KR101819606B1 - 감송향 추출물을 함유하는 고혈압 예방 또는 개선용 식품 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감송향 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환 개선 또는 예방용 식품 조성물에 관한 것이다. 상기 상기 심혈관계 질환은 고혈압 또는 고혈압성 심장질환일 수 있다. 상기 감송향 추출물은 수용성 에폭사이드 가수분해효소 저해 효과가 뛰어나고 NO 생성 억제 효과가 우수하여, 심혈관계 질환의 개선 또는 예방에 효과가 우수할 뿐만 아니라, 천연물질을 유효성분으로 하는 것으로 부작용의 문제가 발생되지 아니하여 심혈관계 질환을 치료 또는 예방하기 위하여 널리 사용할 수 있다.

Description

감송향 추출물을 함유하는 고혈압 예방 또는 개선용 식품 조성물{FOOD COMPOSITION FOR PREVENTING OR IMPROVING THE HYPERTENSION CONTAINING NARDOSTACHYS CHINENSIS EXTRACT}

본 발명은 고혈압 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

급속한 경제발전과 더불어 질병양상도 크게 변하여 고혈압, 허혈성 심질환 및 뇌혈관질환 등 순환기계 질환의 중요성이 더욱 커지고 있다. 최근 통계청이 발표한 자료에 의하면, 2005년 총인구 중에서 65세 이상 노령인구의 비율은 9.1%를 차지하고 있고, 14세 이하 유년인구의 비중은 점차 줄어들고 있으며, 65세 이상 인구의 비중은 지난 2000년에 7.2%를 기록하여 우리 사회는 이미 고령화 사회로 진입한 것으로 평가된다. 또한, 2003년 기준으로 우리나라 국민의 평균수명은 77.5세로 노령인구가 급격하게 증가되고 있는 추세이다. 한편, 통계청이 발표한 우리나라 1인당 GNI는 2004년 14,162달러였으며, 매년 10% 이상 증가하고 있어 삶의 질은 점차 나아지고 있다고 할 수 있다.

이러한 사회적 조건의 변화에 의해, 과거 주요한 사망원인인 전염성 질병에 의한 사망자 수는 급격하게 줄어들고 있는 반면에 암, 고혈압, 뇌혈관질환, 당뇨병 등의 퇴행성 질환에 의한 사망자 수는 꾸준히 증가하고 있다.

고혈압은 만성 순환기계 질환 중 발생빈도가 가장 높은 질환으로 비교적 증상이 없는 편이지만 뇌졸증, 심부전, 관상동맥질환 등 치명적인 합병증을 유발할 수 있기 때문에 보다 적극적인 관리와 치료가 요구된다. 특히, 본태성 고혈압은 고혈압의 80%에 해당하며 유전적 인자와 환경적 인자의 복합적인 산물로서 고혈압의 가족력, 인종, 염분의 섭취량, 인슐린의 저항성, 비만 그리고 과도한 음주 및 노화 등이 관여하는 것으로 생각되고 있다.

최근 고혈압에 대한 일련의 연구결과에 의하면, 수용성 에폭사이드 가수분해효소(soluble epoxide hydrolase, sEH)의 저해제(sEH inhibitor, sEHIs)가 혈압강하 등의 효과를 갖고 있음이 보고되고 있다.

상기 에폭사이드 가수분해효소, 구체적으로 포유류의 수용성 에폭사이드 가수분해효소는 두 개의 domain으로 구성된 homodimer이다. 이 중, C-terminal domain은 에폭사이드 가수분해에 촉매작용을 하는 역할을 하며, N-terminal domain은 인산가수분해효소 역할을 하며, 수용성 에폭사이드 가수분해효소는 고혈압과 관련이 있는 epoxyeicosatrienoic acids(EETs)와 같은 에폭사이드 지방산(epoxy fatty acid) 중간물질을 가수분해하는 것으로 알려져 있다. 상기 수용성 에폭사이드 가수분해효소에 의해 EETs에서 dihydroxyeicosatrienoic acids(DHETs)로 분해되면 그 생화학적 활성을 잃게 되므로, 이로 인하여, 수용성 에폭사이드 가수분해효소 저해에 의해 EETs의 농도를 유지하게 되면 질병을 개선하는데 높은 효과를 보일 것으로 알려져 있다.

기존에 고혈압 치료제로 알려진 물질은 전신에 힘이 빠지거나, 백혈구 감소, 혈관 부종, 간기능 이상, 구토, 마른 기침, 두통, 식욕부진, 및 미각이상을 일으키는 등 부작용과 관련된 문제가 있는 것으로 보고되고 있다.

따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 부작용이 문제되지 아니하고 안전성이 확보되는 천연물질 유래 수용성 에폭사이드 가수분해효소 저해제의 개발이 시급히 요구되고 있다. 특히, 식품으로 사용되는 천연물 유래의 수용성 에폭사이드 가수분해효소 저해제의 경우, 안전성 확보가 용이하므로, 이에 대한 연구의 필요성이 증가되고 있다.

KR2008-0109846A KR2009-0064480A KR2010-0110532A KR2011-0005536A

상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 수용성 에폭사이드 가수분해효소를 효과적으로 저해하고, 혈압 강하능이 있어, 고혈압의 치료, 예방 또는 개선에 유용하고 천연물에서 비롯하여 부작용 등이 문제되지 아니하며, 안정성이 우수한 고혈압 치료 또는 예방용 조성물의 유효성분을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 감송향 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환 개선 또는 예방용 식품조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 심혈관계 질환이란 심장질환과 혈관질환을 포함한 질환으로, 고혈압, 고혈압성 심장질환, 심장병, 부정맥, 뇌졸중, 혈전증, 협심증, 심부전, 심근경색, 죽상경화증 및 동맥경화로 이루어진 군중에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 고혈압 또는 고혈압성 심장질환일 수 있다.

보고된 자료에 의하면, 수용성 에폭사이드 가수분해효소의 저해제는 항염증 또는 항고혈압 효과가 있으므로, 상기 수용성 에폭사이드 가수분해효소의 저해효과에 의하여 고혈압 등의 심혈관계 질환의 치료, 예방 또는 개선 효과가 있을 것으로 예상된다.

본 발명에서, 혈압이란 혈액이 혈관 벽에 가하는 힘을 말한다. 혈압을 읽을 때에는 수축기 혈압(최고혈압)과 확장기 혈압(최저혈압)으로 나누어서 읽는다. 수축기 혈압은 심장이 수축하면서 혈액을 내보낼 때 혈관에 가해지는 압력이고, 확장기 혈압은 심장이 확장(이완)하면서 혈액을 받아들일 때 혈관이 받는 압력이다.

본 발명에서, 고혈압이란 18세 이상의 성인에서 수축기 혈압이 140 mmHg 이상이거나 확장기 혈압이 90 mmHg이상인 질환으로, 원인이 발견되지 않는 경우를 본태성(일차성) 고혈압과 원인이 밝혀져 있고 이에 의해 고혈압이 발생하는 경우으로 구분되며, 전체 고혈압 환자의 약 95%는 본태성 고혈압이다. 상기 고혈압에 의해 유발되는 질병으로는 고혈압심장병(hypertensive heart disease) 등이 있다.

본 발명에서, 동맥경화는 동맥의 벽이 두꺼워져 동맥의 탄력이 저하되는 질환을 의미한다. 상기 동맥경화가 발병되면 경화된 동맥으로부터 혈액을 공급받던 장기에 대한 혈액 공급이 감소하게 되어, 추가적인 질병이 발병될 수 있다. 이와 관련된 대표적인 질병의 예는 심장의 근육에 혈액을 공급하는 심장동맥에 동맥경화의 변화가 오는 심장동맥병 등이 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은 부작용이나 내성 등과 관련된 안전성이 문제될 가능성이 기존 화학적으로 합성된 약물에 비하여 훨씬 적고 투약이 쉬운 천연물질 유래 항고혈압 소재 또는 심혈관계 질환의 치료 또는 예방을 위한 물질에 대하여 연구하기 위하여, 다양한 천연물 유래 성분에 대한 수용성 에폭사이드 가수분해효소 저해능을 확인하던 중, 감송향 추출물이 에폭사이드 가수분해효소 저해 활성이 뛰어날 뿐만 아니라, 상기 감송향 추출물은 기존에 식품으로 사용되던 재료로 안전성도 우수하며, 나아가 감송향 추출물 중 메탄올 추출물과 상기 메탄올 추출물의 헥산 분획물이 다른 용매 또는 분획용매에 의한 경우보다 수용성 에폭사이드 가수분해효소 저해 효과가 더욱 우수하다는 것을 확인하였으며, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 감송향 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환 개선 또는 예방용 식품조성물에 관한 것이다. 상기 심혈관계 질환은 바람직하게는 고혈압일 수 있다.

상기 감송향 추출물은 감송향 메탄올 추출물일 수 있고, 상기 감송향 추출물은 감송향 메탄올 추출물의 헥산 분획물일 수 있다. 또한, 상기 식품조성물은 기능성 식품 조성물일 수 있다.

상기 감송향(Nardostachys chinensis)은 마타리과에 속하는 다년생 초본으로서 인도나 네팔의 산악지대가 원산지로, 그 맛이 달기 때문에 감송향이라고도 불리우며, 감송, 고미치, 향송이라고도 한다.

상기 감송향은 외형이 활모양으로 구부러진 원주모양이고, 바깥면은 황갈색 내지 갈색으로 광택이 있으며, 자른면은 황색이 도는 갈색이다. 상기 바깥면은 5개 내지 6개의 세로 주름과 그 사이에 불규칙한 주림으 있으며, 단단하고, 원뿌리가 길고 두터우며, 수염뿌리가 달려 있고 질은 부드럽고 꺾이기 쉽다. 피층은 짙은 갈색으로 갈라져서 조각을 이루고 목부는 황백색이다.

상기 감송향은 청량감을 주고, 쓴맛이 돌며, 맵고 달고, 민간에서는 충치와 치질에 효과가 있다고 전해지고, 한방에서는 방향성 건위, 복부팽만 해소, 진통 또는 진정의 목적으로 처방되고 있다. 고대부터 진통제의 재료로 사용되기도 하였고, 유태인들은 결혼식에 사용하는 향유 중 하나인 나드향으로 알려져 있다.

상기 감송향은 감송향의 지상부 또는 지하부일 수 있고, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 열매 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 감송향의 뿌리일 수 있다.

본 발명의 추출물은 추출용매로 추출하거나 추출용매로 추출하여 제조한 조추출물에 분획용매를 가하여 분획하여 제조할 수 있다.

상기 추출용매는 물 및 유기용매로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올 등의 탄소수 1 내지 5의 알코올, 에틸아세테이트 또는 아세톤 등의 극성용매와 에테르, 클로로포름, 벤젠, 헥산 또는 디클로로메탄의 비극성용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있다.

본 발명의 추출용매는 바람직하게는 물 및 탄소수 1 내지 4의 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매일 수 있고, 더욱 바람직하게는 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 더더욱 바람직하게는 에탄올 또는 메탄올일 수 있고, 가장 바람직하게는 메탄올일 수 있다.

본 발명의 추출물은 통상의 육상 식물, 일 예로 뿌리, 잎, 줄기, 꽃, 열매 또는 이들의 혼합물을 추출대상으로 한 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있으며, 구체적으로는 냉침추출법, 온침추출법 또는 열 추출법 등일 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 추출물은 상기 용매로 추출한 조추출물에 대하여 분획용매를 가한 후, 분획과정을 더욱 실시한 분획물일 수 있다. 상기 분획용매는 에틸아세테이트, 에테르, 클로로포름, 벤젠, 헥산, 메틸렌클로라이드, 부탄올, 물 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택된 용매, 바람직하게는 헥산, 클로로포름 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 용매, 더욱 바람직하게는 n-헥산(n-hexane)일 수 있다.

상기 제조된 추출물 또는 상기 분획과정을 수행하여 수득한 분획물은 이후 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 상기 농축은 감압 농축기, 일예로 회전 증발기를 이용하여 감압 농축할 수 있으며, 상기 건조는 일예로 동결건조법으로 수행할 수 있다.

본 발명의 일예로, 상기 감송향 추출물은 하기 방법에 의해 수득될 수 있다.

구체적으로, 상기 감송향 추출물은 감송향 뿌리에 메탄올을 가하여 추출하고, 여과 및 감압농축한 후, 동결건조시키는 방법으로 제조할 수 있다. 또한, 상기 감송향 분획물은 상기 감송향 추출물에 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 부탄올 및 물의 분획용매을 순차적으로 첨가한 후, 각 용매 분획물을 분리하는 방법으로 제조할 수 있다.

상기 감송향 메탄올 추출물은 수용성 에폭사이드 가수분해효소의 저해능이 우수할 뿐만 아니라, 천연물 유래의 물질로 부작용이나 내성 등의 문제점이 발생될 가능성이 적고, 안전성이 우수하므로, 상기 감송향 메탄올 추출물은 고혈압을 비롯한 심혈관계 질환의 개선 또는 예방을 위한 식품 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.

이러한 측면에서, 본 발명은 감송향 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환 개선 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

상기 심혈관계 질환이란 심장질환과 혈관질환을 포함한 질환으로, 고혈압, 고혈압성 심장질환, 심장병, 부정맥, 뇌졸중, 혈전증, 협심증, 심부전, 심근경색, 죽상경화증 및 동맥경화로 이루어진 군중에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 고혈압 또는 고혈압성 심장질환일 수 있다.

상기 고혈압은 혈관관련 질병으로, 주로 동맥의 혈압이 높은 동맥성 고혈압일 수 있다. 상기 고혈압은 동맥경화나 고혈압심장병(hypertensive heart disease) 등을 유발할 수 있다.

상기 감송향 추출물은 수용성 에폭사이드 가수분해효소를 유효하게 저해할 수 있다는 결과로부터, 상기 감송향 추출물의 혈압강하능이 확인되었으므로, 상기 감송향 추출물은 고혈압 및 심장병, 동맥경화 또는 뇌출혈 등의 심혈관계 질환에 치료, 예방 또는 개선 효과가 있는 것으로 평가된다.

본 발명의 감송향 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환 개선 또는 예방용 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 감송향 추출물을 0.001 내지 99.99중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있다.

상기 감송향 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환 개선 또는 예방용 조성물은 천연물질의 추출물이라는 점에서 부작용의 문제가 발생되지 아니하고, 심혈관계 질환의 개선 또는 예방 효과가 있다는 점에서 우수한 효과를 가진다.

본 발명의 감송향 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환 개선 또는 예방용 조성물은 인간에 직접 적용될 수 있다.

상기 감송향 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환 개선 또는 예방용 조성물은 상기 감송향 추출물을 유효성분으로 단독으로 포함할 수 있고, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 추가성분 즉, 약제학적으로 허용되거나 영양학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 식품이란 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제 등을 모두 포함하는 의도이다.

본 발명의 식품은 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능식품 등이 있다.

추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

본 발명에서 건강기능식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.

상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 건강기능음료를 포함하는 의도이다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 감송향 추출물을 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 식품 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12g일 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지 않지만, 본 발명의 감송향 추출물 100 중량부 당 0 내지 2,000 중량부 범위에서 선택될 수 있다.

본 발명에서 건강기능음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.

상기 건강기능음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 감송향 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 5 내지 12 g이다.

또한, 감송향 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 감송향 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 포함할 수 있으며, 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 포함할 수 있다.

본 발명의 감송향 추출물은 수용성 에폭사이드 가수분해효소를 저해하여, 심혈관계 질환, 구체적으로 고혈압 또는 고혈압성 심장질환을 갖는 환자 또는 이러한 위험성이 있는 경우에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단된다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 감송향 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환 개선 또는 예방용 식품조성물의 섭취는 수용성 에폭사이드 가수분해효소를 저해하여 EETs와 같은 에폭사이드 지방산(epoxy fatty acid)의 분해를 억제할 수 있어서, 심혈관계 질환의 개선 또는 예방에 효과가 있을 뿐만 아니라, 상기 유효성분인 감송향 추출물은 인공 화합물질인 기존의 심혈관계 질환 치료제와 달리 천연물질인 식물유래 물질로 부작용 등이 문제되지 아니하므로, 감송향 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환 개선 또는 예방용 식품조성물은 산업적으로 그 효과가 매우 크다 할 것이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 감송향의 추출물 및 분획물을 제조하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 감송향 추출물의 추출용매에 따른 수율을 나타낸 그래프로, 가로축은 추출용매를 나타내고, 세로축은 추출수율을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 감송향 추출물의 세포 독성을 확인하기 위한, 세포 생존율(cell viability, %)를 확인한 그래프로, 상기 그래프의 가로축은 추출물의 함량(μg/mL)을 의미하고, 상기 그래프의 세로축은 세포 생존율을 의미하며, 상기 각 그래프에서, G\는 열수 추출액을 의미하고, GM은 메탄올 추출액을 의미하며, GE7 은 70% 에탄올 수용액 추출액을 의미하고, GE는 95% 에탄올 수용액 추출액을 의미하며, GH 는 n-헥산 추출액을 의미하고, GEt 는 에틸아세테이트 추출액을 의미한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 감송향 추출물의 NO 생성능을 대조군 대비 활성으로 나타낸 그래프(% of control)로, 상기 그래프의 가로축은 추출물의 종류를 의미하고, 상기 그래프의 세로축은 NO 생성능을 의미하며, 상기 각 그래프에서, GE는 95% 에탄올 수용액 추출액을 의미하고, GE7 은 70% 에탄올 수용액 추출액을 의미하며, GEt 는 에틸아세테이트 추출액을 의미하고, GH 는 n-헥산 추출액을 의미하며, G\는 열수 추출액을 의미하고, GM은 메탄올 추출액을 의미한다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 감송향 추출물의 수용성 에폭사이드 가수분해효소를 나타낸 그래프(IC₅₀)로, 상기 그래프의 가로축은 추출물의 종류를 의미하고, 상기 그래프의 세로축은 수용성 에폭사이드 가수분해효소를 50% 억제하기 위한 사용량(IC₅₀, μg/mL)을 의미하며, 상기 각 그래프에서, GM은 메탄올 추출액을 의미하며, GE는 95% 에탄올 수용액 추출액을 의미하고, GE7 은 70% 에탄올 수용액 추출액을 의미하며, GEt 는 에틸아세테이트 추출액을 의미하고, GH 는 n-헥산 추출액을 의미하며, G\는 열수 추출액을 의미한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 감송향 추출물의 분획물의 NO 생성능을 대조군 대비 활성으로 나타낸 그래프(% of control)로, 상기 그래프의 가로축은 추출물의 종류를 의미하고, 상기 그래프의 세로축은 NO 생성능을 의미하며, 상기 각 그래프에서, n-hexane fr.은 헥산 분획을 의미하고, chloroform fr.은 클로로포름 분획을 의미하며, ethyl acetate fr.은 에틸 아세테이트 분획을 의미하고, butanol fr.은 부탄올 분획을 의미하며, water fr.은 물 분획을 의미한다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위하여 제조예 및 실시예를 제시한다.　 그러나, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시한 것을 뿐, 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 예들에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 감송향 추출물의 제조

1-1. 추출물의 제조

감송향(Nardostachys chinensis)은 2009년도에 채취된 것으로 전남 목포시 상동 소재의 전원인삼당제약에서 한약재로 시판되는 감송향의 뿌리 건조물을 구입하여 4℃에서 냉장보관하며 사용하였다.

상기 감송향 추출물의 제조를 위하여, 상기 냉장 보관 중인 감송향 뿌리 건조물에 물 도는 유기용매, 구체적으로 메탄올(GM), 95% 에탄올 수용액(GE), 70% 에탄올 수용액(GE7), 에틸아세테이트(GEt) 및 n-헥산(GH)을 각각 500 mL 첨가하고, homogenizer로 마쇄하여 20℃에서 24시간 동안 침지하여 추출하는 방법으로 추출물을 제조하였다. 상기 용매로 물을 이용하는 경우에는 상기 추출온도를 100℃에서 수행하였다.

상기 제조된 추출액은 Whatman NO. 2(Whatman, England)로 감압 여과하여 여액과 잔사로 각각 구분하여 수득하였다. 상기 수득한 잔사는 상기와 같은 방법으로 2회 반복하여 추출 및 여과과정을 수행하였다.

상기 수득한 여액 중 열수 추출액은 동결건조(Freezing dryer, Samwon, Korea)하여, 최종적으로 감송향 열수 추출물을 수득하였고, 나머지 유기용매 추출액은 cooling aspirator(CA-11, Eyela, Tokyo, Japan)가 장착된 vacuum evaporator(N-2N, Eyela, Tokyo, Japan)를 사용하여 35±2℃에서 감압 농축하는 방법으로 추출물을 제조하였다.

상기 추출물의 추출 수율을 측정하여 도 2에 나타내었다. 상기 추출수율은 추출물 제조에 투여된 감송향 대비 수득한 추출물의 중량비(w/w, %)로 구하였다.

상기 도 2에 나타낸 바와 같이, 감송향의 각 용매별 추출 수율은 메탄올 추출물(GM)의 경우, 14.1%로 가장 높았고, 상기 95% 에탄올 수용액 추출물(GE)의 경우, 12.3%이었으며, 상기 70% 에탄올 수용액 추출물(GE7)의 경우, 11.7%이었고, 상기 에틸아세테이트 추출물(GEt)의 경우, 7.1%이었으며, 상기 n-헥산 추출물(GH)의 경우, 7.2%이었다. 또한, 상기 열수 추출물 즉, 열수 환류 추출의 경우, 열수 추출물의 수율은 8.7%이었다.

1-2. 분획물의 제조

감송향(Nardostachys chinensis) 분획물을 제조하기 위하여, 우선 감송향 메탄올 추출물을 제조하였다.

상기 실시예 1-1의 냉장 보관 중인 감송향 뿌리 3.0 kg에 메탄올 20 L를 넣고 homogenizer(BM-2 Nissei bio-mixer, Nihonseiki Kaiseiki LTD, Japan)로 마쇄하면서 상기 실시예 1-1과 같이, 3회 반복 추출하여 총 60 L의 감송향 뿌리 메탄올 추출액을 얻었다.

상기 수득한 메탄올 추출액은 Whatman NO. 2로 감압 여과한 후 여액은 cooling aspirator가 장착된 vacuum evaporator 사용하여 35±2℃에서 감압 농축하는 방법으로 추출물을 제조하여, 추출물 425 g을 수득였다. 상기 추출물은 -20℃ 보관하였다.

상기 추출물의 용매 분획은 우선, 상기 메탄올 추출물 20.0g(141.2 g dry wt. eq.)을 증류수에 녹인 후, n-헥산(5.9 g), 클로로포름(10.3 g), 에틸아세테이트(0.3 g), 부탄올(1.7 g) 및 물(0.8 g)의 순서대로 순차적으로 분획용매를 첨가하고, 용매분획하는 방법으로 수행하였다. 상기 얻어진 분획액은 유기용매를 이용한 분획층의 경우 감압 농축하여 분획물을 수득하였고, 물 분획은 동결건조하여 분획물을 수득하였다.

상기 분획물의 분획 수율은 추출 단계에서 투여된 감송향 대비 수득한 분획물의 중량비(w/w, %)로 구하였다. 감송향의 각 용매별 분획물은 n-헥산의 경우, 5.9 g을 수득하였고, 클로로포름의 경우, 10.3 g을 수득하였으며, 에틸아세테이트의 경우, 0.3 g을 수득하였고, 부탄올의 경우, 1.7 g을 수득하였으며, 물의 경우, 0.8 g을 수득하였다.

실시예 2: 감송향 추출물의 추출용매 별 기능성 확인

2-1. 감송향 추출물의 추출용매 별 안전성(세포독성) 확인

상기 실시예 1에서 제조된 감송향 추출물의 추출용매별 nitric oxide(NO) 생성 저해능을 측정하기 위하여, 세포주로 RAW 264.7 macropharge(mouse) cell line을 ATCC에서 구입하여 배양하였다.

상기 RAW 264.7 macropharge (mouse) cell line는 5% CO₂, 95% 습도 조건 및 37℃의 배양기에서 10% FBS(GIBCO, 16000-044)와 1% penicillin-streptomycin(GIBCO, 15140-122)가 함유된 DMEM medium(GIBCO, 12100-046)이 담긴 75 cm² T-flask를 이용하여 배양하였다.

상기 배양 세포는 2일 또는 3일에 한번씩 계대 배양을 하면서 실험에 사용하였다. 상기 RAW 264.7의 세포수 측정은, single cell로 만든 다음 hemocytometer로 이용하여 수행하였다.

상기 실시예 1에서 제조된 감송향 추출물의 세포독성은 상기 RAW 264.7 cell을 이용한 세포 생존율(cell viability, %)을 MTT assay를 통한 방법으로 확인하였다.

상기 MTT assay는 상기 RAW 264.7 cell을 0.25% trypsin-EDTA를 사용해 monolayer로 부유시키고, 10% FBS MEM medium이 96well plate의 1 well당 1 x 10⁵ / 200 μL가 되도록 분주하여 전 배양하였다. 24시간 후 새로운 배지로 교환한 후 시료 최종 농도를 10 μg/mL, 20 μg/mL, 50 μg/mL 및 100 μg/mL이 되도록 하였고, 전체 부피(total volume)를 200 μL로 하여 72시간 동안 배양하였다.

MTT formazan의 형성은 2 mg/mL 의 MTT(2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromide, Sigma, USA) 용액(in PBS) 20 μL를 첨가하여 3시간 내지 4 시간 동안 배양하는 방법으로 수행하였다. 상기 보라색의 MTT formazan을 DMSO용매 1mL으로 정확히 녹여, 540nm에서 ELISA microplate reader(680, BIO-RAD, JAPAN)로 흡광도(absorbance)를 측정하였다. 상기 측정한 결과는 도 3에 나타내었다.

상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 감송향의 열수 추출물(GW), 95% 에탄올 수용액 추출물(GE) 및 70% 에탄올 수용액 추출물(GE7)은 100 μg/mL의 농도까지 세포에 대한 독성이 나타나지 않았고, 메탄올 추출물(GM)의 경우, 50 μg/mL의 농도에 96.8%의 세포 생존율을 보여, 50 μg/mL의 농도까지는 안전한 것으로 확인하였으며, n-헥산 추출물(GH) 및 에틸아세테이트 추출물(GEt)의 경우 100 μg/mL의 농도에 83%의 세포 생존율을 보여 낮은 독성을 나타내었다.

상기 세포독성과 관련된 결과에 따라, 각 추출용매에 따른 추출물의 NO 생성저해능 및 수용성 에폭사이드 가수분해효소의 저해능을 확인하기 위한 실험에서 각 추출용매 별 추출물의 시료 처리 농도는 50 μg/mL로 결정하였다.

2-2. 감송향 추출물의 추출용매 별 nitric oxide ( NO )생성 저해능 확인

상기 실시예 1에서 제조된 감송향 추출물의 추출용매별 nitric oxide(NO) 생성 저해능을 측정하기 위하여, 24 well plate에 2×10⁵ cells/well의 세포를 주입한 후 24시간 동안 배양하여 세포를 well에 부착시켰다.

상기 실시예 1에서 제조된 감송향 추출물을 상기 RAW 264.7 cell에 농도별(25 ㎍/mL, 50 ㎍/Ml 및 100 ㎍/mL)로 처리한 후, LPS(50 ㎍/mL)와 IFN-γ(0.005 U/mL)을 주입하고, 24시간 배양하였다.

상기 배양액의 상등액 450 μL와 Griess reagent인 1% sulfanilamide 가 함유된 5% H₃PO₄ 및 0.1% N-(1-naphthyl)-ethylendiamide dihydro chloride를 각 well 상의 상등액과 동량 섞어 실온에서 10분간 반응시킨 후, UV-visible spectrophotometer를 이용하여 543 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 결과로부터 NO(nitric oxide) 발현량을 측정한 결과를 도 4에 나타내었다.

상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 시료 무처리군(control)에 대하여, 추출물 전반적으로 NO 생성 저해능을 보였으며, 비교적 극성 용매 추출물인 열수 추출물(GW)과 70% 에탄올 수용액 추출물(GE7)의 NO 생성 저해능이 80.2% 및 78.3%으로 다른 추출물에 비해 낮은 저해 활성을 나타내었다. 반면, 비극성 용매 추출물인 n-헥산 추출물(GH), 에틸 아세테이트 추출물(GEt), 메탄올 추출물(GM)의 NO 생성 저해능은 각각 61.3%, 62.4% 및 56.3%로 나타나, 높은 저해 활성을 나타내었다.

상기 결과로부터 감송향의 메탄올 추출물은 NO 생성 저해능이 가장 우수한 것으로 확인되었다.

2-3. 감송향 추출물의 추출용매 별 수용성 에폭사이드 가수분해효소 저해능 확인

상기 실시예 1에서 제조된 감송향 추출물의 추출용매별 수용성 에폭사이드 가수분해효소(sEH) 저해능을 측정하기 위하여, 상기 감송향 추출물을 5 μg/mL 내지 500 μg/mL의 농도로 DMSO에 녹인 후 형광기질 CMNPC[Cyano-(2-methoxynaphthalen-6-yl) methyl(3-phenyloxiran-2-yl) methyl carbonate] 및 재조합 hsEH(human soluble epoxide hydrolase produced by baculovirus expression system from insect cell)와 반응하여 수용성 에폭사이드 가수분해효소(sEH)의 저해활성을 측정하였다.

상기 측정방법은 구체적으로 다음과 같다. 우선, 96 well plate에 25 mM bis/Tris?HCl buffer(pH 7.0, BSA 0.1 mg/mL 포함) 용액 150 μL을 넣고, blank well에 DMSO 2 μL와 상기 실시예 1에서 제조된 감송향 추출물 DMSO 용액을 농도 별로 2 μL씩 분주하였다.

Microplate reader를 이용하여 30℃에서 5분간 warm-up한 다음, blank well에 25 mM bis/Tris·HCl buffer 20 μL을 넣고, activity well에는 baculovirus expression system에 의해 얻어진 재조합 hsEH(0.6 mg/L in 25 mM bis/Tris·HCl buffer) 20 μL씩 넣었다. 이 black 96-well plate를 microplate reader에 넣고 10초 동안 혼합(mix)한 후 30℃에서 5분간 warm-up하였다.

이어서 기질인 CMNPC 용액 30 μL를 넣어 최종 농도가 5 μM이 되게 조절한 다음, 30℃에서 10분 동안 형광 microplate reader(excitation 340 nm, emission 460 nm)를 이용하여 측정하였다. 상기 측정결과를 도 5에 나타내었다.

상기 도 5에 나타낸 바와 같이, 감송향 추출물 중 메탄올 추출물(GM)의 IC₅₀ 값은 4.5 μg/mL로 가장 좋은 저해활성을 나타내었고, 95% 에탄올 수용액 추출물(GE) 및 n-헥산 추출물(GH)의 IC₅₀ 값은 각각 7.0 μg/ mL 또는 7.5 μg/mL 로 나타났으며, 열수 추출물(GW)의 IC₅₀ 값은 각각 123.5 μg/ mL로 가장 낮은 저해활성을 나타내었다.

실시예 3: 감송향 분획물의 분획용매 별 기능성 확인

3-1. 감송향 메탄올 추출물의 분획물의 분획용매 별 nitric oxide ( NO )생성 저해능 확인

상기 실시예 2에서 확인된 최적의 추출용매인 메탄올을 이용한 감송향 메탄올 추출물의 분획용매별 nitric oxide(NO) 생성 저해능을 측정하기 위하여, 상기 실시예 2-2와 같은 방법으로 수행하였다. 상기 측정한 결과를 도 6에 나타내었다.

상기 도 6에 나타낸 바와 같이, 시료 무처리군(control)에 대해서 NO 생성 저해능은 n-헥산 분획물이 49.7%로 가장 높았고, 클로로포름 분획이 38.7%, 에틸 아세테이트 분획이 21.1%, 부탄올 분획이 11.6% 순으로 나타났으며, 물 분획은 1.9%로 NO 생성 저해능이 가장 약한 것으로 확인되었다.

3-2. 감송향 메탄올 추출물의 분획물의 분획용매 별 수용성 에폭사이드 가수분해효소 저해능 확인

상기 실시예 2에서 확인된 최적의 추출용매인 메탄올을 이용한 감송향 메탄올 추출물의 분획용매별 수용성 에폭사이드 가수분해효소(sEH) 저해능을 측정하기 위하여, 상기 감송향 메탄올 추출물의 분획물을 0.5 μg/mL 내지 200 μg/mL의 농도로 DMSO에 녹인 후 형광기질 CMNPC 및 재조합 hsEH와 반응하여 수용성 에폭사이드 가수분해효소(sEH)의 저해활성을 상기 실시예 2-3과 같은 방법으로 측정하였다.

상기 실시예 2에서 확인된 최적의 추출용매인 메탄올을 이용한 감송향 메탄올 추출물의 분획용매별 수용성 에폭사이드 가수분해효소(sEH)의 저해활성을 측정한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

분획용매	IC50 값(μg/mL)
메탄올 추출물	4.5±0.12
n-헥산 분획물	3.5±0.09
클로로포름 분획물	7.0±1.33
에틸 아세테이트 분획물	21.7±1.92
부탄올 분획물	50.3±1.08
물 분획물	220.1±8.4

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, n-헥산 분획의 IC₅₀ 값이 3.5 μg/mL로 가장 강한 저해 활성을 나타내었고, 다음은 클로로포름 분획으로 IC₅₀ 값이 7.0 μg/mL으로 나타난 반면, 에틸아세테이트 분획과 부탄올 분획에서는 IC₅₀ 값이 각각 21.7 μg/Ml 및 50.3 μg/mL으로 나타났다.

상기 결과로부터 감송향 추출물, 바람직하게는 감송향 메탄올 추출물이 우수한 가용성 에폭사이드 가수분해효소의 저해 효과를 가지고 있고, NO 생성 저해능이 우수함을 나타내며, 상기 결과로부터 혈압 저하능과 항고혈압능을 비롯한 심혈관계 질환 치료, 예방 또는 개선 효과를 가지고 있음을 시사하는 것으로 사료된다.

제조예: 감송향 추출물을 이용한 제제

제조예 1. 건강기능식품의 제조

감송향 메탄올 추출물 분말 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 제조에 사용할 수 있다.

Claims (6)

1. 감송향(Nardostachys chinensis)메탄올 추출물에 헥산을 분획용매로 분획한 헥산 분획물을 유효성분으로 포함하는 고혈압 개선 또는 예방용 식품 조성물.
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