열에 대한 전사 및 임의의 번역 조절 요소들이 인코딩 서열에 공유 부착된 임의 구조를 나타낸다.

본 발명에서 용어, "카세트"는 특정 유전자가 뉴클레오티드 서열에 존재하는 하나 이상의 조절 서열들에 작동 가능하게 연결되도록 삽입되는 경우 삽입된 유전자를 발현할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 따라서, "발현 카세트"는 목적 유전자를 포함할 수 있으며 본 발명의 발현 카세트들은 수피 특이적으로 목적 유전자들의 발현을 촉진하는데 유용하다. 또한, 본 발명의 카세트는 목적 유전자를 용이하게 도입할 수 있도록 게이트웨이(gateway) 카세트 서열을 포함할 수 있다. 이러한 카세트는 본 발명에 따르면 "도입용 카세트"를 나타낸다.

본 발명에 따르면, 상기 카세트는 PtrBP3 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 목적 유전자를 포함할 수 있다. 또한 하나의 프로모터 또는 동일한 수 개의 프로모터가 세포 내에서 단백질을 인코딩하는 둘 이상의(즉, 상이한) 유전자들에 작동 가능하게 연결될 수 있다.

본 발명에서, 용어 "목적 유전자"는 세포 내에서 목적 단백질을 생산하기 위하여 도입될 수 있으며 상기 목적 단백질을 인코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 목적 유전자 또는 목적 단백질은 형질전환 식물체에서 활용하고자 하는 목적에 따라 달라질 수 있으며, 식물체 내에서 발현될 수 있는 유전자 또는 단백질이라면 어떠한 것이라도 무방하다. 즉, 본 발명의 특징은 식물체의 수피 특이적 발현 프로모터에 있으므로 목적 유전자 또는 목적 단백질은 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 상기 목적 단백질은 기준 세포(야생형 세포)에 비해 더 많은 정도로 발현 되며, 바람직하게는 수피에서 특이적으로 발현될 수 있다.

한편, 상기 게이트웨이 발현 시스템은 엔트리벡터와 목적벡터로 구성되며, 구체적으로 상기 엔트리벡터는 목적 유전자의 양말단에 attL1, attL2를 갖는 벡터이며, 목적벡터는 attR1, attR2를 포함하는 벡터이다. 상기 엔트리벡터와 상기 목적 벡터는 재조합효소에 의해 LR 반응을 일으키며, 목적벡터의 attR1과 attR2를 엔트리벡터의 attL1과 attL2로 치환하게 된다. 이 과정에서 엔트리벡터에 포함되어 있던 목적 유전자가 목적벡터로 전달되게 된다.

본 발명에 있어서, "게이트웨이 카세트"는 목적 유전자 도입용 벡터를 제조할 수 있는 카세트로서, 제조하거나 시판되는 것을 이용할 수 있다. 특히 attR1, ccdB 및 attR2 서열을 포함하는 카세트일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 게이트웨이 카세트 중 시판되는 "attR1-CmR-ccdB-attR2" 카세트는 재조합(recombination)되는 25bp의 서열(attR1, attR2), 클로람페니콜 저항 유전자(CmR), 독소유전자(ccdB; clever gene, F plasmid의 유전자로서 독소로서 작용하는 유전자이다. 따라서 ccdB에 의해 죽지 않는 특수한 박테리아를 사용하여서 증폭하고 필요없을시 일반 박테리아로 ccdB를 가지는 박테리아를 죽일 수 있게 만든다)로 이루어진다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 도 6에서 보이는 바와 같이, PtrBP3 프로모터의 수피 특이적 유전자 발현을 확인하기 위하여 카나마이신(kanamycin) 또는 바스타(basta) 저항성 유전자, PtrBP3 프로모터, EGFP 및 GUS 리포터 유전자를 포함하는 발현 카세트를 제조하였다. 또한 도 12에서 보이는 바와 같이 목적유전자를 쉽게 도입할 수 있도록 카나마이신 또는 바스타 저항성 유전자, PtrBP3 프로모터 및 게이트웨이 카세트를 포함하는 목적 유전자 도입용 카세트를 제조하였다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 도입용 카세트를 포함하는 목적 유전자 도입용 벡터를 제공한다.

발현 카세트 및 도입용 카세트는 상기에서 설명한 바와 같다.

상기 재조합 발현 벡터는 상기 발현 카세트를 포함하여 식물체에 도입되어 목적 유전자가 코딩하는 단백질을 생산할 수 있는 벡터이며, 구체적으로는 형질전환 식물체의 수피 특이적으로 목적 유전자가 코딩하는 단백질을 생산할 수 있는 벡터이다. 또한 상기 목적 유전자 도입용 벡터는 상기 도입용 카세트를 포함하여 위치 특이적 재조합(site-specific recombination)을 통해 목적 유전자를 도입하기 용이하게 함으로써 재조합 발현 벡터를 제조할 수 있도록 하는 벡터이다.

상기 발현 벡터 또는 도입용 벡터는 목적 유전자를 도입하여 식물체 내에서 발현시키기 위해 당업계에서 평균적인 기술을 가진 자가 이용할 수 있는 것이라면 어떠한 벡터를 기본 골격(backbone)으로 사용하더라도 무방하며, 이에 제한되지는 않으나 pK2GW7,0, pB2GW7,0, pKGWFS7,0 또는 pBGWFS7,0을 기본 골격으로 하는 것일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 pKGWFS7,0 또는 pBGWFS7,0 벡터에 SacI 및 SpeI 제한효소를 이용하여 PtrBP3 프로모터를 도입함으로써 재조합 발현 벡터인 PtrBP3-pKGWFS7,0 및 PtrBP3-pBGWFS7,0을 제조하였다(도 6). 또한 pK2GW7,0 또는 pB2GW7,0 벡터에 SacI 및 SpeI 제한효소를 이용하여 목적 유전자 도입용 벡터인 PtrBP3-pK2GW7,0 및 PtrBP3-pB2GW7,0을 제조하였다(도 12).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터를 포함하는 세균을 제공한다.

재조합 발현 벡터에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.

상기 세균은 재조합 벡터를 식물체에 도입하여 형질전환 식물체를 제조할 수 있는 것이라면 모두 사용 가능하며, 바람직하게는 아그로박테리움일 수 있고, 더욱 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시언스(Agrobacteriumtumefaciens)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "아그로박테리움"은 그람양성의 세균으로 식물의 뿌리나 줄기의 상처를 통해 식물세포에 감염되어, 자신이 가지고 있는 유전자를 식물 세포의 유전체에 삽입하여 식물세포의 형질전환을 일으키는 암종 세균의 일종이다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 식물체를 제공한다.

재조합 발현 벡터에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "형질전환"이란, DNA를 숙주에 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 구체적으로 본 발명에서는 상기 재조합 발현 벡터를 숙주에 도입하는 것을 의미할 수 있다.

본 발명에서 용어, "식물체"는 수피 특이적으로 목적 유전자를 발현시키기 위해 선택되는 것으로 세포벽이 있고 엽록소가 있어 독립영양으로 광합성을 하는 생물이라면 식물체의 종에 특별히 제한되는 것은 아니다. 또한, "형질전환 식물체"는 숙주로서 상기 식물체를 사용하여 형질전환시킨 식물체를 의미한다.

본 발명에서 숙주세포로의 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떠한 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 식물에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이러한 방법에는 전기충격 핵산분자 전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘 침전, 염화칼슘 침전, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반, 아그로박테리아로 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트 리포멕타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나, 이로 제한되지 않으며, 아그로박테리아로 매개된 형질전환법이 바람직하다.

또한, 구체적으로 본 발명에 따른 형질전환 식물은 상기 PtrBP3 프로모터 및 목적 유전자가 도입되어 발현될 수 있는 식물이라면, 초본 및 목본 식물 모두 제한 없이 포함될 수 있다.

또한, 구체적으로 초본 식물은 오리자 사티바(OryzaSativa; 벼), 제아 메이즈(Zeamays; 옥수수), 미스칸투스(Miscanthus) 종 또는 페니세툼 풀푸레움(Pennisetumpurpureum) 등일 수 있으며, 목본 식물은 유칼립투스(Eucalyptus) 종(예를 들면 E. alba, E. albens, E. amygdalina, E. aromaphloia, E. baileyana, E. balladoniensis, E. bicostata, E. botryoides, E. brachyandra, E. brassiana, E. brevistylis, E. brockwayi, E. camaldulensis, E. ceracea, E. cloeziana, E. coccifera, E. cordata, E. cornuta, E. corticosa, E. crebra, E. croajingoleisis, E. curtisii, E. dalrympleana, E. deglupta, E. delegatensis, E. delicata, E. diversicolor, E. diversifolia, E. dives, E. dolichocarpa, E. dundasii, E. dunnii, E. elata, E. erythrocoiys, E. erythrophloia, E. eudesmoides, E. falcata, E. gamophylla, E. glaucina, E. globulus, E. globulus subsp. bicostata, E. globulussubsp. globulus, E. gongylocarpa, E. grandis, E. grandis×urophylla, E. guilfoylei, E. gunnii, E. hallii, E. houseana, E. jacksonii, E. lansdowneana, E. latisinensis, E. leucophloia, E. leucoxylon, E. lockyeri, E. lucasii, E. maidenii, E. marginata, E. megacarpa, E. melliodora, E. michaeliana, E. microcorys, E. microtheca, E. muelleriana, E. nitens, E. nitida, E. obliqua, E. obtusiflora, E. occidentalis, E. optima, E. ovata, E. pachyphylla, E. pauciflora, E. pellita, E. perriniana, E. petiolaris, E. pilularis, E. piperita, E. platyphylla, E. polyanthemos, E. populnea, E. preissiana, E. pseudoglobulus, E. pulchella, E. radiata, E. radiata subsp. radiata, E. regnans, E. risdoni, E. robertsonii, E. rodwayi, E. rubida, E. rubiginosa, E. saligna, E. salmonophloia, E. scoparia, E. sieberi, E. spathulata, E. staeri, E. stoatei, E. tenuipes, E. tenuiramis, E. tereticornis, E. tetragona, E. tetrodonta, E. tindaliae, E. torquata, E. umbra, E. urophylla, E. vernicosa, E. viminalis, E. wandoo, E. wetarensis, E. willisii, E. willisiisubsp. falciformis, E. willisiisubsp. willisii, E. woodwardii), 포플러스(populus) 종 (예를 들면, P. alba, P. alba×P. grandidentata, P. alba×P. tremula, P. alba×P. tremulavar. glandulosa, P. alba×P. tremuloides, P. balsamifera, P. balsamiferasubsp. trichocarpa, P. balsamifera subsp. trichocarpa×P. deltoides, P. ciliata, P. deltoides, P. euphratica, P. euramericana, P. kitakamiensis, P. lasiocarpa, P. laurifolia, P. maximowiczii, P. maximowiczii×P. balsaferasubsp. trichocarpa, P. nigra, P. sieboldii×P. grandideiztata, P. suaveolens, P. szechuanica, P. tomentosa, P. tremula, P. tremula×P. tremuloides, P. tremuloides, P. wilsonii, P. canadensis, P. yunnanensis), 침엽수(예를 들면, loblolly pine(Pinustaeda), slash pine(Pinuselliotii), ponderosa pine(Pinusponderosa), lodgepole pine(Pinus contorta), Monterey pine(Pinusradiata); Douglas-fir(Pseudotsuga menziesii); Western hemlock(Tsugacanadensis); Sitka spruce(Piceaglauca); redwood(Sequoia sempervirens); silver fir(Abiesamabilis); balsam fir(Abies balsamea)) 및 삼나무(예를 들면 Western red cedar(Thujaplicata), Alaska yellow-cedar(Chamecyparis nootkatensis)) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

더욱 구체적으로는 초본 식물 중에서 애기장대일 수 있으며, 목본 식물 중에서 포플러일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서의 용어, "애기장대(Arabidopsisthaliana)란, 개화식물로서 십자화과(Bressicaceae)에 속하며 농업적인 중요성은 가지고 있지 않으나 현대 식물학에 있어 모델 식물로 널리 사용되고 있는 유전학과 분자생물학적 연구에 매우 중요한 식물이다. 본 발명에 따른 애기장대는 초본 식물의 대표 식물로서 사용될 수 있으며, 구체적으로 Arabidopsisthaliana, ecotype Columbia(Col-0)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "포플러(poplar)"란, 쌍떡잎식물 버드나무목 버드나무과 사시나무속에 속하는 식물의 총칭이다. 구체적으로 본 발명에서 포플러는 목본 식물의 대표 식물로서 사용될 수 있으며, Populus alba×P. tremula var. glandulosa일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 수피 특이적으로 목적 유전자의 발현을 유도할 수 있는 벡터(vector)를 설계하기 위해, 도 6의 모식도처럼 pKGWFS7,0 벡터 또는 pBGWFS7,0 벡터에서 35S 프로모터를 SacI 및 SpeI 제한효소를 사용하여 PtrBP3 프로모터(서열번호 3)로 교체하여 PtrBP3::GUS 구조체를 제작하였다. 이후 상기 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacteriumtumefaciens) 균주 C58에 도입하였고, 상기 균주를 이용하여 floral-dip method(Clough and Bent, 1998)와 leaf disk transformation-regeneration method(Horsch et al., 1985)에 따라 각각 애기장대(Arabidopsisthaliana, ecotype Columbia(Col-0))와 포플러(Populusalba×P. tremula var. glandulosa)를 형질전환시켰다.

구체적으로 본 발명에 따른 형질전환 식물은 목적 유전자의 과발현으로 식물체에서 원하는 단백질을 생산할 수 있도록 상기 PtrBP3 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 도입될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 도입된 유전자가 식물의 수피 특이적으로 발현되는지 확인하기 위해, 본 발명의 PtrBP3::GUS로 형질전환된 애기장대와 형질전환 포플러의각 기관을 분석하였다(도 7 및 도 8). 본 발명의 다른 일 실시예에서는 상기 유전자 발현이 식물의 내부 및 외부 스트레스에 따라 달라지는지 확인하기 위해, 각각의 스트레스에 따른 발현정도를 확인하였다(도 9 및 도 10). 그 결과 본 발명에 따른 형질전환 애기장대 및 형질전환 포플러에서 GUS 단백질은 모든 기관에서 수피 특이적으로 발현되었으며, 식물의 내부 및 외부스트레스와 관계없이 GUS를 발현하는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 PtrBP3 프로모터를 이용하여 목적 유전자를 식물의 수피 특이적으로 발현시킬 수 있어, 다양한 목적으로 농업 분야 등에 광범위하게 활용될 수 있음을 알 수 있었다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 목적 유전자 도입용 벡터의 게이트웨이 카세트에 위치 특이적 재조합(site specific recombination)을 이용하여 목적 유전자를 도입하는 단계를 포함하는, 목적유전자의 수피 특이적 발현 벡터의 제조방법을 제공한다.

상기 위치 특이적 재조합은 엔트리벡터와 목적벡터가 재조합효소에 의해 LR 반응을 일으킴으로써, 목적벡터의 attR1과 attR2가 엔트리벡터의 attL1과 attL2로 치환되는 것을 의미한다. LR 반응에 의해 엔트리벡터의 목적 유전자가 상기 도입용 벡터로 도입되고 목적벡터의 게이트웨이 카세트는 제거되어 목적 유전자를 포함하는 발현 벡터가 만들어 질 수 있다.

상기 재조합 효소는 DNA 이중나선에 특별히 상보성이 있는 작은 DNA 조각을 대체시켜 재조합하는 과정을 이루게 하는 효소로서 일반적으로 Recombinase(Excisionase, Integrase 라고도 한다)라고 하며, 예를 들어 Invitrogen 사의 LR clonase일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 방법에 의해 목적 유전자를 상기 도입용 벡터의 게이트웨이 카세트로 도입하여 목적 유전자를 수피 특이적으로 발현하는 발현 벡터를 용이하게 제조할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는, 수피 특이적으로 목적 유전자를 발현하는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 1) 상기 재조합 발현 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계; 및 2) 상기 형질전환된 식물체 수피(bark) 조직 내에서 목적 유전자를 발현시켜 목적 단백질을 생산하는 단계를 포함하는, 목적 단백질 생산 방법을 제공한다.

상기 PtrBP3 프로모터, 목적 단백질 및 형질전환 식물에 대해서는 전술한 바와 같으며, 상기 방법에 의해 본 발명의 형질전환 식물을 제조할 수 있고, 그에 따라 형질전환 식물체에서 목적 단백질을 생산할 수 있다.

구체적으로 상기 제조방법은 상기 형질전환 식물을 토양 또는 배지에서 재배하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 형질전환식물의 재배는 널리 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 재배 온도, 재배 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다.

사용되는 배지는 특정한 형질전환식물의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다. 배지의 형태로는 고체배지(solid medium), 액체배지(liquid medium), 이중배지(double layer medium)가 있으며, 이에 대한 성분으로는 물, 교질재료로서, 한천, 아가로스(agarose), 겔라이트(gelite) 등이 사용될 수 있다.

무기 영양소로는 15개의 원소, 즉 C, H, O, N, P, K, S, Ca, Mg, Fe, Mn, Cu, Zn, B 및 Mo 등이 형태에 구애받지 않고 첨가되며, 유기 영양소로는 탄수화물, 식물생장 조절물질, 비타민 등이 첨가되고, 아미노산류로는 미오-이노시톨, 글라이신, L-글루타민 등이 첨가될 수 있다.

탄소원으로는 글루코스, 프럭토스, 만노스, 리보오스, 자일로스, 수크로스, 멜리비오스, 셀로비오스, 락토오스, 아밀로스, 탄수화물, 라피노스, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤1 등이 첨가될 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 애기장대(Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia (Col-0)) 및 잡종 포플러 클론인 BH1(Populus alba × P. tremula var. glandulosa BH1)를 23℃의 생장실(16시간 빛/8시간 어둠)에서 토양에 재배하거나 또는 스크리닝을 위한 적당한 항생제 및 2% 수크로스를 포함한 half-strength MS-아가 배지(Murashige and skoog, Sigma)에서 재배하였다.

상기 제조방법에 의해 제조된 형질전환 식물은 목적 유전자를 수피 특이적으로 발현하여 목적 단백질을 생산할 수 있다.

본 발명의 식물체 수피 특이적 프로모터는 식물의 외적 및 내적인 환경 스트레스에 좌우되지 않고 월등한 수피 조직-특이성 및 강력한 발현을 유도할 수 있다.

도 1은 포플러에서 조직별 유전자 발현 분석을 위한 샘플링 모식도이다. A. 각 조직을 분리, 사용하기 위해 1년 동안 자란 포플러 줄기를 이용하였다. BP는 수피; DP는 체관조직; Ca는 형성층; DX는 도관형성조직 MX는 목질부조직이며, WS는 줄기 전체로 일종의 대조구로 사용되었다. B. SL은 주로 정단분열조직이다. C. ML은 잎맥을 제거한 성숙잎이다. B와 C는 목부를 형성하지 않는 대조구로 사용되었다.
도 2는 수피(BP)를 중심으로 한 포플러 조직별 전사체 발현 비교를 나타낸 것이다. 총 10 종류의 포플러 조직 전사체를 비교 분석하여 의미있게 발현이 변화하는 총 17,179 유전자들을 동정하였고, 이들을 수피(BP)를 중심으로 도식화 하였다. 즉, 수피에서 발현이 증가되는 유전자는 빨간색, 반면 감소되는 유전자는 파란색으로 나타내었다. SM은 여름 줄기, WN은 겨울 줄기를 의미한다.
도 3은 수피(BP)에 특이적으로 발현되는 유전자의 발현을 나타낸다. 총 10 종류의 포플러 조직 전사체를 비교 분석하여 의미있게 발현이 변화하는 총 17,179 유전자들 중에서, 수피(BP)에서 특이적으로 발현이 증가하는 유전자 총 245개를 생명정보학 방법을 이용하여 동정하였다. 아래 그림(signal intensity)은 각 조직별 유전자들의 발현량을 비교하여 도식화한 것이고, 위 그림은 유전자 발현량을 표준화시킨 값을 로그 스케일로 도식화한 것이다.
도 4는 수피(BP) 특이적인 Potri.001G220900.1 유전자의 조직별 발현 양상을 나타낸 것이다. 포플러 조직별 총전사체 분석을 한 결과로부터 Potri.001G220900.1 유전자의 발현을 도식화하였다. Ca는 cambium(형성층) 조직을 의미하며, 6DL, 6L, 6D은 각 상이한 빛 조건에서 키운 6일된 포플러 유식물, SL은 shoot apical meristem & young leaf(정단분열조직), YL은 young leaf(어린잎), ML은 mature leaf(성숙잎), BP는 bark & phloem (수피), DP는 developing phloem (체관), DX는 developing xylem(도관모세포), MX은 mature xylem(목질부), SM은 summer(여름시기의 줄기조직), WN는 winter(겨울시기의 줄기조직)을 각각 의미한다.
도 5는 수피(BP) 특이적인 PtrBP3(Potri.001G220900.1) 유전자의 유전정보로서, Phytozome(www.phytozome.net)에서 얻은 PtrBP3(Potri.001G220900.1) 유전자 정보이다. 상기 유전자는 Thaumatin의 패밀리 유전자이고 1개의 인트론이 존재함을 알 수 있다.
도 6은 본 발명에서 사용한 재조합 단백질 유전자 벡터 지도를 나타낸 것이다. PtrBP3 프로모터가 GUS 유전자의 위쪽에 위치하여 GUS 유전자 발현을 조절할 수 있도록 설계하였다. 벡터 골격(backbone)으로는 pKGWFS7,0와 pBGWFS7,0를 이용하였다. 이때 A는 카나마이신(kanamycin) 선별용으로 포플러 형질전환체 개발에 사용하였고, B는 바스타(basta) 선별용으로 애기장대 형질전환체 개발에 사용하였다.
도 7은 형질전환 애기장대(PtrBP3::GUS) 및 형질전환 포플러(PtrBP3::GUS) 식물체에서 수피 조직 특이적인 PtrBP3 프로모터의 활성을 확인한 것이다. A. PtrBP3::GUS 형질전환 애기장대 식물의 GUS 활성 염색실험 결과이다. 50일 동안 토양에서 자란 식물을 이용하였으며, 1번 그림은 아래쪽 줄기의 꽃이다. Ep는 epidermis(표피세포); Ph는 phloem(체관세포); IF는 interfascicular fiber(관다발사이의 섬유세포); Xy는 xylem(도관세포); Pi는 pith cells(수세포)를 가리킨다. B, PtrBP3::GUS 형질전환 포플러 식물의 GUS 활성 염색실험 결과이다. 60일 동안 토양에서 자란 식물을 이용하였다.
도 8은 형질전환 애기장대(PtrBP3::GUS) 유식물체의 발달 단계에 따른 PtrBP3 프로모터의 수피 특이적 활성을 확인한 것이다. A. 3일된 유식물. B. 5일된 유식물. 1번 그림은 전체 유식물 모양, 2번은 하배축과 떡잎 확대 그림이다. C. 7일된 유식물. 1번 그림은 떡잎과 생장점부위 확대 그림, 2번은 하배축이다. D. 10일된 유식물. 1번 그림은 전체 유식물 모양, 2번은 하배축 그림, 3번은 하배축 확대 그림이다.
도 9는 형질전환 애기장대(PtrBP3::GUS)에서 다양한 환경 스트레스에 따른 PtrBP3 프로모터의 수피 특이적 활성 변화를 확인한 것이다. 10일 자란 형질전환 애기장대(PtrBP3::GUS)에 저온(Cold), 건조(Drought), 염분(NaCl), 삼투압(Mannitol) 스트레스를 각각 처리한 후, PtrBP3 프로모터의 수피 특이적 활성의 변화를 조사하였다. Mock은 아무런 스트레스를 처리하지 않은 대조구이다.
도 10은 형질전환 애기장대(PtrBP3::GUS)에서 다양한 식물 호르몬 처리에 따른 PtrBP3 프로모터의 수피 특이적 활성 변화를 확인한 것이다. 10일 자란 형질전환 애기장대(PtrBP3::GUS)에 여러 종류의 식물 호르몬(IAA, Kinetin, ABA)를 12시간동안 각각 처리한 후, PtrBP3 프로모터의 수피 특이적 활성의 변화를 조사하였다. Mock은 아무런 호르몬을 처리하지 않은 대조구이다.
도 11은 형질전환 애기장대(PtrBP3::GUS)에서 다양한 스트레스와 식물 호르몬 처리에 따른 PtrBP3 프로모터의 수피 특이적 활성변화의 정량화 자료이다. 10일 자란 형질전환 애기장대(PtrBP3::GUS)에 저온(Cold), 건조(Drought), 염분(NaCl), 삼투압(Mannitol) 스트레스와 여러 종류의 식물 호르몬(IAA, Kinetin, ABA)를 12시간동안 각각 처리한 후, PtrBP3 프로모터의 수피 특이적 활성의 변화를 양적으로 정량하였다. Control은 아무런 처리를 하지 않은 대조구이다. 오차막대는 세 번 반복실험의 표준편차를 나타낸다.
도 12는 PtrBP3 프로모터를 이용한 재조합 유전자 벡터 지도이다. 기존의 pK2GW7,0 (kanamycin 선별용)와 pB2GW7,0 (basta 선별용) 벡터의 35S 프로모터를 PtrBP3 프로모터로 치환하여 PtrBP3-pK2GW7,0와 PtrBP3-pB2GW7,0 벡터를 각각 개발하였다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1 : 수피 특이적 발현 프로모터 스크리닝 및 형질전환 식물체 제조

1-1 수피 특이적 프로모터의 동정

본 발명자들은 식물체의 수피 조직에서 특이적으로 발현하는 유전자를 탐색하기 위해, 포플러 나무의 여러 조직(정단분열조직, 잎, 수피, 체관조직, 형성층, 도관형성조직, 목질부조직 및 줄기전체조직)을 분리한 후 각 조직에서 mRNA를 추출하였다(도 1).

이후 Affymetrix Poplar Genome Arrays를 이용해 각 조직 별 유전자 발현을 분석하였다. Poplar Genome Array에는 총 61,251개의 프로브셋이 있으며 이들은 총 57,423개의 유전자를 표지하는데, 이들 중에서 반복 존재하는 유전자를 제외하면, Poplar Genome Array로 총 41,558개의 포플러 유전자들의 발현 변화를 연구할 수 있다.

생명정보학 기법을 이용하여 포플러의 8개 조직(정단분열조직, 잎, 수피, 체관조직, 형성층, 도관형성조직, 목질부조직 및 줄기전체조직)과 여름과 겨울의 줄기 조직을 포함한 총 10개 조직의 전사체 분석을 수행하였고, 이 때 각 조직 별로 비교해서 발현이 의미있게 변화하는 총 17,179개의 유전자들을 동정하였다(도 2). 이러한 발현 변화 유전자 17,179개 중에서 수피에 특이적인 발현을 보이는 유전자 총 245개를 동정하였고(도 3), 이 중에서 가장 강한 발현을 보이는 상위 5개 유전자를 선별하여 해당 프로모터를 각각 클로닝하였다.

상기 프로모터는 각 유전자의 번역개시 코돈인 ATG 서열 앞쪽의 약 1.5 kb의 서열을 사용하였다. 각 프로모터의 식물체 내에서의 실질적인 수피 특이적인 활성을 조사하기 위해, GUS 유전자를 리포터로 하여 프로모터::GUS 유전자 재조합 발현벡터를 제조하였고, 이를 애기장대 식물과 포플러 나무에 도입하여 형질전환 식물체를 확보하였다.

상기 5개의 유전자 중에서도 특히, 포플러 Potri.001G220900.1 유전자의 프로모터는 수피 조직 특이적이며 매우 강한 유전자 발현을 보였다(도 4). 포플러의 각 조직에서의 Potri.001G220900.1 유전자의 발현을 살펴보면, 수피 세포에서 특이적이고 강력한 발현 피크를 보이며, 여름시기에 발현이 높고 겨울에는 발현이 낮음을 볼 수 있어서 활발한 생장시기에 이 유전자의 발현이 강함을 보여준다. 이 Potri.001G220900.1 유전자를 PtrBP3라 명명하였다.

상기 PtrBP3 유전자는 thaumatin 패밀리 단백질을 코딩하는 유전자로서(도 5, 서열번호 1 및 서열번호 2), 본 발명에서는 상기 프로모터의 활성을 집중적으로 조사하였다.

이를 위해 본 발명에서는 PtrBP3 프로모터에 GUS 리포터 유전자를 퓨전하여 제조한 벡터를 도입하여 형질전환 포플러 및 형질전환 애기장대를 제조하고, 상기 제조된 형질전환 식물체에서 GUS 유전자의 발현을 확인함으로써 PtrBP3 프로모터의 조직에 따른 활성 여부를 확인하였으며, 본 발명에 사용된 식물 표본 및 PtrBP3::GUS 형질전환 식물체의 구체적인 제조 방법은 하기와 같다.

1-2 식물 표본

애기장대(Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia (Col-0)) 및 잡종 포플러 클론인 BH1(Populus alba × P.tremula var. glandulosa BH1)을 형질전환 실험에 사용하였다. 23℃, 16시간 명/8시간 암 조건으로 MS-아가 배지 또는 토양에서 상기 식물을 배양하였다.

1-3 PtrBP3 프로모터::GUS 형질전환 식물체의 제조

Potri.001G220900.1을 암호화하는 유전자의 5' 말단의 게놈 단편(1499bp)을 PCR로 분리하고, PtrBP3::GUS 구조체를 생산하기 위해 pBGWFS7,0(애기장대 형질전환용) 또는 pKGWFS7,0(포플러 형질전환용)의 GUS 리포터 유전자 앞의 35S 프로모터를 PtrBP3 프로모터와 교체하는 방식으로 상기 게놈 단편을 삽입하였다. 교체한 PtrBP3 프로모터의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3과 같다.

제조한 각 벡터 구조체를 식물체 형질전환을 위하여 먼저 아그로박테리움 투메파시언스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 C58에 도입하였으며, 이를 통해 PtrBP3 프로모터::GUS 형질전환 식물체를 성공적으로 제조하였다.

실시예 2 : PtrBP3 프로모터의 수피 특이적 발현 확인

2-1 GUS 활성 분석

상기 제조된 형질전환식물의 조직에 따른 GUS(beta-glucuronidase) 활성을 확인하기 위하여 조직화학염색을 수행하였다. 1 mM 5-브로모-4-클로로-3-인돌일 베타-D-글루큐로나이드(glucuronide), 100 mM 인산 완충액, 5 mM K3[Fe(CN)6], 5 mM K4[Fe(CN)6] 및 pH 7.0의 10 mM EDTA를 포함하는 GUS 반응 완충액에 37℃에서 18 내지 24시간 동안 표본을 배양하였다. 염색된 조직을 더 잘 볼 수 있도록, 엽록소를 제거하기 위해 상온에서 최소 한 시간 동안 조직 표본을 에탄올로 헹궜다. 그 후 상기 형질전환 식물체의 각 조직에서 GUS 단백질의 발현을 관찰하였다.

2.2 수피 특이적 활성 확인

상기 PtrBP3::GUS 유전자 재조합 발현벡터(도 6)를 이용하여 제조한 형질전환 식물체의 각 조직에서 GUS 단백질의 발현을 관찰하였다. GUS 리포터 단백질은 X-Gluc(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-glucuronide)이라는 기질을 분해하여 파란색 침전물을 만들게 되고, 따라서 프로모터의 활성위치를 파란색으로 표시하게 되는데, 도 7에서 보이는 바와 같이 상기 형질전환 식물체에서는 애기장대 식물의 경우 (목본식물의 수피에 해당하는)피층 세포(Cortex, Co)에서 GUS 활성(파란색)을 확인할 수 있으며 포플러의 경우 피층조직과 체관조직을 포함하는 수피(Bark)에서 GUS 활성이 특이적이며 매우 강함을 확인할 수 있었다.

구체적으로, 토양에서 50일 자란 애기장대 형질전환 식물체의 경우, 줄기의 피층세포에서 수피 특이적이고 매우 강한 GUS 활성을 보였으며, 다른 조직에서는 전혀 활성을 보이지 않았다. 또한 동일 식물체의 다른 기관 즉, 잎과 꽃에서도 전혀 활성을 나타내지 않았다(도 7의 A). 또한, 형질전환 포플러에서도 마찬가지로 수피 특이적이고 매우 강한 GUS 활성을 볼 수 있었다(도 7의 B).

이를 통해 본 발명의 PtrBP3 프로모터는 수피 특이적으로 활성을 가짐을 확인하였으며, 따라서 상기 프로모터를 포함하는 유전자 발현 벡터를 이용하여 목적 유전자를 수피 특이적으로 발현시킬 수 있다.

실시예 3 : 식물의 발달 단계에 따른 PtrBP3 프로모터의 활성 확인

다음으로 PtrBP3 프로모터에 의한 조직 특이적 발현 양상이 식물의 발달단계에 따라 달라지는 것은 아닌지를 확인하기 위해, 식물의 발달 단계에 따른 PtrBP3 프로모터의 활성 변화를 알아보았다.

그 결과, 발아 후 어린 식물, 즉 3일째에는 GUS 활성이 보이지 않았으나, 5일째에 생장점 주변 조직에서 GUS 활성이 관찰되었으며 7일째 강해지고, 10일째로 가면서 수피 조직 특이적인 형태의 활성이 관찰되었다(도 8). 이러한 사실은 PtrBP3 프로모터의 수피 특이적 활성이 10일째 이후 발달함을 알려준다.

실시예 4 : 스트레스에 따른 프로모터 활성 변화 확인

식물은 생장 과정에서 필연적으로 다양한 내적 및 외적인 스트레스를 받게 된다. 먼저 이러한 외적인 환경 스트레스에 처하였을 때 PtrBP3 프로모터 활성 변화를 알아보기 위해, 10일째의 애기장대 유식물을 MS 액체배지에서 12시간 사전 배양 후, 각각 150mM의 NaCl(고염분 스트레스) 또는 300mM의 만니톨(고삼투압 스트레스) 또는 4℃ 보관(저온 스트레스)처리하였다. 건조 스트레스 처리를 위해 층류에서 15분간 건조시켰다. 그 결과 수피 조직에서만 관찰되는 PtrBP3 프로모터 활성이 각각의 스트레스 상황에서 건조 스트레스를 제외하고 커다란 변화는 발견할 수 없었다(도 9).

식물에는 5 종류의 주요 호르몬(옥신, 사이토키닌, 지베렐린, 앱시스산, 에틸렌)이 존재한다. 이러한 식물 호르몬들은 식물 생리의 거의 모든 부분에 있어서 중요한 조절 작용을 한다. 식물의 내적인 스트레스, 즉 생리적 변화를 흉내 내기위해 10일째의 애기장대 유식물을 MS 액체배지에서 12시간 사전 배양 후 1μM의 식물 호르몬(IAA, kinetin, ABA)이 각각 처리된 MS 액체배지로 옮겨 이에 대한 PtrBP3 프로모터의 활성 변화를 살펴보았다. 그 결과 수피 조직에서만 관찰되는 PtrBP3 프로모터 활성이 각각의 식물 호르몬 처리에 의한 의미 있는 변화를 발견할 수 없었다(도 10).

PtrBP3 프로모터 활성의 내적, 외적 스트레스에 의한 변화를 양적으로 정량화하였다. 그 결과, 건조스트레스를 제외하고, 큰 변화는 없었다(도 11). 이는 앞의 도9과 도10의 GUS 리포터 활성 실험 결과와 일치한다.

이러한 결과들은 PtrBP3 프로모터의 활성이 다양한 내적 및 외적인 스트레스에 따라 크게 변화되지 않고, 지속적으로 수피 조직-특이적이며 강한 활성을 가짐을 뒷받침해 주며, 이로써 본 발명을 완성하게 되었다.

실시예 5 : 유틸리티 벡터 제조

본 발명에서 개발한 PtrBP3 프로모터를 이용하여 외래 유용 유전자를 수피 특이적으로 발현시키기 위해서는 재조합 유전자 벡터(예컨대 PtrBP3::GENE)의 제조가 필요하다. 이에 상기 재조합 유전자 벡터 제조를 쉽게 할 수 있도록, PtrBP3 프로모터를 포함하는 유틸리티 벡터를 제조하였다.

일반적인 제한효소와 리가아제를 사용하는 클로닝 방법은 시간이 많이 소요되고 종종 여러 가지 문제가 있을 수 있으나, 게이트웨이(Gateway) 클로닝 방법은 뉴클레오티드 서열 특이적인 재조합 방법을 이용한 것으로 클로닝 하고자 하는 유전자의 뉴클레오티드 서열과 상관없이 매우 효율적인 방법으로 알려져 있다. 기존의 게이트웨이용 벡터는 35S 프로모터와 게이트웨이 카세트(cassette)가 연결되어 있고, 이 게이트웨이 카세트에 목적 유전자를 클로닝하게 된다.

본 발명에서는 35S 프로모터를 PtrBP3 프로모터로 대체시킨 PtrBP3-pK2GW7,0 (kanamycin 선별용) 및 PtrBP3-pB2GW7,0 (basta 선별용) 벡터를 제조하였다(도 12). 이에 상기 벡터들을 활용하여 식물체의 수피에 특이적으로 목적 유전자를 발현하는 형질전환체를 용이하게 제조할 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> A bark-specific promoter and uses thereof <130> KPA161069-KR <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 744 <212> DNA <213> Populus balsamifera subsp. trichocarpa <400> 1 atggccaatc aaattccctt ggcacttacc ttcaccttac tcctcgtctg tttcaaacat 60 gcaggagctc tatcggtcac cttttccttt aagaacaact gcccattcac tgtttggcca 120 gcaagcctaa ataatgctga cagtccacag ctgtcttcga caggctttgc tctgacagca 180 ggtgcttcat cttccctgag tacccctgtg ccatggtctg gtcggttctg gggtcgaacg 240 cgatgcaata cagattcctc aggcaagttt acttgtgcaa ccggtgattg tgcctctggt 300 cgaatagaat gccatggtgc tggtggtata ccaccggcat ccttggcaga gttcgctcta 360 agagctaatg acgggcacga ctactatgat atcagcctgg tggatggttt taacatcccc 420 ctttcagtaa ttccacaagg aggttctagc gagtgccgtt ccacgagctg tgcagctaat 480 gtgaacgctg tttgtgattc taaattagct gttaaagggt ctgatgggac tgtgattgcc 540 tgcaagagtg catgtttggc attcaaccag ccacagttct gctgcactgg tgagttcagt 600 acaccagaca agtgccttgc taccaactac tcaagcactt tcaagcaaca gtgccctgag 660 gcttatagtt atgcttatga tgataaaagt agcctactta cttgtcctag tggatctaac 720 tatgtgatca acttctgtcc atga 744 <210> 2 <211> 247 <212> PRT <213> Populus balsamifera subsp. trichocarpa <400> 2 Met Ala Asn Gln Ile Pro Leu Ala Leu Thr Phe Thr Leu Leu Leu Val 1 5 10 15 Cys Phe Lys His Ala Gly Ala Leu Ser Val Thr Phe Ser Phe Lys Asn 20 25 30 Asn Cys Pro Phe Thr Val Trp Pro Ala Ser Leu Asn Asn Ala Asp Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Ser Ser Thr Gly Phe Ala Leu Thr Ala Gly Ala Ser Ser 50 55 60 Ser Leu Ser Thr Pro Val Pro Trp Ser Gly Arg Phe Trp Gly Arg Thr 65 70 75 80 Arg Cys Asn Thr Asp Ser Ser Gly Lys Phe Thr Cys Ala Thr Gly Asp 85 90 95 Cys Ala Ser Gly Arg Ile Glu Cys His Gly Ala Gly Gly Ile Pro Pro 100 105 110 Ala Ser Leu Ala Glu Phe Ala Leu Arg Ala Asn Asp Gly His Asp Tyr 115 120 125 Tyr Asp Ile Ser Leu Val Asp Gly Phe Asn Ile Pro Leu Ser Val Ile 130 135 140 Pro Gln Gly Gly Ser Ser Glu Cys Arg Ser Thr Ser Cys Ala Ala Asn 145 150 155 160 Val Asn Ala Val Cys Asp Ser Lys Leu Ala Val Lys Gly Ser Asp Gly 165 170 175 Thr Val Ile Ala Cys Lys Ser Ala Cys Leu Ala Phe Asn Gln Pro Gln 180 185 190 Phe Cys Cys Thr Gly Glu Phe Ser Thr Pro Asp Lys Cys Leu Ala Thr 195 200 205 Asn Tyr Ser Ser Thr Phe Lys Gln Gln Cys Pro Glu Ala Tyr Ser Tyr 210 215 220 Ala Tyr Asp Asp Lys Ser Ser Leu Leu Thr Cys Pro Ser Gly Ser Asn 225 230 235 240 Tyr Val Ile Asn Phe Cys Pro 245 <210> 3 <211> 1499 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PtrBP3 promoter <400> 3 atccggacct cggtatttcc tatatttcta tattgtgttc tcttgatttt cctcctgctt 60 acaaggcttg ctgtttgtat attaatggct aattgattct ctctctctct ctctctctct 120 ctctctctct gcttgaattg taatgacgag atgttcagtg tttgcctttt tctgctttat 180 atctgtccat aaaatatctt gaattgcttc aaaatgaagt cggctatagc attcagacaa 240 atgtccaaaa aaataataat aataataata atttgaggat ggaataaatc aaattgataa 300 ttgataatga gactgtagca tctttagctg gaaacatgta ttcatgcata acaaaattaa 360 taatctgaaa gcaattagtg gtgcaatcaa caagatgcag acaagttgtg cctaagtcca 420 agcatgctcc agtttgttta acacttagtc ataaagctag ggccttttag aacatgacgt 480 ccaatctcgt acttgtgttc atacttgtgt tcatacttgt gttcacaacg tgatttatga 540 ttttagatta tacgttagcg ttaaaaataa atttaaaatt taaaaatatt ttttaaagaa 600 attattatca taatttcaaa tagtactata ccaaaaacac aacaactagc agtcaaaatt 660 caactgcaaa tctttctctc tttttacccc acaagagcaa gttagaacta gtcttgaatg 720 tttgcagcat gttaattcgt tggtgaaagt caaattgcta atataatttg taggtaaaga 780 gatatttttc taccttcaaa gatttacagt tagtcaaaac cttttacaac aacagcatga 840 ttttgcctac tatatacgtg aaacatcttc ttcttctttt tcccaagtat cttgcagcat 900 tttccaaaaa caattccaaa aatattcttg taaattgagc aaagggtttt atcattttat 960 tcacaattcc atttttttta atatttacag aaatggaata tttttgtagc ttttttacta 1020 ttctaactaa attttttatg acttgcggcc tatcagttca acaagataat tttacagttt 1080 tcttaaatca aagcaatttg caagtttgaa caagaaagaa gataaaaaaa aaatagtagg 1140 aaatgttcca tacagataat aacccatcac aaggacattt ccacattcta agcttttcct 1200 atcctaacaa tacagtacag ataaccaatt tgtcatcaaa accttgtgat tttaacatat 1260 ttatttttct tatgaaatga agatctgaga ttgacgtgca tgatttattc atgttgagac 1320 aagaagccta aatcttgtga ataaacagct ccctctttct catgactcca caggtctaat 1380 gctaaagaat ccaaatatcc tccacagctc cctgtaatca attatataag catatccctg 1440 cttgcttgcc cttcaattcc ttaaaaacag aaatatcttc agcctgagtt tccagcaat 1499

Claims (15)

1. 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 구성되는, 식물체의 수피(bark) 특이적 프로모터.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자를 수피 특이적으로 발현시키는 것인 프로모터.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 식물체는 포플러 또는 애기장대인 것인 프로모터.
   
4. 제1항의 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자를 포함하는, 목적 유전자의 식물체 수피 특이적 발현 카세트.
   
5. 제1항의 프로모터 및 게이트웨이(gateway) 카세트를 포함하는, 목적 유전자의 식물체 수피 특이적 발현 카세트 제조를 위한 목적 유전자 도입용 카세트.
   
6. 제4항의 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터.
   
7. 제5항의 목적 유전자 도입용 카세트를 포함하는 목적 유전자 도입용 벡터.
   
8. 제6항에 있어서, 상기 벡터는 pK2GW7,0, pB2GW7,0, pKGWFS7,0 또는 pBGWFS7,0을 기본 골격(backbone)으로 하는 것을 특징으로 하는 벡터.
   
9. 제6항의 재조합 발현 벡터를 포함하는 세균.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 세균은 아그로박테리움 투메파시언스(Agrobacterium tumefaciens)인 것을 특징으로 하는 세균.
    
11. 제6항의 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 식물체.
    
12. 제 11항에 있어서 상기 식물체는 포플러 또는 애기장대인 것을 특징으로 하는 식물체.
    
13. 제7항의 목적 유전자 도입용 벡터의 게이트웨이 카세트에, 위치 특이적 재조합(site specific recombination)을 이용하여 목적 유전자를 도입하는 단계를 포함하는, 목적 유전자의 식물체 수피 특이적 발현 벡터의 제조방법.
    
14. 제6항의 재조합 발현 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는, 수피 특이적으로 목적 유전자를 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법.
    
15. 1) 제6항의 재조합 발현 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계; 및
    2) 상기 형질전환된 식물체의 수피(bark) 조직 내에서 목적 유전자를 발현시켜 목적 단백질을 생산하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 생산방법.
    

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