KR101786135B1 - 세포의 선택적 용균 - Google Patents

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Abstract

본 명세서는 박테리아 등의 미생물을 포함하는 샘플 중의 세포의 선택적 용균을 위한 방법 및 장치를 개시하고 있다. 선택적 용균은 알칼리성 조건 하에 비이온성 계면 활성제 중에서 샘플을 인큐베이팅함으로써 이루어진다.

Description

세포의 선택적 용균 {SELECTIVE LYSIS OF CELLS}
본 발명은 진핵 세포, 특히 동물 세포, 가령 혈구의 용균에 관한 것이다. 또한 본 발명은 고농도의 다른 세포가 있는 샘플 중에서 박테리아 등의 저농도의 미생물을 검출하는 것에 관한 것이다.
분자 진단의 목표는 혈액 등의 샘플 중의 병원체 (보통 박테리아) 소량을 신속하게 검출하고자 하는 것이다. 그러나 혈액은 후천성 면역을 담당하는 백혈구와, 산소 수송을 담당하는 적혈구, 그리고 상처 치유를 담당하는 혈소판을 포함하는 복잡한 매트릭스이다. 이로 인해 다량의 세포내 물질을 함유하는 전혈과 같은 샘플 중에서 병원체를 직접적으로 검출하는 것은 복잡하다.
전통적인 검출법은 선택적 배지 및/또는 표지자를 함유하는 배지 상에서 박테리아를 생장시키는 것을 포함한다. 보통 이러한 분석법은 확인이 일어나기 최소 1일 또는 2일 전의 배양 단계가 필수적이다.
PCR 기반법을 위해서, 신선한 혈액 샘플 중의 박테리아 양은 이러한 샘플 중에 존재하는 박테리아를 더 배양하지 않고도 검출하기에 충분한 이론적으로 매우 많은 양이다. 그러나, 박테리아 극소량을 조기 검출하기 위해서는 다량의 혈액이 필요하다. 특히 백혈구 중의 다량의 DNA는 DNA 기반 검출법에서 백그라운드 (background)를 현저히 증가시킨다. 또한 헤모글로빈의 헴의 존재는 DNA 폴리머라아제의 활성을 크게 감소시킨다. 인간 혈액 1 마이크로리터에는 약 4000 내지 11,000개의 백혈구와, 약 150,000 내지 400,000개의 혈소판이 함유되어 있다. 혈액 중의 DNA 농도는 30 내지 60 ㎍/ml이다. 박테리아 종 약 10 내지 100,000 종의 존재를 전혈 10 ml 중에서 검출해 내는 것은 매우 어려운 일이다.
백혈구 중 다량의 DNA는 관련없는 PCR 생성물을 유발시킬 수 있거나, 박테리아의 DNA의 검출을 위하여 디자인된 프라이머를 제거할 수 있다. 이로 인해 PCR 또는 다른 방법을 통하여 박테리아 DNA를 검출하기에 앞서, DNA를 완전히 정제하고 포유류 DNA를 분리할 필요가 있다.
PCR 반응으로 인하여 방해받는 것 이외에도, 다량의 포유류 DNA는 샘플의 점도를 증가시킨다. 뿐만 아니라, 용균된 포유류 세포로부터 유래한 단백질 및 막은 샘플의 여과를 방해하는 복합체를 형성시킨다. 이는 특히 소형화된 장치에서 문제가 된다. 이미 다량인 샘플을 추가로 희석하는 것은 불필요하게 긴 조작 단계를 초래하게 한다.
전술한 이유로, 혈액 샘플로부터 인간 DNA를 제거하기 위한 방법이 필요하다.
포유류 DNA가 존재할 때 박테리아 DNA를 특이적으로 분석하는 방법은 알려져 있다. SIRSLab사의 Looxter™은 샘플로부터 풍부하게 존재하는 메틸화된 DNA 방법을 사용한다. 박테리아 DNA는 강하게 메틸화되기 때문에, 이 방법은 박테리아 DNA의 인리치먼트 (enrichment)를 초래한다. Molzym사의 Molysis™는 포유류 세포를 선택적으로 용균시키기 위한 분해제와 계면 활성제를 사용한다. 이러한 용균 단계 다음에는 이 분해제/계면 활성제에 의하여 영향받지 않는 DNAse를 사용하여 분해시키는 단계가 뒤따른다. 다른 방법으로는 Roche사 (Septifast™)가 시판하는 것으로서, 인간 DNA에 특이적으로 결합하는 것을 방해하고 인간 DNA 증폭을 방해하도록 특수 고안된 PCR 프라이머를 사용하는 것이 있다.
US 6,803,208은 박테리아가 도핑된 고도 희석된 혈소판 현탁액이 37℃에서 15분간 용균된 후에, 필터 상에 남아있는 박테리아의 육안 검사를 위해 0.4 ㎛ 필터에 소량의 용균된 샘플을 여과할 수 있도록 하는 것이 특징인 방법을 개시하고 있다. 그러나, 이 방법은 실온(ambient temperature)에서 다량의 샘플을 처리할 수 없다.
본 발명의 구체적인 양호한 측면은 첨부되는 독립항 및 종속항에 기재된다. 종속항에 기재된 특징들은 독립항의 특징과 조합될 수 있고, 또한 청구 범위에 명백히 기재된 것이 아니라도, 적당한 다른 종속항의 특징과도 조합될 수 있다.
본 발명의 한 가지 측면은 미생물을 함유하거나 함유할 것으로 생각되는 샘플 중의 진핵 세포, 특히 동물 세포의 선택적 용균 방법에 관한 것이다. 이 방법은 미생물을 함유하거나 또는 함유할 것으로 생각되는 진핵 세포, 특히 동물 세포를 함유하는 샘플을 제공하는 단계와, 이 샘플에 비이온성 계면 활성제와 완충액을 첨가하여 pH 약 9.5 이상의 용액을 생성시키는 단계와, 이 용액을 진핵 세포, 특히 동물 세포를 용균하기에 충분한 시간 동안, 가령 30초 내지 10분간, 더욱 좋기로는 2분 내지 6분간 인큐베이팅하는 단계를 포함한다. 특정 실시 상태에 있어서, 이 용균은 15 내지 30℃, 더욱 좋기로는 실온 근처에서 수행할 수 있다.
구체적인 실시 상태에 있어서, 샘플은 포유류 혈액 샘플, 가령 전혈 샘플이다.
다른 구체적인 실시 상태에 있어서, 미생물은 박테리아 또는 균류이다.
구체적인 실시 상태에 따르면, 첨가되는 계면 활성제와 첨가되는 완충액의 부피 대 샘플의 부피는 2/1 내지 1/10이다.
구체적인 실시 상태에 있어서, 비이온성 계면 활성제는 Nonidet, Brij, Tween, Igepal, 환원형 triton, 옥틸글루코사이드, cholaat 및 Triton으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 더욱 양호한 예로는 Triton X-100, Nonidet P40, 소듐 데옥시콜레이트 및/또는 Igepal CA 630이 있다.
구체적인 실시 상태에 있어서, 본 명세서에 사용되는 알칼리성 완충액은 pKa 값이 9보다 큰 것들이다. 그러한 것들의 예로는, 보레이트, 카보네이트, CAPS (N-사이클로헥실-3-아미노프로판술포닉), CAPSO (3-(사이클로헥실아미노)-2-하이드록시-1-프로판술폰산), CHES (2-(N-사이클로헥실아미노)에탄 술폰산), 피로포스페이트 및 에탄올아민이 있다. 구체적인 예는 소듐 카보네이트이다. 완충액은 본 발명에 따른 비율로 샘플과 혼합될 때에, 최종 용액의 pH는 약 9.5 이상이어야 하는 정도의 충분한 완충능을 가져야 한다.
구체적인 실시 상태에 있어서, 본 발명의 방법은 0.7 ㎛ 이하, 더욱 좋기로는 0.5 ㎛ 이하의 세공 크기를 갖는 필터 등의, 필터 상에 미생물을 계속 유지하는 세공 크기를 갖는 필터 상에 인큐베이팅된 용액을 여과시키는 단계를 더 포함한다. 본 발명의 방법은 효소 처리법 또는 열 처리법을 필요로 하지 않고 다량의 샘플을 여과하는 것을 용이하게 한다.
구체적인 실시 상태에 있어서, 본 발명의 방법은 본 발명에 따른 선택적 용균 후에 산 또는 산 완충액을 첨가하여, pH 약 7 내지 9로 만드는 단계, 즉 "중화 단계"를 더 포함한다.
구체적인 실시 상태에 있어서, 전술한 바와 같은 방법 다음에는, 미생물의 검출 단계가 온다. 이의 예로는 세포 계수 (cytometry), 현미경 관찰, PCR, 또는 배양이 있다.
구체적인 실시 상태에 있어서, 전술한 바와 같은 방법 다음에는 미생물의 용균 단계가 온다.
본 발명의 또 다른 측면은 40 ml보다 적은 부피, 좋기로는 20 ml, 더욱 좋기로는 1 내지 20 ml의 샘플 용액을 담기 위한 용균 챔버 (2)와, 상기 용균 챔버와 연결된 pH 약 9.5 이상의 알칼리성 완충액과 비이온성 계면 활성제를 포함하는 리저버 (3), 또는 상기 용균 챔버와 연결된 pH 약 9.5 이상의 알칼리성 완충액을 포함하는 리저버 (31), 상기 용균 챔버와 연결된 비이온성 계면활성제를 포함하는 리저버 (32), 필터 상에 박테리아를 계속 유지하는 세공 크기를 가지고, 용균 후에 샘플을 여과시키기 위한, 용균 챔버에 연결된 필터 (4), DNA 존재 여부를 분석하기 위한 검출 챔버 (5)를 포함하는 샘플 중의 미생물 검출용 장치 (1)에 관한 것이다.
여기서, 알칼리성 완충액의 pKa는 9.5보다 큰 것이 보통이고, 최종 용액의 pH는 약 9.5 이상이며, 비이온성 계면 활성제는 보통 Triton X-100, 소듐데옥시콜레이트, Nonidet P40 및/또는 Igepal CA 630이다.
본 발명에 기재된 방법은 박테리아 및 균류가 온전하게 남아 있으면서 (사멸 또는 생존 상태), 샘플 내의 백혈구 및 적혈구 세포의 선택적 용균을 가능하게 한다.
본 발명에 기재된 방법은 샘플을 실질적으로 희석시키지 않고 샘플을 처리할 수 있게 해주어, 궁극적으로 다량의 샘플을 처리할 수 있게 하여 준다. 뿐만 아니라, 예컨대 열 또는 DNAase로 인한 DNA의 효소 파괴가 없어, 이 기술 분야에 알려져 있는 방법에 비하면 처리 과정을 덜 복잡하게 하여 준다.
본 발명에 기재된 방법은 점도가 낮고, 응집물이 적은 용균된 샘플을 생성시키는데, 이로써 박테리아를 계속 유지하는 필터 상에서 용균된 샘플 다량을 여과시킬 수 있게 하여 준다. 이러한 필터 상에서 박테리아를 추가로 처리하는 것은 약 100 내지 1000 ㎕의 부피로 진행할 수 있는데, 이로써 다음 단계를 위한 다량의 샘플을 처리 가능하게 하고, 중화나 세척 등의 통합 카트리지 중에서 완전 자동화된 필요한 처리를 가능할 수 있게 한다.
본 발명의 전술한 특징 및 다른 특징, 특성 및 장점은 이하의 발명의 상세한 설명과 함께, 첨부된 도면으로부터 명백해질 것인데, 이러한 것들은 본 발명의 원리를 예를 들어 설명하기 위한 것이다. 본 명세서의 기재는 오로지 설명을 위한 것이며 본 발명의 범위를 한정하고자 함이 아니다. 아래에 기재된 도면의 기호는 첨부된 도면에 나타낸다.
도 1은 본 발명의 방법의 구체적인 실시 상태에 따른 상이한 pH 값에서의 선택적 용균 후 다량의 혈액의 여과능을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 방법의 구체적인 실시 상태에 따른 상이한 pH값에서의 용균 후 상이한 박테리아의 회수를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 방법의 구체적인 실시 상태에 따른 상이한 인큐베이션 시간의 용균 후 상이한 박테리아의 회수를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 선택적 용균에 의한 인간 백그라운드 DNA의 감소를 나타낸다.
도 5 및 6은 각각 1 및 5 ml 전혈에서 병원체의 각각 상이한 타입의 검출을 나타낸다.
도 7은 본 발명에 따르는 방법이 수행되는 장치와 수동형 방법 간의 비교를 나타낸다.
도 8은 시판되는 패혈증 검출 테스트와, 본 발명에 따른 방법을 비교한 것을 나타낸다.
도 9는 본 발명에 따른 필터 상의 선택적 용균과 캡처 후의 병원체의 용균을 나타낸다.
도 10은 본 발명에 따른 필터 상의 선택적 용균과 캡처 후에 수행하였을 때 다른 용균법과 비교하여 병원체 용균 효능을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 실시 상태에서 기재된 선택적 용균을 수행하기 위한 장치의 실시 상태를 나타내는 개략도이다.
도 12는 본 발명의 실시 상태에서 기재된 선택적 용균 단위를 포함하는 통합 장치의 예를 나타낸다.
다른 도면에서도 동일한 참조 기호는 동일하거나 유사한 요소를 나타내는 것이다.
본 발명은 구체적인 실시 상태에 관하여 특정 도면을 참조로 하여 설명을 할 것이지만, 이 발명이 그것에 한정되는 것은 아니고 청구 범위에 의하여만 정하여진다. 청구 범위내에 사용된 참조 번호는 청구 범위를 한정하려는 의도로 사용되어서는 아니된다. 도면은 개략적으로만 나타낸 것이고 본 발명을 한정하고자 함은 아니다. 도면에서, 각 요소 중 일부의 크기는 확대되어 있으며 설명을 목적으로 원래 크기로 작도되지 않았다. "포함하는"이라는 용어가 본 명세서 및 청구 범위에 사용된 경우, 이는 다른 요소나 단계를 배제하는 것이 아니다. 단수를 나타내는 관사 "a", "an", 또는 "the"가 사용될 때, 정관사 또는 부정관사는 별도로 언급하지 않은 한, 다수개의 명사를 포함하도록 사용된다.
더욱이, 명세서와 청구 범위에서 제1, 제2, 제3 등의 용어가 유사한 요소를 구분하기 위하여 사용되고, 또한 순차적 또는 시간적 순서를 설명하기 위한 것은 꼭 아니다. 이렇게 사용된 용어는 적당한 상황 하에서 호환 사용되고, 본 명세서에 설명된 발명의 실시 상태는 본 명세서에서 기술되고 설명된 것과 다른 순서로 작동될 수 있는 것으로 이해된다.
이하에 제공되는 용어 또는 정의는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제공된다. 이러한 정의는 이 기술 분야의 숙련자가 이해하는 것보다 좁은 범위를 가지는 것으로 해석되어서는 아니된다.
발명의 상세한 설명
본 명세서에 사용된 "혈구"라는 용어는 혈액 중에 존재하는 포유류의 세포를 말하는 것이고, 적혈구, 백혈구 및 혈소판을 포함한다.
본 명세서에 사용된 "전혈"이라는 용어는 혈장과 혈구를 포함하는 미처리된 혈액을 말하는 것인데, 항응고제로 처리되었을 수도 있다.
"샘플"이라는 용어는 세포내 물질을 포함하는 수성 현탁액을 말하는데, 림프, 뇌척수액, 혈액 (전혈 및 혈장), 타액 등의 체액을 포함할 뿐만 아니라, 예컨대, 근육, 뇌, 간 또는 기타 조직 등의 균질화된 현탁액의 수성 분획도 포함한다.
본 발명에 사용된 "진핵"이라는 용어는 동물, 특히 혈액을 함유하는 동물 등의, 균류를 제외한 진핵 생물 개체를 말하는 것이며, 여기에는 척추 동물과 갑각류 등의 비척추 동물이 포함된다. 척추 동물에는 냉혈 동물 (어류, 파충류, 양서류) 및 온혈 동물 (조류 및 포유류)이 포함된다. 포유류에는 영장류와, 특히 인간이 포함된다.
본 발명에 사용된 "선택적 용균"이라는 용어는 샘플 (가령 혈액)중의 미생물 세포 (가령 박테리아 세포)의 백분율이, 온전하게 남아 있는 샘플이 수집된 개체로부터의 진핵 세포의 백분율에 비하여 유의하게 높은 (예컨대, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 250, 500, 또는 1000배 더 높은) 샘플이 얻어질 때를 말한다.
본 발명에 사용된 "미생물"이라는 용어는 박테리아 (그람 양성 및 그람 음성 박테리아 뿐 아니라, 박테리아 포자)와, 효모와 곰팡이 등의 단세포 균류와 같이 샘플이 수집되는 유기체에 병원체로서 존재하는 것들을 말한다.
본 발명의 첫번째 측면은 박테리아 등의 미생물을 함유하거나 함유할 것으로 생각되는 샘플 중의 진핵 세포, 특히 동물 세포의 선택적 용균 방법에 관한 것이다. 이 방법의 목표는 샘플 중의 소량의 박테리아의 검출 방법의 민감성을 증가 (샘플 1 ml당 10000, 1000, 100 또는 그 미만의 미생물)시키기 위한 것이다. 본 발명의 배경에도 설명되어 있는 바와 같이, 샘플 중의 진핵 세포, 특히 동물 세포의 DNA는 PCR 기반 검출 방법을 간섭하고, 단백질 및 막과 함께 응집물을 형성하면, 용균된 샘플의 여과에 현저한 효과를 미치면서 용균 후 점도를 증가시킨다. 이 문제를 해결하기 위하여, 진핵 세포, 특히 동물 세포는 미생물의 실질적인 일부 (즉, 20%, 40%, 60%, 80%, 90% 또는 95% 이상)가 생존하거나, 처리에 의하여 사멸한 경우에도 세포벽 속의 박테리아 DNA를 여전히 포함할 수 있도록 선택적으로 용균된다. 본 발명에 기재된 방법에서, 전술한 문제점을 해결한다.
본 발명에 기재된 방법은 샘플이 어떠한 타입이더라도 적용 가능한데, 여기서 미생물, 특히 박테리아로부터의 DNA 검출은 DNA를 포함하는 다른 세포, 특히 미생물이 병원체로서 존재하는 숙주의 세포의 존재에 의하여 방해받는다.
이하, 본 발명에 기재된 방법을 포유류 혈액 샘플 중의 소량의 박테리아의 존재를 연구하는 실시 상태에 대하여 설명한다.
혈액 샘플은 혈장 또는 혈소판 조제물 등의 가공된 분획 또는 전혈로서 보관할 수 있다. 보통 본 발명에 기재된 방법은 신선하게 분리된 전혈에 대하여 수행한다. 이러한 샘플은 예컨대 응고를 회피하기 위하여 헤파린, EDTA 또는 시트레이트 등으로 처리한다.
또는 이 방법은 정맥으로부터 계면 활성제 및 완충액이 든 튜브로 직접 혈액을 수집함으로써 신선한 혈액에 대하여 수행한다.
그러므로, 신선한 혈액 샘플 또는 보관해 두었던 샘플에 완충액 및 비이온성 계면 활성제를 보충한다. 완충액 및 이의 농축액은 제공된 혈액 샘플의 완충능을 보상하고, pH 9.5 이상, 더욱 구체적으로는 pH 9.5 내지 11.5, 더욱더 구체적으로는 pH 9.5 내지 10.5을 얻기 위하여 선택된다. 11.5 이상의 pH 값은 그람 양성 박테리아 및 균류 등의 더욱 강력한 미생물에 대하여 적합하다. 마찬가지로 완충액은 pH의 요구되는 변화를 얻기 위하여 샘플 부피의 최대 200%, 150%, 100%, 50%, 20%, 또는 10%에 해당하는 완충액 부피가 첨가될 수 있도록 충분히 농축된다.
본 발명에 적합한 완충액의 pKa는 보통 9 이상, 9.5 이상 또는 10 이상이며, 적합한 완충액으로는 보레이트, 카보네이트, CAPS, CAPSO, CHES, 피로포스페이트, 에탄올아민과, 전술한 pH 범위의 최적 완충능을 가지는 일반적으로 사용되는 다른 완충액이 있다.
적당한 계면 활성제는 비이온성 계면 활성제인데, 이는 한편으로는 진핵 세포, 특히 동물 세포에 대한 용균 활성을 가지고, 다른 한편으로는 DNA 및 단백질에 대한 용해능을 가진다.
비이온성 계면 활성제의 예로는 알킬글리코사이드, Brij 35 (C12E23 폴리옥시에틸렌글리콜 도데실 에테르) (15,7), Brij 58 (C16E20 폴리옥시에틸렌글리콜도데실 에테르) (16), Genapol (13 to 19), MEGA-8, -9, -10 등의 글루카니드 (glucanids), 옥틸글루코사이드 (12,6), Pluronic F127, Triton X-100 (C14H220(C2H40)n) (13,4), Triton X-114 (C24H4206) (12,4), Tween 20 (폴리소르베이트 20) (16, 7) 및 Tween 80 (폴리소르베이트 80) (15) Nonidet P40 소듐 데옥시콜레이트, 환원형 Triton X-100 및/또는 Igepal CA 630이 있다. 비이온성 계면 활성제의 더 좋은 구체적인 예는 Triton-X 100이다.
계면 활성제의 가장 효과적인 농도는 계면 활성제에 따라 달라지나, 보통은 0.1 내지 5% 범위, 더욱 구체적으로는 0.1 내지 1% 범위이다. 계면 활성제 (고체 또는 액체) %는 각각 w/v % 또는 v/v %를 말한다.
완충액 및 계면 활성제의 존재 중에 혈액 샘플의 인큐베이션은 10분 이내, 좋기로는 30초 내지 10분, 더 좋기로는 약 1 내지 3, 1 내지 5, 1 내지 8, 2 내지 6, 또는 1 내지 10분간, 10 내지 30℃에서, 더 좋기로는 실온 근처에서 수행한다.
본 발명에 따른 방법은 10분 이하의 시간 동안 30℃ 미만의 온도에서 선택적 용균이 일어난다는 장점을 가진다. 따라서, 본 발명의 방법은 샘플을 가열할 필요 없이 실온에서 일반적으로 수행할 수 있다.
선택적으로는, 용균 후에, 용균된 샘플의 pH는 중화 단계에서 산이나 산성 완충액을 첨가함으로써 중성값 (즉, 7 내지 9)으로 만든다. 중성 pH의 용균된 샘플은 박테리아 세포를 더 용균시킴 없이, 그리고 용균된 샘플의 흐름 특성의 현저한 변화 없이, 장기간 (1, 2, 6, 12 또는 24시간까지도) 보관할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.
본 발명의 방법에서 연구된 다른 파라미터는 용균 후에 혈액 샘플의 흐름 특성의 평가이다. 이는 0.22 ㎛ 필터를 통하여 여과될 수 있는 용균된 혈액의 부피를 확인함으로써 결정할 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 샘플 1 부피에 대하여, 완충액/계면 활성제 용액 1 부피를 첨가함으로써 희석되는 전혈 2, 5, 7.5, 또는 10 ml의 여과를 가능하게 한다.
일반적으로 본 발명에 따른 방법은 보통은 원심분리나 여과를 수행함으로써 온전한 박테리아 세포를 샘플로부터 분리하는 단계를 포함한다. 특정 실시 상태에 있어서, 온전한 박테리아는 시판되는 세공 크기가 0.4 또는 0.22 ㎛인 필터와 같이, 0.5 내지 10 ㎛ 크기의 박테리아를 계속 유지하기 위하여 세공 크기가 1 ㎛ 미만인 필터 상에 용균된 샘플을 통과시킴으로써 샘플로부터 온전한 박테리아를 분리한다. 샘플을 여과하기 위하여, 다양한 시판되는 장치가 있는데, 가령, 시린지 내에서 용균한 후에 액체가 시린지의 플런저 상의 수동 가압에 의하여 필터 상에 통과될 수 있도록 하는, 시린지 상에 고정되어 사용되는 필터가 있다.
이하에는 박테리아 (또는 균류)가 필터 상에 존재하는지를 연구한다. 특정 실시 상태에 있어서, 미생물의 존재는 PCR로 검사한다. 이러한 목적으로, 박테리아 (또는 균류)를 필터로부터 세척해 내고, PCR 증폭으로 더 처리한다. 또는 필터를 용균 완충액으로 세정하여 미생물로부터 DNA를 분리하고, 이를 PCR 반응에 더 사용한다.
다른 검출 단계는 세포 계수, 현미경, PCR 또는 배양에 의하여 수행할 수 있다.
샘플의 용균, 미생물의 여과 및 검출은 하나의 장치 내에서 수행할 수 있다 (개략적인 것은 도 11에 도시됨). 따라서, 본 발명의 한 가지 측면은 1 내지 10 ml 부피의 샘플 용액을 담기 위한 용균 챔버 (2)와, 상기 용균 챔버와 연결된 알칼리성 완충액과 비이온성 계면 활성제를 포함하는 리저버 (3), 또는 상기 용균 챔버 (2)와 연결된 알칼리성 완충액을 포함하는 리저버 (31)와, 상기 용균 챔버 (2)와 연결된 비이온성 계면활성제를 포함하는 리저버 (32)를 포함하는 장치 (1)에 관한 것이다. 장치 내에서, 용균 챔버는, 필터 상에 박테리아를 계속 유지함으로써 용균 후에 샘플을 여과시키기 위한 필터 (4)에 연결된다. 이 장치는 분리 챔버내에서 필터로부터 미생물을 분리하여 이를 용균시키기 위한 채널을 더 포함한다. 또는, 이 장치는 필터 상에 미생물을 용균시키기 위한 수단과, 필터로부터 용균된 박테리아 또는 균류 세포의 DNA를 분리 챔버로 전달하기 위한 채널을 더 포함한다. 이 장치는 DNA 존재 여부를 분석하기 위한 DNA 정제 및 검출 챔버 (5)를 더 포함할 수 있다. 통상적으로 검출 챔버는 PCR 모듈이다.
선택적 용균과, 이에 이은 DNA 정제 및 확인 단계가 일어나는 장치의 예를 도 12에 나타낸다.
본 발명을 설명하는 시스템과 방법의 다른 예는 이 기술 분야의 숙련자에게 명백할 수 있다.
본 발명에 따른 장치에 대하여 양호한 실시 상태와, 특정 구조 및 배열, 재료를 설명하였지만, 다양한 변화 또는 변형도 본 발명의 범위 및 정신을 벗어나지 않고 가능함을 이해하여야 한다.
실시예 1
여과에 미치는 pH의 효과
이 실험의 목적은 여과 효율에 미치는 완충액 pH의 효과를 측정하기 위함이다. 완충능은 이 기술 분야의 숙련자에게 알려져 있는 통상의 기술을 사용하여 최종 용액의 pH를 측정함으로써 확인되는 바와 같이, 최종 용액에서의 유사한 pH를 얻기 위하여 충분하였다.
완충액은 다음 성분을 함유한다.
1M NaBorate, pH 9.0 +1% Triton X-100
1M NaBorate, pH 9.5 +1% Triton X-100
1M NaCarbonate, pH 10.0 +1% Triton X-100
1M NaCarbonate, pH 10.3 +1% Triton X-100
1M NaCarbonate, pH 10.8 +1% Triton X-100
완충액 1 ml를 전혈 1 ml와 혼합하고, 이를 3분간 인큐베이팅하였다. 이후, 중화 완충액을 첨가하고, 이 혼합물을 직경 25 mm와, 세공 크기 0.45 ㎛의 크기 선택적 필터로, 진공 여과 장치를 사용하여 여과하였다. 막히기 전에 필터를 통과할 수 있는 혈액의 부피를 측정하였다. 결과는 도 1에 나타낸다. 이 실험은, 최종 pH 값은 약 9.5 이상이어야만 저농도의 병원체를 분석하기 위한 여과된 혈액의 충분한 부피가 얻어짐을 증명하였다.
실시예 2
혈구의 선택적 용균 후에 온전한 병원체 (E. c oli)의 회수에 미치는 완충액 pH 효과를 나타낸다.
사용된 완충액은 다음 성분을 함유한다.
1M NaBorate, pH 9.0 +1% Triton X-100
1M NaBorate, pH 9.5 +1% Triton X-100
1M NaCarbonate, pH 10.0 +1% Triton X-100
1M NaCarbonate, pH 10.5 +1% Triton X-100
혈액 1 ml에 동량의 박테리아를 넣는다. 이 부피를 3분간 전술한 완충액으로 처리한다. 이후, 혈액을 원심분리 (10분, 4000 g)하여, 온전한 박테리아를 수집한다. 박테리아를 표준 알칼리성 용균법을 사용하여 용균하고, DNA를 Qiagen spin columns (QiaAmp blood mini kit)를 사용하여 정제한다. DNA의 양을 리얼 타임 PCR을 사용하여 정량한다. 그 결과는 도 2에 나타낸다.
전술한 도면은 선택적 용균 완충액의 pH의 함수로서 박테리아의 회수율을 나타낸다. 낮은 pH에서는, 백혈구 DNA가 분해되지 않고, PCR 반응을 방해한다. 높은 pH값에서는 박테리아가 선택적 용균 단계 동안에 용균되기 시작하고, 회수되지 않는다.
실시예 3
병원체의 회수율에 미치는 인큐베이션 시간의 영향
이 실시예는 온전한 병원체의 회수율에 미치는 본 발명에 따른 선택적 용균 완충액을 처리한 혈액의 장기간 인큐베이션의 영향을 증명한다. 고정된 수의 P. aeruginosa 박테리아를 혈액에 첨가하였다. 이 혈액 1 ml를 선택적 용균 완충액 (1 M NaCarbonate pH 10.0 + 1 % Triton X-100) 1 ml와 혼합하고, 이를 1, 2, 3, 5, 7 또는 10분간 인큐베이팅하였다. 이후에, 1 ml 중화 완충액을 첨가하였다. 병원체를 원심분리 (10분간 4000 g)하여 수집하고, 박테리아 펠릿을 세척하였다. 마지막으로, 세포를 표준 알칼리성 용균법으로 용균시킨 다음에, QiaAmp blood mini 키트를 사용하여 DNA 정제하였다. 회수된 DNA 양을 리얼 타임 PCR로 측정하였다. 그 결과는 도 3에 나타내는데, 인큐베이션은 30초 내지 10분간 수행하는 것이 바람직함을 나타낸다.
실시예 4
본 발명에 따른 선택적 용균에 의한 인간 백그라운드의 감소
본 방법에서 진핵 세포 DNA, 더욱 구체적으로는 백혈구 DNA의 양을 감소시키는 것은 중요한데, 왜냐하면 이것들이 존재할 때는 병원체 DNA 또는 RNA를 검출하기 위한 이어지는 PCR 반응을 방해하기 때문이다. 남아 있는 백그라운드 DNA의 양을 시험하기 위하여, 상이한 혈액 샘플을 본 발명에 따른 선택적 용균 프로토콜을 사용하여 처리하였고, PCR 반응 중의 백혈구 DNA의 양은 RNaseP 검출 키트 (Applied Biosystems)를 사용하여 분석한다. 이들 샘플의 Ct값을 전체 백혈구 DNA가 존재하는 200 ㎕ 혈액 전혈 샘플로부터 얻은 것과 비교하였다. 문헌으로부터, 200 ㎕ 혈액 전혈 샘플로부터 유래한 인간 DNA는 병원체 DNA 증폭을 억제하지 않고 PCR 반응에 의하여 용인될 수 있는 백그라운드 DNA의 최대량임이 알려져 있다. 상이한 PCR 반응의 결과는 도 4에 나타낸다.
이 도면은, 본 발명의 방법에 따라 처리된 혈액 샘플 (1 M NaCarbonate pH 10.0 + 1 % Triton X-100) 1 ml와 200 ㎕ 전혈 참조 샘플 사이의 인간 백그라운드 양의 차이를 나타낸다.
상이한 샘플을 처리하고, PCR 결과는 개별적인 데이터 포인트로서 나타낸다. 이들 결과는 백그라운드 DNA의 양은 200 ㎕ 전혈 혈액 참조 샘플에 비하여, 본 발명에 따라 처리된 샘플 1 ml 중에서 백그라운드 DNA의 양이 훨씬 낮았음을 (즉, 더 높은 Ct 값) 증명한다. 이 결과는 본 발명에 따른 방법을 사용하였을 때 백혈구 DNA가 효과적이고 충분하게 샘플로부터 제거됨을 입증하는 것이다.
실시예 5
이 실시예의 목적은 본 발명에 따른 방법을 사용함으로 인하여 전혈로부터 상이한 병원체 타입을 검출할 수 있다는 것을 증명하기 위한 것이다. 상이한 타입의 병원체인 그람 음성균 (P. aeruginosa), 그람 양성균 (S. aureus) 및 균류 (C. albicans)를 1 ml 혈액과 함께 혼합하였다. 이 혈액 샘플을 선택적 용균 완충액 (1 ml의 1M NaCarbonate pH 10.0 + 1% TX-100 용액)으로 3분간 처리한 다음에, pH 중화처리를 하고, 모든 세포를 유지하기에 충분한 작은 크기의 세공를 가지는 크기 선별 필터를 사용하여 여과하였다. 필터를 세척하여 헤모글로빈이나 백혈구 DNA 등의 남아 있는 억제제를 제거하였다. 이어서, 세포를 표준 알칼리성 용균 프로토콜에 따라 용균하고, DNA를 Qiagen blood mini 키트를 사용하여 정제하였다.
병원성 DNA를 리얼 타임 PCR로 검출하였는데 Ct 값은 DNA의 양에 대한 척도이다. 정량을 위하여, 소량의 혈액 샘플을 혈액 아가 플레이트 상에 플레이팅하여, CFU 수를 얻었다. 도 5에 제시된 바와 같은 데이터는 전체 혈구로부터 소수의 병원체를 검출할 수 있음을 나타낸다. 참조 샘플은 소량의 PBS 완충액 중에 동일한 수의 박테리아를 함유하는데, 이는 직접 용균된 다음에, DNA 정제하고 리얼 타임 PCR을 사용하는 정량 분석에 들어간다. 참조 측정값 및 실제 혈액으로부터의 인리치먼트 실험 결과는 유사한 Ct 값을 나타내었는데, 그러므로 이는 높은 회수율을 증명하는 것이다. 음성 대조군 (박테리아가 없는 혈액)은 PCR 시그널을 나타내지 않는다.
이 분석법은 더 많은 양의 혈액이 사용될 수 있도록 한다. 실험 장치는 이전의 실시예와 같지만, 혈액의 양을 5 ml로 증가시켰다. 참조 샘플은 5 ml 혈액 샘플과 동일한 양의 병원체를 함유하지만, 세포들은 소량의 PBS 중에 남아있고 바로 용균된다. 이 결과는 도 6에 나타낸다.
이 실험은 다량의 혈액으로부터 소수의 병원체를 회수할 수 있는 가능성을 증명한다. 데이터는 회수된 병원체 DNA의 농도는 참조 샘플과 유사함을 나타낸다. 그러므로, 병원체의 대부분은 선택적 용균 동안에 온전하게 남아있고, 백혈구 DNA 감소는 병원체 PCR 억제를 예방하기에 효과적인 것으로 결론을 내릴 수 있다.
실시예 6
본 발명에 따른 선택적 용균 방법은 다양한 방법으로 수행될 수 있는데, 그러한 것들로는 수동형 방법과, 본 발명의 장치에 의하여 수행되는 방법 (통합형 방법)이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 실시예는 이러한 통합형 방법과 수동형 방법을 비교한다. 수동형 방법은 손수 피펫팅하는 단계와 원심분리하는 단계를 필요로 하는 반면에, 통합형 방법은 요구되는 작업을 모두 수행할 수 있는 미세유체 카트리지와 크기 선택적 필터를 사용한다. 기본적인 생화학적 프로토콜은 유사하다. 즉, 1M NaCarbonate + 1% Triton X-100 용액을 사용하여 백혈구와 적혈구의 선택적 용해를 한 다음에, 3분간 중화 단계가 이어진다. 다음 단계에서, 이 혼합물은 원심분리되거나 (수동형) 또는 여과된다 (통합형). 그리고 세포를 세척하고, 마지막으로 DNA를 표준 알칼리성 용균 절차를 사용하여 분리한다. 마지막 단계에서, DNA는 Qiagen blood mini 키트를 사용하여 정제하고, 리얼 타임 PCR로 검출한다. 통합형 방법과 수동형 방법의 결과는 도 7에서 볼 수 있다. 비교 가능한 결과가 얻어졌는데, 이는 곧 이 결과가 분석 방법의 실행 방식과는 관계가 없음을 증명한다.
실시예 7
이 실시예에서, 본 발명에 따른 방법은 시판되는 MolYsis Complete 키트 (Molzym) 방법을 벤치마킹한다. 이 키트는 포유류 세포를 선택적으로 용균하기 위한 분해제와 계면 활성제를 사용한다. 이 용균 단계 이후에는 이러한 분해제/계면 활성제에 의하여 영향받지 않는 DNAase를 사용하여 분해하는 단계가 이어진다.
이 실시예를 위하여, 혈액 샘플 1 ml에 상이한 농도의 S. aureus를 넣었다. 혈액 1 ml를 실시예 5에 기재된 바와 같이 처리하고, 제조업자 지침에 따라 MolYsis 키트를 사용하여 1 ml 더 처리하였다. 도 8에, 세포의 농도에 따라 Ct 값을 플롯팅하였으며, 이는 본 발명에 따른 방법은 효소나 분해용 염을 첨가하지 않고도 적어도 공지의 MolYsis 키트에서와 같이 효율적임을 나타낸다.
실시예 8
혈구의 선택적 용균과, 크기 선택적 필터 상에서 병원체 세포의 인리치먼트 후, 알칼리성 용균을 수행하여, PCR 분석에 사용 가능한 DNA를 만들기 위한 필터 상의 상이한 병원체의 동시 용균을 실시하였다.
도 9는 통합형 카트리지 상에서 수행된 알칼리성 용균 절차의 결과를 나타낸다. 혈액 1 ml에, 106개 세포의 S. aureus, P. aeruginosa 및 C. albicans를 첨가하였다. 혈구의 선택적 용균 및 필터 상의 병원체 인리치먼트 후에, 200 mM NaOH, 0.5% SDS를 함유하는 용액 200 ㎕를 사용하여 알칼리성 용균을 실시하였고, 이를 95℃에서 10분간 인큐베이팅하여 필터 중의 병원체의 완전한 용균을 얻었다. 병원체 DNA를 함유하는 용출액을 1 M 시트르산 용액 20 ㎕를 사용하여 중화시키고, QIAamp DNA/Blood Mini 키트를 사용하여 정화하였다. 대조군 샘플로서 각 병원체 106개 세포를 전술한 바와 같이, 벤치 상에서 용균시키고, 중화시키고 정제하였다.
알칼리성 용균 절차를 최적화하고 벤치마킹하기 위하여, Candida albicans를 모델 시스템으로 선택하였는데, 이들 효모 세포는 용균되기 어려운 단단한 세포벽으로 알려져 있기 때문이다. 도 10은 다른 용균 방법, 즉 고강도 초음파 (HiFU) 처리 및 시판되는 키트 (BD GeneOhm lysis 키트)와, 알칼리성 용균 방법 (열처리와 함께 50 mM NaOH, 0.25% SDS 사용)을 비교하고 있다. 알칼리성 용균 및 시판 키트에 의한 용균을 위하여, 이들 샘플을 원심분리를 사용하여 1 ml 내지 160 및 100 ㎕로 각각 농축시켰다. HiFU를 위하여, 세포 용액 2 ml를 농축하지 않고 그대로 사용하였다. 용균 이후, 용균되지 않는 세포와 찌꺼기를 원심 분리하여 샘플로부터 제거하였다. 조질 용균액 1 ㎕를 PCR 투입액으로 사용하였다.
NaOH 및 SDS 혼합물은 각 개별 화합물보다 용균에 더 효과적이다. 어느 한 쪽 화합물의 농축액이 증가하면 용균능이 더 증가하지 않았다. 가열 인큐베이션 단계가 없는 알칼리성 용균은 유의하게 덜 효과적이다. 용균능은 2분간 95℃에서 인큐베이션 함으로써 증가할 수 있지만, 장기간 카트리지 인큐베이션으로 분석법을 통합시키기 위해서는 70℃가 바람직하다.
알칼리성 용균을 위해서, 세포를 50 mM NaOH 및 0.25% SDS를 함유하는 용균액 100 ㎕ 중에 재현탁시켰다. 이어서, 샘플을 10분간 70℃에서 인큐베이션한 다음에, 실온으로 급속 냉각시키고, 30 ㎕ 500 mM Tris-HCl, pH 7.0를 첨가하여 중화시켰다 (150 mM Tris의 최종 농도를 생성하는데, 즉, NaOH 농도의 3배).
미정제 용균물 PCR을 위하여, 용균되지 않은 세포와 찌꺼기를 원심분리 (5분, 14000 g)하여 샘플로부터 제거하였다. 상청액 1 ㎕를 25 ㎕ PCR 반응에 첨가하였다. PCR에 의하여 검출하는 것은 rRNA 유전자 (Apollo)를 타겟팅하는 Taqman PCR 분석법에 기반하였다. PCR 반응은 500 nM 포워드 프라이머 및 300 nM 리버스 프라이머 및 FAM-BHQ1 레이블 프로브 (Biolegio BV가 합성한 올리고뉴클레오타이드 커스텀)를 사용하여, Taqman Universal mastermix (Applied Biosystems)에서 수행하였다. PCR 반응을 Biorad CFX 리얼 타임 PCR 시스템으로 수행하였다. 고열 작동 폴리머라아제를 활성화시키기 위하여 95℃에서 10분간 초기 가열 단계 다음에, 95℃에서 15초간 50 사이클과, 60℃에서 1분 사이클을 증폭을 위해 사용하였다. 형광 시그널을 60℃ 단계 중의 각 사이클에서 검출하였다. Biorad CFX 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다.

Claims (15)

  1. a) 미생물을 함유하거나 함유하는 것으로 생각되는 동물 세포(animal cells)를 함유하는 포유류 혈액 샘플을 제공하는 단계와, 여기서, 상기 포유류 혈액 샘플은 전혈이며,
    b) 비이온성 계면 활성제(non-ionic detergent)와 완충액(buffer)을 상기 전혈(whole blood)에 첨가하여 pH가 9.5 또는 그 이상인 용액을 얻는 단계와, 여기서, 상기 첨가된 비이온성 계면 활성제와 첨가된 완충액의 부피와 상기 전혈 샘플의 부피비율은 2/1과 1/10 사이이고, 그리고 여기서 상기 비이온성 계면 활성제는 0.1과 5 %(w/v% 또는 v/v%) 사이의 범위내 농도로 존재하며,
    c) 상기 동물 세포를 용균(lyse) 하기에 충분한 시간 동안 상기 용액을 인큐베이팅하는 단계,
    를 포함하는 미생물을 함유하거나 함유할 것으로 생각되는 포유류 혈액 샘플 내의 동물 세포의 선택적 용균 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 박테리아(bacterium)인 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 진균류(fungus)인 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 인큐베이팅 단계 c)는 30초 및 10분 사이에서 수행되는 것인 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 비이온성 계면 활성제는 노니데트(Nonidet) P40, 데옥시콜레이트, 이게팔(Igepal) CA 630 또는 트리톤-엑스(Triton-X) 100을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 인큐베이팅된 용액을 원심분리하고 상기 미생물을 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 인큐베이팅된 용액을 필터 상에서 여과하여 인큐베이팅된 용액에서 미생물을 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 미생물을 용균(lysing)하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 핵산에 기반한 분자 분석법을 더 포함하는 것인 방법.
  14. - 40 ml보다 적은 부피의 미생물을 함유하거나 또는 함유하는 것으로 생각되는 동물 세포(animal cells)를 함유하는 포유류 혈액 샘플을 수용하고 용균시키기 위한 용균 챔버 (2)와, 여기서, 상기 포유류 혈액 샘플은 전혈이며,
    - 전혈에 비이온성 계면 활성제와 완충액을 첨가하여 pH 9.5 이상의 용액을 얻기 위하여, 상기 용균 챔버와 연결된 pH 9.5 이상의 알칼리성 완충액과 비이온성 계면 활성제를 포함하는 리저버 (3), 또는 상기 용균 챔버와 연결된 pH 9.5 이상의 알칼리성 완충액을 포함하는 리저버 (31) 및 상기 용균 챔버와 연결된 비이온성 계면 활성제를 포함하는 리저버 (32)와,
    - 상기 용균 챔버에서 동물 세포를 인큐베이션과 용균시킨 후 용액을 여과하여 용액으로부터 미생물을 분리하기 위하여 용균 챔버와 연결된 필터 (4), 및
    - DNA 존재 여부를 분석하기 위한 검출 챔버 (5)를 포함하는,
    미생물을 함유하거나 함유하는 것으로 생각되는 동물 혈액 샘플 중 미생물 검출용 장치 (1).
  15. 제14항에 있어서, 상기 알칼리성 완충액의 pKa는 9.0보다 크고, 그리고 비이온성 계면 활성제는 트리톤-엑스(Triton-X)100인 것인 장치.
KR1020127014376A 2009-12-08 2010-12-07 세포의 선택적 용균 KR101786135B1 (ko)

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Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2831969A1 (en) * 2011-06-06 2012-12-30 Biocartis S.A. Selective lysis of cells by ionic surfactants
US10774300B2 (en) * 2011-07-22 2020-09-15 Biomerieux, Inc. Methods and kits for isolating microorganisms from culture
ES2396820B1 (es) 2011-07-26 2014-01-31 Universidad Autónoma de Madrid Método para evaluar la integridad de la pared celular bacteriana.
CA2859697C (en) * 2011-12-21 2021-06-08 Geneohm Sciences Canada Inc. Enrichment & isolation of microbial cells & microbial nucleic acids from a biological sample
EP2684947A1 (en) * 2012-07-09 2014-01-15 Biocartis SA A method for filtering a biological sample
EP2900819B1 (en) 2012-09-28 2020-10-28 Cepheid Methods for dna and rna extraction from fixed paraffin-embedded tissue samples
US9707555B2 (en) 2012-11-30 2017-07-18 Qvella Corporation Method for pretreatment of microbial samples
US8975060B2 (en) * 2012-11-30 2015-03-10 Qvella Corporation Method for pretreatment of microbial samples
FR3001464B1 (fr) * 2013-01-25 2016-02-26 Biomerieux Sa Procede d'isolement specifique d'acides nucleiques d'interet
EP3004323B1 (en) * 2013-05-31 2019-04-17 3i Diagnostics, Inc. Rapid microbial detection
JP6466437B2 (ja) 2013-10-30 2019-02-06 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＭｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ 微生物を複雑な試料から単離する方法
CA2930495C (en) * 2013-12-02 2022-07-05 Biocartis N.V. Extraction of circulating nucleic acids
EP2942394A1 (en) 2014-05-09 2015-11-11 Molzym GmbH & Co. KG New method for isolating microbial DNA
WO2015172255A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Qvella Corporation Apparatus, system and method for performing automated centrifugal separation
CN106661606B (zh) 2014-06-13 2021-12-21 Q-莱纳公司 用于检测和表征微生物的方法
EP3164204B1 (en) * 2014-07-02 2021-03-10 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Selective nucleic acid separation
NL2013266B1 (en) 2014-07-25 2016-05-19 Microbiome Ltd Novel test for microbial blood infections.
US11414712B2 (en) 2014-09-17 2022-08-16 Helixbind, Inc. Methods and devices for detecting and identifying microorganisms
WO2016153355A2 (en) 2015-03-26 2016-09-29 Microbiome Limited Novel isolation and amplification process control
WO2016169579A1 (en) * 2015-04-20 2016-10-27 Qiagen Gmbh Method, lysis solution and kit for selectively depleting animal nucleic acids in a sample
GB201507026D0 (en) 2015-04-24 2015-06-10 Linea Ab Q Medical sample transportation container
CN104931317B (zh) * 2015-06-11 2018-05-25 宁波美晶医疗技术有限公司 一种血液前处理液
GB201511129D0 (en) 2015-06-24 2015-08-05 Linea Ab Q Method of determining antimicrobial susceptibility of a microorganism
WO2017042819A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 Molecular Detection Israel Ltd. Methods for isolating microbial cells from a blood sample
JP7073328B2 (ja) * 2016-03-14 2022-05-23 ヘリックスバインド・インコーポレイテッド 集積流体デバイスと関連する方法
US10465231B2 (en) 2016-03-22 2019-11-05 Siemens Healthcare Gmbh Method and apparatus for enriching pathogen DNA
CA3020581A1 (en) * 2016-04-14 2017-10-19 T2 Biosystems, Inc. Methods and systems for amplification in complex samples
WO2017182775A1 (en) * 2016-04-18 2017-10-26 Momentum Bioscience Limited Microorganism detection involving filtration
GB2554767A (en) 2016-04-21 2018-04-11 Q Linea Ab Detecting and characterising a microorganism
GB201617713D0 (en) 2016-10-19 2016-11-30 Q-Linea Ab Method for recovering microbial cells
GB2557654A (en) 2016-12-14 2018-06-27 Uea Enterprises Ltd Method for nucleic acid depletion
US11149246B2 (en) 2016-12-29 2021-10-19 Shoreline Biome, Llc Methods for cell lysis and preparation of high molecular weight DNA from modified cells
CA3048844C (en) * 2016-12-29 2023-12-12 Shoreline Biome, Llc Combined lysis protocol for comprehensive cell lysis
CN106893680B (zh) * 2017-03-03 2020-10-02 上海市临床检验中心 一种从血液样本中富集丝状真菌的方法
WO2018160907A1 (en) * 2017-03-03 2018-09-07 Counsyl, Inc. Extraction of nucleic acids for reduced probe count variability
EP3456839A1 (en) * 2017-09-14 2019-03-20 Siemens Healthcare GmbH Method of enrichment of micro-organisms in a metagenomics workflow
JP2019075997A (ja) * 2017-10-20 2019-05-23 花王株式会社 吸収性物品に移行した微生物から核酸又はタンパク質を抽出する方法
US20220064695A1 (en) * 2018-03-11 2022-03-03 Bacteria Detection Ltd Methods for isolating microbial cells from a blood sample
GB201805479D0 (en) * 2018-04-03 2018-05-16 Momentum Bioscience Ltd Microorganism separation and detection
JP7062552B2 (ja) 2018-08-06 2022-05-06 株式会社日立製作所 微生物検査
CN112391291B (zh) * 2019-08-19 2022-03-29 广州微远医疗器械有限公司 细胞内微生物的富集方法及试剂
WO2021055495A1 (en) * 2019-09-17 2021-03-25 Juno Bio Limited Methods and systems for selective nucleic acid depletion
GB201914538D0 (en) 2019-10-08 2019-11-20 Momentum Bioscience Ltd Microorganism capture from antimicrobial-containing solution
WO2021229667A1 (ja) * 2020-05-12 2021-11-18 株式会社日立ハイテク 自動分析装置、自動分析方法
AU2021400825A1 (en) * 2020-12-16 2023-07-06 Biofire Diagnostics, Llc Systems, methods, and apparatuses for concentration and identification of a microorganism from blood
CN116249784A (zh) * 2020-12-25 2023-06-09 豪夫迈·罗氏有限公司 人血细胞的选择性裂解
CN113088454A (zh) * 2021-04-08 2021-07-09 武汉轻工大学 一种从被感染细胞中分离完整细菌的方法
CN114480575B (zh) * 2022-01-19 2024-04-09 武汉承启医学科技有限公司 一种快速检测病原体的方法

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4610961A (en) 1982-12-27 1986-09-09 Eastman Kodak Company Inhibition of reduction activities of leukocytes
US4652517A (en) * 1984-06-11 1987-03-24 Diagnostic Research Limited Partnership Methods for the in vitro detection and identification of unknown pathogens or genetic entities
WO1993016384A1 (en) * 1992-02-07 1993-08-19 Abbott Laboratories Method for accurately enumerating and sensitively qualifying heterogeneous cell populations in cytolytic processing conditions
AU686577B2 (en) 1992-10-30 1998-02-12 Innogenetics, Inc. Measurement of total molecule in a sample and methods based thereon
AU4586096A (en) * 1995-03-10 1996-09-19 Becton Dickinson & Company Sample processing method for whole blood
US6632399B1 (en) 1998-05-22 2003-10-14 Tecan Trading Ag Devices and methods for using centripetal acceleration to drive fluid movement in a microfluidics system for performing biological fluid assays
US6887693B2 (en) * 1998-12-24 2005-05-03 Cepheid Device and method for lysing cells, spores, or microorganisms
JP3811616B2 (ja) * 1999-05-25 2006-08-23 ミリポア・コーポレイション 哺乳動物細胞調製物中の微生物を、ａｔｐ生物発光を利用して迅速に検出して計数する方法
DK1181098T4 (da) * 1999-05-28 2011-09-26 Cepheid Patron til udførelse af en kemisk reaktion
US6803208B2 (en) 2001-07-30 2004-10-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Automated epifluorescence microscopy for detection of bacterial contamination in platelets
JP4227019B2 (ja) 2001-10-23 2009-02-18 デンカ生研株式会社 血液中の血球と菌の分離方法および血液中の菌の検出方法
ES2215957T3 (es) * 2002-08-01 2004-10-16 Mtm Laboratories Ag Metodo para diagnostico basado en una solucion.
DE602004020999D1 (de) 2003-08-15 2009-06-18 Univ South Florida Materialien und verfahren zum einfangen von krankheitserregern und zur abtrennung von aurintricarbonsäure aus einer probe
WO2005068647A2 (en) * 2003-12-09 2005-07-28 Biomerieux, Inc. Methods for detecting bacterial pathogens
EP1695086B1 (en) 2003-12-09 2009-02-18 BioMerieux, Inc. Methods for detecting bacterial pathogens
DE102005009479A1 (de) 2005-03-02 2006-09-07 Molzym Gmbh & Co. Kg Verwendung von Nukleasen zum Abbau von Nukleinsäure in Gegenwart von chaotropen Agenzien und/oder Tensiden
GB0508981D0 (en) 2005-05-03 2005-06-08 Acolyte Biomedica Ltd Distinguishing cells in a sample
EP1882739A1 (en) 2006-06-30 2008-01-30 Qiagen GmbH Nucleic acid extraction method
WO2008078808A1 (ja) 2006-12-27 2008-07-03 Medibic 真空採血管
JP4522434B2 (ja) 2007-05-31 2010-08-11 キヤノン株式会社 血液採取用容器
US8481265B2 (en) 2007-08-02 2013-07-09 Universite Laval Concentration and enrichment of microbial cells and microbial nucleic acids from bodily fluids
KR20090058221A (ko) * 2007-12-04 2009-06-09 삼성전자주식회사 시료 중의 세포 집단으로부터 죽은 세포를 선택적으로파쇄하는 방법
EP2087934A1 (de) 2008-02-07 2009-08-12 Qiagen GmbH Verfahren und Vorrichtung zur automatisierten Prozessierung einer Probe
JP5599013B2 (ja) 2008-04-03 2014-10-01 キヤノン株式会社 血液検体からの微生物核酸の抽出方法
RU2541775C2 (ru) 2008-10-31 2015-02-20 Биомерьё, Инк. Способ идентификации микроорганизмов из тестируемого образца гемокультуры
MX2011003982A (es) 2008-10-31 2011-09-21 Bio Merieux Inc Métodos para la separación, caracterización y/o identificación de microorganismos usando espectroscopia.
CA2741008C (en) 2008-10-31 2018-08-28 Biomerieux, Inc. Methods for separation and characterization of microorganisms using identifier agents
CA2760982C (en) 2009-05-15 2019-01-15 Biomerieux, Inc. System and methods for rapid identification and/or characterization of a microbial agent in a sample

Also Published As

Publication number Publication date
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JP2016127844A (ja) 2016-07-14
US10308976B2 (en) 2019-06-04
US20130171615A1 (en) 2013-07-04
EP2333105A1 (en) 2011-06-15
EP2510123B1 (en) 2014-09-24
CN102725423A (zh) 2012-10-10
EP2510123A1 (en) 2012-10-17
US11072813B2 (en) 2021-07-27
EP2510123B2 (en) 2019-01-09
RU2556130C2 (ru) 2015-07-10
BR112012013926A2 (pt) 2016-04-26
ES2509968T3 (es) 2014-10-20
RU2012128662A (ru) 2014-01-20

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