KR101834698B1 - D-타가투로네이트 에피머화효소를 포함하는, 비인산헥소오스의 에피머화 방법 - Google Patents

D-타가투로네이트 에피머화효소를 포함하는, 비인산헥소오스의 에피머화 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 호열균 유래 당 에피머화효소인 D-타카투로네이트 에피머라아제를 포함하는, 비인산헥소오스의 에피머화용 조성물 및 이 조성물을 이용한 비인산헥소오스 에피머의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 D-타카투로네이트 에피머라아제는 비인산헥소오스의 에피머화 반응을 효과적으로 유도하며, 비인산헥소오스의 에피머 형태, 특히 희귀헥소오스당을 용이하게 수득할 수 있는바, 제약 및 식품산업에서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

D-타가투로네이트 에피머화효소를 포함하는, 비인산헥소오스의 에피머화 방법 {Method for non-phosphate sugar epimerization comprising D-tagaturonate epimerase}
본 발명은 호열균 유래 D-타가투로네이트 에피머화효소를 포함하는, 비인산헥소오스의 에피머화용 조성물 및 이 조성물을 이용한 비인산헥소오스 에피머의 제조 방법에 관한 것이다.
감미료는 단맛을 느끼게 하는 조미료 및 식품첨가물로 정의될 수 있으며, 일반적으로 탄수화물 중 식이섬유를 제외한 당류와 고감미를 가지는 식품첨가물이 이에 해당한다. 가장 대표적인 감미료로서 설탕을 꼽을 수 있으며, 지난 십 수 세기 동안 인류는 설탕의 단맛에 길들여져 왔다. 설탕은 포도당과 과당이 α-1,2 결합된 이당류로서, 낮은 비용으로 식품에 이상적인 감미를 부여할 뿐 아니라, 풍미와 색택을 증진시키고, 보존성을 높이는 등 가공식품에 큰 역할을 수행해 왔다.
그러나, 요즘 급증하고 있는 비만과 당뇨병의 주된 원인을 생활수준의 향상에 따른 설탕이 다량 함유된 고열량 식품의 과잉 섭취에 두고 있다. 이에 따라 ‘저칼로리 식품소재’나 ‘건강 기능성’ 등이 식품산업의 새로운 제품 개발 핵심어 (keywords)로 등장하고 있다. 특히 열량 감소를 위한 노력은 고감미도, 저(무)칼로리, 기능성을 지닌 대체감미료의 개발과 더불어 글로벌 식품소재화 및 상품화까지 확대 적용하고자 하는 움직임으로 연결되고 있다.
자연 소재 감미료인 설탕, 포도당, 및 과당을 대체하여 가공 식품 제조에 적용되고 있는 감미 소재들은 (i) 상대당도가 현저히 높아 칼로리 저하에 기여할 수 있는 고감미 소재(예: 스테비오사이드, 아스파탐 등), (ii) 난소화성의 무칼로리 감미 소재(예: 수크랄로오스 등), (iii) 생활습관병의 위해 요소(risk factors) 조절을 통해 건강지향적인 소비자 욕구를 충족시키고자 개발된 기능성 감미 소재(예: 자일리톨과 같은 당 알코올류, 올리고당류 등) 등으로 구분할 수 있다. 설탕 과다 섭취가 비만, 당뇨병 등의 생활습관병을 유발할 수 있다는 보고는 이러한 대체 감미소재들에 대한 관심을 더욱 증대시켜 관련 시장의 확대 및 성장이 되고 있다. 또한 생활습관병 예방을 목적으로 하는 웰빙식, 건강식에 대한 소비자 강한 욕구는, 설탕 첨가비율이 높은 식품류에서 대체감미료의 적용을 시도하는 움직임으로 연결되고 있다. 이에 따라 국내에서도, 자일리톨을 첨가한 머핀과 식빵, 기능성 당 알코올 및 올리고당을 첨가한 젤리, 자일리톨과 에리스리톨을 첨가한 유자차, 당뇨병 환자들을 위한 대체감미료 첨가 케이크, 트레할로오스를 첨가한 떡, 고감미 저칼로리 대체감미료를 적용한 음료 등, 설탕 대체감미료를 제과, 제빵, 떡, 음료의 제조 공정에 적용하고자 하는 다수의 연구가 발표되고 있다.
가공식품에서 설탕은 단맛을 제공하는 감미료로서의 역할 뿐 아니라, 최종 제품에 바람직한 물성을 제공하는 이화학적 특성을 지닌 기능소재로서의 역할로 다양한 식품에 적용되고 있다. 즉, 설탕은 단맛 이외에도 (i) 히드록실기(hydroxyl)에서 기인한 탁월한 흡습성으로 제품에 보습효과를 줄 수 있고, (ii) 전분 호화 및 노화 억제제로서, 가공 중 사용량과 사용시점에 따라 전분 함유 식품의 물성을 조절할 수 있으며, (iii) 아미노기 함유성분과의 메일라드(Maillard) 반응과 열처리에 의한 카라멜(Caramelization) 반응으로 색소 및 향미 성분을 생성하여 제품에 물성 및 관능적 특성을 부여할 수 있다. 따라서, 가공식품에서의 대체감미료 적용은 상대당도를 고려한 단순한 양적 대체가 아닌, 최종 제품에서의 이화학적 변화 및 소비자가 느끼는 관능적 특성에 대한 검토를 필요로 한다.
이에, 본 발명자들은 설탕, 포도당, 및 과당 등 기존 감미료를 대체할 수 있는 기능성 대체 천연감미료로 주목 받고 있는 비인산헥소오스의 생산 극대화를 위한 연구개발 도중, 호열균 유래 당 에피머화 효소가 비인산헥소오스의 에피머화에 매우 효과적임을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 호열균 유래 당 에피머화효소를 포함하는, 비인산헥소오스의 에피머화용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 양상은 상기 조성물을 이용한 비인산헥소오스 에피머의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 호열균 유래 당 에피머화효소를 포함하는, 비인산헥소오스의 에피머화용 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서, 호열균은 극한생물 (extremophile)의 일종으로 상대적으로 높은 온도, 즉 약 60℃ 이상에서 최적의 생육온도를 갖는 미생물을 의미하며, 바람직하게는 서모토갤 목 (Thermotogales Order)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서모토가 속 (The Genus of Thermotoga), 퍼비도박테리움 속(The Genus of Fervidobacterium)과 칼던에어로박터 (구 써모언에어로박터) 속(The Genus of Caldanaerobacter: previously Thermoanaerobacter)일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 당 에피머화 효소 (epimerase)는 당, 즉 단당류 또는 다당류를 기질로 인식하여, 이들의 에피머화를 촉진하는 효소를 지칭하는 것으로 그 종류를 제한하지 않으며, 바람직하게는 알도오스-1-에피머화효소, D-타가토스 3-에피머화효소, L-리불로오스-5-포스페이트 4-에피머화효소, UDP-N-아세틸글루코사민 2-에피머화효소, 리불로오스 포스페이트 3-에피머화효소, 뉴클레오티드 슈가에피머화효소, UDP-글루코오스-4-에피머화효소 및 D-타가투로네이트 에피머화효소일 수 있지만, 그 종류를 제한하지 않는다. 더욱 바람직하게는 상기 당 에피머화 효소는 서모토가 마리티마 (Thermotoga maritima)와 칼던에어로박터 연세이엔시스 KB-1(Caldanaerobacter yonseiensis KB-1)에서 유래될 수 있다.
상기 당 에피머화 효소는 천연적으로 존재하는 효소이거나 생물학적 또는 화학적 방법에 의하여 합성된 효소를 모두 포함한다.
상기 효소는 해당 유전자를 수득 한 후, 형질전환 등의 통상적인 방법에 의해 미생물에 도입될 수 있다. 상기 에피머화 효소 유전자는 단일 또는 복수 개의 변이 유전자의 형태로 미생물로 형질전환될 수 있다. 상기 미생물은 원핵 세포 및 진핵 세포를 포함하며, 바람직하게는 원핵 세포이다. 상기 미생물의 일 예는 대장균이다.
본 발명에 따른 호열균 유래 당 에피머화효소는 비인산헥소오스의 에피머화 반응을 효과적으로 유도하며, 비인산헥소오스의 에피머 형태, 특히 희귀헥소오스당을 용이하게 수득할 수 있는 바, 제약 및 식품산업에서 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 비인산화헥소오스는 알도헥소오스 또는 케토헥소오스일 수 있으며, 상기 알도헥소오스는 바람직하게는 알로오스 (allose), 알트로오스 (altrose), 글루코오스 (glucose), 만노오스 (mannose), 글로오스 (gulose), 이도오스 (idose), 탈로오스 (talose) 또는 갈락토오스 (galactose)일 수 있으며, 상기 케토헥소오스는 프럭토오스 (fructose), 사이코오스 (psicose), 소르보오스 (sorbose), 또는 타가토오스 (tagatose)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 에피머화는 바람직하게는 비인산헥소오스의 C-2, C-3 또는 C-4 에피머화일 수 있다.
특히, 본 발명의 상기 당 에피머화 효소가 서모토가 마리티마 (Thermotoga maritima) 또는 칼던에어로박터 연세이엔시스 KB-1 (Caldanaerobacter yonseiensis KB-1) 유래 D-타가투로네이트 에피머화효소, UDP-글루코오스-4-에피머화효소인 경우, 이 효소는 프럭토오스 (fructose)를 비인산헥소오스 에피머화하여 타가토오스 (tagatose)를 제조할 수 있으며, 타카토오스를 에피머화 하여 프럭토오스를 제조할 수도 있다.
또한, 본 발명은 비인산헥소오스를 상기 조성물로 처리하는 단계를 포함하는, 비인산헥소오스 에피머의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 상기에서 정의한 바에 의한다.
본 발명에 있어서, 상기 비인산화헥소오스는 알도헥소오스 또는 케토헥소오스일 수 있으며, 상기 알도헥소오스는 바람직하게는 알로오스 (allose), 알트로오스 (altrose), 글루코오스 (glucose), 만노오스 (mannose), 글로오스 (gulose), 이도오스 (idose), 탈로오스 (talose) 또는 갈락토오스 (galactose)일 수 있으며, 상기 케토헥소오스는 프럭토오스 (fructose), 사이코오스 (psicose), 소르보오스 (sorbose), 또는 타가토오스 (tagatose)일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 호열균 유래 당 에피머화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 이 제조합 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 이 숙주세포를 배양하여 호열균 유래 당 에피머화효소를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 “폴리뉴클레오티드(polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 호열균 유래 당 에피머화효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다.
또한 상기 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 최소 70%의 상동성, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다. 본 발명에서 상기 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pQE 시리즈, pBAD 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, CMV, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 호열균 유래 당 에피머화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예를 들면, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 따라서, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T5 프로모터, T7 프로모터, PBAD 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, CMV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
한편, 상기 벡터는 본 발명의 종양 표적용 펩타이드 뿐만 아니라 이 펩타이드가 융합된 항체의 단편 또는 항체를 발현할 수 있다. 펩타이드가 융합된 항체 또는 항체의 단편의 경우, 벡터는 펩타이드와 항체 또는 이의 단편이 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환 (co-transfomation) 및 표적 형질전환 (targeted transformation)을 통하여 숙주 세포로 도입될 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, SP2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 호열균 유래 당 에피머화효소 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 삽입은, 당업계에 널리 알려진 삽입 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, 열충격 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명에 따른 호열균 유래 당 에피머화효소는 비인산헥소오스의 에피머화 반응을 효과적으로 유도하며, 비인산헥소오스의 에피머 형태, 특히 희귀헥소오스당을 용이하게 수득할 수 있는 바, 제약 및 식품산업에서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 서모토가 마리티마 (T. maritima)와 칼던에어로박터 연세이엔시스 KB-1 (C. yonseiensis KB-1) 유래 당 에피머화 효소의 유전 정보를 나타낸 도이다.
도 2는 상기 효소의 비인산헥소오스의 에피머화 가능성을 확인하기 위한 실험을 모식도로 나타낸 도이다.
도 3은 서모토가 마리티마 유래 유전자 중 비인산헥소오스의 에피머화 가능성이 있는 4개의 상기 유전자들(TM 0282, 1034, 0416, 및 0509)과 칼던에어로박터 연세이엔시스 KB-1 유래 비인산헥소오스 에피머화 가능성이 있는 1개의 상기 유전자 (CYTE)의 PCR 증폭산물을 확인한 도이다.
도 4는 상기 5개의 유전자들의 발현과 그 중 3개의 발현된 효소(TM 0416, TM 0509 및 CYTE)의 정제를 SDS-PAGE를 통해 확인한 도이다.
도 5는 순수분리된 UDP-글루코오스 4-에피머라아제의 글루코오스와 갈락토오스 반응생성물을 BioLC를 통해 분석한 도이다.
도 6은 순수분리된 UDP-글루코오스 4-에피머라아제의 프럭토오스와 타가토오스 반응생성물을 BioLC를 통해 분석한 도이다.
도 7은 순수분리된 UDP-글루코오스 4-에피머라아제의 프럭토오스와의 반응시간에 따른 타가토오스의 제조수율을 분석한 도이다.
도 8은 순수분리된 D-타카투로네이트 에피머라아제의 프럭토오스와 타가토오스 반응생성물을 BioLC를 통해 분석한 도이다.
도 9는 순수분리된 D-타카투로네이트 에피머라아제의 프럭토오스와의 반응시간에 따른 타가토오스의 제조수율을 분석한 도이다.
도 10은 상기 호열균 유래 당 에피머화효소에 의해 비인산헥소오스의 가능한 에피머화 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 비인산헥소오스의 에피머화를 위한 효소의 선별
비인산헥소오스, 특히 희귀헥소오스를 제조할 수 있는 효소를 개발하기 위하여, 호열균인 서모토가 마리티마 (T. maritima)와 칼던에어로박터 연세이엔시스 KB-1 (C. yonseiensis KB-1) 유래 당 에피머화 효소를 검토하였다.
상기 서모토가 마리티마 (T. maritima)는 DSMZ 3109 type strain을 직접 균주분양받아 절대혐기배양법으로 수득하였으며, 칼던에어로박터 연세이엔시스 KB-1 (C. yonseiensis KB-1)는 인도네시아 화산지역 열수에서 절대혐기배양법을 통해 실험실에서 직접 순수분리하여 수득하였다.
구체적으로, 서모토가 마리티마 (T. maritima)와 칼던에어로박터 연세이엔시스 KB-1 (C. yonseiensis KB-1)의 당 에피머화 효소는 알도오스-1-에피머화효소, D-타가토스 3-에피머화효소, L-리불로오스-5-포스페이트 4-에피머화효소, UDP-N-아세틸글루코사민 2-에피머화효소, 리불로오스 포스페이트 3-에피머화효소, 뉴클레오티드 슈가에피머화효소, UDP-글루코오스-4-에피머화효소 및 D-타가투로네이트 에피머화효소로 상기 효소의 일부 유전 정보는 도 1과 같다.
상기 7가지 효소의 유전자 정보를 바탕으로 비인산헥소오스 에피머화 가능성을 확인하였다. 도 2는 상기 효소의 비인산헥소오스의 에피머화 가능성을 확인하기 위한 실험을 모식도로 나타낸 도이다.
실시예 2: 서모토가 마리티마 ( T. maritima )와 칼던에어로박터 연세이엔시스 KB-1( C. yonseiensis KB-1) 유래 UDP-글루코오스-4-에피머화효소 및 D-타가투로네이트 에피머화효소의 클로닝
서모토가 마리티마 (T. maritima) MSB8의 UDP-글루코오스 4-에피머라아제를 코딩하는 유전자의 염기서열을 분석하여, 프라이머 TM-UDP-glucose 4-epi (NdeI) F: 5'-CATATGAACATTCTGGTAACAGGCG-3' 및 프라이머 TM-UDP-glucose 4-epi (XhoI) R: 5'-CTCGAGTCACTCAAGGGTTTTTCTG-3'를 제작하고, 서모토가 마리티마 MSB8의 전체 유전자(genomic DNA)로부터 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하였다.
서모토가 마리티마 (T. maritima) MSB8의 알도오스 1-에피머라제를 코딩하는 유전자의 염기서열을 분석하여, 프라이머 TM-aldose 1-epi (NdeⅠ) F: 5'-CATATGGAATATCTGATGAGCCACA-3' 및 프라이머 TM-aldose 1-epi (BamHI) R: 5'-GGATCCTCAAACTTCAACAGAAAATC-3' 를 제작하고, 서모토가 마리티마 MSB8의 지노믹 DNA로부터 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하였다.
서모토가 마리티마 (T. maritima) MSB8의 UDP-N-아세틸글루코사민 2-에피머라제를 코딩하는 유전자의 염기서열을 분석하여, 프라이머 TM-UDP-glucosamine 2-epi (NdeⅠ) F: 5'-CATATGGTGATCAGAGTTCTCAGCG-3' 및 프라이머 TM-UDP-glucosamine 2-epi (XhoⅠ) R: 5'-CTCGAGTCAGCAGAACTCCTCTG-3'를 제작하고, 서모토가 마리티마 MSB8의 지노믹 DNA로부터 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하였다.
서모토가 마리티마 (T. maritima) MSB8의 D-타가토스 3-에피머라제를 코딩하는 유전자의 염기서열을 분석하여, 프라이머 TM-D-tagatose 3-epi (NdeⅠ) F: 5'-CATATGttgaagctatctctggtgatc-3' 및 프라이머 TM-D-tagatose 3-epi (BamHⅠ) R: 5'-GGATCCtcatgtaagtttaataatcagttc-3'를 제작하고, 서모토가 마리티마 MSB8의 지노믹 DNA로부터 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하였다.
칼던에어로박터 연세이엔시스 (C. yonseiensis) KB-1의 D-타가투로네이트 에피머라제를 코딩하는 유전자의 염기서열을 분석하여 프라이머 CY-D-tagaturo epi (NdeⅠ) F: 5'-CATATGAttaacaaagtagctgagtatctttc-3' 및 프라이머 CY-D-tagaturo epi (BamHⅠ) R: 5'-GGATCCTTATTTACTGAATATCTCTTTAAAGTG-3'를 제작하고, 칼던에어로박터 연세이엔시스 KB-1의 지노믹 DNA로부터 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하였다
이용된 PCR 반응액은 다음과 같다: 100 ng 주형 (수득한 서모토가 마리티마 MSB8 및 칼던에어로박터 연세이엔시스 KB-1지노믹 DNA), 0.5 ㎕ (2.5 units/㎕) TaKaRa Prime Star, 10 ㎕ 5X Prime star buffer, 4 ㎕ dNTP 혼합물 (2.5 mM), 0.2 μM (최종 농도) 각 Forward 및 Reverse 프라이머, 멸균 증류수로 최종 50 ㎕까지 넣고, PCR을 수행하여 상기 유전자들을 증폭시켰다. PCR 반응은 95 ℃에서 1분의 변성, 58℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 수행하였다. PCR 산물을 도 3과 같이 확인하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 증폭된 산물은 1% 아가로스 겔에서 전기영동을 수행하여 확인하였다. Lane 1 (A1E)은 T. maritima 알도오스 1-에피머화효소 (TM0282, 1,071 bp), lane 2 (G2E)는 T. maritima UDP-N-아세틸글루코사민 2-에피머화효소 (TM1034, 1,137 bp), lane 3 (T3E)은 T. maritima D-타가토스 3-에피머화효소 (TM0416, 813 bp), lane 4 (G4E)는 T. maritima UDP-글루코오스 4-에피머화효소 (TM0509, 930 bp), 및 lane 5 (CYTE)는 C. yonseiensis D-타가투로네이트 에피머화효소 (CYTE, 1,452 bp) 암호화 유전자의 PCR 증폭산물이다.
상기 PCR산물을 pTOP Blunt V2 벡터 (Enzynomics Co., 한국)에 삽입하여 서모토가 마리티마 MSB8의 알도오스 1-에피머화효소, UDP-N-아세틸글루코사민 2-에피머화효소, D-타가토스 3-에피머화효소, UDP-글루코오스 4-에피머효소 및 칼던에어로박터 연세이엔시스 KB-1의 D-타가투로네이트 에피머화효소를 암호화하는 유전자가 포함된 벡터 pTOPV2-A1E, G2E, T3E, G4E 및 CYTE를 제작하였다.
또한, 상기 재조합 벡터를 형질전환을 위해 준비된 적격 (competent) 100 μl 대장균 DH5α와 혼합한 후, 42℃에서 45초간 열충격 (heat-shock)으로 상기 벡터가 도입된 형질전환 대장균을 제조하고, 암피실린 100 μg/ml을 포함하는 LB배지에 도말하여 형질전환된 대장균을 선별하였다.
실시예 3: 재조합 발현벡터 및 재조합 균주의 제조
실시예 2의 4개의 재조합 벡터pTOPV2-A1E, G2E, T3E, G4E 및 CYTE의 플라스미드 DNA를 회수하기 위해 플라스미드 추출 키트 (QIAGEN, 미국)를 이용하여 플라스미드 DNA를 회수하였다 또한, 상기 UDP-글루코오스 4-에피머라아제를 포함한 5개의 유전자를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 상기 효소의 유전자 TM0282 (A1E), 1034 (G2E), 0416 (T3E), 0509 (G4E) 및 CYTE를 제한효소 NdeI 및 XhoI 또는 BamHI 처리하고 이를 동일한 제한효소로 처리한 발현벡터 pET15b (Novagen, 미합중국)에 라이게이션시켜 재조합 벡터를 제조하였다. 뒤이어, 상기 재조합 발현벡터 pET 15b-A1E, G2E, T3E, G4E 및 CYTE를 형질전환을 위해 준비된 적격 (competent) 대장균 BL21 (E. coli BL21/DE3)와 혼합한 후, 42℃에서 45초간 열충격 (heat-shock)으로 상기 벡터가 도입된 형질전환 대장균을 제조하고 암피실린 100 μg/ml을 포함하는 LB배지에 도말하여 형질전환된 대장균을 선별하였다. 이를 "대장균 BL21/DE3 pET 15b-A1E, G2E, T3E, G4E 및 CYTE (E. coli BL21/DE3 pET 15b-G4E)"라 명명하였다.
실시예 4: 재조합 UDP -글루코오스 4- 에피머효소 D - 타가투로네이트 에피머화효소를 포함한 5개 효소의 발현
상기 실시예 3에서 제조된 재조합 균주 대장균 BL21/DE3 pET 15b-A1E, G2E, T3E, G4E 및 CYTE를 LB 배지에 1% (v/v) 접종하고, 37 ℃에서 2시간 반 동안 배양한 다음, 최종 농도가 1 mM이 되도록 IPTG를 첨가하여, 6시간 동안 재조합 UDP-글루코오스 4-에피머효소 D-타가투로네이트 에피머화효소를 포함한 5개 효소의 발현을 유도하였다. 발현된 효소의 활성을 측정하기 위하여, 배양액을 원심분리 (10,000 ×g, 10분)하여 균체만을 모으고, 20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 5 mM 이미다졸 (pH 7.9)에 다시 현탁시켰다. 이어, 초음파 처리하여 세포를 완전히 파쇄한 다음, 이를 효소액으로 사용하여 프럭토오스 에피머반응을 실시하였다. 프럭토오스 에피머반응은 상기 효소액 1 mg와 기질로 50 mM 프럭토오스를 혼합하고 1 ㎖의 효소 반응액 (20 mM Tris-HCl, pH 7.5)을 80℃에서 3시간 동안 반응시켜서 수행하였다. 생성된 산물은 Carbo PAC-PA1 컬럼 (4x250mm) 및 ED50 전기화학 검출기를 장착한 Bio-LC (Dionex, 미국)에 주입하여 분석하였다. 상기 분석에서 이동상인 16 mM NaOH를 1.0 ml/분의 속도로 흘려주고 크로마토그램을 수득하였다. D-타가토오스와 D-프럭토오스의 스탠다드 및 모든 효소반응샘플은 상기의 조성물과 같이 반응하여 증류수로 10배 희석하여 5 mM 농도의 당을 측정하였다. 스탠다드는 시그마에서 구입한 D-타가토오스와 D-프럭토오스를 측정하였고, UDP-글루코오스 4-에피머화효소와 프럭토오스를 반응한 생성물을 분석하였다. 타가토오스가 일정량 검출되는 것을 확인하였다.
실시예 5: UDP -글루코오스 4- 에피머효소 D - 타가투로네이트 에피머화효소의 순수분리
상기 실시예 4의 방법으로 발현시킨 재조합 UDP-글루코오스 4-에피머화효소, D-타가투로네이트 에피머화효소를 정제하기 위하여, 재조합 균주 배양액을 원심분리 (10,000×g, 10분)하여 균주만을 모은 다음, 초음파 처리하여 대장균의 세포벽을 파괴하고, 14,000×g에서 20분간 원심분리하여 침전물(균체)을 제거하고 상등액을 수득하였다. 이어, 상기 상등액을 70℃에서 15분간 열처리하고, 14,000×g에 서 20분간 원심분리하여 침전물을 제거한 후, 상등액을 수득한 다음, Ni2 + 컬럼 크로마토그래피 수행하여, 재조합 UDP-글루코오스 4-에피머라아제와 D-타가투로네이트 에피머화효소를 분리하였다. 발현된 재조합 단백질의 N-말단에 붙어있는 헥사히스티딘을 제거하기 위해 Thrombin (NOVAGEN, 미합중국)을 처리하였고, 처리한 효소액을 최종적으로 S200 gel 컬럼(GE Healthcare)을 이용하여 순수분리하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, T. maritima 유래의 재조합 알도오스 1-에피머라아제(A1E), UDP-N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제(G2E), D-타가토오스 3-에피머라아제(T3E), UDP-글루코오스 4-에피머라아제(G4E)와 C. yonseiensis 유래의 재조합 D-타가투로네이트 에피머라아제 (CYTE)를 암호화 하고 있는 유전자의 발현을 SDS-PAGE 단백질 전기영동을 통해 확인하였고, 그 중 G4E와 CYTE의 his-tag을 thrombin을 이용하여 잘라내고 gel 컬럼을 통해 최종 정제하였다.
실시예 6: 순수분리된 UDP -글루코오스 4- 에피머라아제의 글루코오스와 갈락토오스 반응생성물 분석
글루코오스와 갈락토오스의 에피머반응은 실시예 5에서 순수분리한 UDP-글루코오스 4-에피머화효소액 1 mg과 기질로 50 mM 글루코오스와 갈락토오스를 각각 혼합하고 1 ㎖의 효소 반응액(20 mM Tris-HCl, pH 7.5)을 80℃에서 3시간 동안 반응하였다. 생성된 산물은 Carbo PAC-PA1 컬럼 (4x250 mm) 및 ED50 전기화학 검출기를 장착한 Bio-LC (Dionex, 미합중국)에 주입하여 분석하였다. 상기분석에서 이동상인 16 mM NaOH를 1.0 ml/분의 속도로 흘려주고 크로마토그램을 수득하였다. D-글루코오스, D-갈락토오스, 및 D-만노오스의 스탠다드 및 모든 효소반응샘플은 실시예 4와 같이 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 순수분리된 UDP-글루코오스 4-에피머라제의 D-글루코오스와 D-갈락토오스 반응생성물을 BioLC를 통해 분석한 도이다. a는 순수분리된 UDP-글루코오스 4-에피머라제의 D-글루코오스와 D-갈락토오스의 반응물과 생성물을 확인하기 위한 기준물(standard)-D-글루코오스, D-갈락토오스 및 D-만노오스-로써 BioLC를 통해 분석한 결과이다. b는 순수분리된 UDP-글루코오스 4-에피머라제에 기질로 D-글루코오스와 반응시 D-만노오스가 검출되는 것을 확인한 결과이다. c는 순수분리된 UDP-글루코오스 4-에피머라제에 기질로 D-갈락토오스와 반응시 D-글루코오스가 검출되는 것을 확인한 결과이다. 도 5에 나타난 바와 같이, 순수분리된 UDP-글루코오스 4-에피머라제에 기질로 D-글루코오스를 반응시 D-만노오스가, D-갈락토오스를 반응시 D-글루코오스가 일정량 검출되는 것을 확인하였다.
실시예 7: 순수분리된 UDP -글루코오스 4- 에피머라제의 프럭토오스와 타가토오스 반응생성물 분석
프럭토오스와 타가토오스의 에피머반응은 실시예 5에서 순수분리한 UDP-글루코오스 4-에피머화효소액 1 mg과 기질로 50 mM D-프럭토오스와 D-타가토오스를 각각 혼합하고 1 ㎖의 효소 반응액(20 mM Tris-HCl, pH 7.5)을 70℃에서 75시간 동안 반응하였다. 생성된 산물은 Carbo PAC-PA1 컬럼 (4x250 mm) 및 ED50 전기화학 검출기를 장착한 Bio-LC (Dionex, 미국)에 주입하여 분석하였다. 상기분석에서 이동상인 16 mM NaOH를 0.7 ml/분의 속도로 흘려주고 크로마토그램을 수득하였다. D-프럭토오스와 D-타가토오스의 스탠다드 및 모든 효소반응샘플은 실시예 4와 같이 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6는 순수분리된 UDP-글루코오스 4-에피머라제의 D-프럭토오스와 D-타가토오스 반응생성물을 BioLC를 통해 분석한 도이다. A는 순수분리된 UDP-글루코오스 4-에피머라제의 D-프럭토오스와 D-타가토오스의 반응물과 생성물을 확인하기 위한 기준물(standard)-D-프럭토오스, D-타가토오스-로써 BioLC를 통해 분석한 결과이다. B는 순수분리된 UDP-글루코오스 4-에피머라제에 기질로 D-프럭토오스와 반응시 D-타가토오스가 검출되는 것을 확인한 결과이다. 그림 C는 순수분리된 UDP-글루코오스 4-에피머라제에 기질로 D-타가토오스와 반응시 D-프럭토오스가 검출되는 것을 확인한 결과이다. 도 6에 나타난 바와 같이, 순수분리된 UDP-글루코오스 4-에피머라제에 기질로 D-프럭토오스를 반응시 D-타가토오스가, D-타가토오스를 반응시 D-프럭토오스가 일정량 검출되는 것을 확인하였다.
실시예 8: 순수분리된 UDP -글루코오스 4- 에피머라제의 프럭토오스와의 반응시간에 따른 타가토오스의 제조 수율
상기 실시예 5에서 순수분리한 UDP-글루코오스 4-에피머라아제를 이용하여 프럭토오스로부터 타가토오스를 제조할 때, 반응(온도, 시간)에 따른 타가토오스 제조 수율을 측정하였다. 순수분리된 효소 반응액 1 mg에 기질을 10 mM 프럭토오스로 하여 60, 70, 및 80℃에서 96시간동안 반응시켰다. 96시간 반응 중에 시간(0, 3, 6, 9, 15, 24, 48, 72, 및 96 h)별로 샘플링하여 타가토스 전환수율을 분석하였다. 상기 반응액 25 μl를 950 μl 증류수와 혼합하여 2 ml 용량의 바이알에 넣고, 반응액 50 μl 를 시료로 Carbo PAC-PA1 컬럼 (4x250 mm) 및 ED50 전기화학 검출기를 장착한 Bio-LC (Dionex, 미합중국)에 주입하여 분석하였다. 상기분석에서 이동상인 16 mM NaOH를 0.7 ml/분 의 속도로 흘려주고 크로마토그램을 수득하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 순수 정제된 UDP-글루코오스 4-에피머화효소와 D-프럭토오스를 반응하였을 때, 96 시간 동안 온도가 상승함에 따라, 각 온도에서 반응시간이 증가함에 따라, D-타가토오스로 전환수율이 증가하였고, 특히 80℃에서 72시간만에 D-프럭토오스에서 D-타가토오스로의 30% 전환수율에 도달하였다.
실시예 9: 순수분리된 D - 타가투로네이트 에피머라제의 프럭토오스와 타가토오스 반응생성물 분석
프럭토오스와 타가토오스의 에피머반응은 실시예 5에서 순수분리한 D-타가투로네이트 에피머효소액 1 mg과 기질로 50 mM D-프럭토오스와 D-타가토오스를 각각 혼합하고 1 ㎖의 효소 반응액(20 mM Tris-HCl, pH 7.5)을 70℃에서 75시간 동안 반응하였다. 생성된 산물은 Carbo PAC-PA1 컬럼 (4x250 mm) 및 ED50 전기화학 검출기를 장착한 Bio-LC (Dionex, 미국)에 주입하여 분석하였다. 상기분석에서 이동상인 16 mM NaOH를 0.7 ml/분의 속도로 흘려주고 크로마토그램을 수득하였다. D-프럭토오스와 D-타가토오스의 스탠다드 및 모든 효소반응샘플은 실시예 4와 같이 측정하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8은 순수분리된 D-타가투로네이트 에피머라제의 D-프럭토오스와 D-타가토오스 반응생성물을 BioLC를 통해 분석한 도이다. D는 순수분리된 D-타가투로네이트 에피머라제의 D-프럭토오스와 D-타가토오스의 반응물과 생성물을 확인하기 위한 기준물(standard)-D-프럭토오스, D-타가토오스-로써 BioLC를 통해 분석한 결과이다. E는 순수분리된 D-타가투로네이트 에피머라제에 기질로 D-프럭토오스와 반응시 D-타가토오스가 검출되는 것을 확인한 결과이다. 그림 F는 순수분리된 D-타가투로네이트 에피머라제에 기질로 D-타가토오스와 반응시 D-프럭토오스가 검출되는 것을 확인한 결과이다. 도 8에 나타난 바와 같이, 순수분리된 D-타가투로네이트 에피머라제에 기질로 D-프럭토오스를 반응시 D-타가토오스가, D-타가토오스를 반응시 D-프럭토오스가 일정량 검출되는 것을 확인하였다.
실시예 10: 순수분리된 D- 타가투로네이트 에피머라제의 프럭토오스와의 반응시간에 따른 타가토오스의 제조 수율
상기 실시예 5에서 순수분리한 D-타가투로네이트 에피머라제를 이용하여 프럭토오스로부터 타가토오스를 제조할 때, 반응(온도, 시간)에 따른 타가토오스 제조 수율을 측정하였다. 순수분리된 효소 반응액 1 mg에 기질을 10 mM 프럭토오스로 하여 70℃에서 75시간동안 반응시켰다. 75시간 반응 중에 시간 (0, 1, 3, 5, 13, 27, 48, 및 75h)별로 샘플링하여 타가토스 전환수율을 분석하였다. 상기 반응액 25 μl를 950 μl 증류수와 혼합하여 2 ml 용량의 바이알에 넣고, 반응액 50 μl 를 시료로 Carbo PAC-PA1 컬럼 (4x250 mm) 및 ED50 전기화학 검출기를 장착한 Bio-LC (Dionex, 미합중국)에 주입하여 분석하였다. 상기분석에서 이동상인 16 mM NaOH를 0.7 ml/분 의 속도로 흘려주고 크로마토그램을 수득하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 순수 정제된 D-타가투로네이트 에피머 효소와 D-프럭토오스를 반응하였을 때, 75 시간 동안 반응시간이 증가함에 따라, D-타가토오스로 전환수율이 증가하였고, 특히 75시간만에 D-프럭토오스에서 D-타가토오스로의 19% 전환수율에 도달하였다.
상기 결과를 종합하여 볼 때, 호열균 유래 당 에피머화효소는 비인산헥소오스의 에피머화를 가능하게 할 것으로 예상되며, 그 예상되는 에피머화를 도 10에 나타내었다.

Claims (5)

  1. 비인산헥소오스를 칼던에어로박터 연세이엔시스 KB-1 유래 D-타가투로네이트 에피머화효소로 직접 처리하는 단계; 를 포함하며, 상기 비인산헥소오스는 프럭토오스 또는 타가토오스인 것을 특징으로 하는, 비인산헥소오스 에피머의 제조방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 비인산 헥소오스는 프럭토오스이며, 제조되는 비인산헥소오스 에피머는 타가토오스인 것을 특징으로 하는, 비인산헥소오스 에피머의 제조방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 비인산 헥소오스는 타가토오스이며, 제조되는 비인산헥소오스 에피머는 프럭토오스인 것을 특징으로 하는, 비인산헥소오스 에피머의 제조방법.
  4. 삭제
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 에피머는 비인산헥소오스의 C-4 에피머인 것을 특징으로 하는, 비인산헥소오스 에피머의 제조방법.
KR1020170063434A 2013-11-19 2017-05-23 D-타가투로네이트 에피머화효소를 포함하는, 비인산헥소오스의 에피머화 방법 KR101834698B1 (ko)

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