KR101824946B1 - 디아세틸 생산능이 우수한 락토코커스 락티스 서브스페시스 크레모리스 lrcc5306 균주, 상기 균주를 이용한 디아세틸 생산방법, 및 이를 이용한 발효버터의 제조방법 - Google Patents

디아세틸 생산능이 우수한 락토코커스 락티스 서브스페시스 크레모리스 lrcc5306 균주, 상기 균주를 이용한 디아세틸 생산방법, 및 이를 이용한 발효버터의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 시유로부터 분리한 디아세틸 생산능이 우수한 락토코커스 락티스 서브스페시스 크레모리스 LRCC5306 균주, 이의 배양조건 최적화를 통해 디아세틸 생산량 증가시키는 방법 및 이를 이용하여 제조한 디아세틸 농도가 높은 발효크림을 일반버터와 혼합함으로써 별도의 교유(처닝) 과정이 없이 발효 풍미가 우수한 발효버터 제조방법에 관한 것이다.

Description

디아세틸 생산능이 우수한 락토코커스 락티스 서브스페시스 크레모리스 LRCC5306 균주, 상기 균주를 이용한 디아세틸 생산방법, 및 이를 이용한 발효버터의 제조방법{LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. CREMORIS LRCC5306 STRAIN, METHOD FOR PRODUCING DIACETYL USING THE SAME, AND METHOD FOR MANUFACTURING CULTURED BUTTER USING THE SAME}
본 발명은 시유로 부터 분리한 디아세틸 생산능이 우수한 락토코커스 락티스 서브스페시스 크레모리스 LRCC5306(기탁번호 KCCM11733P) 균주, 이의 배양조건 최적화를 통해 디아세틸 생산량 증가시키는 방법 및 이를 이용하여 제조한 디아세틸 농도가 높은 발효크림을 가공버터 및 식용유지(일반버터)와 혼합함으로써, 별도의 교유(처닝) 과정이 없이 발효 풍미가 우수한 발효버터 제조방법에 관한 것이다.
식생활 양식의 서구화로 2000년 이후 버터를 비롯한 유제품 소비실적이 꾸준히 증가하고 있으며 최근 국내외 요리관련 방송의 영향으로 버터에 대한 소비자의 관심이 역시 급격히 증가하고 있다.
버터는 물과 식염을 사용하여 처닝 과정으로 우유, 크림 또는 우유의 크림거품으로부터 생성된다. 이러한 버터는 제조 방법 및 원료에 따라 구분이 되는데 그 예로서 100% 우유로만 만든 천연버터, 유산균을 첨가하여 발효시켜 특유의 향을 증가시킨 발효버터, 마가린이나 기타 성분들과 혼합시킨 가공버터 등이 있다. 그 동안 국내와 일본에서는 천연버터에 대한 선호도가 높았던 반면 유럽에서는 대부분 발효버터를 이용하여 베이커리 및 요리 시 풍미를 풍부하게 해주는 방법을 선호하여 왔다. 그러나 최근 유산균 발효에 대한 소비자 우호도가 증가함에 따라 국내 유통업계에서 유럽산 발효버터 제품을 수입, 판매하면서 발효크림, 발효버터 등에 대한 소비가 서서히 늘어나는 추세이다. 앞으로 이러한 추세에 대응하기 위해 발효크림과 발효버터를 국내 자체 기술로 제조하는 기술을 확보한다면 새로운 경제적 부가가치 창출이 가능할 것으로 예상된다.
하지만 현재 국내의 발효버터 제조기술을 유럽의 선진 발효버터 제조기술과 비교하면 가장 큰 문제로 발효버터 내 낮은 디아세틸 농도를 들 수 있다. 발효제품에서 나타나는 독특한 향기성분으로는 휘발성 유기산 및 휘발성 카보닐(Carbonyl) 화합물이 주종을 이루고 있으며 이러한 휘발성 카보닐 화합물의 일종인 디아세틸(Diacetyl)이 바로 치즈나 버터와 같은 유제품의 바람직한 향기 성분으로 알려져 있다. 이러한 디아세틸은 유산균에서 구연산 대사경로(Citrate Fermentation Pathway)를 통해 생성되며, 이 경로의 전구체로 쓰이는 구연산(Citrate)는 발효 후 저장 중 디아세틸의 안정화에도 기여하게 된다.
디아세틸 성분은 발효과정에서 생성되는 물질로, 발효버터의 디아세틸 함량 0.4 ~ 1.2 mg/kg으로 일반버터에 비해 약 2 ~ 5배 많다. 발효 진행 시 디아세틸의 함량이 증가하다가 과발효 시 그 양이 다시 감소하게 되어 발효 풍미가 약해지게 된다. 또한 발효 후 교유, 수분 제거 등의 공정에 의해 디아세틸의 손실이 생길 수 있다.
따라서 발효크림과 발효버터에 우수한 발효풍미를 부여하기 위해선 고농도의 디아세틸을 분비하는 유산균을 확보하는 것과 이 유산균이 최적의 디아세틸을 생산할 수 있는 발효조건이 필수적이기에 버터의 디아세틸 함량을 증가시켜 향미를 향상시키려는 연구가 시도되어 왔었다.
한국 공개특허 제1989-0007652호는 미생물 및 효소를 이용한 버터향의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 생크림(유지방 30-40%)에 유산균 4종(str.diacetylactis, Leu.cremoris 및 str.lactis, str.cremoris의 4 균주)을 사용하여 버터향의 주성분으로서 디아세틸(diacetyl)을 생성시킨 후 지방분해효소를 단시간 처리하여 디아세틸(diacetyl)을 다량으로 생성하도록 함과 동시에 저온살균후 약 24 시간 내지 약 40 시간 숙성시킴으로써 우수한 버터향을 제조하도록 하는 방법을 제공한다. 그러나 이는 여전히 고가의 효소를 사용하여야 하는 문제점과 함께 유산균 발효시간 외 장시간이 소요되어 실제 산업화에 적용하기 어려운 한계가 있다.
이하 후술하겠지만, 상기 한국 공개특허 제1989-0007652호에서는 생크림에 유산균 4종을 투여하여 발효하고 지방분해효소를 첨가하여 디아세틸을 생성시키는 방법에 따라 기술하였으며 이 때의 디아세틸 생성량은 3.77 ppm, 즉 3.77 mg/kg인데 반해, 본 발명의 락토코커스 락티스 서브스페시스 크레모리스 LRCC5306 균주와 본 발명에 따른 조건에 따라 제조한 발효크림의 디아세틸 생성량은 23.4 mg/kg으로서, 기존의 선행기술에 비해 월등히 진보한 결과를 보였다.
아울러, 국내 자체기술로 발효버터를 제조하는 또 다른 문제점으로는 국내 발효버터 제조공정 미확보에 있다. 일반으로 전통적인 방법으로 발효버터를 제조하기 위해서는 원유에서 수분을 분리하여 크림을 제조한 후 유산균을 투여하여 발효한 다음, 필수적으로 교유(처닝, Churning)과정을 거쳐 제조된다. 교유 과정은 크림 내 잔존수분을 제거하고 지방끼리 뭉치게 하여 고형화하는 단계로서 버터를 만들기 위해서는 반드시 요구되는 공정이다. 그러나 발효 단계, 교유 단계, 그리고 교유 후 형태를 만들어주는 성형 단계를 연결시켜야 하기에 대규모 설비투자와 함께 산업체 내의 공정라인에 큰 변경을 주게 되어 경제성, 효율성에 큰 부담을 주게 된다.
유럽에서도 이러한 전통적 발효버터 제조공정을 단순화시키고자 니조(NIZO) 시스템이란 것을 고안하여 이 시스템을 이용하여 제조한 버터를 상용화시키고 있다. 이 니조(NIZO) 시스템은 전통 발효버터 제조 중 순차적으로 진행되는 단계들을 병렬적으로 진행한 다음, 병렬적 단계에서 완성된 중간제품들을 마지막 단계에서 혼합하는 시스템으로, 예를 들면 유산균으로 발효한 크림, 신맛을 내게 하기 위한 젖산, 향과 질감을 위한 천연버터 등을 혼합하여 빠른 시간 내에 발효버터를 완성하는 기술이다. 그러나 이 시스템은 중간중간의 여러 병렬적 단계들이 존재하며 마지막 최종 단계에선 역시나 최종적으로 교유 단계가 필수적이다.
따라서 복잡한 발효버터 제조공정을 단순화시키거나 혹은 교유 단계를 배제시킬 수 있는 제조공정 개발을 통해서 발효버터를 완성시킬 수 있다면 경제적 부가가치 외에 기술적으로도 우수한 국내 자체기술로서 활용이 가능할 것이다.
한국 공개특허 제1989-0007652호
이에 본 발명자들은 디아세틸 생산능이 우수한 신규 균주를 발견하고 이를 이용하여 제조한 발효크림을 가공버터 및 식용유지와 혼합함으로써, 별도의 교유(처닝) 과정이 없이 버터 고유의 풍미가 우수한 감칠맛이 증진된 발효버터를 제조할 수 있다는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서 본 발명은 디아세틸 생산능이 우수한 락토코커스 락티스 서브스페시스 크레모리스 LRCC5306(Lactococcus lactis subsp . cremoris , 기탁번호 KCCM11733P) 균주를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 이용한 디아세틸의 대량 생산방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 이용하여 제조한 발효크림을 이용하여, 교유단계(Churning) 없이 발효버터로 제조하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해 질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 아래와 같은 구성을 포함한다.
본 발명은 디아세틸 생산능이 우수한 락토코커스 락티스 서브스페시스 크레모리스 LRCC5306(Lactococcus lactis subsp . cremoris , 기탁번호 KCCM11733P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 락토코커스 락티스 서브스페시스 크레모리스 LRCC5306(Lactococcus lactis subsp . cremoris , 기탁번호 KCCM11733P)를 배양하는 단계; 및 (b) 종균 배양액을 구연산이 포함된 배지에서 첨가하고 발효시켜 디아세틸을 생성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 디아세틸 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 유크림을 포함하는 원료에 구연산을 첨가하고 락토코커스 락티스 서브스페시스 크레모리스 LRCC5306(Lactococcus lactis subsp . cremoris , 기탁번호 KCCM11733P) 균주의 종균 배양액을 접종하여 발효시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 발효물에 종균 배양액의 접종 시점을 기준으로 10 ~ 12 시간 경과한 시점에 철분(iron) 또는 망간(manganese) 또는 이들의 혼합물을 포함하는 첨가제를 첨가하고 배양하여 발효크림을 얻는 단계; 및
(c) 상기 발효크림에 가공버터 및 식용유지를 혼합하여 발효버터를 제조하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효버터의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 락토코커스 락티스 서브스페시스 크레모리스 LRCC5306 균주는 디아세틸 생성능이 우수하며, 치즈, 발효크림, 발효버터 등 다양한 유제품 제조 시 발효풍미 부여에 유용하다.
또한 본 발명에 따른 발효버터의 제조방법은 교유(처닝) 과정 없이 간소화된 공정으로 버터 고유의 풍미를 강화시킨 발효버터 제조가 가능하다는 이점이 있다.
도 1은 락토코커스 락티스 서브스페시스 크레모리스 LRCC5306의 당이용성 측정 결과이다.
도 2는 락토코커스 락티스 서브스페시스 크레모리스 LRCC5306의 16s rDNA 유전동정 결과이다.
도 3은 락토코커스 락티스 서브스페시스 크레모리스 LRCC5306 균주와 ATCC373 균주를 MRS 액상배지에 배양하였을 때 배양시간에 따른 디아세틸 생성량 분석 결과이다.
도 4는 락토코커스 락티스 서브스페시스 크레모리스 LRCC5306를 MRS 액상배지에 배양하면서 철분, 마그네슘, 망간, 칼슘을 첨가하는 시간에 따른 디아세틸 생성량 분석 결과이다.
도 5는 일반적인 종래의 발효버터의 제조 공정의 모식도이다.
도 6은 본 발명에서 따른 락토코커스 락티스 서브스페시스 크레모리스 LRCC5306 균주를 이용한 발효버터의 제조 공정의 모식도이다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 실시예는 발명의 요지가 변경되지 않는 한 다양한 형태로 변형될 수 있다. 그러나 본 발명의 권리범위가 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되면 공지 구성 및 기능에 대한 설명은 생략한다. 본 명세서에서 "포함"한다는 것은 특별한 기재가 없는 한 다른 구성요소를℃ 더 포함할 수 있음을 의미한다.
아울러, 본 발명에서 사용한 '발효크림'은 유크림으로부터 LRCC5306 균주를 투여하고 발효하여 얻은 것을 의미하며, '발효버터'는 발효크림을 교유 과정 없이 가공버터 및 식용유지를 혼합한 다음 고형화하여 얻은 것을 의미하는 것이다.
실험예 1: 락토코커스 락티스 서브스페시스 크레모리스 LRCC5306 의 선별
(1) 시료 채취 및 유산균 분리
우유를 기반으로 생장하는 유산균의 분리를 위해 롯데푸드 파스퇴르 공장 (강원도 횡성, 한국)에서 유우로부터 착유, 이송 및 집합된 시유를 채취하였다. 착유 시점 기준으로 2일 이내이면서 멸균 전의 시유만을 선별한 다음 채취된 시유를 멸균 식염수로 단계별로 희석한 뒤 0.1 ㎖를 취하였다. 이를 0.002 중량%의 BCP(Bromocresol purple)와 1.5 중량%의 한천(Agar)이 첨가된 MRS 고체배지에 도말하여 37℃가 유지되는 배양기에서 48 시간 배양하였다.
배양 후 노란색의 환이 나타나는 콜로니(Colony)를 선별하여 개체별로 동일한 배지에 2 ~ 3회 계대배양함으로써 각 균주를 순수 분리하였다.
상기 균주를 개체별로 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 48 시간 동안 재배양한 뒤 4℃로 냉장 보관하면서 사용하였다.
(2) 디아세틸 생성 우수 균주 선별
일반적인 디아세틸 생성 유산균의 대사 기작을 살펴보면, 영양분으로 이용된 포도당(Glucose)로부터 해당작용(Glycolysis)을 거쳐 생성된 피루브산(Pyruvate) 혹은 구연산 회로(TCA, Tricarboxylic Acid Cycle)로부터 생성된 구연산(Citrate)을 거쳐 생성된 피루브산(Pyruvate)로부터 알파-아세토락테이트가 생성되고, 결국 알파-아세토락테이트로부터 디아세틸이 생성되게 된다. 그러나 생성된 디아세틸은 보관시간, 보관온도 등 여러 조건에 따라 아세토인(Acetoin)으로 전환된다.
따라서 고농도 디아세틸 생성 균주를 선별하는 경우, 디아세틸의 전구체가 되는 알파-아세토락테이트 생성량을 함께 비교하는 것이 더욱 효율적인 방법으로 알려져 있다.
상기의 실험예에서 분리된 균주들은 MRS 고체배지에 접종하여 30℃에서 24 시간 동안 활성화한 다음, 활성화된 콜로니를 채취하여 MRS 액상배지 (MRS broth, Difco, USA) 10 ml이 첨가된 15 ml 멸균 튜브에 접종하고 동일한 조건으로 종균배양하였다.
알파-아세토락테이트 및 디아세틸 생성 균주를 선별하기 위해 MRS 액상배지에 구연산(citrate) 0.1 중량%를 첨가한 배지를 제조하고, 상기 균주들의 종균배양액을 1 중량% 접종하여 30℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후 배양액을 회수하여 원심분리(12,000 rpm, 10 분)한 다음, 가스크로마토 그래피-전저포획검출기를 (Gas Chromatography-Electron Capture Detector, Agilent, USA) 이용하여 알파-아세토락테이트, 디아세틸의 농도를 측정하였다. 각각의 표준품은 시그마 사(Sigma, USA)의 표준시약을 이용하였다. 분석 결과, 디아세틸 농도가 가장 높게 나타나는 균주를 최종 선별하였으며 이 때의 디아세틸 생성농도는 1.32 mg/L였다.
최종 선별된 균주는 MRS 액체배지에 접종하여 30?에서 48 시간 동안 배양하여 증식시키고, 원심분리(10,000 g, 10 분)하여 균체를 획득하였다. 상기 균체를 MRS 액체배지 : 글리세롤(Glycerol)이 4 : 1 비율로 포함된 냉동보관용액(Freezing solution)에 1 ml 첨가한 뒤, 크라이오튜브(Cryo-tube)에 넣어 -70℃에서 냉동보관하였다. 냉동된 균주를 이 후의 테스트를 위한 스타터로 사용하였다.
실험예 2: 균주의 특징 분석 및 동정
(1) 특징 분석
선별된 균주의 형태학적 및 생화학적 특징을 분석하였다. 이하 [표 1]를 참조하면, 상기 균주는 그람 양성, 간균으로 포자형성능 및 카탈라아제(Catalase) 음성으로 확인되었다.
특징 결과분석
콜로니 형태(Colony shape) 소형의 둥근 형태
콜로니 색(Colony color) 밝은 갈색
세포형태(shape) 구균(Coccus)
그람염색(Gram staining) 그람 양성
호기조건 통성 혐기성
포자 형성능(Endospore) 음성
포자 형태(Spore shape) 음성
카탈라아제 테스트(Catalase test) 음성
(2) 균주 동정
상기 균주의 당이용성을 API 50 CHL 키트(Biomerieux France)를 이용하여 분석하였다. 이하 [표 2] 및 도 1을 참조하면, 락토코커스 락티스 표준균주 (Lactococcus lactis ssp. lactis 1)와 87.7 % 일치하지만, 표준 균주(Lactobacillus plantarum 1)와 99.6 % 일치하지만, 아미그달린(Amygdalin)에 대한 이용성은 75 % 다른 것으로 확인되었다.
스트립(Strip) 0-19
튜브/기질		 +/- 스트립(Strip) 20-39
튜브/기질		 +/- 스트립(Strip) 40-49
튜브/기질		 +/-
0 대조군 - 20 α-메틸-D-만노시드
(Mannoside)		 - 40 D-투라노스
(TURanose)		 +
1 글리세롤 - 21 α-메틸-D-글루코시드 - 41 D-리로스
(LYXose)		 -
2 에리트리톨
(ERYthritol)		 - 22 N-아세틸-글루코사민 + 42 D-타가토스
(TAGatose)		 -
3 D-아라비노즈
(Arabinose)		 - 23 아미그달린
(AMYgdalin)		 + 43 D-푸코스
(FUCose)		 -
4 L-아라비노즈 + 24 알부틴 (ARButin) + 44 L-푸코스 -
5 리보스 (Ribose) + 25 에스쿨린 (Esculin) + 45 D-아라비톨
(ArabitoL)		 -
6 D-자일로스
(XYLose)		 - 26 살리신 (SALicin) + 46 L-알비톨 -
7 L-자일로스 - 27 셀로비오스
(CELobiose)		 + 47 굴루코나테
(GlucoNaTe)		 +
8 아도니톨
(ADOnitol)		 - 28 말토스 (MALtose) + 48 2-게톤-글루코네이트 -
9 β-메틸-D-자일로스 - 29 락토스 (LACtose) + 49 5-게토-글루코네이트 -
10 갈락토스
(GALactose)		 + 30 멜리비오스
(MELibiose)		 +
11 글루코스
(GLUcose)		 + 31 수크로스
(Sucrose)		 +
12 프럭토스
(FRUctose)		 + 32 트레할로스
(TREhalose)		 +
13 만노스 (MANose) + 33 이눌린 (INUline) -
14 스로보스
(SroBose)		 - 34 멜리지토스
(MeLeZitose)		 +
15 람노스
(RHAmnose)		 - 35 라프피노스
(RAFfinose)		 +
16 둘시톨(DULcitol) - 36 전분 -
17 이노시톨
(INOsitol)		 - 37 글리코겐
(GLYcoGen)		 -
18 만니톨(MANitol) + 38 자일리톨
(XyLiTol)		 -
19 솔비톨(SORbitol) + 39 젠티오비오스
(GENtiobiose)		 +
상기 균주의 16s rRNA 유전자 염기서열은 서열번호 1과 같다. 염기서열 분석 결과 상기 균주는 락토코커스 속 균주와 최대 100 % 상동성(Partial Sequence)을 가진다. 이는 도 2에서 확인할 수 있다.
이에 본 발명자는 상기 균주를 새로운 락토코커스 락티스 크레모리스 균주로 동정하였고, 락토코커스 락티스 서브스페시스 크레모리스 LRCC5306으로 명명하여 한국미생물보존센터에 2015년 7월 22일자로 기탁하였다(기탁번호 KCCM11733P).
실험예 3: 락토코커스 락티스 서브스페시스 크레모리스 LRCC5306 의 디아세틸 최적생성조건
신규한 유산균 락토코커스 락티스 서브스페시스 크레모리스 LRCC5306의 디아세틸 생성을 위한 최적조건을 확립하고자 하였다. LRCC5306 균주의 디아세틸 생성능을 비교하기 위한 대조군으로는 디아세틸 생성 관련하여 많은 연구가 되어 있는 기존의 락토바실러스 카제이 ATCC 393 균주를 한국미생물보존센터로부터 분양받아 실험하였다.
(1) 최적 온도 조건 확립
최적 디아세틸 생성을 위한 LRCC5306 균주의 배양 온도를 비교하였다. 상기 실험예 1에서와 동일하게 구연산이 0.1 중량% 첨가된 MRS 액상배지에 LRCC5306 균주와 ATCC373 균주의 종균배양액 1.0 중량%를 첨가한 다음, 10, 20, 25, 30, 37℃에서 각각 배양을 진행하였다. 24 시간 배양 후 배양온도에 따른 디아세틸 생성능 역시 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 분석하여 [표 3]에 나타내었다. 결과에 나타낸 것처럼, LRCC5306의 경우 디아세틸을 최적으로 생산할 수 있는 배양 온도는 20 ~ 25℃인 것으로 확인되었으며, 이는 일반적으로 락토코커스 락티스 균주들이 25℃ 이하의 낮은 온도에서 대사산물 분비능이 우수하다는 기존의 연구와 유사한 것으로 나타났다. 20℃와 25℃ 간에는 디아세틸 생성능이 유의적으로 차이가 나지는 않았으나, 다소 높은 편인 20℃를 최적 온도로 설정하였다. ATCC373 균주의 경우, LRCC5306 균주와 마찬가지로 20℃에서 최적의 디아세틸을 생성하였으나 37℃를 제외한 다른 온도에서는 대체로 LRCC5306 균주에 비해 디아세틸 생성량이 낮은 것으로 확인되었다.
배양온도(℃) 디아세틸 (mg/L)
LRCC5306 ATCC373
0 0.0 0.0
10 0.0 0.0
20 20.64 15.41
25 18.32 10.52.
30 14.25 8.05
37 11.48 6.91
(2) 최적 배양 시간 확립
최적 디아세틸 생성을 위한 LRCC5306 균주의 배양 시간을 비교하였다. 상기의 실험예들과 동일하게 구연산이 0.1 중량% 첨가된 MRS 액상배지에 LRCC5306 균주와 ATCC373 균주의 종균배양액 1.0 중량%를 첨가한 다음, 20℃에서 배양을 진행하였으며, 접종 시점을 기준하여 적정 시간별로 샘플링을 진행하였고 시간대별 샘플의 디아세틸 생성능을 분석하여 [도 3]에 나타내었다. [도 3]에 나타낸 것처럼, LRCC5306의 디아세틸 생성 패턴은 14 ~ 16 시간에 가장 높게 나타났으며, 그 시간이 지나갈수록 오히려 감소하는 경향을 나타내었다. ATCC373의 경우, LRCC5306에 비해 다소 빠른 13 시간 정도에서 최적의 디아세틸 생성량을 나타내었으나 대체로 LRCC5306에 비해서는 낮은 농도로 나타났다. 따라서 LRCC5306의 디아세틸 생성을 위한 최적 배양시간은 15 시간으로 설정하였다.
(3) 최적 구연산 농도 확립
LRCC5306 균주와 ATCC373 균주의 배양 시 첨가하는 구연산 농도에 따라 생성되는 디아세틸 농도를 비교하고자 하였다. 상기의 실험예와 동일하게 MRS 액상배지를 제조한 다음, 첨가되는 구연산 농도를 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 중량%로 다르게 하여 투여한 다음 20℃에서 15 시간 배양하였다. 구연산 첨가 농도에 따른 디아세틸 생성능은 [표 4]에 나타내었다. 구연산 첨가 농도의 경우, 첨가하지 않은 경우에 비해 첨가하였을 경우 크게 유의적으로 디아세틸 농도가 증가한 것으로 나타났다. 그러나 농도에 따라 디아세틸 생성량이 유의적으로 변하는 것은 확인할 수 없었으며, 0.2 중량% 첨가할 경우 최적인 것으로 확인되었다.
구연산(중량%) 디아세틸(mg/L)
LRCC5306 ATCC373
0 27.42 21.44
0.1 40.48 31.73
0.2 43.26 31.86
0.3 42.75 31.91
0.5 43.01 31.74
1.0 42.85 31.86
2.0 34.43 29.35
3.0 35.20 26.22
(4) 첨가제(철분, 마그네슘, 망간, 칼슘)가 균주 생장에 미치는 영향 평가
일반적인 디아세틸 생성 기작에 따르면, 전구체인 알파-아세토락테이트로부터 디아세틸이 생성될 때 관여하는 효소가 알파-아세토락테이트 디카복실레이즈(α-Acetolactate decarboxylase)인 것으로 알려져 있다. 기존의 문헌에 따르면 철분(Iron)을 비롯하여 특정한 금속 이온 첨가 시 이 알파-아세토락테이트 디카복실레이즈의 역가를 향상시킬 수 있다고 하였으며, 따라서 본 발명의 LRCC5306 균주 배양 시 다양한 금속 이온에 의한 영향을 확인하기로 하였다.
상기 실험예와 동일하게 LRCC5306 균주와 ATCC373 균주를 종균배양하였고 구연산이 0.2 중량% 첨가된 MRS 액상배지에 종균배양액 1.0 중량%를 접종한 다음, 20℃에서 배양하면서 배양시간에 따라, 상기 구연산, 종균배양액이 포함한 액상 배지 100 중량부에 대해 철분 (Fe3 +, Iron), 마그네슘 (Mg 2+, Magenisium), 망간 (Mn2 +, Manganese), 칼슘 (Ca2 +, Calcium)을 0.01 중량부를 추가로 첨가하여 주었다. 최종 배양시간은 동일하게 15 시간에 종료하였으며, 배양 종료 후 회수하여 상기 실험예 1에서와 같은 방법으로 디아세틸 농도를 분석하여 [도 4]에 나타내었다.
결과에 나타낸 것처럼, 접종 시간 기준하여 10 시간 경과 시점에 철분을 첨가한 군에서 디아세틸이 가장 많이 증가하였으며, 망간을 첨가하였을 경우 12 시간 시점에 첨가한 군이 두 번째로 높은 증가량을 나타내었다. 마그네슘과 칼슘을 첨가할 경우 본 발명의 LRCC5306 균주의 디아세틸 생성량에는 큰 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.
이는 배양 초기, 즉 10 시간 이전에 첨가되는 철분은 알파-아세토락테이트 디카복실레이즈의 활성을 높여주기보다는 균체 생장에 이용되는 것으로 추정되며, 디아세틸이 발생되기 시작하는 10 시간 시점에 철분을 첨가해주는 것이 디아세틸 농도 증가에 영향을 준 것으로 여겨진다. 따라서 LRCC5306의 종균배양액을 접종한 다음 경과 10 시간 시점에 철분을 첨가하는 것이 LRCC5306의 디아세틸 생성을 가장 증가시켜주는 것으로 설정하였다.
상기에서 확인된 철분과 망간을 농도별로 첨가하였을 경우의 디아세틸 생성량을 비교하고자 하였다. 상기와 동일한 방법으로 구연산 0.2 중량%가 첨가된 액상배지에 LRCC5306 균주의 종균배양액 1.0 중량%를 투여하여 배양하였으며, 철분과 망간은 접종 시점 기준하여 각각 배양 10 시간과 12 시간에 액상배지 100 중량부에 대해 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1 중량부를 추가로 첨가하여 주었다. 최종 배양시간은 15 시간으로 종료하였다. 철분과 망간 첨가 농도에 따른 디아세틸 분석결과는 [표 6]에 나타내었다.
[표 6]에 나타낸 것처럼, 철분과 망간 모두 0.0001 중량부에서는 디아세틸 증가량이 유의적으로 나타나지 않았으며, 반면 0.001 중량부 이상 첨가할 경우엔 농도별로 증가량이 거의 차이가 없는 것으로 나타났다. 이는 금속이온이 디아세틸 생성에 중요 성분으로 작용은 하지만 역가 향상에 많은 농도를 사용하지 않는 것으로 여겨진다. 따라서 경제성을 고려하여 최적 금속이온 농도는 철분과 망간 모두 0.001 중량부로 결정하였으며 디아세틸 생성량이 다소 높은 것으로 확인된 철분을 본 발명의 최종 금속이온으로 결정하였다.
투여농도(중량부) LRCC5306 균주 배양 중 디아세틸(mg/L)
철분 망간
0.0001 41.72 42.44
0.001 66.51 62.74
0.01 63.31 64.18
0.1 64.12 62.91
1 63.25 62.16
실험예 4: 락토코커스 락티스 서브스페시스 크레모리스 LRCC5306 을 이용한 발효크림 제조
본 발명의 LRCC5306 균주와 상기의 실험예 3에서 확립된 최적 배양조건을 이용하여 실제 발효크림을 제조하고자 하였다.
본 발명의 LRCC5306 균주의 준비를 위해 상기에서 서술한 실험예에 따라 MRS 고체배지에서 활성화시킨 다음, MRS 액상배지에서 종균배양을 진행하였다. 배양종료된 배양액을 회수하여 원심분리(8,000 rpm, 10 분)한 다음 상등액을 제거하고 0.1 M 인산완충액(Phosphate buffer, pH 6.8)를 일정량 투여하고 균체를 현탁해주었다. 동일한 단계를 3회 반복한 다음 최종 상등액을 제거 후 초기 종균배양액 대비하여 5 부피%에 해당하는 0.1 M 인산완충액을 첨가하고 균체를 현탁함으로써 종균배양액을 완성하였다.
발효크림의 제조를 위해 시중에서 판매되는 유크림을 구매하여 사용하였으며, 유크림 78.8 g과 탈지유 20 g에 구연산 0.2 g를 첨가하고 상기에서 제조한 LRCC5306 종균배양액을 1 g 투여한 다음 20℃에서 배양하였다. 접종 기준 배양 10 시간 시점에 철분 0.001 g을 첨가한 다음 5 시간 동안 추가 배양하여 발효크림을 완성하였다.
완성된 발효크림의 초기 생균수는 2.11 x 108 CFU/g 였으며, 15 시간 발효 후 발효크림의 생균수는 1.42 x 109 CFU/g 로 나타났고, 디아세틸 농도 측정 결과 23.4 mg/kg로 확인되었다.
실험예 5: 종래의 발효버터 제조 및 본 발명에 따른 발효버터 제조
종래의 전통적인 발효버터 제조방법에 따라 LRCC5306을 이용한 발효버터를 제조하고, 이를 상기 실험예 4에서의 발효크림을 첨가한 발효버터를 제조하여 비교하기로 하였다.
도 5는 전통적인 발효버터의 제조 공정을 나타낸 것으로, 먼저 발효버터 제조를 위해 시중에서 판매되는 우유를 이용하였으며, 원심분리 및 유크림 분리기를 이용하여 수분을 1차 제거하고 유크림만을 95℃에서 20 분간 살균하여 준비하였다. 준비된 유크림을 전통적 발효버터 제조방법에 따라 물리적인 전처리 단계로서 19℃에서 5 시간 → 14℃에서 4 시간 → 9℃에서 9 시간 등 총 18 시간 동안 전처리하여 주었다. 그 다음 유산균 발효단계로서 상기 실험예에서 준비한 LRCC5306 균주의 종균배양액 1 중량%를 첨가하고 15 시간 동안 발효시킨 다음 4℃에서 12 시간 동안 저온숙성을 진행하였다. 저온 숙성 후 교유 단계를 위해 시중에서 판매하는 휘핑기(Whipper)를 이용하여 수작업으로 교반하여 주었으며 고형화가 이루어져 수분과 완전히 분리될 때까지 진행하여 주었다. 최종적으로 분리된 수분은 제거하고 고형화된 부분만을 회수하여 전통적 방법에 의한 발효버터를 완성하였다.
다음으로 도 6은 본 발명에 따른 발효버터의 제조 공정을 나타낸 것으로, 상기 실험예 4에서 완성한 발효크림을 회수하여 75℃에서 5 분 동안 살균한 다음 살균된 발효크림 12 g과 가공버터 63 g(Prepared edible fat 97/3, 버터 97%, 야자유 3%) 및 식용유지 25 g을 혼합하였으며 60℃ 항온 수조에서 30 분 동안 용해, 교반한 다음 4℃로 옮겨 20 분 동안 급속 냉각시켜 본 발명에 따른 발효버터를 제조하였다.
완성된 전통적 방식의 발효버터와, 본 발명에 따른 발효크림으로부터 제조한 발효버터의 디아세틸 농도와 총 제조 시간을 분석, 비교하여 [표 7]에 나타내었다.
구체적으로, 전통적 방식을 거쳐 발효버터를 제조한 경우, 총 50 시간의 제조시간이 소요되었으며 이때의 디아세틸은 0.91 mg/kg이 생성된 것으로 확인되었다. 반면 본 발명에 따른 발효버터 제조 공정의 경우, 총 20.5 시간이 소요되며 이때의 디아세틸은 2.64 mg/kg인 것으로 확인되었다.
일반적인 발효버터의 디아세틸이 0.4 내지 1.2 mg/kg인 것을 비교한다면 상기 실험예에서 확립된 조건을 통해 발효크림을 만들고 이를 본 발명의 방법에 따라 발효버터를 제조할 경우 높은 디아세틸 생성이 가능한 것으로 확인할 수 있다.
구분 제조시간 및 디아세틸 농도
제조시간 공정단계 전통적 발효버터 발효크림 유래 발효버터
유크림 분리 1 0
유크림 살균 3 3
물리적 전처리 18 0
유산균 발효 15 15
저온 숙성 12 0
교유 및 고형화 1 0
제품 성형 0 1
총 제조시간 50 시간 19 시간
디아세틸 디아세틸 (mg/kg) 0.91 2.64
실험예 6: 탈지분유가 본 발명의 발효버터에 미치는 영향
실시예 1과 동일한 방법으로 유크림 77.8 g과 탈지유 20 g에 구연산 0.2 g을 혼합하여 LRCC5306 종균배양액 2 g을 접종하고 20 ℃ 온도에서 15 시간 발효하여 발효크림을 제조하였다. 이렇게 제조된 발효크림을 75℃에서 5 분 동안 살균하고, 탈지분유 0.5 g(실험예 6-1), 1 g(실험예 6-2), 2 g(실험예 6-3), 4 g(실험예 6-4) 각각을, 살균된 발효크림 12 g, 식용유지 23 g, 가공버터에 혼합하여 100 g이 되도록 하고, 이를 60℃ 항온 수조에서 용해시키며 혼합하였다. 혼합물을 0℃ 항온 수조에서 교반하면서 급속 냉각시켜 발효버터를 제조하였다.
탈지분유를 첨가하여 만든 발효버터(실험예 6)와 첨가하지 않은 발효버터(실험예 5)의 감칠맛 지표를 분석하여 [표 8]에 나타내었다. 상기 맛 분석 결과는 Taste Sensing System(Cat.N.O. : SA-402B) 기기를 사용하였으며 기준물질로 MSG(Mono sodium glutamate)를 사용하였다.
구분 실험예 5 실험예 6-1 실험예 6-2 실험예 6-3 실험예 6-4
탈지분유 첨가량(중량%) 무첨가 0.5 중량% 1 중량% 2 중량% 4 중량%
감칠맛(Umami) 4.6 4.8 5.1 6.8 7.1
상기 [표 8]을 살펴보면, 본 발명에 따른 발효버터에 탈지분유를 2.0 ~ 4.0 중량%를 첨가하면 감칠맛(Umami)이 기존 무첨가 발효버터 대비 47 ~ 54% 증가하는 것으로 확인되었다. 그러나 2.0 중량% 첨가하였을 때 증가한 감칠맛과 4.0 중량% 첨가하였을 때 증가한 감칠맛을 비교하여 보면 첨가되는 탈지분유 농도에 따라 감칠맛이 증가하지는 않는 것으로 확인되었으며, 이는 단순히 탈지분유 투여농도와 감칠맛이 비례하지 않는 것으로 판단된다. 감칠맛이 증가하면 발효버터 내 버터 고유의 고소한 풍미를 더욱 상승시켜 진한 유풍미의 맛을 가질 수 있었다.
실시예 1: 발효버터의 제조
유크림 76 g, 탈지유 20 g, 및 구연산 2 g을 혼합하여 LRCC5306 종균배양액 2 g을 투여하여 20℃에서 15 시간 발효하여 발효크림을 제조하였다. 이렇게 제조된 발효크림을 75℃에서 5 분 동안 살균하고, 살균된 발효크림 12 g, 가공버터 63 g(이때 가공버터(Prepared edible fat 97/3, 네덜란드산)는 버터 97 % 및 야자유 3 %가 혼합되어 있는 것을 사용하였음), 식용유지 23 g과 탈지분유 2 g을 혼합하여 60℃ 항온 수조에서 용해시켜 혼합하였다. 혼합물을 0℃ 항온 수조에서 교반하면서 급속냉각시켜 발효버터를 제조하였다.
실시예 2: 발효버터의 제조
실시예 1과 동일한 방법으로 유크림 77.8 g과 탈지유 20 g에 구연산 0.2 g을 혼합하여 LRCC5306 종균배양액 2 g을 접종하고 20℃ 온도에서 15 시간 발효하여 발효크림을 제조하였다. 이렇게 제조된 발효크림을 75℃에서 5분 동안 살균하고, 살균된 발효크림 12 g, 가공버터 63 g, 식용유지 23 g과 탈지분유 2 g을 혼합하여 60℃ 항온 수조에서 용해시키며 혼합하였다. 혼합물을 0℃ 항온 수조에서 교반하면서 급속냉각시켜 발효버터를 제조하였다.
실시예 3: 첨가제를 이용한 발효버터의 제조
실시예 1과 동일한 방법으로 유크림 77.8 g과 탈지유 20 g에 구연산 0.2 g을 혼합하여 LRCC5306 종균배양액 2 g을 접종하고 20 ℃온도에서 15 시간 발효시켰다. 구체적으로 LRCC5306 종균배양액을 접종한 시간으로부터 10 시간 후, 다시 말해, 발효 10 시간에 철분(Fe3 +) 0.001 g을 혼합하고 3 시간 동안 추가 발효하여 총 15 시간을 발효시킴으로써 발효크림을 제조하였다.
이렇게 제조된 발효크림을 75℃에서 5 분 동안 살균하고, 살균된 발효크림 12 g, 가공버터 63 g, 식용유지 23 g과 탈지분유 2 g을 혼합하여 60℃ 항온 수조에서 용해시키며 혼합하였다. 혼합물을 0℃ 항온 수조에서 교반하면서 급속냉각시켜 발효버터를 제조하였다.
실시예 4: 첨가제를 이용한 발효버터의 제조
실시예 1과 동일한 방법으로 유크림 77.8 g과 탈지유 20 g에 구연산 0.2 g을 혼합하여 LRCC5306 종균배양액 2 g을 접종하고 20℃ 온도에서 15 시간 발효시켰다. 구체적으로 LRCC5306 종균배양액을 접종한 시간으로부터 12 시간 후, 다시 말해, 발효 12 시간에 망간(Mn2 +) 0.001 g을 혼합하고 3 시간 동안 추가 발효하여 총 15 시간을 발효시킴으로써 발효크림을 제조하였다.
이렇게 제조된 발효크림을 75℃에서 5 분 동안 살균하고, 살균된 발효크림 12 g, 가공버터 63 g, 식용유지 23 g과 탈지분유 2 g을 혼합하여 60℃ 항온 수조에서 용해시키며 혼합하였다. 혼합물을 0℃ 항온 수조에서 교반하면서 급속냉각시켜 발효버터를 제조하였다.
비교예 1: 일반버터의 제조
가공버터 63 g과 식용유지 25 g을 혼합하여 일반버터를 제조하였다.
비교예 2 내지 3: 수입산 발효버터
시판되고 있는 유럽산 발효버터 2종을 구매하여, 구체적으로 ISIGNY SAINTE-MERE(제조사: ISIGNY, 프랑스)는 비교예 2로, 루어팍 버터(제조사: ARLA, 덴마크)는 비교예 3으로 하여, 본 발명의 LRCC5306을 이용하여 제조한 상기 실시예의 발효버터와 비교하였다. 특히 상기 프랑스산 발효버터의 경우 국내 소비자들로부터 선호도가 높아 본 발명과 비교하고자 하였다.
실험예 7: 디아세틸 함량 분석방법
상기 실시예 1 ~ 4과 비교예 1 ~ 3에서 제조한 버터에 함유된 디아세틸 함량 측정하여, 하기 [표 9]에 나타내었다.
1) 기기종류: GC/ECD
2) 칼럼: DB-WAX(30 m x 0.25 mm x 0.5 ㎛)
3) 검출기: ECD(전자포획검출기)
4) 시험용액 주입부 및 검출기의 온도: 200℃, 220℃
5) 캐리어 가스 및 유량: 1.0 ml/min (split 2:1)
6) 칼럼오븐 온도조건: 40℃에서 2 분간 유지하고, 5 ℃/min의 비율로 100℃까지 온도를 상승시킨 후 40℃/min의 비율로 200℃까지 상승, 200℃에서 2 분간 유지하였다.
* 정량한계 0.07 mg/kg
구 분 디아세틸 함량(mg/kg)
실시예 1 1.36
실시예 2 1.45
실시예 3 2.71
실시예 4 2.64
비교예 1 0.22
비교예 2 0.48
비교예 3 1.14
상기 표 9의 결과에 의하면, 상기의 실험예들에서 확립된 방법 즉, 실시예 3에서의 디아세틸 함량은 2.71 mg/kg이었으며, 철분을 첨가하지 않은 실시예 1과 실시예 2에서의 디아세틸 농도를 비교하여 볼 때, 철분(iron) 첨가로 인해 디아세틸의 생성 능력이 높아지며 발효버터 내 디아세틸의 풍미가 증가하였다는 것을 확인할 수 있었다. 이는 시중에서 판매되는 수입산 발효버터에 비해 월등히 높은 함량으로 확인되었다.
따라서 상기 실험예 5 ~ 6, 실시예 1 ~ 4, 및 비교예 1 ~ 3의 결과를 살펴보면, 본 발명에 따른 발효버터가 수입산 발효버터에 비해 맛과 풍미는 유사하면서도 발효풍미의 지표인 디아세틸은 월등히 높은 것으로 판단할 수 있다. 또한 본 발명의 발효버터 제조방법은 공정을 간소화시키면서도 교유 단계 등을 배제시킴으로써 현장 적용에 매우 유리한 측면을 가지고 있어 기술성, 경제성 등에서 우수성이 높은 우수한 발명이다.
이상으로 본 발명에 대해 상세히 설명하였다. 다만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되지 않고, 이하의 특허청구범위에 의해 정해진다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11733P 20150722
<110> LOTTE FOODS CO., LTD. <120> Lactococcus lactis subsp. cremoris LRCC5306 strain, method for producing diacetyl using the same, and method for manufacturing cultured butter using the same <130> DP-2015-0403 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1335 <212> DNA <213> Lactococcus lactis subsp. cremoris LRCC5306 <400> 1 cccaactccc gtggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc 60 gtgctgatcc gcgattacta gcgattccga cttcatgtag gcgagttgca gcctacaatc 120 cgaactgaga atggttttaa gagattagct aaacatcact gtctcgcgac tcgttgtacc 180 atccattgta gcacgtgtgt agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc 240 caccttcctc cggtttatca ccggcagtct cgttagagtg cccaacttaa tgatggcaac 300 taacaatagg ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac 360 gacaaccatg caccacctgt atcccgtgtc ccgaaggaac ttcctatctc taggaatagc 420 acgagtatgt caagacctgg taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc 480 accgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt tgagtttcaa ccttgcggtc gtactcccca 540 ggcggagtgc ttattgcgtt agctgcgata cagagaactt atagctccct acatctagca 600 ctcatcgttt acggcgtgga ctaccagggt atctaatcct gtttgctccc cacgctttcg 660 agcctcagtg tcagttacag gccagagagc cgctttcgcc accggtgttc ctccatatat 720 ctacgcattt caccgctaca catggaattc cactctcctc tcctgcactc aagtctacca 780 gtttccaatg catacaatgg ttgagccact gccttttaca ccagacttaa taaaccacct 840 gcgctcgctt tacgcccaat aaatccggac aacgctcggg acctacgtat taccgcggct 900 gctggcacgt agttagccgt ccctttctgg gtagttaccg tcacttgatg agctttccac 960 tctcaccaac gttcttctct accaacagag ttttacgatc cgaaaacctt cttcactcac 1020 gcggcgttgc tcggtcagac tttcgtccat tgccgaagat tccctactgc tgcctcccgt 1080 aggagtttgg gccgtgtctc agtcccaatg tggccgatca ccctctcagg tcggctatgt 1140 atcatcgcct tggtgagcct ttacctcacc aactagctaa tacaacgcgg gatcatcttt 1200 gagtgatgca attgcatctt tcaaacttaa aacttatgtt taaagttgtt atgcggtatt 1260 agcattcgtt tccaaatgtt gtcccccgct caaaggcaga ttccccacgc gttactcacc 1320 cgttcgctgc tcttc 1335

Claims (10)

  1. 삭제
  2. 유크림을 포함하는 원료에,
    구연산; 락토코커스 락티스 서브스페시스 크레모리스 LRCC5306(Lactococcus lactis subsp. cremoris, 기탁번호 KCCM11733P)의 종균 배양액; 및 철분(iron)인 첨가제;
    를 첨가하고 배양하는 단계를 포함하되,
    상기 첨가제는 종균 배양액의 배지 내 첨가 시점을 기준으로 10 ~ 12 시간 경과한 시점에 첨가하는 것을 특징으로 하는 발효크림의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 구연산은 배지 전체 중량에 대해 0.1 ~ 2 중량%로 첨가하는 발효크림의 제조방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 첨가제는 배지를 100 중량부로 하였을 때, 0.001 ~ 0.01 중량부로 첨가하는 발효크림의 제조방법.
  5. 삭제
  6. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 발효크림.
  7. 제6항의 발효크림을 사용하여 제조한 식품.
  8. 제6항의 발효크림에 가공버터 및 식용유지를 혼합하는 단계를 포함하고, 교유 단계를 포함하지 아니하는 발효버터의 제조방법.
  9. 삭제
  10. 제8항의 방법으로 제조되는 발효버터.
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Title
Analytical Biochemistry. 1987, Volume 160, Issue 2, pp. 323-331.
Methods in enzymology. 1988, Volume 166, pp. 234-240.

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