ES2509968T5 - Lisis selectiva de células - Google Patents

Lisis selectiva de células Download PDF

Info

Publication number
ES2509968T5
ES2509968T5 ES10807664T ES10807664T ES2509968T5 ES 2509968 T5 ES2509968 T5 ES 2509968T5 ES 10807664 T ES10807664 T ES 10807664T ES 10807664 T ES10807664 T ES 10807664T ES 2509968 T5 ES2509968 T5 ES 2509968T5
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
blood
sample
lysis
dna
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10807664T
Other languages
English (en)
Other versions
ES2509968T3 (es
Inventor
Meerbergen Bart Edward Gusta Jozef Van
Oana Mihaela Piciu
Ron Gill
Kristiane Anne Schmidt
Sieglinde Neerken
Marc Wilhelmus Gijsbert Ponjee
Zeynep Seflek Unay
Roel Penterman
De Wiel Paul Arnold Van
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biocartis NV
Original Assignee
Biocartis NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=42136346&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2509968(T5) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biocartis NV filed Critical Biocartis NV
Application granted granted Critical
Publication of ES2509968T3 publication Critical patent/ES2509968T3/es
Publication of ES2509968T5 publication Critical patent/ES2509968T5/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/06—Hydrolysis; Cell lysis; Extraction of intracellular or cell wall material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)

Description

DESCRIPCION
Lisis selectiva de celulas.
CAMPO DE LA INVENCION
La presente invencion se refiere a la lisis de celulas eucariotas, en particular celulas animales, tales como celulas sangufneas. La presente invencion se refiere adicionalmente a la deteccion de bajas concentraciones de microorganismos, tales como bacterias, en muestras con altas concentraciones de otras celulas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
El diagnostico molecular tiene como objetivo la deteccion rapida de cantidades mfnimas de patogenos (tfpicamente bacterias) es muestras tal como sangre. Sin embargo, la sangre es una matriz compleja y comprende globulos blancos (leucocitos) para el sistema inmune adaptativo, globulos rojos (eritrocitos) para el transporte de oxfgeno, y plaquetas (trombocitos) para la cicatrizacion de heridas. Esto complica la deteccion directa de patogenos en muestras tal como sangre entera, que contienen una gran cantidad de material celular.
Los procedimientos de deteccion clasicos comprenden el crecimiento de bacterias en medios selectivos y/o medios con indicadores. Tfpicamente, dichos ensayos requieren una etapa de cultivo de al menos 1 o 2 dfas antes de que pueda tener lugar la identificacion.
Para los procedimientos basados en PCR, la cantidad de bacterias en una muestra de sangre fresca es en teorfa lo suficientemente alta para detectarse sin un cultivo adicional de las bacterias presentes en dicha muestra. Sin embargo, para permitir una deteccion temprana de cantidades mfnimas de bacterias, se requieren grandes volumenes de sangre. La gran cantidad de ADN especialmente en los globulos blancos, aumenta dramaticamente los antecedentes en los procedimientos de deteccion basada en ADN. Ademas, la presencia de hemo procedente de la hemoglobina disminuye fuertemente la actividad de la ADN polimerasa. Un microlitro de sangre humana contiene aproximadamente de 4.000 a 11.000 globulos blancos y aproximadamente de 150.000 a 400.000 plaquetas. La concentracion de ADN en sangre esta entre 30 y 60 |il/ml. Es extremadamente diffcil detectar en un volumen de 10 ml de sangre entera la presencia de aproximadamente 10 a 100.000 de una especie bacteriana.
Las elevadas cantidades de ADN de los globulos blancos pueden dar lugar a productos de PCR no relevantes, o pueden eliminar los cebadores disenados para la deteccion de ADN bacteriano. Esto requiere una minuciosa purificacion de ADN y la separacion de ADN mamffero antes de que el ADN bacteriano pueda detectarse a traves de PCR u otros procedimientos.
Ademas de interferir con la propia reaccion de PCR, la cantidad de ADN mamffero aumenta la viscosidad de una muestra. Ademas, las protefnas y las membranas de las celulas mamfferas sometidas a lisis forman complejos que impiden la filtracion de una muestra. Esto es particularmente un problema para los dispositivos miniaturizados. La dilucion adicion del ya gran volumen de muestra da como resultado largas etapas de manipulacion inaceptables. Por los motivos anteriores, se requieren en consecuencia procedimientos para extraer ADN humano de una muestra de sangre.
Se conocen procedimientos para ensayar especfficamente el ADN bacteriano en presencia de ADN mamffero. Looxter™, de la empresa SIRSLab, usa un procedimiento para enriquecer el ADN metilado de una muestra. Puesto que el ADN bacteriano esta fuertemente metilado, este enfoque da como resultado un enriquecimiento del ADN bacteriano. Molysis™, de la empresa Molzym, usa agentes caotropicos y detergentes para lisar selectivamente celulas mamfferas. Esta etapa de lisis se sigue de una digestion con una ADNasa que no se ve afectada por este agente caotropico/detergente. Los enfoques alternativos, tales como los comercializados por Roche (Septifast™) se basan en pares de cebadores de PCR que estan disenados especfficamente para impedir la union inespecffica a ADN humano y la amplificacion de ADN humano.
El documento US 6.803.208 describe un procedimiento en el que una suspension altamente diluida de plaquetas sangufneas dopada con bacterias se lisa a 37 °C durante 15 minutos, despues de lo cual es posible filtrar una pequena cantidad de muestra lisada sobre un filtro de 0,4 |im para realizar una inspeccion visual de las bacterias que estan retenidas en el filtro. Sin embargo, este procedimiento no permite procesar grandes volumenes de muestra a temperatura ambiente.
Sullivan N M y col. ("Practical aerobic membrane filtration blood culture technique: development of procedure", Journal of Clinical Microbiology, vol. 1, N° 1, enero de 1975) desvelan diversos tampones para la lisis selectiva de celulas sangufneas para detectar microorganismos en la sangre. El documento WO 00/72970 A1 (Cepheid, 7 de diciembre de 2000) desvela un dispositivo de cartucho para la deteccion de ADN.
RESUMEN DE LA INVENCION
La invencion se define en las reivindicaciones independientes y dependientes adjuntas.
Un aspecto de la invencion se refiere a un procedimiento para la lisis selectiva de celulas animales, en una muestra que contiene, o se sospecha que contiene, un microorganismo. Este procedimiento comprende las etapas de proporcionar una muestra con celulas eucariotas, en particular, celulas animales, que contiene, o se sospecha que contiene un microorganismo, anadir un detergente no ionico y un tampon a la muestra para obtener una solucion con un pH de aproximadamente 9,5 o mas, e incubar la solucion durante un periodo de tiempo lo suficientemente largo para lisar las celulas animales, por ejemplo, entre 30 segundos y 10 minutos, mas preferiblemente entre 2 y 6 minutos. La lisis puede realizarse en realizaciones particulares entre 15 y 30 °C, mas preferiblemente aproximadamente la temperatura ambiente.
De acuerdo con la invencion, la muestra es una muestra de sangre de mamffero, sangre entera.
En otras realizaciones particulares, el microorganismo es una bacteria u hongo.
De acuerdo con realizaciones particulares, la relacion entre el volumen de detergente anadido y de tampon anadido y el volumen de muestra esta entre 2/1 y 1/10.
En realizaciones particulares, el detergente no ionico se selecciona entre el grupo que comprende Nonidet, Brij, Tween, Igepal, triton reducido, octilglucosido, colato y Triton. Ejemplos mas preferidos son Triton X-100, Nonidet P40, desoxicolato sodico y/o Igepal CA 630.
En realizaciones particulares, el tampon alcalino, como se usa en el presente documento, tiene un valor pKa por encima de 9. Ejemplos del mismo son borato, carbonato, CAPS (N-ciclohexil-3-amino-propanosulfonico), CAPSO (acido 3-(ciclohexilamino)-2-hidroxi-1-propanosulfonico), CHES (acido 2-(N-ciclohexilamino)etano sulfonico), pirofosfato y etanolamina. Un ejemplo particular es carbonato sodico. El tampon debe tener suficiente capacidad de tampon que cuando se mezcla con la muestra en relaciones de acuerdo con la presente invencion, el pH de la solucion final es de aproximadamente 9,5 o superior.
En realizaciones particulares, el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de filtrar la solucion incubada en un filtro con un tamano de poro que retiene microorganismos en el filtro, tal como un filtro con un tamano de poro de menos de 0,7 pm, mas preferiblemente menos de 0,5 pm. El procedimiento de la presente invencion facilita la filtracion de elevados volumenes de muestra sin etapas del proceso enzimatico o termo-relacionado.
En realizaciones particulares, el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de anadir, despues de la lisis selectiva de acuerdo con la invencion, un acido o un tampon acido para obtener un pH entre aproximadamente 7 y 9, una "etapa de neutralizacion".
En realizaciones particulares, los procedimientos que se han descrito anteriormente estan seguidos de deteccion de los microorganismos. Ejemplos de los mismos son citometrfa, microscopfa, PCR o cultivo. En realizaciones particulares, los procedimientos que se han descrito anteriormente, estan seguidos de la lisis de microorganismos. Un aspecto que no forma parte de la presente invencion se refiere a un dispositivo (1) para la deteccion de microorganismos en una muestra, que comprende: una camara de lisis (2) para aceptar un fluido de muestra con un volumen por debajo de 40 ml, preferiblemente por debajo de 20 ml, y mas preferiblemente entre 1 y 20 ml, un deposito (3) que comprende un tampon alcalino con un pH de aproximadamente 9,5 o mas, y que comprende un detergente no ionico, o un deposito que comprende un tampon alcalino (31) con un pH de aproximadamente 9,5 o mas, un deposito que comprende un detergente no ionico (32), conectado a la camara de lisis, un filtro (4) conectado a la camara de lisis para filtrar la muestra despues de la lisis, teniendo el filtro un tamano de poro que retiene bacterias en el filtro, y una camara de deteccion (5) para ensayar la presencia de ADN.
En el presente documento, el tampon alcalino tiene tfpicamente un pKa por encima de 9,5 por lo que la solucion final tendra un pH de aproximadamente 9,5 o superior, y el detergente no ionico es tfpicamente Triton X-100, desoxicolato sodico, Nonidet P40 y/o Igepal CA 630.
Los procedimientos que se describen en la presente invencion permiten una lisis selectiva de globulos blancos y rojos en una muestra mientras que las bacterias y hongos permanecen intactos (ya sean muertos o vivos).
Los procedimientos que se describen en la presente invencion hacen posible procesar una muestra sin diluir sustancialmente dicha muestra y, en consecuencia, permiten procesar mayores volumenes de muestra. Ademas, no hay necesidad de degradacion enzimatica de ADN mediante, por ejemplo, ADNasa o el uso de calor, haciendo este procedimiento menos complejo en comparacion con procedimientos conocidos en la tecnica.
Los procedimientos que se describen en la presente invencion dan como resultado muestras lisadas con una baja viscosidad y un mfnimo de agregados, lo que hace posible filtrar grandes volumenes de la muestra lisada sobre un filtro que retiene bacterias. El procesamiento adicional de las bacterias en dicho filtro puede continuar con volumenes entre aproximadamente 100-1000 pl, lo que hace posible procesar grandes volumenes de muestra para procedimientos posteriores, y realizar las manipulaciones necesarias, tales como neutralizacion y lavado, completamente automatizadas en un cartucho integrado.
Las anteriores y otras caracterfsticas, rasgos y ventajas de la presente invencion se seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada, tomada junto con los dibujos adjuntos, que ilustran, a modo de ejemplo, los principios de la invencion. Esta descripcion se da unicamente a modo de ejemplo, sin limitar el alcance de la invencion. Las figuras de referencia que se citan a continuacion se refieren a los dibujos adjuntos.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra la eficacia de filtracion de grandes volumenes de sangre despues de la lisis selectiva a diferentes valores de pH de acuerdo con una realizacion particular de los procedimientos de la invencion. La figura 2 muestra la recuperacion de diferentes bacterias despues de la lisis a diferentes valores de pH de acuerdo con una realizacion particular de los procedimientos de la invencion.
La figura 3 muestra la recuperacion de diferentes bacterias despues de la lisis en diferentes tiempos de incubacion de acuerdo con una realizacion particular de los procedimientos de la invencion.
La figura 4 muestra la reduccion de ADN de fondo humano mediante lisis selectiva de acuerdo con la presente invencion.
Las figuras 5 y 6 muestran la deteccion de diferentes tipos de patogenos en 1 y 5 ml de sangre entera respectivamente.
La figura 7 muestra una comparacion entre un procedimiento realizado de forma manual o con dispositivo de acuerdo con la presente invencion.
La figura 8 muestra una comparacion del procedimiento de acuerdo con la invencion con una prueba de deteccion de sepsis disponible en el mercado.
La figura 9 muestra la lisis de patogenos despues de la lisis selectiva y la captura en el filtro de acuerdo con la presente invencion.
La figura 10 muestra la eficacia de la lisis de patogenos en comparacion con otros procedimientos de lisis cuando se realizan despues de la lisis selectiva y la captura en el filtro de acuerdo con la presente invencion.
La figura 11 muestra una vision esquematica de un dispositivo para realizar una lisis selectiva como se describe en las realizaciones de la presente invencion.
La figura 12 muestra un ejemplo de un dispositivo integrado que comprende una unidad de lisis selectiva. En las diferentes figuras, los mismos signos de referencia se refieren a elementos iguales o analogos.
La presente invencion se describira con respecto a realizaciones particulares y con referencia a ciertos dibujos, pero la invencion no se limita a las mismas, sino solo por las reivindicaciones. Cualquier signo de referencia en las reivindicaciones no deberan interpretarse como limitantes del alcance. Los dibujos descritos son unicamente esquematicos y no son limitantes. En los dibujos, el tamano de algunos de los elementos puede exagerarse y no dibujarse a escala para fines ilustrativos. Cuando se usa el termino "que comprende" en la presente descripcion y las reivindicaciones, esto no excluye otros elementos o etapas. Cuando se usa un artfculo indefinido o definido al hacer referencia a un nombre singular, por ejemplo "un" o "una", "el" o "la", este incluye un plural de ese nombre, a menos que se indique especfficamente otra cosa.
Ademas, los terminos primero, segundo, tercero y similares en la descripcion y en las reivindicaciones, se usan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronologico. Debe apreciarse que los terminos usados de este modo son intercambiables en las circunstancias apropiadas y que las realizaciones de la invencion descritas en el presente documento son capaces de funcionar en otras secuencias que las descritas o ilustradas en el presente documento.
Los siguientes terminos o definiciones se proporcionan unicamente para facilitar el entendimiento de la invencion. No debe interpretarse que estas definiciones tienen un alcance menor que el entendido por un experto en la tecnica. DESCRIPCION DETALLADA DE LAS REALIZACIONES
"Celulas sangufneas" en el contexto de la presente invencion se refiere a celulas mamfferas presentes en la sangre e incluye globulos rojos (eritrocitos), globulos blancos (leucocitos) y plaquetas sangufneas (trombocitos).
"Sangre entera" en el contexto de la presente invencion se refiere a sangre no procesada que comprende plasma y celulas sangufneas, potencialmente tratada con un anticoagulante.
"Muestra" se refiere a una suspension acuosa que comprende material celular y comprende fluidos corporales, tales como linfa, lfquido cefalorraqufdeo, sangre (sangre entera y plasma), saliva, pero tambien comprende, por ejemplo, la fraccion acuosa de suspensiones homogeneizadas, tales como, por ejemplo, musculos, cerebro, hfgado u otros tejidos. De acuerdo con la invencion, la muestra es una muestra de sangre entera.
"Eucariotico" en la presente invencion se refiere a cualquier tipo de organismo eucariotico, excluyendo a los hongos, tales como animales, en particular, animales que contienen sangre, y comprende animales invertebrados, tales como crustaceos y vertebrados. Los vertebrados comprenden tanto animales de sangre frfa (peces, reptiles, anfibios) como animales de sangre caliente (aves y mamfferos). Los mamfferos comprenden en particular primates, y mas particularmente seres humanos.
"Lisis selectiva", como se usa en la presente invencion, se obtiene cuando en una muestra (tal como sangre) el porcentaje de celulas de microorganismos (tales como celulas bacterianas) en esa muestra que permanece intacta es significativamente mayor (por ejemplo 2, 5, 10, 20, 50, 100, 250, 500 o 1000 veces mas) en comparacion con el porcentaje de las celulas eucariotas del organismo del cual se recoge la muestra que permanece intacta.
"Microorganismo", como se usa en la presente invencion, se refiere a bacterias (bacterias gram positivas y gram negativas, asf como esporas bacterianas) y hongos unicelulares, tales como levaduras y mohos, que estan presentes en el organismo a partir del cual se ha recogido una muestra, tfpicamente como un patogeno.
Un primer aspecto de la presente invencion se refiere a un procedimiento para la lisis selectiva de celulas eucariotas, en particular celulas animales, en una muestra de sangre entera, que contiene, o se sospecha que contiene, microorganismos tales como bacterias. El objetivo del procedimiento es aumentar la sensibilidad de una prueba para la deteccion de cantidades mfnimas de bacterias en una muestra (es decir, menos de 10000, 1000, 100 o incluso menos microorganismos por ml de muestra). Como se explica en los antecedentes de la invencion, el ADN de celulas eucariotas, en particular de celulas animales, en una muestra interfiere con los procedimientos de deteccion basados en PCR y este ADN, junto con protefnas y membranas forman agregados que aumenta la viscosidad despues de la lisis y que tiene un impacto dramatico en la filtracion de una muestra lisada. Para resolver este problema, las celulas eucariotas, en particular las celulas animales, se lisan selectivamente por lo que una parte sustancial (es decir, mas del 20%, 40%, 60%, 80%, 90% o incluso mas del 95%) de los microorganismos permanecen vivos, o si eliminan por el tratamiento, aun comprenden el ADN bacteriano en la pared celular. En los procedimientos que se describen en la presente invencion se abordan los problemas que se han mencionado anteriormente.
Los procedimientos que se describen en la presente invencion pueden aplicarse particularmente a cualquier tipo de muestra de sangre entera en la que la deteccion del ADN procedente de microorganismos, particularmente de bacterias, se altera por la presencia de otras celulas que comprenden ADN, en particular celulas de un huesped donde el microorganismo esta presente como un patogeno.
Los procedimientos que se describen en la presente invencion se ilustran ahora adicionalmente para realizaciones en las que se investiga la presencia de cantidades mfnimas de bacterias en una muestra de sangre de mamffero.
La muestra sangufnea puede almacenarse como sangre entera. Tfpicamente, los procedimientos que se describen en la presente invencion se realizan en sangre entera recien aislada. Dichas muestras se tratan generalmente con, por ejemplo, heparina, EDTA o citrato para evitar la coagulacion.
Como alternativa, el procedimiento se realiza en sangre fresca extrayendo la sangre de la vena directamente en un tubo con detergente y tampon.
Por consiguiente, una muestra de sangre fresca o una muestra conservada se complementa con un tampon y un detergente no ionico. La seleccion del tampon y su concentracion se seleccionan con el fin de compensar la capacidad tamponante de la muestra de sangre proporcionada y para obtener un pH alrededor de o mayor de 9,5, mas particularmente entre 9,5 y 11,5, incluso mas particularmente entre 9,5 y 10,5. Los valores de pH por encima de 11,5 son adecuados para organismos mas robustos, tales como bacterias gram positivas y hongos. De forma analoga, el tampon se concentra lo suficientemente de tal forma que como mucho se anada un volumen de tampon del 200%, 150%, 100%, 50%, 20% o el 10% del volumen de muestra a la muestra para obtener el cambio necesario en el pH.
Los tampones adecuados en el contexto de la presente invencion tfpicamente tienen un pKa por encima de 9, por encima de 9,5 o incluso por encima de 10, e incluyen borato, carbonato, CAPS, CAPSO, CHES, pirofosfato, etanolamina, y otros tampones usados habitualmente con una capacidad tamponante optima en los intervalos de pH que se han mencionado anteriormente.
Los detergentes adecuados son detergentes no ionicos, que, por un lado, tienen un efecto lftico unicamente en las celulas eucariotas, en particular las celulas animales, y, por otro lado, tienen un efecto solubilizante sobre el ADN y las protefnas.
Ejemplos de detergentes no ionicos son alquil glucosidos, Brij 35 (C12E23 Polioxietilenglicoldodecil eter) (15,7), Brij 58 (C16E20 Polioxietilenglicoldodecil eter) (16), Genapol (13 a 19), glucamidas, tales como MEGA-8, -9, -10, octilglucosido (12,6), Pluronic F127, Triton X-100 (C14H22O(C2H4O)n) (13,4), Triton X-114 (C24H42O6) (12,4), Tween 20 (Polisorbato 20) (16,7) y Tween 80 (Polisorbato 80) (15) Nonidet P40 desoxicolato sodico, Triton X-100 reducido y/o Igepal CA 630. Un ejemplo preferido particular de un detergente no ionico es Triton-X 100.
La concentracion mas eficaz de detergente depende de detergente a detergente, pero tfpicamente esta dentro del intervalo de entre el 0,1 y el 5%, mas particularmente entre el 0,1 y el 1%. Dependiendo del detergente (solido o lfquido) % se refiere a respectivamente % p/v o % v/v.
La incubacion de una muestra de sangre en presencia de tampon y detergente se realiza en 10 minutos, preferiblemente entre 30 segundos y 10 minutos y mas preferiblemente entre aproximadamente 1 a 3, 1-5, 1-8, 2-6 o 1-10 minutos, a temperaturas entre 10 °C y 30 °C, mas preferiblemente aproximadamente la temperatura ambiente. Los procedimientos de acuerdo con la presente invencion tienen la ventaja de que se obtiene una lisis selectiva en menos de 10 minutos, a temperaturas por debajo de 30 °C. Por consiguiente, los procedimientos pueden realizarse generalmente a temperaturas ambiente sin la necesidad de calentar la muestra.
Opcionalmente, despues de la lisis, el pH de la muestra lisada se lleva a un valor neutro (es decir, entre 7 y 9) mediante la adicion de un acido o un tampon acido en una etapa de neutralizacion. Se descubrio que una muestra lisada a pH neutro puede almacenarse durante un tiempo prolongado (hasta 1, 2, 6, 12 o incluso 24 horas) sin una lisis adicional de las celulas bacterianas y sin cambios dramaticos en las propiedades fluidas de la muestra lisada. Otro parametro investigado en los procedimientos de la presente invencion es la evaluacion de las propiedades fluidas de la muestra de sangre despues de la lisis. Esto puede determinarse verificando que volumen de sangre lisada puede filtrarse a traves de un filtro de 0,22 pm. Los procedimientos de acuerdo con la presente invencion permiten la filtracion de al menos 2, 5, 7, 5 o incluso 10 ml de sangre entera que se diluyo mediante la adicion de 1 volumen de solucion de tampon/detergente a 1 volumen de muestra.
Generalmente, los procedimientos de acuerdo con la presente invencion comprenden una etapa en la que las celulas bacterianas intactas se separan de la muestra, tfpicamente se realiza por centrifugacion o filtracion. En realizaciones particulares, las bacterias intactas se separan de la muestra por el paso de la muestra lisada por un filtro, con un tamano de poro por debajo de 1 pm, para retener las bacterias que tienen tfpicamente un tamano entre 0,5 y 10 pm, tales como filtros disponibles en el mercado con un tamano de poro de 0,4 o 0,22 pm. Para la filtracion de muestras existe una amplia diversidad de dispositivos disponibles en el mercado, tales como filtros adaptados para ajustarse en una jeringa de tal manera que despues de la lisis dentro de una jeringa, el fluido pueda pasarse por el filtro mediante presion manual sobre el embolo de la jeringa.
En lo sucesivo puede investigarse la presencia de bacterias (u hongos) en el filtro. En realizaciones particulares, la presencia de microorganismos se investiga por PCR. Para este fin, las bacterias (u hongos) pueden eliminarse mediante lavado del filtro y tratarse adicionalmente para su amplificacion por PCR. Como alternativa, el filtro se aclara con un tampon de lisis para liberar el ADN de los microorganismos, que se usa adicionalmente en una reaccion de PCR.
Pueden realizarse otras etapas de deteccion mediante citometrfa, microscopfa, PCR o cultivo.
La lisis de la muestra, la filtracion y la deteccion de microorganismos puede realizarse en un dispositivo (representado esquematicamente en la figura 11). Por consiguiente, un aspecto de la presente divulgacion se refiere a un dispositivo (1), que comprende una camara de lisis (2) para aceptar un fluido de muestra con un volumen entre 1 y 10 ml, un deposito (3) que comprende un tampon alcalino con tensioactivos como se ha descrito anteriormente, o un deposito que comprende un tampon alcalino (31) como se ha descrito anteriormente, y un deposito que comprende tensioactivos (32) como se ha descrito anteriormente, estando los depositos conectados a la camara de lisis (2). En el dispositivo, la camara de lisis se conecta a un filtro (4) para filtrar la muestra despues de la lisis por lo que los microorganismos se retienen en el filtro. El dispositivo comprende adicionalmente canales para eliminar los microorganismos del filtro y lisarlos en una camara separada. Como alternativa, el dispositivo comprende adicionalmente medios para lisar los microorganismos en el filtro, y canales para transferir ADN procedente de celulas bacterianas o fungicas lisadas del filtro a una camara separada. El dispositivo puede contener adicionalmente una camara de purificacion y deteccion de ADN (5) para ensayar la presencia de a Dn . Tfpicamente, la camara de deteccion es un modulo PCR.
En la figura 12, se representa un ejemplo de un dispositivo en el que tiene lugar la lisis selectiva y la purificacion e identificacion de ADN posterior.
Otras disposiciones de los procedimientos que incluyen la invencion seran obvias para los expertos en la tecnica. Debe apreciarse que aunque las realizaciones preferidas, construcciones especfficas y configuraciones, asf como los materiales, se han analizado en el presente documento para dispositivos de acuerdo con la presente divulgacion, pueden hacerse diversos cambios o modificaciones en forma y detalle.
EJEMPLO 1
Efecto del pH en la filtracion
El objetivo de este experimento es evaluar el efecto del pH del tampon en la eficacia de filtracion. La capacidad del tampon fue suficiente para obtener un pH similar en la solucion final segun se confirmo midiendo el pH de la solucion final usando tecnicas convencionales conocidas por el experto en la tecnica.
Los tampones contenfan:
- Borato de Na 1 M, pH 9,0 Triton X-100 al 1%
- Borato de Na 1 M, pH 9,5 Triton X-100 al 1%
- Carbonato de Na 1 M, pH 10,0 Triton X-100 al 1%
- Carbonato de Na 1 M, pH 10,3 Triton X-100 al 1%
- Carbonato de Na 1 M, pH 10,8 Triton X-100 al 1%
Se mezclo 1 ml de tampon con 1 ml de sangre entera y se incubo durante 3 minutos. En lo sucesivo, se anadio el tampon de neutralizacion y la mezcla se filtro a traves de un filtro de seleccion de tamano de 25 mm de diametro y con un tamano de poro de 0,45 pm usando una preparacion de filtracion de vacfo. Se midio el volumen de sangre que podia pasar el filtro antes de que se obstruya. Los resultados se muestran en la figura 1. Este experimento demuestra que el valor de pH final debe ser aproximadamente 9,5 o superior para conseguir volumenes suficientes de sangre filtrada para el analisis de bajas concentraciones de patogenos.
EJEMPLO 2.
Se muestra el efecto del pH del tampon en la recuperacion de patogenos intactos (E. coli) despues de la lisis de las celulas sangufneas.
Los tampones usados contenfan:
- Borato de Na 1 M, pH 9,0 Triton X-100 al 1%
- Borato de Na 1 M, pH 9,5 Triton X-100 al 1%
- Carbonato de Na 1 M, pH 10,0 Triton X-100 al 1 %
- Carbonato de Na 1 M, pH 10,5 Triton X-100 al 1%
Se anaden cantidades identicas de bacterias a 1 ml de sangre. Este volumen se trata con los tampones que se han mencionado anteriormente durante 3 min. En lo sucesivo, la sangre se centrifuga (10 min, 4000 g) para recoger las bacterias intactas. Las bacterias se lisan usando un procedimiento de lisis alcalina convencional y el ADN se purifica usando columnas de centrifugacion Qiagen (mini-kit de sangre QiaAmp). La cantidad de ADN se cuantifica usando PCR en tiempo real. El resultado se muestra en la figura 2.
La figura que se ha mencionado anteriormente muestra la recuperacion de las bacterias en funcion del pH del tampon de lisis selectiva. A valores de pH bajos, el ADN de los globulos blancos no se degrada e inhibe la reaccion de PCR. A valores de pH altos, las bacterias comienzan a lisarse durante la lisis selectiva y no se recuperan.
EJEMPLO 3.
Influencia del tiempo de incubacion en la recuperacion de patogenos.
Este ejemplo demuestra la influencia de la incubacion prolongada de sangre con el tampon de lisis selectiva de acuerdo con la invencion sobre la recuperacion de patogenos intactos. Se anadio un numero fijo de bacterias P. aeruginosa a la sangre. Se mezclo 1 ml de sangre de adicion con 1 ml de tampon de lisis selectiva (Carbonato de Na 1 M, pH 10,0 Triton X-100 al 1%) y se incubo durante 1, 2, 3, 5, 7 o 10 minutos. En lo sucesivo, se anadio 1 ml de tampon de neutralizacion. Los patogenos se recogieron por centrifugacion (10 min en 4000 g) y el granulo bacteriano se lavo. Finalmente, las celulas se lisaron mediante lisis alcalina convencional seguida de la purificacion de ADN usando el mini-kit de sangre QiaAmp. La cantidad de ADN recuperado se midio mediante PCR en tiempo real. Los resultados se visualizan en la figura 3 e indican que la incubacion se realiza preferiblemente entre 30 segundos y 10 minutos.
EJEMPLO 4
Reduccion del fondo humano por lisis selectiva de acuerdo con la presente invencion.
La reduccion de la cantidad de ADN de celulas eucariotas, mas especfficamente ADN de globulos blancos en el procedimiento actual, es importante ya que, cuando esta presente, inhibira una reaccion de PCR posterior para detectar ADN o ARN de patogenos. Para probar la cantidad de ADN de fondo restante, se procesan muestras de sangre diferentes con el protocolo de lisis selectiva de acuerdo con la presente invencion, y la cantidad de ADN de globulos blancos en la reaccion de PCR se analiza usando el kit de deteccion de RNasaP (Applied Biosystems). Los valores de Ct de estas muestras se comparan con las obtenidas a partir de 200 pl de muestras sangufneas de sangre entera, donde estaba presente todo el ADN de globulos blancos. A partir de la bibliograffa se sabe que el ADN humano que se origina de 200 pl de sangre entera es la cantidad maxima de ADN de fondo que puede tolerarse por una reaccion de PCR sin inhibicion de la amplificacion de ADN de patogenos. El resultado de las reacciones de PCR diferentes se muestra en la figura 4.
Esta figura muestra la diferencia en la cantidad de fondo humano entre el 1 ml de muestras de sangre procesada de acuerdo con el procedimiento de la presente invencion (Carbonato de Na 1 M, pH 10,0 Triton X-100 al 1%) y 200 pl de muestras de referencia de sangre entera. Se procesan diferentes muestras y los resultados del analisis por PCR se muestran como puntos de datos individuales. Estos resultados demuestran que la cantidad de ADN de fondo es mucho menor (= mayores valores de Ct) en las muestras de 1 ml procesadas de acuerdo con la presente invencion en comparacion con los 200 pl de muestras de referencia de sangre entera. Este resultado demuestra que el ADN de globulos blancos se elimina eficaz y suficientemente de la muestra al usar el procedimiento de acuerdo con la presente invencion.
EJEMPLO 5
El objetivo de este ejemplo es demostrar la deteccion de diferentes tipos de patogenos de sangre entera usando el procedimiento de acuerdo con la presente invencion. Los diferentes tipos de patogenos, bacterias gram-negativas (P. aeruginosa), gram-positivas (S. aureus) y hongos (C. albicans), se mezclaron juntos en 1 ml de sangre. La muestra de sangre se trato con el tampon de lisis selectiva (1 ml de una solucion 1 M de Carbonato de Na, pH 10,0 TX-100 al 1%) durante 3 min seguido de neutralizacion del pH y filtracion usando un filtro de seleccion de tamano con poros lo suficientemente pequenos para retener todas las celulas. El filtro se lavo para eliminar los inhibidores restantes, tal como hemoglobina y ADN de los globulos blancos. En lo sucesivo, las celulas se lisaron tras un protocolo de lisis alcalina convencional y el ADN se purifico usando el mini-kit de sangre Qiagen.
El ADN patogeno se detecto mediante PCR en tiempo real; el valor de Ct es una medida para la cantidad de ADN. Para la cuantificacion, una pequena parte de la muestra de sangre de adicion se puso en placas sobre una placa de agar sangre para obtener el recuento de UFC. Los datos que se presentan en la figura 5 muestran que es posible detectar un bajo numero de patogenos de sangre entera. La muestra de referencia contiene el mismo numero de bacterias en un pequeno volumen de tampon PBS que se lisa directamente seguido de purificacion de ADN y cuantificacion usando PCR en tiempo real. Las medidas de referencia y los experimentos de enriquecimiento reales de la sangre dan valores de Ct similares, demostrando de este modo las elevadas velocidades de recuperacion. El control negativo (sangre sin bacterias) no muestra ninguna senal de PCR.
El ensayo permite el uso de mayores volumenes de sangre. La preparacion experimental es identica al ejemplo anterior pero la cantidad de sangre aumenta a 5 ml. La muestra de referencia contiene el mismo numero de patogenos que la muestra de sangre de 5 ml pero las celulas permanecen en un pequeno volumen de PBS y se lisan directamente. Los resultados se representan en la figura 6.
Este experimento demuestra la posibilidad de recuperar un bajo numero de patogenos a partir de grandes volumenes de sangre. Los datos muestran que la concentracion de ADN de patogenos recuperado es similar a la referencia. Por lo tanto, puede concluirse que la mayor parte de los patogenos permanecen intactos durante la lisis selectiva y la reduccion del ADN de globulos blancos es eficaz para impedir la inhibicion del PCR de patogenos. EJEMPLO 6.
El procedimiento de lisis selectiva de acuerdo con la presente invencion puede realizarse de diversas formas, incluyendo, pero sin limitacion, un procedimiento manual y un procedimiento en el que el metodo se realiza por un dispositivo de acuerdo con la presente divulgacion (procedimiento integrado). El presente ejemplo compara tal procedimiento integrado y un procedimiento manual. El procedimiento manual requiere etapas de pipeteado manual y centrifugacion mientras que el procedimiento integrado usa un cartucho de microfluido y un filtro de seleccion de tamano, capaz de realizar todas las operaciones requeridas. El protocolo bioqufmico basico es similar: lisis selectiva de globulos blancos y rojos usando una solucion de Carbonato de Na 1 M Triton X-100 al 1% seguida de una etapa de neutralizacion despues de 3 min. En la siguiente etapa, la mezcla se centrifuga (manual) o se filtra (integrado) y las celulas se lavan y finalmente el ADN se libera por medio de un procedimiento de lisis alcalina convencional. En una ultima etapa, el ADN se purifica usando el mini-kit de sangre Qiagen y se detecta por PCR en tiempo real. Los resultados del procedimiento integrado y manual pueden encontrarse en la siguiente figura 7. Se consiguen resultados comparables, lo que demuestra que el resultado es independiente del formato de implementacion del ensayo.
EJEMPLO 7
En este ejemplo, el procedimiento de acuerdo con la presente invencion es comparable a un procedimiento disponible en el mercado, concretamente el kit MolYsis Complete (Molzym). Este kit usa agentes caotropicos y detergentes para lisar selectivamente las celulas mamfferas. Esta etapa de lisis se sigue de una digestion con una ADNasa que no se ve afectada por este agente caotropico/detergente.
Para este experimento, se anadio 1 ml de muestras de sangre en diferentes concentraciones de S. aureus. Se proceso 1 ml de sangre como se describe en el Ejemplo 5 y se proceso 1 ml mas con el kit MolYsis de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los valores de Ct se representan en relacion a la concentracion de celulas en la figura 8 y muestran que el procedimiento de acuerdo con la presente invencion es al menos tan eficaz como el kit MolYsis conocido sin la adicion de enzimas o sales caotropicas.
EJEMPLO 8
Despues de la lisis selectiva de celulas sangufneas y el enriquecimiento de las celulas de patogenos en el filtro de seleccion de tamano, se empleo lisis alcalina para conseguir la lisis simultanea de diferentes patogenos en el filtro para hacer disponible el ADN para el analisis por PCR.
La figura 9 muestra el resultado del procedimiento de lisis alcalina realizado en un cartucho integrado. Se anadio 1 ml de sangre a 106 celulas de S. aureus, P. aeruginosa y C. albicans. Despues de la lisis selectiva de celulas sangufneas y el enriquecimiento de patogenos en el filtro, se realizo la lisis alcalina, usando 200 pl de una solucion que contiene NaOH 200 mM, SDS al 0,5% que se incuba a 95 °C durante 10 min para obtener la lisis completa de los patogenos en el filtro. Los eluatos que contienen el ADN de patogenos se neutralizaron con 20 pl de una solucion 1 M de acido cftrico y se purificaron usando el Mini-kit de ADN/Sangre QIAamp. Como una muestra de control, se lisaron 106 celulas de cada patogeno en el banco, se neutralizaron y se purificaron como se ha descrito anteriormente.
Para la optimizacion y la prueba de comparacion del procedimiento de lisis alcalina, se selecciono Candida albicans como sistema modelo ya que estas celulas de levadura se conocen bien por sus paredes celulares rfgidas que son diffciles de lisar. La figura 10 compara el procedimiento de lisis alcalina (usando NaOH 50 mM, SDS al 0,25% en combinacion con tratamiento de calor) con otros procedimientos de lisis, concretamente tratamiento de ultrasonidos de alta densidad (HiFU) y un kit comercial (kit de lisis BD GeneOhm). Para la lisis alcalina y la lisis mediante el kit comercial, las muestras se concentraron de 1 ml a 160 y 100 pl, respectivamente, usando centrifugacion. Para el tratamiento HiFU se usaron 2 ml de solucion celular, sin concentracion previa. Despues de la lisis, las celulas no lisadas y los residuos se eliminaron de la muestra por centrifugacion. Se uso 1 pl de lisado en bruto como entrada para el PCR.
La combinacion de NaOH y SDS es mas eficaz para la lisis que cada uno de los compuestos individuales. Un aumento de la concentracion de cualquier compuesto no aumento adicionalmente la eficacia de la lisis. La lisis alcalina sin una etapa de incubacion de calor es significativamente menos eficaz. La eficacia de la lisis puede aumentarse por incubacion durante 2 min a 95 °C, sin embargo, para la integracion del ensayo en un cartucho se prefiere una incubacion durante mayor tiempo a 70 °C.
Para la lisis alcalina, las celulas se suspendieron de nuevo en 100 pl de una solucion de lisis que contiene NaOH 50 mM y SDS al 0,25%. Posteriormente, las muestras se incubaron durante 10 min a 70 °C, se enfriaron rapidamente a temperatura ambiente y se neutralizaron mediante la adicion de 30 pl de Tris-HCI 500 mM, pH 7,0 (produciendo una concentracion final de Tris 150 mM, es decir, 3 veces la concentracion de NaOH).
Para el analisis por PCR del lisado en bruto, las celulas no lisadas y los residuos se eliminaron de la muestra por centrifugacion (5 min, 14.000 g). Se anadio 1 pl de sobrenadante a 25 pl de reaccion de PCR. La deteccion por PCR se baso en un ensayo PCR Taqman en direccion al gen ARNr (Apollo). La reaccion de PCR se realizo en una mezcla maestra Universal Taqman (Applied Biosystems), usando un cebador directo 500 nM y un cebador indirecto 300 nM y una sonda marcada con FAM-BHQ1 (todos los oligonucleotidos se sintetizaron de forma personalizada por Biolegio BV). La reaccion de PCR se realizo en un sistema de PCR en tiempo real Biorad CFX. Despues de una etapa de calor inicial de 10 min a 95 °C para activar la polimerasa con inicio caliente, se usaron 50 ciclos de 15 s a 95 °C y 1 min a 60 °C para la amplificacion. Se detectaron senales de fluorescencia en cada ciclo durante la etapa de 60 °C. El analisis de datos se realizo con el software Biorad CFX.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para la lisis selectiva de celulas animales en una muestra de sangre de mamffero que contiene, o se sospecha que contiene, un microorganismo, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
- a) proporcionar una muestra de sangre de mamffero con celulas animales que contiene, o se sospecha que contiene, un microorganismo, en la que dicha muestra de sangre es sangre entera,
- b) anadir un detergente no ionico y un tampon a dicha sangre entera para obtener una solucion con un pH de aproximadamente 9,5 o superior, en la que la relacion entre el volumen de detergente anadido y el tampon anadido y el volumen de dicha sangre entera esta entre 2/1 y 1/10,
- c) incubar dicha solucion durante un periodo de tiempo lo suficientemente largo para lisar las celulas animales.
2. Un procedimiento para la lisis selectiva de celulas animales en una muestra de sangre de mamffero que contiene, o se sospecha que contiene, un microorganismo, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
- a) proporcionar una muestra de sangre de mamffero con celulas animales que contiene, o se sospecha que contiene, un microorganismo, en la que dicha muestra de sangre es sangre entera
- b) anadir un detergente no ionico y un tampon a dicha sangre entera para obtener una solucion con un pH de aproximadamente 9,5 o superior, en la que el detergente no ionico esta presente en una concentracion en el intervalo de entre el 0,1 y el 5 % (% p/v p % v/v),
- c) incubar dicha solucion durante un periodo de tiempo lo suficientemente largo para lisar las celulas animales.
3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que dicho microorganismo es una bacteria.
4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que dicho microorganismo es un hongo.
5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha etapa de incubacion c) se realiza entre 30 segundos y 10 minutos.
6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que la relacion entre el volumen de detergente anadido y de tampon anadido y el volumen de dicha sangre entera esta entre 2/1 y 1/10.
7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 a 5, en el que el detergente no ionico esta presente en una concentracion del 0,1 y el 5% (% p/v o % v/v).
8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el detergente no ionico se selecciona entre el grupo que comprende Nonidet P40, desoxicolato, Igepal CA 630 y/o Triton-X 100.
9. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende adicionalmente la etapa de centrifugar dicha solucion incubada y aislar dichos microorganismos.
10. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende adicionalmente la etapa de filtrar dicha solucion incubada en un filtro con un tamano de poro que retiene los microorganismos en dicho filtro.
11. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende adicionalmente la etapa de lisar dichos microorganismos.
12. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende adicionalmente un ensayo molecular basado en acidos nucleicos.
ES10807664T 2009-12-08 2010-12-07 Lisis selectiva de células Active ES2509968T5 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09178363 2009-12-08
EP09178363A EP2333105A1 (en) 2009-12-08 2009-12-08 Selective lysis of cells
PCT/IB2010/055628 WO2011070507A1 (en) 2009-12-08 2010-12-07 Selective lysis of cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2509968T3 ES2509968T3 (es) 2014-10-20
ES2509968T5 true ES2509968T5 (es) 2019-04-24

Family

ID=42136346

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10807664T Active ES2509968T5 (es) 2009-12-08 2010-12-07 Lisis selectiva de células

Country Status (12)

Country Link
US (2) US10308976B2 (es)
EP (2) EP2333105A1 (es)
JP (2) JP5937013B2 (es)
KR (1) KR101786135B1 (es)
CN (1) CN102725423B (es)
AU (2) AU2010329527B2 (es)
BR (1) BR112012013926A2 (es)
CA (1) CA2782451C (es)
ES (1) ES2509968T5 (es)
RU (1) RU2556130C2 (es)
WO (1) WO2011070507A1 (es)
ZA (1) ZA201203787B (es)

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2012266754B2 (en) * 2011-06-06 2016-04-21 Biocartis Nv Selective lysis of cells by ionic surfactants
EP3434759A1 (en) * 2011-07-22 2019-01-30 bioMerieux, Inc. Method and kit isolating microorganisms from culture
ES2396820B1 (es) 2011-07-26 2014-01-31 Universidad Autónoma de Madrid Método para evaluar la integridad de la pared celular bacteriana.
US10053722B2 (en) 2011-12-21 2018-08-21 Geneohm Sciences Canada Inc. Enrichment and isolation of microbial cells and microbial nucleic acids from a biological sample
EP2684947A1 (en) * 2012-07-09 2014-01-15 Biocartis SA A method for filtering a biological sample
ES2843202T3 (es) 2012-09-28 2021-07-16 Cepheid Métodos para la extracción de ADN y ARN a partir de muestras de tejido fijado embebido en parafina
US8975060B2 (en) 2012-11-30 2015-03-10 Qvella Corporation Method for pretreatment of microbial samples
US9707555B2 (en) 2012-11-30 2017-07-18 Qvella Corporation Method for pretreatment of microbial samples
FR3001464B1 (fr) * 2013-01-25 2016-02-26 Biomerieux Sa Procede d'isolement specifique d'acides nucleiques d'interet
WO2014193481A1 (en) * 2013-05-31 2014-12-04 Rajesh Krishnamurthy Rapid microbial detection
EP3063290B1 (en) 2013-10-30 2018-11-21 Merck Patent GmbH Method for isolating microorganisms from a complex sample
US10385330B2 (en) * 2013-12-02 2019-08-20 Biocartis N.V. Extraction of circulating nucleic acids
EP2942394A1 (en) 2014-05-09 2015-11-11 Molzym GmbH & Co. KG New method for isolating microbial DNA
JP6760845B2 (ja) 2014-05-16 2020-09-23 クヴェッラ コーポレーション 自動式遠心分離を行うための装置、システム、および方法
US10655188B2 (en) 2014-06-13 2020-05-19 Q-Linea Ab Method for determining the identity and antimicrobial susceptibility of a microorganism
ES2872344T3 (es) * 2014-07-02 2021-11-02 Siemens Healthcare Diagnostics Inc Separación selectiva de ácidos nucleicos
NL2013266B1 (en) 2014-07-25 2016-05-19 Microbiome Ltd Novel test for microbial blood infections.
EP3696267A1 (en) * 2014-09-17 2020-08-19 Helixbind Inc. Methods for lysing eukaryotic cells
WO2016153355A2 (en) 2015-03-26 2016-09-29 Microbiome Limited Novel isolation and amplification process control
EP3719141B1 (en) 2015-04-20 2023-01-25 QIAGEN GmbH Method, lysis solution and kit for selectively depleting animal nucleic acids in a sample
GB201507026D0 (en) 2015-04-24 2015-06-10 Linea Ab Q Medical sample transportation container
CN104931317B (zh) * 2015-06-11 2018-05-25 宁波美晶医疗技术有限公司 一种血液前处理液
GB201511129D0 (en) 2015-06-24 2015-08-05 Linea Ab Q Method of determining antimicrobial susceptibility of a microorganism
EP3347485B1 (en) 2015-09-11 2021-11-03 Bacteria Detection Ltd Methods for isolating microbial cells from a blood sample
US10730041B2 (en) 2016-03-14 2020-08-04 Helixbind, Inc. Integrated fluidic devices and related methods
US10465231B2 (en) 2016-03-22 2019-11-05 Siemens Healthcare Gmbh Method and apparatus for enriching pathogen DNA
CA3020581A1 (en) * 2016-04-14 2017-10-19 T2 Biosystems, Inc. Methods and systems for amplification in complex samples
WO2017182775A1 (en) * 2016-04-18 2017-10-26 Momentum Bioscience Limited Microorganism detection involving filtration
GB2554767A (en) 2016-04-21 2018-04-11 Q Linea Ab Detecting and characterising a microorganism
EP3457849A1 (en) * 2016-06-24 2019-03-27 Lonza Inc. Synergistic antimicrobial combinations containing quaternary ammonium biocide
GB201617713D0 (en) 2016-10-19 2016-11-30 Q-Linea Ab Method for recovering microbial cells
GB2557654A (en) 2016-12-14 2018-06-27 Uea Enterprises Ltd Method for nucleic acid depletion
US11149246B2 (en) 2016-12-29 2021-10-19 Shoreline Biome, Llc Methods for cell lysis and preparation of high molecular weight DNA from modified cells
KR102281213B1 (ko) * 2016-12-29 2021-07-22 쇼어라인 바이옴, 엘엘씨 포괄적인 세포 용해를 위한 조합된 용해 프로토콜
CN106893680B (zh) * 2017-03-03 2020-10-02 上海市临床检验中心 一种从血液样本中富集丝状真菌的方法
WO2018160907A1 (en) * 2017-03-03 2018-09-07 Counsyl, Inc. Extraction of nucleic acids for reduced probe count variability
EP3456839A1 (en) * 2017-09-14 2019-03-20 Siemens Healthcare GmbH Method of enrichment of micro-organisms in a metagenomics workflow
JP2019075997A (ja) * 2017-10-20 2019-05-23 花王株式会社 吸収性物品に移行した微生物から核酸又はタンパク質を抽出する方法
US20220064695A1 (en) * 2018-03-11 2022-03-03 Bacteria Detection Ltd Methods for isolating microbial cells from a blood sample
GB201805479D0 (en) * 2018-04-03 2018-05-16 Momentum Bioscience Ltd Microorganism separation and detection
JP7062552B2 (ja) 2018-08-06 2022-05-06 株式会社日立製作所 微生物検査
CN112391291B (zh) * 2019-08-19 2022-03-29 广州微远医疗器械有限公司 细胞内微生物的富集方法及试剂
WO2021055495A1 (en) * 2019-09-17 2021-03-25 Juno Bio Limited Methods and systems for selective nucleic acid depletion
GB201914538D0 (en) 2019-10-08 2019-11-20 Momentum Bioscience Ltd Microorganism capture from antimicrobial-containing solution
US20230167480A1 (en) * 2020-05-12 2023-06-01 Hitachi High-Tech Corporation Automatic analyzer and automatic analysis method
DE102020209001B4 (de) * 2020-07-17 2024-04-18 Hahn-Schickard-Gesellschaft für angewandte Forschung e.V. Lyse einer Probe mittels Magnetelementen und rotatorischer Relativbewegung
EP4263795A1 (en) * 2020-12-16 2023-10-25 BioFire Diagnostics, LLC Systems, methods, and apparatuses for concentration and identification of a microorganism from blood
US20240084404A1 (en) * 2020-12-25 2024-03-14 Roche Molecular Systems, Inc. Selective lysis of human blood cells
CN113088454A (zh) * 2021-04-08 2021-07-09 武汉轻工大学 一种从被感染细胞中分离完整细菌的方法
CN114480575B (zh) * 2022-01-19 2024-04-09 武汉承启医学科技有限公司 一种快速检测病原体的方法
EP4389911A1 (en) * 2022-12-21 2024-06-26 Mobidiag Oy Methods and systems for isolating an analyte

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4610961A (en) 1982-12-27 1986-09-09 Eastman Kodak Company Inhibition of reduction activities of leukocytes
US4652517A (en) * 1984-06-11 1987-03-24 Diagnostic Research Limited Partnership Methods for the in vitro detection and identification of unknown pathogens or genetic entities
JP2565844B2 (ja) * 1992-02-07 1996-12-18 アボツト・ラボラトリーズ 細胞溶解処理条件下で異種細胞集団を正確に計数し，感受性に関する格付けを行う方法
AU686577B2 (en) 1992-10-30 1998-02-12 Innogenetics, Inc. Measurement of total molecule in a sample and methods based thereon
AU4586096A (en) * 1995-03-10 1996-09-19 Becton Dickinson & Company Sample processing method for whole blood
US6632399B1 (en) 1998-05-22 2003-10-14 Tecan Trading Ag Devices and methods for using centripetal acceleration to drive fluid movement in a microfluidics system for performing biological fluid assays
US6465201B1 (en) * 1999-05-25 2002-10-15 Millipore Corporation Method for rapidly detecting and enumerating microorganisms in mammalian cell preparations using ATP bioluminescence
JP4495866B2 (ja) * 1999-05-28 2010-07-07 セフィード 化学反応を制御するためのカートリッジ
US6878540B2 (en) * 1999-06-25 2005-04-12 Cepheid Device for lysing cells, spores, or microorganisms
US6803208B2 (en) 2001-07-30 2004-10-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Automated epifluorescence microscopy for detection of bacterial contamination in platelets
WO2003035899A1 (fr) * 2001-10-23 2003-05-01 Denka Seiken Co., Ltd. Procede de separation des globules sanguins d'un micro-organisme dans le sens et procede de detection de ce micro-organisme dans le sang
ATE261126T1 (de) * 2002-08-01 2004-03-15 Mtm Lab Ag Verfahren für lösung-basierte diagnose
AU2004269340B2 (en) 2003-08-15 2010-09-16 University Of South Florida Materials and methods for capture of pathogens and removal of aurintricarboxylic acid from a sample
EP1692512B1 (en) * 2003-12-09 2012-09-05 bioMérieux, Inc. Methods for detecting bacterial pathogens
ES2320350T3 (es) * 2003-12-09 2009-05-21 Biomerieux, Inc. Procedimientos para detectar patogenos bacterianos.
DE102005009479A1 (de) 2005-03-02 2006-09-07 Molzym Gmbh & Co. Kg Verwendung von Nukleasen zum Abbau von Nukleinsäure in Gegenwart von chaotropen Agenzien und/oder Tensiden
GB0508981D0 (en) * 2005-05-03 2005-06-08 Acolyte Biomedica Ltd Distinguishing cells in a sample
EP1882739A1 (en) 2006-06-30 2008-01-30 Qiagen GmbH Nucleic acid extraction method
JP4195504B2 (ja) 2006-12-27 2008-12-10 株式会社メディビック 真空採血管
JP4522434B2 (ja) 2007-05-31 2010-08-11 キヤノン株式会社 血液採取用容器
CA2693565C (en) 2007-08-02 2015-05-26 Universite Laval Concentration and enrichment of microbial cells and microbial nucleic acids from bodily fluids
KR20090058221A (ko) * 2007-12-04 2009-06-09 삼성전자주식회사 시료 중의 세포 집단으로부터 죽은 세포를 선택적으로파쇄하는 방법
EP2087934A1 (de) † 2008-02-07 2009-08-12 Qiagen GmbH Verfahren und Vorrichtung zur automatisierten Prozessierung einer Probe
JP5599013B2 (ja) 2008-04-03 2014-10-01 キヤノン株式会社 血液検体からの微生物核酸の抽出方法
US9128058B2 (en) * 2008-10-31 2015-09-08 Biomerieux, Inc. Method for separation and characterization of microorganisms using identifier agents
CA2741036C (en) 2008-10-31 2018-01-09 Biomerieux, Inc. Methods for separation, characterization, and/or identification of microorganisms using raman spectroscopy
US8652800B2 (en) 2008-10-31 2014-02-18 Biomerieux, Inc. Method for separation, characterization and/or identification of microorganisms using spectroscopy
AU2010248809B2 (en) 2009-05-15 2015-07-09 Biomerieux, Inc. System and methods for rapid identification and/or characterization of a microbial agent in a sample

Also Published As

Publication number Publication date
CN102725423B (zh) 2015-04-01
US11072813B2 (en) 2021-07-27
US10308976B2 (en) 2019-06-04
ES2509968T3 (es) 2014-10-20
JP5937013B2 (ja) 2016-06-22
EP2333105A1 (en) 2011-06-15
KR101786135B1 (ko) 2017-11-15
RU2556130C2 (ru) 2015-07-10
EP2510123A1 (en) 2012-10-17
CA2782451C (en) 2018-01-02
AU2010329527A1 (en) 2012-06-14
BR112012013926A2 (pt) 2016-04-26
US20190218595A1 (en) 2019-07-18
CN102725423A (zh) 2012-10-10
WO2011070507A1 (en) 2011-06-16
AU2016204193A1 (en) 2016-07-14
EP2510123B1 (en) 2014-09-24
US20130171615A1 (en) 2013-07-04
EP2510123B2 (en) 2019-01-09
AU2010329527B2 (en) 2016-05-19
CA2782451A1 (en) 2011-06-16
KR20120115242A (ko) 2012-10-17
RU2012128662A (ru) 2014-01-20
JP2013512685A (ja) 2013-04-18
JP2016127844A (ja) 2016-07-14
ZA201203787B (en) 2013-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2509968T5 (es) Lisis selectiva de células
AU2012266754B2 (en) Selective lysis of cells by ionic surfactants
US10450558B2 (en) Method for isolating microbial DNA
EP2710127A1 (en) Selective ultrasonic lysis of blood and other biological fluids and tissues
US20100305312A1 (en) Method For The Extraction And Purification Of Nucleic Acids On A Membrane
CN116042603A (zh) 一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取方法及试剂
US20110275090A1 (en) Use of achromopeptidase for lysis at room temperature
JP2012080853A (ja) 抗酸菌ｄｎａの抽出精製法
JP5599013B2 (ja) 血液検体からの微生物核酸の抽出方法
US20190153427A1 (en) Determination of rna in blood or other fluids
JP2023052559A (ja) ビーズ破砕用チューブ並びに微生物からデオキシリボ核酸及び／又はリボ核酸を抽出する方法