KR101831947B1 - 아토르바스타틴을 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 HMG-CoA 환원효소 저해제를 포함하는 난청 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 아토르바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴 및 심바스타틴으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 당뇨매개성 난청의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 HMG-CoA 환원효소(reductase) 저해제를 포함하는 약학 조성물은 당뇨에 의해 유발된 청각세포의 사멸을 억제하므로, 당뇨매개성 감각신경계 난청의 예방 또는 치료제로 매우 유용하다.

Description

아토르바스타틴을 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition Comprising Atorvastatin for Preventing or Treating Hearing Loss}

본 발명은 HMG-CoA 환원효소(reductase) 저해제를 포함하는 난청 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 아토르바스타틴 (atorvastatin), 플루바스타틴 (fluvastatin), 로바스타틴 (lovastatin), 피타바스타틴 (pitavastatin), 프라바스타틴 (pravastatin), 로수바스타틴 (rosuvastatin) 및 심바스타틴 (simvastatin)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 당뇨매개성 난청의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

난청은 대부분이 돌발성, 약물성 (항생제, 항암제), 소음성, 외상성, 노인성, 선천성 등의 환경적 요인과 유전적 요인들에 의해 형성되며, 주로 청각세포의 손상 및 죽음과 같은 특징을 보이는 감각신경성 난청에 의해 발생한다. 감각신경성 난청의 치료를 위해 내이유모세표 (inner ear hair cell) 재생, 유모세포의 증식 (proliferation)과 분화 (differentiation)에 관여하는 신호경로 기전들이 많이 밝혀졌으며 유전자치료 (Gene editing) 혹은 세포이식 (cell transplantation) 등의 기술이 개발되면서 최근 수년간 유모세포재생 연구에 큰 진전을 이루어 내고 있으나, 아직까지 명확한 난청 억제 및 예방에 관한 기전이나 예방 및 치료제 개발은 미미한 실정이다 (Hanyang Med Rev, 2015).

2014년 국제당뇨병연맹(International Diabetes Federation, IDF)보고에 따르면 전 세계 인구의 8.3%인 약 3억 8천7백만 명이 당뇨병 환자로 추산한다. 당뇨병과 난청과의 관계는 1980년대부터 제기되어 왔으며, 당뇨질환이 내이의 신경과 혈관에 손상을 입힐 수 있으므로 난청을 겪기 쉽고 청력에 유의한 영향을 미친다는 보고가 다수 발표되었다. 미국 NIH 1995년 및 ADA 2014 보고에 따르면 당뇨는 미세혈관과 신경 합병증을 야기하며, 이로 인하여 내이의 혈관계와 신경계에 손상을 줘서 감각신경계 난청을 일으키는 데 영향을 줄 수 있는 것으로 보고되어 있다. 또한 당뇨병을 유발시킨 동물을 통해 당뇨와 난청과의 관계를 연구한 결과, 고혈당 상태를 약 2개월 기간 지속하면 당뇨합병증인 말초신경병증과 같은 청신경의 손상으로 난청이 유발되는 것이 보고되었다 (Neurosci Lett, 2008). 당뇨병환자에서 고지혈증은 흔하게 동반되고, 당뇨병성 합병증의 발병에 영향을 준다. 고지혈증 (dyslipidemia)은 외유모세포의 기능에 민감한 영향을 미칠 수 있으며, 고지혈증(hyperlipidemia) 및 지방증 (lipidosis), 고혈압 등 노화성 난청 진행과 고음역 역치손실과 관련이 있는 것으로 추측되고 있다. 또한 중성지방의 증가는 청감각의 감소를 예측하는 지표로 의미가 있으며 (Otol Neurotol, 2006), 2010-2012 국민건강영양조사, 질병관리본부 자료조사에 따르면 평균연령 44.9세 남, 녀 성인 기준 난청을 유발하는 여러 가지 인자들 중 당뇨, 고혈압, 고지혈증과 같은 만성질환이 난청유발 요인으로 보고되어 만성질환과 난청이 밀접한 연관이 있음을 시사하고 있다. 그러나, 아직까지 만성질환에 의해 난청이 발생하는 명확한 발병기전이 밝혀진 바가 없다.

스타틴은 전 세계적으로 가장 많이 처방되는 약물 중 하나로 관상동맥 내의 염증을 낮추고(Hs-CRP), 혈전을 안정화(plaque stability)시킴으로써 관상동맥 내 죽상경화(atherosclerosis)를 억제하는 효과를 보이는 것으로 알려져 있다. 그 외에도 혈관의 수축작용을 억제함으로써 고혈압을 비롯한 심혈관질환에도 효과를 보이는 것으로 알려져 있다 (Lancet, 2008, 2012; Eur Heart J, 2003). 스타틴 계열 약물들 중 아트로바스타틴 (atorvastatin)은 혈관내피세포의 염증반응을 억제하여 노화성 난청 마우스모델의 청력기관 내이의 기능을 유지시켜 난청을 지연 또는 억제하는 것으로 알려져 있으며 (Neuroscience Letters, 2007), 저용량의 아트로바스타틴 (5 mg/kg)이 소음성 난청 랫트모델에서 통계적으로 유의하게 난청억제 효과가 있음이 보고된 바 있다 (The International Journal of Occupational and Environmental Medicine, 2016). 유방암 세포 이종이식모델에서 아트로바스타틴은 종양 스트레스단백질 마커인 JNK 활성을 증가시키며, ERK와 AKT 단백질 활성을 저하시켜 종양의 성장과 전이를 억제하는 것으로 보고되었다 (Front. Med. China, 2009). 또한 아트로바스타틴은 비만 C57 아우스에서 췌장베타세포 소포체 스트레스를 완화시키고 세포성장을 촉진하여 비만을 통해 유도되는 제2형 당뇨를 억제하는 것으로 보고되었다 (Lipids in Health and Disease, 2014). 이밖에 심바스타틴 (simvastatin)은 약물이 분자생물 스트렙토조토신 (streptozotocin)으로 제1형 당뇨유도 마우스모델에서 췌장베타세포 염증반응을 억제하여 기능을 유지시킴으로써 당뇨를 억제 또는 지연시키는 것으로 보고된 바 있다 (Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2007).

이렇게 난청은 당뇨, 고지혈증과 같은 다양한 만성질환과 밀접한 연관성이 있음이 최근 연구결과들을 통해 보고되고 있으나, 난청의 예방 및 치료를 위한 명확한 분자기전연구 및 치료방안을 아직까지 제시하지는 못하는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 당뇨와 같은 만성질환에 의해 유발되는 난청의 발병기전을 밝혀 당뇨매개성 난청을 예방 및 치료하고자 예의 노력한 결과, HMG-CoA 환원효소(reductase) 저해제가 당뇨 마우스모델 및 세포주모델에서 당뇨뿐 아니라 난청을 개선하고 청력저하를 억제할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 HMG-CoA 환원효소(reductase) 저해제를 유효성분으로 함유하는 난청 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 정제를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HMG-CoA 환원효소(reductase) 저해제를 유효성분으로 함유하는 난청 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, HMG-CoA 환원효소(reductase) 저해제를 유효성분으로 함유하는 난청 예방 또는 치료용 약학 조성물을 포함하는 정제를 제공한다.

본 발명에 따른 HMG-CoA 환원효소(reductase) 저해제를 포함하는 약학 조성물은 당뇨에 의해 유발된 청각세포의 사멸을 억제하므로, 당뇨매개성 감각신경계 난청의 예방 또는 치료제로 매우 유용하다.

도 1은 인비보 (in-vivo) 실험에 대한 개략도를 나타낸 것이다.
도 2의 (A)는 정상식이 마우스 (왼쪽)와 고지방/과당식이 마우스 (오른쪽)에서 좌, 우 ABR (청뇌간반응)을 측정한 결과이며, (B)는 12주 동안 정상식이 및 고지방/과당식이 후 체형의 크기를 비교한 것이고, (C)는 체중변화, (D)는 혈당수준, (E)는 포도당 내성 (GTT), (F)는 인슐린 내성 (ITT)을 분석한 결과이다.
도 3은 당뇨 마우스 (고지방/과당식이 12주차)에 아토르바스타틴 투여 전/후 청력 및 당뇨에 대한 효과를 나타낸 것으로, (A)는 좌, 우 ABR (청뇌간반응)을 측정한 결과이며, (B)는 12주 후 체중변화, (C)는 혈당수준, (D)는 포도당 내성 (GTT), (E)는 인슐린 내성 (ITT)을 분석한 결과이다.
도 4의 (A)는 HEI-OC1 세포에 팔미테이트 (palmitate)를 24시간 처리한 후, 세포사멸을 관찰한 것이고, (B)는 활성 카스파제-3 및 PARP의 단백질 수준을 웨스턴 블랏으로 확인한 것이며, (C)는 AKT 단백질의 인산화를 측정한 결과이다.
도 5는 팔미테이트 (palmitate)에 의해 유도되는 세포사멸에서 아토르바스타틴의 효과를 나타낸 것으로, (A)는 팔미테이트와 아토르바스타틴을 함께 24시간 동안 처리한 후, 세포 생존력을 WST-1 분석으로 측정한 것이며, (B)는 아토르바스타틴 처리 후, 농도 및 시간별로 AKT 인산화를 측정한 것이고, (C)는 활성 카스파제-3, 인산화된 AKT 및 총 AKT (대조군)의 단백질 수준을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이며, (D)는 세포의 총 추출물에서 ATP 함량을 측정한 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 당뇨마우스 모델 및 당뇨매개성 난청 세포주를 확립한 후, HMG-CoA 환원효소(reductase) 저해제인 아토르바스타틴 (atorvastatin)을 처리하여, 세포사멸 억제 및 미토콘드리아 에너지 (ATP) 생성 유지를 통해 청력 및 당뇨가 개선되는 것을 관찰하였다. 즉, HMG-CoA 환원효소(reductase) 저해제에 의한 당뇨매개성 난청의 개선 또는 치료 효과를 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일관점에서 HMG-CoA 환원효소(reductase) 저해제를 유효성분으로 함유하는 난청 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 "HMG-CoA 환원효소 저해제" 즉, "스타틴"은 지질 강하제로 심혈관 질환 (CVD)을 감소시키는 것으로 알려져 있으며, 콜레스테롤 생산에 중요한 역할을 하는 HMG-CoA 환원효소를 억제한다.

본 발명에 있어서, 상기 HMG-CoA 환원효소(reductase) 저해제는 아토르바스타틴 (atorvastatin), 플루바스타틴 (fluvastatin), 로바스타틴 (lovastatin), 피타바스타틴 (pitavastatin), 프라바스타틴 (pravastatin), 로수바스타틴 (rosuvastatin) 및 심바스타틴 (simvastatin)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 아토르바스타틴 (atorvastatin)인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "난청(hearing loss)"이라 함은 전음성 난청(conductive hearing loss) 및 감각신경성 난청 (sensorineural hearing loss)을 포함한다. 전음성 난청은 외이, 고막, 중이 등 소리를 전달해주는 기관의 장애로 인하여 음파의 전달이 정상적으로 이루어지지 않는 상태로 발생하는 난청을 말하며, 감각신경성 난청은 달팽이관의 소리를 감지하는 기능에 이상이 생기거나 소리에 의한 자극을 뇌로 전달하는 청신경 또는 중추신경계의 이상으로 발생하는 난청을 말한다. 감각신경성 난청의 원인으로는 매우 다양한 것들이 있으며, 미로염이나 뇌수막염 등의 염증성 질환, 소음성 난청, 이독성 약물, 측두골 골절 등의 외상, 노인성 난청, 메니에르병, 돌발성 감각신경성 난청, 갑상선 기능저하 등의 대사이상, 뇌의 허혈성 질환, 백혈병 등의 혈액 질환, 다발성 경화증 등의 신경학적 이상, 면역이상, 청신경 종양 등의 종양성 질환, 골질환 등에서 감각신경성 난청을 유발할 수 있다.

본 발명에 있어서, 감각신경성 난청은 내이의 유모세포 및 주변조직의 손상에 기인한 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 난청은 감각신경성 난청인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 당뇨에 의해 유발된 당뇨매개성 난청인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, HMG-CoA 환원효소 저해제를 함유하는 조성물은 청각세포의 세포사멸 억제, AKT 인산화 증가 또는 ATP 생성을 유지시키는 것을 특징으로 할 수 있으며, 또한 인슐린 저항성 (insulin tolerance) 또는 당내성 (glucose tolerance)을 감소시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, HMG-CoA 환원효소 저해제를 함유하는 조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, HMG-CoA 환원효소 저해제를 함유하는 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 경구적으로(예를 들면, 복용 또는 흡입) 또는 비경구적으로(예를 들면, 주사, 침착, 이식, 좌약) 투여될 수 있으며, 주사는 예를 들면, 정맥주사, 피하주사, 근육내주사 또는 복강내주사일 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 투여 경로에 따라, 정제, 캡슐제, 과립제, 파인 서브틸래 (fine subtilae), 분제, 설하 정제, 좌약, 연고, 주사제, 유탁액제, 현탁액제, 시럽제, 분무제 등으로 제형화될 수 있다. 상기 여러 가지 형태의 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 각 제형에 통상적으로 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체(carrier)를 사용하여 공지기술에 의해 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예는 부형제, 결합제, 붕해제(disintegrating agent), 윤활제, 방부제, 항산화제, 등장제(isotonic agent), 완충제, 피막제, 감미제, 용해제, 기제(base), 분산제, 습윤제, 현탁화제, 안정제, 착색제 등을 포함한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약제의 형태에 따라 다르지만, 본 발명의 화합물 (HMG-CoA 환원효소 저해제)을 약 0.01 내지 95 중량%로 포함한다.

본 발명에 따른 약학조성물의 유효성분인 HMG-CoA 환원효소 저해제의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중, 질환에 따라 달라질 수 있으나, 0.001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 HMG-CoA 환원효소 저해제의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 기관지내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 난청의 예방 또는 치료 효과를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 HMG-CoA 환원효소 저해제를 함유하는 조성물을 포함하는 정제에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 정제는 코팅된 형태인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 HMG-CoA 환원효소(reductase) 저해제를 유효성분으로 함유하는 난청 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

상기 식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강식품은 유효성분인 HMG-CoA 환원효소 저해제 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 식품 조성물에 함유된 HMG-CoA 환원효소 저해의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 식품 조성물의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

[ 실시예 ]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 인비보 (in- vivo ) 실험을 위한 당뇨마우스 모델 확립

총 68마리 C57/BL6J 수컷 마우스를 정상군 (15 마리)과 당뇨유도군 (53 마리)으로 분류하였다. 모든 마우스에 청성뇌간반응 (Auditory brainstem response; ABR) 사전 청력검사를 시행하여 선천적 비정상 청력을 가진 마우스는 배제하였다. TDT ABR 기기를 이용하여 16 kHz, 32 kHz의 단음 (tone burst)을 주어 웨이브 V의 파형이 나오는 최소자극 음 크기 (dB)를 청력역치로 판정하였다. 0, 8, 16 주 동안 약물투여 전 당뇨 유도과정 및 약물투여 후 실험군과 대조군의 청력을 측정하여 난청발생 및 난청예방 효과를 비교 분석하고 통계적 유의성을 확인하였다.

당뇨매개성 난청 동물모델은 60 % 고지방 (High fat) 사료와 30 % 과당 (fructose)이 함유된 물을 12 주간 공급하며 사육하여 당뇨를 유도하였다. 12주 동안 2주 1회 혈당 측정 및 포도당 내성 (glucose tolerance), 인슐린 내성 (insulin tolerance)을 테스트하고, 매주 몸무게 측정, 주 2회 Food/water 섭취 효율 시험을 수행하여 당뇨모델을 확립하였다. 당뇨 유도시 혈당 220mg/dl 이상, 인슐린/포도당 저항성의 통계적 유의성, 청력 이상 여부에 따라 당뇨 및 당뇨매개성 난청여부를 판정하여 선별기준에 부적합한 개체를 배제 후 최종 30마리를 실험군과 대조군으로 재분류하였다.

실험군은 아토르바스타틴 (20 mg/kg) 그룹 15마리와 대조군 vehicle (DMSO+normal saline) 15마리로 각각 분류하였으며, 2일 1회 5주간 복강내 투여하여 사용하였다. 약물투여 기간 중 체중, Food 섭취 효율 시험을 수행하였으며, 투여기간 종료 직전 청력검사, 혈당 측정, 포도당 및 인슐린 내성 테스트를 수행하였다.

실시예 2: 당뇨마우스 모델에서 청력변화 및 당뇨유도 확인

마우스에 60 % 고지방 (High fat) 사료와 30 % 과당 (fructose)이 함유된 물을 12 주간 공급하여 사육하면서 당뇨를 유도하는 과정 중, 8주차에 청성뇌간반응 (auditory brainstem response; ABR)을 시험하였다. 그 결과, 16KHz, 32KHz 마우스 양쪽 귀 청력역치가 모두 통계적으로 유의하게 증가하여 청력저하가 뚜렷하게 관찰되었다 (도 2A).

그 다음, 당뇨 유도 12주차 당뇨 마우스모델의 체형 크기, 체중, 혈당, 포도당 저항성 및 인슐린 저항성을 측정하였다. 그 결과, 크기 및 체중은 3주 후부터 통계적으로 유효한 차이를 보이며 증가했으며 (도 2B 및 2C), 혈당 (도 2D), 내당능 (도 2E) 그리고 인슐린저항성 (도 2F)이 정상그룹에 비해 유의한 차이를 나타내는 것으로 관찰되었다.

이러한 결과는 마우스가 최종 당뇨가 유도된 것으로 판정할 수 있으며, 결과적으로 고지방/과당식이 당뇨 마우스모델에서 당뇨에 의해 청력감소가 동반된다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 당뇨마우스 모델에 아토르바스타틴 투여 전, 후 청력변화 및 당뇨개선 확인

고지방/과당식이 12주차 당뇨판정 마우스에 5주간 2일 1회 아토르바스타틴 (20 mg/kg)을 복강 내 투여한 실험군과 normal saline을 투여한 대조군의 청성뇌간반응 (auditory brainstem response; ABR)을 시험하였다.

그 결과, 대조군의 16KHz, 32KHz 양쪽 귀 청력역치가 8주차에 비해 평균 약 10kHz 증가한 반면, 아토르바스타틴을 투여한 실험군은 8주차와 유사한 청력역치 값으로 관찰되었다 (도 3A). 즉, 아토르바스타틴을 투여한 실험군이 대조군에 비해 당뇨에 의해 유도된 청력저하가 억제되는 것을 알 수 있다.

또한, 12주차 당뇨판정 마우스에 아토르바스타틴을 투여한 실험군 및 대조군에서 체중, 혈당, 포도당 저항성 및 인슐린 저항성을 측정하였다. 그 결과, 체중 감소와 더불어 혈당 및 내당능 그리고 인슐린저항성이 유의하게 개선되는 것으로 관찰되었다 (도 3B, 3C, 3D 및 3E). 모든 통계적 유의성은 SPSS 프로그램의 One-Way ANOVA 및 student T-test를 실시하여 분석하였다.

이러한 결과는 아토르바스타틴 복용군은 비복용군에 비해 당뇨 개선과 당뇨에 의한 청력저하를 동시에 막는 것을 나타낸다.

실시예 4: 포화지방산 팔미테이트에 의한 청각세포의 세포사멸

고지방/과당식이 즉, 비만을 통한 당뇨마우스 모델을 대체할 세포실험 모델은 비만과정에 과도하게 증가되는 지방합성과정 중간산물인 포화지방산 팔미테이트 (palmitate)에 의한 세포독성 실험모델을 고안하였다. 중요 청각기능을 담당하는 청각세포주 (HEI-OC1; House-Ear Institute-organ of Corti 1)를 사용하였으며, 당뇨매개성 난청 세포주 모델은 팔미테이트 (palmitate)를 처리하여 사용하였다.

세포사멸을 평가하기 위해, 청각세포주인 HEI-OC1 세포에 팔미테이트 200-800 μM 농도별 처리하여 24시간 후 PI (Propidium iodide) 염색과 세포형태를 분석하였다. 그 결과, 팔미테이트 농도 200 μM 부터 세포의 형태 변화와 더불어 세포사멸이 야기되며 농도가 증가할수록 그 현상이 더욱 뚜렷한 것으로 나타났다 (도 4A). 또한, 세포사멸 기전 분석을 통해 세포독성에 의한 세포사가 유도되는 것을 분석한 결과, 절단된 카스파제-3와 PARP 단백질이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며 (도 4B), 반면, 세포생존에 중요 단백질로 알려진 AKT 단백질의 인산화는 감소하는 것을 알 수 있었다 (도 4C).

종합적으로, 팔미테이트는 세포생존 관련 AKT 단백질의 인산화를 감소시키고 세포사멸 기전을 활성화시켜 세포사멸을 유도함으로써, 고지방/과당식이 당뇨모델에서 청력의 감소는 과도한 지방산합성으로 축적되는 중간산물인 포화지방산 팔미테이트가 청력기관에 독성을 야기해 결과적으로 청각기관의 기능감소를 초래할 수 있음을 시사한다.

실시예 5: 팔미테이트에 의해 야기되는 세포사멸 과정에서 아토르바스타틴의 효과

팔미테이트에 의한 청각세포주 (HEI-OC1) 세포독성 및 세포생존능을 WST-1 분석을 통해 정량화한 결과, 팔미테이트 100, 200, 400 μM 농도별 처리하여 24시간 후 각각 약 20-40 %의 세포사멸이 관찰되었다. 또한, 아트로바스타틴 250, 500, 1000 nM 각각 단독 처리 시에는 세포독성이 나타나지 않았다 (도 5A).

팔미테이트의 세포독성으로부터 아토르바스타틴의 기능을 평가하기 위해, 아트로바스타틴을 농도별로 전처리하고 팔미테이트를 농도별로 후처리 하였다.

그 결과, 팔미테이트 단독 처리에서 관찰되었던 세포사멸이 유의하게 억제되는 것을 관찰하였다 (도 5A). 또한, 아토르바스타틴은 세포생존 단백질 AKT의 인산화를 증가시키며 (도 5B), 팔미테이트 처리에 의해 AKT 단백질 인산화 감소를 억제하는 것을 확인하였다 (도 5C). 더불어, 아토르바스타틴의 세포보호 효과 및 에너지대사에 대한 영향을 ATP detection luminescence로 평가한 결과, 아토르바스타틴은 팔미테이트에 의한 세포사멸 억제뿐 아니라 미토콘드리아 에너지 (ATP) 생성을 유지시켜 세포생존에 필수적인 에너지생성 대사과정을 유지시켜 주는 것을 알 수 있었다 (도 5D).

팔미테이트의 세포독성 및 세포사멸 효과와 아토르바스타틴의 세포보호 효과는 정량적 수치화를 통해 통계적 유의성을 student T-test를 실시하여 분석하였다.

이러한 결과를 통해, 당뇨모델 동물실험에서 보여준 아토르바스타틴의 청력보호 효과가 청각기관 구성세포의 세포사멸 억제, 세포생존에 중요한 단백질의 활성화 및 에너지생성 대사과정 유지를 통한 청력감소 억제에 의한 것임을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

1. 아토르바스타틴 (atorvastatin)을 유효성분으로 함유하는 당뇨에 의해 유발된 당뇨매개성 난청의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 청각 및 지지세포의 세포사멸 억제, AKT 인산화 증가 또는 ATP 생성을 유지시키는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 인슐린 저항성 (insulin tolerance) 또는 당내성 (glucose tolerance)을 감소시키는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 약학적으로 허용되는 부형제, 결합제, 활택제, 윤활제, 붕해제, 감미제, 향미제 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 정제.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 정제는 코팅된 형태인 것을 특징으로 하는 정제.
   

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